（动物遗传育种与繁殖专业论文）防御素基因克隆及其在大肠杆菌中的表达.pdf

本研究由 中1 3 1 农业科学院创新基金 提供资助 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。尽我所知，除了文中特，i u ) j n 以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学 位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 锻幼 z 舻月妒日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名 乃之砑 孵年月叫日 0 ；一年占旯 细 摘要 本文主要根据g e n b a n k 已公布的兔防御素n p 一1 基因和猪防御素p b d - 1 基因序列， 分别选用原核或真核高效表达载体构建重组表达质粒，以期在大肠杆菌或c o s 一7 细胞中 得到高效表达，为进一步研究这两个抗菌肽奠定基础。 在实验一中。根据兔防御素n p 一1 基因序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子，应用计 算机辅助设计，去除基因原有的影响其在大肠杆菌中高效表达的成分，对原有的n p - 1 基因序列进行改造，经改造后的n p - 1 基因其编码的氨基酸多肽链一级结构保持不变。 将改造后的n p - 1 基因分为两段进行人工合成，这两个片段为互补链，各含5 9b p ，中间 有1 3 b p 的碱基重叠互补。采用p c r 技术将两个片段延伸成一条完整的n p l 基因链。为 了让n p - 1 基因能正确有效地连接到表达载体p m a l p 2 x 上，我们设计了分别带有x b ai 、 h i n d i i i 酶切位点的扩增该基因的上下游引物。将该基因扩增得到的带酶切位点的产物克 隆到p g e m _ te a s yv e c t o r 上，经酶切鉴定和序列分析正确后，再经双酶切连接到用同 样酶切的载体p m a l - p 2 x 上，并将得到的重组表达载体转化大肠杆菌丘c 0 1 1t b l ，以浓 度为0 1 m m 的i p t g 诱导表达。诱导产物经1 2 的聚丙烯酸胺凝胶电泳进行检测，结果显 示有分子量约为4 o k d 的特异蛋白质条带出现，说明兔n p l 基因在大肠杆菌中得到成 功表达。 在实验二中，根竭猪防御素p b d 一1 基因序列，应用计算机软件设计出一对带有酶切 位点h i n di i i ，x b ai 的引物。从新鲜的猪舌表皮组织细胞中分离提取总r n a ，经逆转录 p c r ( r t p c r ) 扩增出猪防御素p b d 一1 基因的第一链c d n a ，将回收的第一链c d n a 产物用 上述特异引物再次扩增、回收，得到约2 1 3 b p 的目的片段，用l d n a 连接酶将其克隆到 p g e m - te a s yv e c t o r 上，然后双酶切克隆质粒，再将回收的目的条带连接蓟同样经双酶 切回收后的真核表达质粒p c d n a 3 1 ( + ) 上。经酶切鉴定和序列分析，猪防御素d b d 一1 基因成功连接到表达载体上。序列分析结果同时显示，在猪p b d 一1 基因扩增产物中编码 成熟肽部分的一个碱基与发表的p b d 一1c d n a 序列不同，即第1 0 4 位碱基e ha 变为g ，导 致该处编码的氨基酸e h 赖氨酸变为精氨酸。该碱基的变异可能与猪品种不同有关。本实 验猪防御素p b d l 基因表达载体的成功构建，为进一步研究p b d - 1 基因表达产物的抗菌 活性及其抗菌机理打卞了基础。 关键词：兔防御素；猪防御素；基因：表达载体；构建 a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h es e q u e n c eo fr a b b i td e f e n s i nn p - 1a n dp o r c i n ed e f e n s i np b d 一1g e n e p u b l i s h e di no e n b a n k ，w es e l e c t e dr e s p e c t i v e l yp m k a r y o n o re u k 甜y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rt o c o n s t r u c tr e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dh o p i n gf o rg e t t i n ge x p r e s s i o np r o t e i ni ne c o l io r c o s 一7c e l l s ，a l lt h e s el a i dd o w naf o u n d a t i o ni nr e s e a r c ho f t h e s et w oa n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s i ne x p e r i m e n ti ，w es e l e c t e dt h ec o d o nu s a g eb i a so fe c o l i ，r e m o v e di n f l u e n c ef a c t o r s o fe x p r e s s i o ni ne c o l i ，a n dm o d i f i e di n t r i n s i cs e q u e n c eo fn p lg e n ew i t ht h eh e l po f c o m p u t e r , b u ta m i n oa c i ds e q u e n c ee n c o d e db ym o d i f i e d n p 1g e n ew a su n c h a n g e dy e t t h e s e q u e n c eo f n e w n p 1g e n ew a sd i v i d e di n t ot w op i e c e sw h i c hc o m p l e m e n t e de a c ho t h e rw i t h 1 3 b p t h e s et w op i e c e se a c ho fw h i c hc o n t a i n e d5 9 b p w e l es y n t h e s i z e dc h e m i c a l l y , a n d s t r e t c h e di n t oac o m p l e t ec h a i nb yp c r t w op r i m e r sw i t hx b aia n dh i n d l i lr e s t r i c t i o n e n z y m e ss i t e sw e r ed e l s i g u e df o rn p - 1g e n eb e i n gc o r r e c t l yl i n k e dt oe x p r e s s i o nv e c t o r p m a l p 2 x a tf i r s t , n p - lg e n ew i t he n z y m e ss i t e sw a sc l o n e di n t op g e m - te a s yv e c t o r , a n d t h e nc o n n e c t e dw i t hp m a l - p 2 xv e c t o rb yt h es a m ee n z y m ed i g e s t i o n a tl a s t ，r e c o m b i n a n t p m a l - p 2 xe x p r e s s i o np l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l it b lw h i c hw a si n d u c e db y o i m mi p t g t h er e s u l to f as o m e4 0 k ds p e c i f i cp r o t e i nb a n da p p e a r i n gi n1 2 s d s - p a g e e l e c t r o p h o r e s i sd e m o n s t r a t e d t h a tr a b b i t n p 一1g e n e e x p r e s s e ds u c c e s s f u l l y i n e c o l i t b l i ne x p e r i m e n ti i ，a c c o r d i n gt os e q u e n c eo fp o r c i n ed e f e n s i np b d - lg e n e ，w ed e s i g n e da c o u p l eo fp r i m e r sw i t hr e s t r i c t i o ne n z y m es i t ex b ai ，a n dh i n d i i lb yc o m p u t e r a f t e rt o t a l r n a b e i n gi s o l a t e df r o mp o r c i n et o n g u et i s s u ec e l l s , t h ef i r s tc d n ac h a i nc o u l db eg o r e n f r o mi tb yr t - p c r ，a n d 咀l e n g t ho f2 1 3 b pt a r g e tg e n ef r a g m e n tc o u l db eg m n e db ya m p l i f i n g f u r t h e rt h ef i r s te d n ac h a i nw i t hac o u p l eo fs p e c i a lp r i m e r st o o t h et a r g e tg e n ef r a g m e n t w a sc l o n e di n t op g e m - te a s yv e c t o rw i t ht 4 d n ae n z y m e ，a n dt h e ni n s e r t e di n t oe u k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o rp c d n a 3 1 ( + ) w h i c hw a sd i g e s t e db yx b a ia n dh i n d i le n z y m e s i tw a s a f f m e dt h a tp o r c i n ed e f e n s i np b d - lg e n eh a db e e ns u c c e s s f u l l yl i g a t e dt oe x p r e s s i o n p l a s m i db yr e s t r i c t i o ne n z y m ea n a l y s i sa n dd n as e q u e n c i n g t h er e s u l to fd n as e q u e n c i n g d e m o n s t r a t e dt h a tab a s eo fp o r c i n ed e f e u s i np b d lg e n ew a sd i f f 既 e n ta sc o m p a r e dt ot h e s e q u e n c ep u b l i s h e di ng e n b a n k , t h a tw a sa gm u t a t i o nh a p p e n i n ga tp o s i t i o n1 0 4 t h i s c h a n g e sc a u s e da m i n oa c i ds u b s t i t u t i o ni nt h em a t u r ep e p t i d es e q u e n c ea tp o s i t i o n3 5w h e r e a 2 l y sw a sc h a n g e di n t oaa r g ，t h i sd i f f e r e n c em a y b er e s u l to fp i gb r e e do re r r o ri np c r t h e s u c c e s s f u lc o n s t r u c t i o no f p b d dg e n ee x p r e s s i o nv e c t o rl a i dd o w nt h ef o u n d a t i o ni nr e s e a r c h o f a n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e s ，a n da n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s m k e yw o r d s ：r a b b i td e f e n s i n ；p o r c i n ed e f e n s i n ；g e n e ；e x p r e s s i o nv e c t o r ；c o n s t r u c t i o n 3 四川农业大学硕士学位论文文献综述 皇墨鼍墨置_ ii ! 墨曼喜鼍量置| 皇葛暑墨置田e 皇皇皇置薯暑曼置置曼皇皇量皇鼍墨 第一部分： 文献综述：抗菌肽的研究进展 自2 0 世纪3 0 年代初发现青霉索的抗菌作用以来，抗生素在预防和治疗人 类与动物疾病方面作出了巨大贡献。然而，由于在治疗人类疾病和动物产品生产 中长期、广泛、甚至不加选择滥用抗生素药物和抗生素饲料添加剂已导致了一系 列耐药微生物的产生，这给细菌性疾病的预防与控制带来了极大的困难和麻烦。 此外，传统的抗生素类药物对真菌性疾病的治疗效果显得不尽人意，如白色念珠 菌感染等；现有药物对支原体、衣原体、螺旋体及一些恶性肿瘤的治疗果效不理 想，对艾滋病毒更是无可奈何。因此设计和开发新型抗菌药物来治疗人类疾病特 别是一些顽症和绝症显得迫在眉睫。目前一种新型的抗菌药物抗菌肽以其特 有的抗菌机理和抗菌特性正受到研究者的关注。 1 抗菌肽的发现与分类 1 1 抗菌肽的发现 抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ，a b p ) ，也称肽类抗生素( p e p t i d e a n t i b i o t i c s ) ，是生物细胞特定基因编码的一类具有广谱抗微生物活性的小分子 多肽，其生成和释放是机体炎症反应的组成部分，是宿主防御病源微生物入侵的 重要分子屏障。抗菌肽最早是2 0 世纪8 0 年代由瑞典科学家b o m a n 等在惜古比天 蚕( h y a t o p h o r ac e c r o p i a ) 蛹中发现的，被称为天蚕素( c e c r o p i n s ) 。随后s t e i n e r 等测定了它的一级结构( s t e i n e rh ，e t 占五1 9 8 1 ) 。之后一些实验室又分别从 家蚕、柞蚕蛹、肉蝇、烟草天蛾、麻蝇等分离出其它一些类似的具有抗菌活性的 多肽。目前天蚕素类( c e c r o p i n s ) 抗菌肽是研究较多的一类抗菌肽。 随着研究的深入，人们发现了更多种类的抗菌肽物质，不仅在无脊椎动物中， 而且在两栖动物、哺乳动物、植物及细菌和真菌。甚至在某些病毒中都发现了抗 菌肽物质。z a s l o f f 等在去除爪蟾( x e n o p u s ) 卵巢的实验时发现了m a g a i n i n s ( z a s l o f fm ，e t8 1 ，1 9 8 7 ) 。1 9 8 9 年，l e e 等( l e ejy ，e fa ，1 9 8 9 ) 从猪的 小肠分离到一种类似天蚕素的抗菌肽，命名为c e c p ( c e c r o p i np 1 ) 。h r i s h 还从 兔的中性粒细胞( p 删) 中提取出一种具有杀菌作用的阳离子蛋白，后来证实是 4 一种富含精氨酸、半胱氨酸的阳离子多欣( s e l s t e dme ，e ta l , 1 9 8 3 ) ，g a n z 等将其命名为防御素( d e f e n s i n s ) ( g a n zt ，e tn l ，1 9 9 4 ) 。t h i o n i n s 是最早从 植物中分离的抗菌肽，它们对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、酵母及哺乳动物细 胞均有毒性。以后人们发现细菌也能产生抗菌肽物质，其中，细菌素是常见的一 类抗菌肽，它能特异性杀死竞争菌，而对宿主自身无害。目前发现h i v - i 包膜蛋 自质尾部也具有抗菌肽的功能，它同从其他慢性病毒穿膜蛋自得到的抗菌肽一 样。都具有抗菌活性和细胞毒性。 1 2 抗菌肽的分类 自惜古比天蚕( h y a t o p h o r ac e c r o p i a ) 中分离出c e c r o p i n s 天蚕素抗菌肽 后，人们又从其它昆虫上发现了多种抗菌肽。随后在两栖类、哺乳动物的一些器 官组织或特定细胞中也发现了抗菌肽，这使人们认识到抗菌肽可能是自然界中许 多物种普遍拥有的对抗外来微生物侵袭的一类物质。目前对此类物质还没有统一 的分类方法，但习惯上人们常根据来源将其分为以下几类： 1 ) 昆虫类抗菌肽 c e c r o p i n s 是主要的一类昆虫抗菌肽，昆虫中分离得到的抗 菌肽大多归入此类( h o l a kt a 。a ta ，1 9 8 8 ：p s e pk ，e tn l , 1 9 9 9 ) 。惜古比天蚕 中分离出的抗菌肽有c e c r o p i na 、b 、d 三种，三者之间有较高的同源性。研究 显示，在不同的昆虫中也存在c e c r o p i n 类抗菌肽。l e e 等在a p h i n g i dm o t h ， a g r i u sc o n v o l v u l i 幼虫免疫血淋巴中分离到2 种分子量和氨基酸组成均相似的 抗菌肽，在大小和一级结构上与c e c r o p i nd 有很高的同源性( l e eh i ，e tn l , 1 9 9 9 ) 。此外，l o w e n b e r g e n 等在埃及伊蚊( a e d e sa e g y p t i ) 血淋巴( l o w e n b e r g e n c ，p fa l ，1 9 9 9 ) ，y a n g 等在中国家蚕( b o m b y xm o r i ) 脂肪体中分别分离碍到与 c e c r o p i n a 和d 有较高同源性的抗菌肽( y a n gj ，e ta l ，1 9 9 9 ) 。在惜吉比天蚕 中还分离得到含1 8 4 个氨基酸的杀菌蛋白( a t t a c i n ) ，它属于昆虫抗菌肽体系的 成员。但不归于c e c r o p i n s 一类抗菌肽。此外在中国家蚕( b o m b y xm o r i ) 中， 我国学者分离得到一种新型抗菌肽c m i v 。随着对昆虫抗菌肽研究的深入，有更 多的与c e c r o p i n s 不相同的新型抗菌肽被发现。如从黑腹果蝇( d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ) 中诱导分离出的m e t c h n i k o w i n ( l e v a s h i n ab a ，e ta j ，1 9 9 5 ) 等。 昆虫体内还有一类结构与哺乳动物嗜中性白细胞中分离到的防御素具极大 相似性的肽类物质，称为昆虫防御素。第一种昆虫防御素由m a s t u r y a m a 于1 9 9 8 年在一种半翅目昆虫肉蝇( s a r c o p h a g a p e r e g r i n a ) 中发现的( m a s t u r y a m a k ，e t 8 a1 9 8 8 ) 。大多数昆虫防御素分子量为4 k d a 左右，由3 8 至4 3 个氨基酸残基组 成，氨基酸序列中含有6 个c y s ，且这6 个c y s 的位置很保守，能形成3 个分子 内二硫键。不同种类昆虫防御素分子结构具有很大的同源性，其主要差异在于n 端的环的大小。昆虫防御素抗g 而对g 一几乎不起作用，另外与哺乳动物防御素 相比，昆虫防御素时真菌及真核细胞不起作用。 此外还有一种需要提及的昆虫抗菌肽就是蜂毒素蛋白m e l i t t i n ，这类抗菌 肽的共同特点是富含甘氨酸，分子量为8 2 7 k d ，有很强的抗菌活性，能够作用 于真核细胞。它还有一个特点就是有较强的溶血作用，因而限制了其作为抗菌药 物的使用。研究还发现在免疫蜜蜂血淋巴中存在一种富含脯氮酸的抗菌肽 a p i d a e c i n ，它是蜜蜂的主要抗菌肽，对多种植物病原菌及人类致病菌具有很强 的杀伤作用( c a s t e e l sp ，e ta l ，1 9 8 9 ；c r a i gag e ta l ，1 9 8 9 ) 。新的抗 菌肽的不断发现丰富了昆虫抗菌肽家族的成员，同时也暗示了昆虫抗菌肽在昆虫 免疫系统中的重要地位和其作用的复杂性。 2 ) 两栖类动物抗菌肽在无尾两栖类动物中，人们很早就发现其皮肤中含有大 量活性物质。1 9 7 0 年，c s o r d a s 等在研究欧洲铃蟾皮肤分泌物中的向细胞性物质 ( c y t o t r o p i cs u b s t a n c e s ) 时发现了第一个具有溶血作用的蛙皮抗菌肽 b o m b i n i n ：而直到1 9 8 7 年，z a s l o f f 从非洲爪蟾的皮肤分泌物中提取了蛙皮抗 菌肽马盖林宁( m a g a i n i n s ) 族，人们才开始重视此类肽的研究( z a s l o f fm ，e t a ，1 9 8 7 ) 。m a g a i n i n 分子有i 、i i 两型，其同源性很高。两栖类抗菌肽家族具 有多样性。椐研究铃蟾抗菌肽b o m b i n i n 与爪蟾抗菌肽m a g a i n i n 在序列上没有同 源性。g i b s o n 等从亚洲蟾蜍中分离得到三种肽，类似予b o m b i n i n ( b o m b i n i n - i i k e - p e p t i d e ) 。其抗菌活性也超过m a g a i n i n i i ( g i b s o n 明，e ta 五 1 9 9 1 ) 。此外。有人从r a n ab r e v i p o d ap o r s a 蛙皮中发现一种独特的抗菌肽 b r e v i n i n l 2 ( n o r i y u k im ，e ta a1 9 9 2 ) 。s i m o n 等从澳大利亚树蛙l i t o r i a c h l o r is 皮肤也分离到一种新抗菌肽c a e r i n l ( s h i ns y ，e ta l ，1 9 9 9 ) 。据不完 全统计，目前已从无尾两栖动物8 个属约4 0 多种的皮肤中提取出了抗菌肽。 3 ) 水产动物抗菌敖1 9 9 6 年，o r e n 等从豹鳎体上分离到一种3 3 个氨基酸残基 6 的抗菌肽并命名为p a r d a x i n ，研究发现它具有比蜂毒素更强的抗菌活性和更低 的人红血球溶血活性( o r e nz ，e ta l , 1 9 9 6 ) 。a z u m i 等从一种海鞘的血细胞 中分离到的抗菌肽h a l o c y a m i n ea ，在体外可抑制某些鱼r n a 病毒的生长，也能抑 制某些海水细菌的生长( h z u m ik ，8 ta l ，1 9 9 0 ) 。p a r k 等从泥鳅体上分离到 一个2 1 氨基酸的抗菌肽m i s g u r i n ，具有较强的体外广谱抗菌活性且没有明显的 溶血作用( p a r kcb ，e ta l , 1 9 9 7 ) 。s a i t o 等从鲎体上分离到的一个7 9 个 氨基酸残基的分子与兔和牛的嗜中性白血球防御素相似( s a i t ot ，e ta l ， 1 9 9 5 ) 。1 9 9 7 年d e s t o u m i e u x 等从养殖的南美白对虾的血细胞和血浆中分离了几 种抗菌活性因子，其中3 种具有抗真菌和抗细菌尤其是抗革兰氏阳性菌的活力 ( d e s t o u m i e u xd 。e ta 1 9 9 3 ) 。 4 ) 哺飘动物抗菌肽目前在哺乳动物中发现的抗菌肽主要有防御素 ( d e f e n s i n s ) 和c a t h e l i c i d i n s 两类。现已从不同物种分离出8 0 多种防御素。 防御素最初由l e h r e r 小组在2 0 世纪8 0 年代早期分离得到，几年后报道了第一 个防御素的序列，目前已有数十种d e f e n s i n s 序列发表。防御素在人和动物中分 布比较广泛。目前在人类嗜中性白细胞中已发现至少有6 种a 一防御素，2 种d 一 防御素。还有其它多种抗菌肽。在兔的嗜中性自细胞中发现了n p - 1 、n p 一2 、 n p 一3 a 、n p 一3 b 、n p 一4 和n p - 5 六种o 【一防御素，其总量占细胞蛋白质的1 5 一2 0 。 牛的b 一防御素是d i a m o n d 等首次在气管黏膜上皮细胞中发现的短肽，命名为t a p 。 后来又在牛的粒性细胞中发现了1 3 种与t a p 序列高度同源的b 一防御素。r o m e o 等在牛中性白细胞中发现一种与d e f e n s i n s 相似的多肽b a c t e n e c i n s ，它只有1 2 个氨基酸残基和一个分予内二硫键，这是目前发现的一个最特殊的防御素。猪的 防御寨p b d - im r n a 广泛分表于胸腺、碑、肝脏、肾、淋巴节、膀胱、脑、睾丸、 肌肉、皮肤、骨髓及心脏等多种器官的组织细胞中。d n a 印迹结果表明，在猪舌 中该防御素的含量最多可达2 0 l o o m g l 。c a t h e l i c i d i n s 家族是哺乳动物抗菌肽 中另一重要成员，目前仅在哺乳动物中发现。利用c a t h e l i n 结构域保守区的探 针已经从多种动物如兔( l a r r i c kj ，a ta ，t 9 9 1 ) 、猪( s t o r i c ip 。e ta l ， 1 9 9 4 ；t o s s ia ，e ta ，1 9 9 5 ) 、母牛( z a n e t t im 。p fa , 1 9 9 3 ) ，绵羊( b a g e l l a l ，p fa , 1 9 9 5 ) 马( s c o c c h im ，e ta 1 1 9 9 9 ) 、，j 、鼠( g a l l orl ，e ta ， 1 9 9 7 ) 、人( a g e r b e r t hb ，e ta l ，1 9 9 5 ) 、山羊( s h a m o v a0 ，e a 五1 9 9 9 ) 、 7 大鼠( t r a v i ssm ，e t8 ，2 0 0 0 ) 、豚鼠( n a g a o k ai ，e ta l1 9 9 7 ) 和猴( b a l s r ，p fa 五2 0 0 1 ：z h a oc ，e ta l ，2 0 0 1 ) 中发现了3 0 多种抗菌肽。此外，在哺 乳动物中也发现了与昆虫c e c r o p i n 抗菌肽类似的物质。l e e 等在猪的小肠中发 现一个与昆虫c e c r o p i n 高度同源的抗菌肽，即c e c r o p i np 1 ( l e ejy ，e ta l 1 9 8 9 ) 。 5 ) 植物抗菌肽在植物界中，抗菌肽的发现更早。大约5 0 多年前，人类已从植 物中分离到硫素( t h i o n i n ) ，实验表明它们在体外能抑制细菌及真菌的生长，但 直至u 1 9 7 2 年才第一次证实硫素可以杀死许多种病源菌，对植物具有保护作用。植 物产生的d e f e n s i n s 是m e n d e z 等于1 9 9 9 年从小麦、大麦粒中首先分离得到。与其 它抗菌肽相比，植物防御素抑杀真菌的活性很高，这从侧面表明真菌是植物界主 要的病原菌。迄今为止所发现的植物抗蘸肽都富含半胱氨酸( c y s ) ，并且所有的 半胱氨酸都形成分子内二硫键。根据二硫键的数量及高级结构的不同可分为5 大 i 类，其中一类是从玉米种子中分离得到的腿p l 和在i m p a t i e n sb a l s a m i n a 种 子中分离得到的l b - a m p s ，只含4 个c y s ，能抑制真菌和革兰氏阳性菌的生长， 后者还是迄今为止在植物中发现的最短抗菌肽( b r o e k a e r tw f 。e ta l , 1 9 9 7 ) 。 6 ) 细菌抗菌肽虽然抗菌肽能抑杀细菌，但是细菌也能产生抗菌肽来保护自 己。其中，细菌素是最常见的一类抗菌肽，它能特异性杀死竞争菌。而对宿主自 身无害。这是由于转录后的修饰作用或宿主有特殊的免疫机制( r g 晓燕，2 0 0 2 ) 。 与高等有机体产生豹抗菌肽相比，它更象传统的抗生素。同传统的抗生素一样， 通过抑制特定的蛋白而起作用，这种特异性能选择性地杀死与它亲缘关系较近的 菌株，以保证其在生态环境中的地位。有很多细菌抗菌肽不是由核糖体合成的， 这与真核生物抗菌肽是由核糖体产生有所不同。此类抗菌肤常含有某些特殊的氨 基酸，如羊毛甲硫氨酸，因此在高级结构和作用模式上与前面几类抗菌肽不同。 7 ) 病毒抗菌肽h i v l 包膜蛋白胞质尾部是最早发现的病毒抗菌肽，它们同从 其它慢性病毒穿胰蛋白得到的抗菌肽一样，都有抗菌活性和细胞毒作用。所有这 些抗菌肽精氨酸含量高，不含赖氨酸( h a n c o c kr e w ，e fa l ，2 0 0 0 ) 。 目前研究人员还在低等水生生物柄海鞘s t y e l ac l a v a 中发现了抗菌肽 s t y e l i n s ( i nh l ，e a l ，1 9 9 7 ) 。因此有理由相信。随着研究范围的不断扩大， 将会有越来越多新的抗菌肽物质被发现。 8 2 抗菌肽的基因结构特点 第一个被测定结构的抗菌肽基因是惜古比天蚕的c e c r o p i nb ( x a n t h o p o u l o s k g ，e a l ，1 9 8 8 ) ，该基因共i k b ，含一个内含子，将编码的信息分隔开。在表 达序列前有启动子的多结构部位，分别是：帽子位点( c a p s i t e ) 、t a t a 框( t a t a b o x ) 、c a a t 框( c a a tb o x ) ，这些属于r n a 聚合酶i i 的启动子结构。后来陆续 对天蚕素a 和天蚕素d 的基因结构进行了分析( s u ns c ，e ta 五1 9 9 1 ) ，证明天 蚕素( c e c r o p i n s ) 基因家族是一个大的基因族。约有2 0 k b ，基因间有插入成分。 天蚕素a 、天蚕素b 和天蚕素d 的基因均位于其上，天蚕素a 基因是单拷贝，天蚕 素b 基因是多拷贝，天蚕素d 基因是单或多拷贝，各个基因之间相距较远。每个基 因均含有1 个t a t ab o x 、1 个帽子位点( c a p s i t e ) 和1 个多聚腺苷酸加尾信号序 列。昆虫抗菌肽基因组的多数抗菌肽基因是单拷贝的，但同一类抗菌肽的不同形 式常在基因组中排列成族，这使得抗菌肽基因在基因组中具有形式上的多拷贝和 多组分连续分布的特点，这对于昆虫快速免疫是有意义的。一般来说，抗菌肤基 因转录翻译的前体形式是单个存在的，但c a s a t e e l s 等发现蜜蜂的一种主要抗菌 肽a p i d a e c i n 具有多重肽链的前体结构，c a s a t e e l sj k 认为这种结构有可能是放 大昆虫抗菌反应的一种机制( c a s a t e e l sj k ，e ta ，1 9 9 3 ) 。抗菌肽基因在昆虫基 因组中的分布和组成特点是昆虫能够快速、有效地抵御微生物侵袭的分子基础。 防御素作为抗菌肽的一个大类，其基因结构有其自身特点。n 防御素前体 分子为9 3 9 5 个氨基酸残基组成，信号序列为1 9 个氨基酸残基，前区序列长4 0 4 5 个氨基酸残基，成熟肽组成了前肽分子的羧基酸，终止密码子紧随成熟肽序列 之后( l e h r e rr i ，e a l ，1 9 9 3 ) 。n 防御紊5 端序列高度保守。骨髓源性防御 素基因组成包括：3 个外显子和2 个内含子。第一个外显子编码5 端编码未翻 译区，第二个外显子编码信号序列前区序列，第三个外显子编码成熟肽和3 端 未翻译区。在中性粒细胞系，防御素基因只有在未成熟的前体细胞、前髓细胞、 髓细胞中被翻译出来( r o s el i n z m e i e r ，e t8 三1 9 9 3 ) 。b 防御素前体分子由6 4 6 8 个氨基酸残基组成，信号序列和前区序列长2 2 3 2 个氨基酸残基。t a p 基因 结构分析显示有两个外显子，外显子间有一个1 6 k b 的内含子，外显子1 编码 t a p 前体分子的信号序列和部分前区序列，外显子2 编码部分前区序列和成熟 肽序列ah b d lc d n a 有3 6 2 b p ，含有两个外显子。人b 防御紊基因均位于染色体 9 8 p 2 3 上q 防御素位点附近( 1 i d el i u ，p 8 五1 9 9 8 ) 。证明c l 和b 防御素基因 有一个共同起源。n 一防御索和b 一防御素在序列和结构上虽有诸多不同，但它们 在水溶液中的三维结构几乎一致，由此推测两者可能从同一基因经过不同的分枝 进化而来( l i ul ，p fa l ，1 9 9 9 ) 。 2 0 世纪9 0 年代，发现c a t h e l i c i d i n s 抗菌肽具有共同的结构特征，即n 末 端都含有一个c a t h e l i n 区域。c a t h e l i c i d i n 基因含4 个外显子和3 个内含子 ( y a n gd ，e ta l ，2 0 0 1 ) ，其中前3 个外显子编码5 u t r 和p r e p r o r e g i o n ( 前 体区) ，而裂解位点和成熟多肽及3 u t r 由第4 个外显子编码。前体多肽的n 端 p r e p r o r e g i o n 由1 2 31 4 4 个氨基酸组成，其中包括含2 9 3 0 个的信号肽和 9 4 1 1 4 个氨基酸与c a t h e li n 相似的前片段( p r o p i e c e ) ，c 端含1 2 9 7 个氨 基酸，各前体多肽的p r e p r o r e g i o n 都十分相似。在其基因的5 区域存在参与炎 症和急性期反应的核因子( n f ) 结合位点，如n f kb 、i l 一6 应答元件、急性期应 答因子( a p r f ) 和y 一干扰索应答元件等。与防御素不同的是，c a t h e l i c i d i n s 在 骨髓合成前体多肽( p r e p r o p e p t i d e ) ，并以无活性的肽原( p r e o p e p t i d e ) 形式在 嗜中性粒细胞储存，在粒细胞脱粒过程中释放出有活性的成熟肽。 动物抗菌肽基因具有真核基因基本的结构特征，只是不同抗菌肽基因在5 非翻译区的大小，内含子的有无及大小以及p o l ya 的长短方面存在差异( t a n i a i k ，e ta j ，1 9 9 5 ) ，抗菌肽基因的结构分柝显示，其5 上游序列含有多种与诱 导表达相关的顺式调控元件，如白细胞介素6 反应元件( i l - 6 r e ) 、脂多糖反应 元件( l p s r e ) 、n f k b 相关元件等( t a n i a ik ，e ta ，1 9 9 5 ：y a m a n oy e t a l1 9 9 8 ) 。不同的抗菌肽基因为适应各自的诱导表达方式，在顺式调控元件的 组成和数量以及位置均有其特殊性，但对绝大多数昆虫抗菌肽基因的表达调控起 主要作用的顺式调控元件是n f - k b 。k b 首先发现于哺乳动物免疫球蛋白k 轻链基 因内含子中，是一种b 细胞特异的增强子，n f k b 是结合其上的反式作用因子， 它的保守结合序列是5 g g g r n n y y c c - 3 与昆虫n f k b 相关模块高度同源，其相 似的结构提示抗菌肽基因具有共同的类似的转录调控机制。 3 抗菌肽的结构特点及其抗菌机理 3 1 抗菌肽的结构特点 抗菌肽在自然界广泛存在，迄今已从动植物体内分离到了多种不同的抗菌 1 0 肽。根据抗茵肽的组成和结构特点，可将其分为四类。第一类为无半胱氨酸的螺 旋结构。与细菌细胞膜相互作用时，可折叠成有利于穿膜的疏水或双亲性a 一螺旋 结构。包括来源于昆虫的c e c r o p i n s ，鱼类的m i s g u r i n 、爪蟾的m a g a i n i n s 以及 人的c a t h e l i c i d i n 家族的i l - 3 7 等。第二类为无半胱氨酸的延伸性螺旋结构。 这类抗菌肽常富含脯氨酸、精氨酸和色氨酸的某一种。从猪骨髓细胞中分离的 p r 一3 9 的结构不像其它抗菌肽所形成的a 一螺旋或一折叠构象，是一种较伸展的 结构，这可能与其脯氨酸含量高有关。第三类为含一个= 硫键的环链一线状结构。 二硫键的位置常在c 一端，故环链结构也常在c 一端，n 一端为长的线状结构，如爪蟾皮 肤细胞产生的b a c t e n e c i n 。有的环链结构处于分子中间，如牛中性粒细胞分泌的 b a c t e n e c i n 。第四类是含2 3 个二硫键的b 一折叠结构。该类抗菌肽主要为防御 素( d e f e n s i n ) 。防御索由2 9 4 5 个氨基酸残基组成，富含精氨酸和双亲性的b 一 折叠结构是其显著的特征，其中6 个半胱氨酸形成3 个二硫键。以增加其稳定性。哺 乳动物的防御素有。一防御素和b 一防御素两种。它主要存在于中性粒细胞、巨 噬细胞等细胞中。 综上所述，通常抗菌肤的一级结构具有如下典型特征：由3 0 多个氮基酸残 基组成的肽链，其n 端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸，其c 端富含丙 氨酸、缬氨酸和甘氨酸等非极性氨基酸，而其中间部分则富含脯氨酸( b o m a nh g 日 a ，1 9 8 7 ：j a y n e sj m ，e ta l ，1 9 8 9 ) 。这一结构特征使抗菌肽具有表面活性 剂活性e 另外，一些天然的抗菌肽的c 端往往是酰胺化的，这被认为可能与抗菌 肽的广谱抗菌活性有关。通过圆二色性分析、理论推测和腊质体模拟实验研究抗 菌肽盼二级结构特征，结果表明，抗菌肽能够在一定条件下形成a 一螺旋和b 一折 叠。q 一螺旋的位置可分别处于肽链的n 端，整条肽链或肽链的c 端。而实际上， 抗菌肽有许多保守序列，抗菌肽的两端，特别是n 端更易形成a 一螺旋，中阃部分 易形成b 一折叠或铰链。抗菌肽的一螺旋具有近乎完美的水脂两亲性，即圆柱形 分子的纵轴一边为带正电荷的亲水区，而对称面为疏水区( o r e nz 。e t 8 上1 9 9 6 ) 。此二级结构是决定抗菌肽破膜活性的基础。 3 2 抗菌肽的抗菌机理 目前研究认为抗菌肽可能主要是通过以下机制杀伤微生物和肿瘤细胞。 1 ) 胞膜攻击作用 大多数抗菌肽最基本的作用机制是破坏肿瘤细胞或细菌质膜结构，引起胞 内水溶性物质大量渗出，从而最终导致肿瘤细胞和细菌死亡( d e k k e rn ，e t a 五2 0 0 1 ) 。昆虫天蚕素抗菌肽分子是通过其两亲性n 一螺旋上正电荷与细菌细胞 质膜磷脂分子上负电荷之问的静电吸引而结合聚集在质膜上。随后抗菌肽分子中 的疏水段c 端( 酰胺基) o 一螺旋插入到疏水的细菌细胞膜中央，双亲的a 一螺旋留 在质膜表面，打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序，使得膜外正电荷增多， 超过闽值时导致膜去极化。由于抗菌肽分子的n 一螺旋是亲水、疏水两亲性的， 所以当抗菌肽分子相互聚集在一起时可形成离子通道，导致阳离子外流，最后细 菌失去保护，不能保持正常的渗透压而死亡。从猪小肠中分离得到的抗菌肽c e c p 与天蚕素的作用机制类似，也是通过膜攻击来完成对细菌的杀伤，但其c 端为羧 基而非酰胺基，抗菌谱也有所不同，其作用机制主要是通过碱性氨基酸与细菌外 膜表面的磷脂酰头部结合，由于分子的旋转导致c e c p 的疏水残基与膜的疏水区 结合，超过阈值时，则在质膜上形成瞬时小孔，导致菌体内容物溢出，菌体崩解死 亡( p a r ky ，e ta ，2 0 0 3 ，y a n gd ，e ta l ，2 0 0 1 ) 。防御素作用于细胞膜，可增 加生物膜的通透性而发挥作用。尽管防御素分子太小而不能以单聚体的形式造成 膜穿孔，但其分子结构和电生理研究提示。防御素分子能以多聚体的形式作用于