（劳动卫生与环境卫生学专业论文）染发剂中染料成分的检测方法研究.pdf

目录 中文摘要 a b s t r a c t 第一章绪论1 1染发剂分类1 1 1 氧化型染发剂1 1 2 直接型染发剂3 1 2 1 半持久性染发剂3 1 2 2 暂时性染发剂3 1 3 金属盐类染发剂3 1 4 天然植物型染发剂4 2 染发剂的安全问题4 2 1 急性毒性5 2 2 致敏性5 2 3 致癌性5 2 4 致畸性6 2 5 内分泌效应：6 3 染发剂的卫生管理6 4 染发剂的检测7 5 研究意义9 第二章薄层色谱法1 0 l实验方法1o 1 1 实验器材1o 1 2 主要试剂lo 1 3 分析步骤1 1 1 3 1 标准溶液的配制1 1 1 3 2 样品前处理1 1 1 3 3 点样、展开及显色1 l 中国疾病预防控制中心硕：j ：学位论文 1 3 4 薄层色谱条件1 1 2 条件试验1 1 2 1 展开剂的选择1 l 2 2 显色剂的选择1 2 2 3染料成分的分离1 3 2 3 1 第一组的分离1 5 2 3 2 第二组的分离1 6 2 - 3 3 第三组的分离1 7 3样品测定17 3 1 配方已知样品的测定1 7 3 2 配方未知样品的测定2 3 4d 、结2 6 第三章液相色谱法2 7 1 实验方法2 7 1 1 实验器材2 7 1 2 主要试剂2 7 1 3 标准溶液的配制2 8 1 3 1 储备液的配制2 8 1 3 2 混合标准溶液的配制2 8 1 4 样品前处理2 8 1 5 色谱条件2 8 2 条件试验2 9 2 1 色谱柱的选择2 9 2 2 检测波长的选择3 0 2 3 流动相的选择3l 2 3 1 水相的选择31 2 3 2 有机相的选择3 2 3 方法特性研究3 7 3 1 标准曲线和线性范围3 7 中国疾病预防控制中心硕士学位论文 3 2 检出限及定量下限3 8 、3 3 精密度4 0 3 4 准确度4 1 4 样品测定4 3 4 1 配方已知的样品测定4 3 4 2 配方未知的样品测定5 1 5 方法比对5 6 5 1配方已知样品的比较5 6 5 2 配方未知样品的比较5 6 结论5 8 附录6 1 参考文献6 5 综述6 8 致谢7 7 | j 嗨 。二 一 中囝疾病预防控制中心硕二l ：学位论文 中文摘要 染发剂中染料成分的检测方法研究 染发剂可分为4 种，即氧化型( 又称持久性) 、直接型( 暂时性和半持久性) 、 金属盐类和天然植物型染发剂。其中的氧化型染发剂是最重要的一种，约占市场 份额的8 0 。氧化型染发剂中含有的染料成分多属于芳香胺类化合物，如p 一苯二 胺( p p d ) 、p 一氨基苯酚等，而芳香胺类化合物中有很多物质具有一定的致癌性。 p p d 是氧化型染料中使用最为广泛的一种染料中间体前体，它及其衍生物甲苯胺 已被证实具有潜在的致敏性。鉴于染发剂成分所属的化学种类及数目庞大的接触 者，染发剂的安全性被广为关注，是目前研究最为广泛的一种化妆品。 针对染发剂，各国均颁布了相应的安全法规，如我国化妆品卫生规范 ( 2 0 0 7 年版) 中规定了染发成分的限制使用范围及部分染料成分的检测方法， 但检测覆盖率还不到1 0 ；欧盟化妆品规程也有染发剂的相关规定，并提供 了部分成分的检测方法，但也很难满足众多染发成分的检测需求j 本研究建立了染发剂中多种染料成分的薄层色谱法( t l c ) 和高效液相色谱 ( h p l c ) 法，为染发剂的卫生监督、技术评审、开发研究等提供了良好的检测手 段。其中，t l c 法用于4 1 种染料成分的定性检测。样品经9 5 乙醇溶液超声提取， 离心后取上清液点样；展开剂为乙酸乙酯、乙酸乙酯+ 冰乙酸= 2 0 + 1 、甲醇和二氯 甲烷+ 乙醚= 5 + 1 等；显色剂为埃里克试剂和磷钼酸试剂。标准和样品同时展开， 通过比较r ，值和斑点的颜色进行定性。t l c 方法适用于配方已知或染料成分较少 的样品中染料成分的快速鉴定。h p l c 法用于3 7 种染料成分的定性和其中3 4 种 成分的定量检测。样品经9 5 乙醇溶液超声提取、离心，取上清液用0 4 5 p r o 微 孔滤膜过滤；选择键合有酰胺键的c 。色谱柱，含对离子试剂的磷酸盐缓冲液和 乙腈或甲醇的混合流动相体系，用二极管阵列检测器进行检测，并根据化合物的 紫外光谱图和保留时间定性，2 8 0 n m 、2 6 0 n m 和2 3 0 n m 等多个检测波下用峰面积 定量。经方法特性研究，线性范围、检出限、精密度、准确度等指标均符合实际 样品的分析要求。h p l c 法适用于各种染发剂样品的定性定量分析，尤其是对于 配方未知的样品具有很强的染发成分鉴定能力。 关键词：染发剂；薄层色谱；高效液相色谱：检测 中国疾病预防控制中心硕：j ：学位论文 a b s t r a c t s t u d yo na n a l y t i c a lm e t h o d s o fd y e si nh a i rd y i n gf o r m u l a t i o n s h a i rd y e sa r ec l a s s i f i e di n t ot h ef o l l o w i n gc a t e g o r i e s ：o x i d a t i v e ( p e r m a n e n t ) d y e s ，d i r e c t ( t e m p o r a r yo rs e m i p e r m a n e n t ) d y e s ，m e t a ls a l t s a n dn a t u r a ld y e s a m o n gt h e s e ，o x i d a t i v eh a i rd y e sa r et h em o s ti m p o r t a n tg r o u pa n dh a v ea m a r k e t s h a r eo fa p p r o x i m a t e l y8 0 m o s to ft h eo x i d a t i v ed y e si nd y ef o r m u l a t i o n sa r eo f a r o m a t i cn a t u r e ，s u c ha sp - p h e n y l e n e d i a m i n e ( p p d ) ，p - a m i n o p h e n o l ，e t c s o m eo f a r o m a t i ca m i n e sh a v ep o t e n t i a lc a r c i n o g e n i c i t y p p d ，o n e o ft h em o s tc o m m o n p r i m a r yi n t e r m e d i a t e so fo x i d a t i v e h a i rd y e sa n di t sd e r i v a t i v e s ，s u c ha sp a r a t o l u e n e d i a m i n e ，h a v eac l e a rp o t e n t i a lt oi n d u c ea n de l i c i tc o n t a c ta l l e r g y g i v e nt h e c h e m i c a lc l a s so fh a i rd y ei n g r e d i e n t sa n dt h es i z eo ft h ee x p o s e dp o p u l a t i o n s ，t h e s a f e t ya s p e c t so fh a i rd y e sh a v eb e e nf o c u s e do na n d n o wh a i rd y e sa r ea m o n g s tt h e m o s te x t e n s i v e l ys t u d i e dc o s m e t i ci n g r e d i e n t s m a n yc o u n t r i e sh a v eb a n n e dh o m o l o g o u sr e g u l a t o r ys a f e t ys c h e m e so nh a i r d y e s i no u rc o u n t r y , t h ec o n t e n to fd y e si nh a i rc o l o r i n gf o r m u l a t i o n si s r e s t r i c t e d a c c o r d i n gt o ( ( s a n i t a r ys t a n d a r d sf o rc o s m e t i c s ) ) a n ds o ，d o e si na n n e xi i io f t h ee u c o s m e t i c sd i r e c t i v e s a n i t a r ys t a n d a r d sf o rc o s m e t i c s ) ) d e f i n e sa m e t h o do fa n a l y s i s o f8k i n d so fd y e s b u tc o m p a r e dw i t h9 3k i n d so fl i m i t e dd y e s ，t h er a t i oi sl e s st h a n 10 e uc o s m e t i c sd i r e c t i v ed e f i n e sam e t h o do fa n a l y s i so f12k i n d so fd y e s t h e f o r t h c o m i n gm e t h o d s c a l ln o tr e a c ht h ed e m a n do fa n a l y s i so fs om a n yk i n d so fd y e s i nt h i sr e s e a r c h ，t w om e t h o d sh a v eb e e nd e v e l o p e df o rt h ea n a l y s i so fd y e sb yt l c a n dh p l c ，a n dc a nb eag o o dt e c h n i c a ls u p p o r tf o rs a n i t a r ys u r v e i l l a n c e ，r i s k a s s e s s m e n t ，r e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n t 4 1k i n d so fd y e sc a nb ei d e n t i f i e db yt l c s a m p l ep r e p a r a t i o n - - s u p e r s o n i cw a v ee x t r a c t i o nw i t h9 5 e t h a n o la n dc e n t r i f u g e d p r i o rt ot l c ；d e v e l o p m e n ts o l v e n t e t h y la c e t a t e ，m e t h a n o l ，e t h y la c e t a t e + a c e t i c a c i d = 2 0 + l ，d i c h l o r o m e t h a n e + d i e t h y le t h e r = 5 + 1 ；s p r a yr e a g e n t e h r l i c hr e a g e n ta n d p h o s p h o m o l y b d i ca c i d i d e n t i f yb yc o m p a r i n gt h ec o l o ra n dt h er fv a l u eo fs a m p l e s w i t ht h o s eo ft h es t a n d a r d s t h em e t h o db yt l ci ss u i t a b l e f o rs i m p l ea n dq u i c k i d e n t i f i c a t i o n 3 7k i n d so fd y e sw e r ei d e n t i f i e da n d3 4k i n d sw e r eq u a n t i t a t e db yh p l c 中国疾病预防控制中心硕士学位论文 s a m p l ep r e p a r a t i o n s u p e r s o n i cw a v ee x t r a c t i o nw i t h9 5 e t h a n o l ，c e n t r i f u g e da n d f i l t e r e dt h r o u g h0 4 5i _ t mm e m b r a n ef i l e r ；t h es e p a r a t i o nc o l u m nw a sd i s c o v e r yr p a m i d ec16 ；m o b i l ep h a s ew a sa c e t o n i t r i l eo rm e t h a n o l + p h o s p h a t eb u f f e r ( 2 5 m m ， p h6 0 ，0 1 1 - h e p t a n e s u l f o n i ca c i ds o d i u m ) ；t h ew a v e l e n g t hw a ss e t a t2 8 0 n m ， 2 6 0 n ma n d2 3 0 n m w i t hd a d i d e n t i f yb yt h er e t e n t i o nt i m ea n dt h es p e c t r aa n d q u a n t i t a t eb yp e a ka r e a s t h e l i n e a rr a n g e ，d e t e c t i o na n dr e c o v e r yr a t e a r ea l l s a t i s f a c t o r y t h em e t h o db yh p l c i ss u i t a b l ef o rt h eq u a l i t a t i o na n dq u a n t i t a t i o no f s a m p l e s k e y w o r d s ：h a i rd y e s ；t l c ：h p l c ；a n a l y s i s 中国疾病预防控制中心硕士学位论文 第一章绪论 随着生活水平的不断提高，人们开始注重生活质量和消费质量。染发作为美 容方式之一，已经成为一种世界流行的时尚。不用说追求多彩发色的时髦青少年， 绝大多数中老年人为了留住青春也都成了染发一族，染发产品在改善我们的生活 质量方面发挥着重要和积极的作用。实际上，染发剂的使用由来已久，至少可追 溯到距今四千年前，埃及第三王朝曾流行用指甲花染料把头发染成橙红色调；在 罗马帝国时代，人们把铅梳子蘸到醋中梳头以使白发变黑。很多人认为染发可以 让自己富有色彩，充满自信。在英国，染发剂的消费增长率已经连续8 年高居生 活必需品之首。在我国，消费人群也不断扩大，城市中青少年彩色染发者逐年增 多，同时中老年人群中染发者比例也呈上升趋势。根据中国美容美发协会的调查， 近几年来我国染发者初次染发的年龄已经提早了1 0 岁以上。在我国，大面积使 用染发剂的时间并不长，所以目前染发剂引起的各种健康问题并没有引起人们的 足够重视，但是染发人群出现低龄化，意味着人们染发的时间可能越来越长，而 染发剂的各种隐性危害很可能在今后几年内突出地显现出来。 1 染发剂分类 染发剂是指能够改变头发颜色的化妆品，可将头发染成色彩各异、深浅不同 的颜色。目前染发剂的分类方式有多种，如根据染发色泽持续时间、剂型和生产 原料等分类，但这些分类方式都不够科学和全面。g e r h a r dj n o h y n e k a 1 】对染发 剂的组成结构和化学性质进行综述，把染发剂分为氧化型染发剂、直接型染发剂、 金属盐类染发剂和天然植物型染发剂。 1 1 氧化型染发剂( 又称持久性染发剂) 氧化型染发剂以其染色效果好、色调变化宽、维持时间长等诸多优点而成为 最受欢迎的染发剂，在欧洲和美国约占市场分额的8 0 。与其他类型的染发剂不 同，氧化型染发剂由两剂组成，使用前混匀，在头发中发生化学反应而产生颜色， 其主要成分如图1 1 。 中国疾病预防控制中心硕士学位论文 氧 化 型 染 发 剂 染料中间体 前体 p 苯二胺，p - 氨基苯酚等 竺竺竺鲨翌卜孙而磊i 磊磊 氧化剂 辅加剂 过氧化氢、过硼酸钠和过氧化氢脲等 稳定剂( 抗氧化剂) 、表面活性剂、p h 调节剂等 图1 1氧化型染发剂的成分示意图 氧化型染发剂的染发机理是，染料中间体前体( 如p 苯二胺) 作为小分子物 质，渗入发质内部经氧化剂( 如过氧化氢) 氧化成为染料中间体，其有效物质是 二亚胺。染料中间体在偶合剂的作用下进行偶合反应，生成大分子的吲哚等各种 色泽的染料。这些不溶于水的大分子染料一方面覆盖在头发表面，另一方面渗入 毛髓内部，达到永久染发的效果。不同结构的染料成分可将头发染成不同的颜色。 最终染色的深浅不仅取决于染料成分的不同，也与同一种染料成分的浓度有关。 当偶合剂( 如间苯二酚) 存在时，反应按a 通路进行，生成目的染料；当偶合 剂不存在时，反应可能沿b 通路进行，生成具有遗传毒性和致敏性的副产物斑 德罗斯基体，具体见图1 2 。 图1 2 氧化型染发剂的染发机理 2 1 2 直接型染发剂 这是第二大重要的染发产品，包括半持久性和暂时性2 种染发剂。 1 2 1 半持久性染发剂 半持久性染发剂是和持久性染发产品的色泽持续时间和牢固度相比较而言 的，使用的主要染料有硝基苯二胺、硝基氨基苯酚、氨基葸醌及偶氮型酸性染料 等。半永久性染发剂可配成乳液、香波、凝胶等产品形式。使用时将染发剂涂刷 在头发上，保持2 0 - - 3 0 m i n ，然后用水冲洗，就可以使头发着色。其作用原理是 分子量较小的染料分子渗透到头发表皮，部分进入皮质中而直接染发，不需要经 过氧化作用就可将毛发染成各种不同的色泽。染发后可保持色泽近一个月。这类 染发剂比持久性染发剂刺激性小，不易损伤头发和引起过敏，但色泽牢固度差， 要经常使用。半持久性染发剂基本上类似于洗发剂，有些含有与香波同样的成分， 只不过多加了几种染料。这类染发剂的优点是无需使用显色剂，因此，对一些不 适宜使用氧化型染发剂的人或不愿让氧化剂损伤头发的人，是最合适的染发剂。 1 2 2 暂时性染发剂 暂时性染发剂是一种只需用香波洗涤一次就可除去的染发剂。由于这些染发 剂的颗粒较大不能通过表皮进入发干，因此只能沉积在头发表面上，形成着色覆 盖层。这样染发剂与头发的相互作用不强，易被香波洗去。所用染料主要为偶氮 类、三苯甲烷、葸醌或吲达胺类物质。由于暂时性染发剂只是暂时黏附在头发表 面，所以深色头发染不上较浅的颜色。但因其只滞留在头发表面，对头发损伤少， 产品相对安全。其染色原理是带正电荷的染料离子与带负电荷的头发发生作用， 形成一种较不稳定的有色化合物。这种化合物不能用机械的方法从头发表面去 除，但可用香波洗掉，所以染色后保持时间较短。染发时须用梳蘸水反复地将它 涂在头发上。由于这种染发剂使用方便，而且如果染得不好也可改染别的颜色， 故很受消费者的欢迎。 1 3 金属盐类染发剂 金属盐类染发剂又称矿物性染发剂，含有铅、铁、铜、镍、铋、钻等金属， 其中相当一部分具有毒性。金属盐类染发剂已不再使用金属粉末而是以结合于有 机分子中的金属原子铅化物或银化物为成分，可染成黑色、棕色等。如乙酸铅以 3 中国疾病预防控制中心硕士学位论文 铅原子与角质素中的硫反应生成深色的硫化铅，可用于染黑发。这类制品中含有 的金属盐包括铝盐、铜盐或银盐等，加入量约为1 。每天梳头时加以使用，在 空气中发生氧化作用后，就会逐渐产生颜色。由于上述金属盐都具有毒性，故有 些国家已禁止使用，如欧盟已将乙酸铅列入禁用物质清单；随着化妆品卫生规 范( 2 0 0 7 年版) 的出台，我国也已禁止在化妆品中使用乙酸铅，但也有一些国 家仍然允许使用。 1 4 天然植物型染发剂 天然植物型染发剂是正在研究开发的新一代染发剂，是从指甲花、西洋甘菊 花、蓼蓝、茜草、靛青、咖啡粉等天然色素中提取成分而制成的染发剂。一般不 损伤头发结构和不破坏所贮藏的色素，对人体及环境危害较小。虽然1 至2 个月 颜色就会慢慢消失，且染发效果有一定的局限性，但由于刺激性小，安全性高而 越来越受到人们的欢迎。目前推向市场的并不多，且价格昂贵。近年来法国、印 度已推出以苏木精为原料的天然产品，日本推出以辣椒红、虫胶酸、胭脂红酸等 为原料的天然染发剂，我国也有全天然黑发油产品。天然染发植物种类很多，较 常用的是指甲花叶，有效成份是2 羟基1 ，4 萘醌，在酸性条件下可使毛发染色。 指甲花叶和槐兰叶的混合提取物可使白色染成黑兰色；春黄菊、芹菜提取物可配 制成黄色染发剂；指甲花、苏木精、尖叶香泻树、鼠尾草、儿茶等的提取物可配 制成不同颜色的染发剂；黑豆色素为鲜艳悦目的紫红色；桑椹中提取的颜料成分 能使毛发染黑。此外，指甲花与单宁酸及铜、铁等金属相配制，也可得到各种不 同的染料。最近法国推出一种黑色染发剂，是以苏木精羰基化合物为主要原料制 成，使用安全，染发效果持久。以植物染料着色，其色度较浅，须经多次染色， 方能达到理想发色。 2 染发剂的安全问题 染发剂中的染料成分多属于芳香胺类化合物，芳香胺中有很多物质具有致癌 性，所以染发剂的安全性一直受到人们的极大关注。持久性染发过程中只有让毛 发表皮破损，染料才进得去，从而达到着色的效果，所以对头发的伤害是难免的， 氧化剂的浓度过高也会对皮肤造成损伤。化妆品及其成分要求在正常或可预测的 4 中国疾病预防控制中心硕士学位论文 使用条件下对人体健康无害，因此对它们的评价应建立在零危险的基础上，但是 这对任何天然的或合成的化合物几乎都是不可能的，这也是对染发剂安全性评价 的主要挑战。鉴于染发剂所属的化学类别及数量巨大的接触者，染发剂已成为最 为被广泛研究的化妆品。虽然几乎所有的毒理学和流行病学研究都表明染发剂在 常规使用条件下对人体健康无害或危害性可忽略，但仍有些研究表明其对人体健 康不利，染发剂的安全问题主要表现在以下几个方面。 2 1 急性毒性 急性毒性实验结果表明，几乎所有的染料成分如p 苯二胺( p p d ) 、间苯二 酚等均有着中度或低度的急性毒性，但由染发剂引起的人类中毒事件却极少，有 报道也是经口服而中毒。高剂量的p p d 对人类和高级哺乳动物的主要影响机制 是引起血管神经性水肿而导致急性呼吸困难。在大多数报道的中毒事件中p p d 都是以固体形式摄入，因此有可能摄入高剂量而中毒。不过，现代的染发产品中 所含的染料成分浓度均很低，因此基本上可以忽略由染发产品引起急性中毒的可 能性。 2 2 致敏性 关于染发剂特别是p p d 引起的变态反应是近年来的一个热点问题。p p d 是 氧化型染发剂中最常见的一种成分，已经明确它和它的衍生物有致敏的潜能，大 量的动物和人体实验均已经证实。p p d 等染发原料是一种已知的致敏剂，正确使 用也可能导致某些人过敏。染发引起的过敏反应与消费者的机体敏感程度有关。 根据消费者机体敏感程度不同，致敏反应的轻重不一，可能是局部的，也可能是 大范围的。p p d 和它的衍生物是职业性过敏( 特别是美容师和美发师) 的一个重 要原因。但是随着染发剂使用量越来越多，由p p d 引起的接触性变态反应的发 病率却保持不变甚至下斛2 1 ，这应归功于成功的管理措施即预防性标签，改善的 职业安全措施如戴防护手套，在染发过程中减少与头皮的接触面积，提高消费者 的危险意识等。虽然大部分染发剂变态反应病例由p p d 或其衍生物引起，一些 直接染料( 硝基和葸醌类染料) 也具有致敏的潜在性，但发病率低【i 】。 2 3 致癌性 5 中国疾病预防控制中心硕1 ：学位论文 几十年来毒理学家和流行病学家一直密切关注染发剂成分的潜在致癌性。流 行病学研究，早在1 9 世纪末就已证实联苯胺、4 氨基联苯胺、2 萘胺等芳香胺 类化合物可导致染料工业职业暴露的工人膀胱癌的发病率升高。现在绝大多数流 行病学研究结果均表明染发剂致癌的可能性很小。染发剂中所含的一些致癌物质 在上个世纪7 0 年代开始就被淘汰，这也许是染发剂致癌可能性小的主要原因。 尽管有些研究报道发现，染发与某些癌症存在一定相关【3 1 ，但据国际癌症研究机 构对染发与癌症关系进行的评估认为，没有充分证据证明消费者染发致癌。欧盟 未将p p d 列入致癌物质名单，美国、日本等国也均未禁止染发产品中使用p p d 。 染发剂是否致癌事关重大，有待医学人员进行更深入的研究。 2 4 致畸性 对染发剂和人体生殖的潜在效应之间进行的流行病学调查中，大部分结果发 现，染发剂与美容师及其后代的不育或胎儿畸形之间相关性不大，但也有一些相 反的结果 4 1 。目前还没有充分的证据认为染发剂与生殖效应之间相关。 2 s 内分泌效应 内分泌紊乱假说是现在争论的一个热点，环境化学物质可能会导致激素活性 改变而引起内分泌紊乱。间苯二酚，氧化型染料中的一个重要成分，被疑为影响 甲状腺而引起甲状腺肿5 1 ，但这还只是一个假说，并没有充分的实验室和流行病 学依据。 3 染发剂的卫生管理 随着经济发展和生活水平的提高，人们对染发类化妆品的需求越来越大。染 发剂中染料及其杂质含量对人体健康的影响也越来越受到国内外研究者的重视。 2 0 0 1 年6 月美国科学家m g a g o d o m i n g u e z 发表了长期使用持久性染发剂与膀胱 癌相关的论文【3 1 。欧盟化妆品和非食品科学委员会( s c c n f p ) 对该研究结果非 常重视，并迅速采取措施，明确要求染发剂生产厂家提供已使用的染发剂原料清 单及其安全性资料( 必须包括致突变性及致癌性) ，并进行重新评价。 在我国，染发产品是化妆品卫生监督管理的重要内容之一。目前实施的卫生 6 中国疾病预防控制中心硕士学位论文 监管方式主要包括：一是实行上市许可制度。考虑到染发产品的特殊性，我国将 其作为特殊用途化妆品管理。染发产品必须经过毒理学、卫生化学等一系列试验， 并通过专家委员会的危险性评估后方可上市。二是规范染发产品原料管理。为了 进一步加强对染发产品的管理，2 0 0 5 年卫生部组织专家对目前常用染发产品原 料的安全性资料进行了评价，并制定了染发剂原料名单( 试行) 。这个名单规 定了目前允许使用的染发剂原料及其限制使用条件和警示标识，未列入名单中的 染发剂原料禁止使用。这个名单已于2 0 0 6 年1 月1 日正式实施。卫生部亦根据 最新的染发剂原料安全性研究结果对名单进行不定期调整。化妆品卫生规范 ( 2 0 0 7 年版) 又对名单做了适当的修订，去除m 苯二胺，m 苯二胺硫酸盐和 n 甲氧乙基一p 苯二胺h c l 调整为9 3 种。三是严格染发产品警示语标识。鉴于染 发产品引起的过敏反应较为普遍，为提醒消费者合理使用，卫生部对染发剂警示 语标识作了强制规定。规定染发剂产品标签上必须标注如下警示语，“对某些个 体可能引起过敏反应，应按说明书预先进行皮肤测试。不可用于染眉毛和眼睫毛， 如果不慎入眼，应立即冲洗。专业使用时，应戴合适手套”。另外，对使用致敏 原料的产品，还要求标识相应原料信息，如含p 苯二胺的染发剂标签上除警示语 外，还需标注“含苯二胺类”字样。四是开展染发产品的监督检查。2 0 0 6 年卫 生部部署在全国范围内开展化妆品专项整治工作，重点整治违法使用的染发剂原 料以及超限制使用的染发剂原料。 4 染发剂的检测 染料成分多为芳香胺类、氨基酚类和多羟基苯类化合物，对这类物质进行分 析最常使用的是色谱法。欧盟和日本规定的染发剂检测方法都是薄层色谱( t l c ) 法，但t l c 法在定量方面存在一定困难。在我国，化妆品卫生规范( 2 0 0 7 年版) 中只规定了染发剂中8 种氧化型染料的高效液相色谱( h p l c ) 检测方法， 远不能满足染发剂分析的需要。针对种类繁多的染发成分，各国科学家一直在积 极地研究新方法以适应不断增加的新型染发剂的检测要求。由于氧化型染发剂所 占的份额最大，故研究人员将重点放在这一领域，只有少数文献报道了直接型染 发剂的检测方法研究。文献中报道的方法很多，有t l c 法、高效薄层色谱法、 h p l c 法、高效液相色谱质谱联用技术( h p l c m s ) 法、气相色谱( g c ) 法、 7 中困疾病预防控制中心硕二i ：学位论文 气相色谱质谱联用技术( g c m s ) 法、毛细管电泳( c e ) 等。下面就近几年的 研究情况作一简单介绍。 国外，m a r i al u i s ad ig i o i a 等人先用苯甲醛将p p d 衍生，再用g c m s 在选 择离子监测模式( s i m ) 下分析染发剂中的p p d 。转化成胺衍生物后仪器的响应 度增强，从而提高了方法的灵敏度和准确度。此法使用稳定的n 苯亚甲基4 甲 基苯胺为内标，是检测染发剂中p p d 的一个有效方法1 6 】。s u r e s hc h a n d r ar a s t o g i 等人研究了使用反相离子对色谱法来检测染发剂中氧化型染料的分析方法。使用 庚烷磺酸钠为离子对试剂，c 1 6 酰胺柱和二级管阵列( d a d ) 检测器及梯度洗脱， 鉴定了1 2 种常用的染料成分，并使用外标法对1 0 种进行了定量分析，此法可作 为常规分析方法1 7 。k e g g e n r e i c h 等人用反相h p l c 法检测4 一氨基m 甲苯酚 ( 4 a c ) 和5 氨基o 甲苯酚( 5 - a c ) ，用荧光胺进行柱前衍生，相比紫外检测 器灵敏度分别提高了十倍和五十倍，检出限分别为l n g 和1 0 0 p g 引。接着他们又 使用l c d a d m s 测定了人上皮细胞中的4 。a c 和5 - a c 及其代谢产物，为研究 4 a c 和5 - a c 的生物转化提供了途径【9 1 。u r s u l av i n c e n t 等人首先用正庚烷进行 三步液液萃取将染发剂基质与染料成分分离，然后用r p h p l c d a d 进行检测。 主要研究了p p d 、m 苯二胺、m 氨基苯酚和间苯二酚4 种染料成分的检测方法， 实验的灵敏度、准确度及回收率均很高【1 0 1 。接着他们又对方法进行了确认和最 优化的研究，使用梯度洗脱，d a d 或m s 检测器对1 3 种染料成分进行了鉴定， 并制定了9 种染料成分的标准曲线【l l 】。d a v i dk o h 等人用t l c 法对市场上买到 的染发剂进行了简单的p p d 定性检测，目的是调查不标识标签的染发剂是否含 有p p d 。用乙醇为溶剂，1 0 0 + 1 5 的甲醇和氨水混合液为流动相，方法简单，实 用性强【1 2 】。c e c i l i as c a r p i 等人研究了用h p l c 同时测定9 种直接型染料的检测方 法，应用d a d 检测器，选择4 5 0 n m 和6 5 0 n m 两种波长定量，该方法不需要任 何的提取步骤，快速准确，可作为一种常规分析方法【l 3 1 。 国内，刘丽等人用超声波提取g c m s 法测定了氧化型染发剂中的1 6 种染 料成分。用乙酸乙酯作溶剂，超声提取5m i n 。提取后的清液直接用g c m s 进 行分析。方法简单、快速，能有效提取和分离测定染发剂中的1 6 种染料【1 4 】。郑 志方等人用h p l c 法测定了染发剂中的p 苯二胺、o 氨基苯酚、氢醌及间苯二酚。 该法简便快速且具有良好的精密度和准确度【1 5 】。朱英等人用g c m s 法同时测定 中国疾病预防控制中心硕士学位论文 了氧化型染发剂中的8 种染料中间体。8 种染料在1 2 m i n 内得到很好的分离，精 密度和回收率均较高1 6 】。吴卫平等人用三氟乙酸酐衍生化毛细管气相色谱法测 定染发剂中p 苯二胺、m - 苯二胺、o - 苯二胺，分离效果、灵敏度及精密度均较好 1 7 1 o 5 研究意义 鉴于染发剂存在的各种安全问题及数目庞大的接触者和使用者，加强对染发 剂的卫生管理和日常监督是非常必要的。一套完善的检测方法可以规范化妆品企 业，从源头上防止不合格的染发产品流入市场，并为卫生监督提供有力的技术支 持，最大程度地维护人民群众的健康利益。我国化妆品卫生规范( 2 0 0 7 年版) 中规定了9 3 种允许使用的染发剂原料，而法定方法只能检测其中的8 种，存在 着大量的监测空白，急需建立相应的染发剂检测方法。 文献报道了很多种检测方法，但多集中于少数几种染料成分，最多只能检测 1 6 种，与9 3 种限用成分相比，覆盖率仍太低。本研究建立了4 1 种染料成分( 见 附录表1 ) 的检测方法，一种是t l c 法，适用于快速简单的定性判断；另一种 是h p l c 法，适用于进行定性和定量检测。 9 中国疾病预防控制中心硕士学位论文 第二章薄层色谱法 薄层色谱法是一种平面色谱法，是将固定相于玻璃等载板上涂布成均匀的薄 层，将被分离物质点在薄层的一端，置展开室中，展开剂( 流动相) 借毛细作用 从薄层点样的一端展开到另一端，在此过程中不同的物质得以分离。分离的原理 随所用的固定相不同而异，基本上与柱色谱相同，也可分为吸附薄层法、分配薄 层法、离子交换薄层法以及凝胶薄层法等。 薄层色谱法具有设备简单、操作方便、分离速度快等优点。经典的薄层色谱 法在仪器自动化程度、分辨率及重现性等方面不及以后发展起来的气相色谱法和 高效液相色谱法，被认为只是一种定性和半定量的方法而未受到足够的重视，但 薄层色谱法有以下特点：( 1 ) 由于固定相是一次性使用，样品的预处理比较简单； ( 2 ) 对被分离物质的性质( 挥发性或非挥发性，极性或非极性) 没有限制，应用 范围广；( 3 ) 平面色谱具有多路柱效应，可同时平行分离多个样品大大节约了分 析时间；( 4 ) 固定相、流动相选择范围宽，有利于不同性质化合物的分离；( 5 ) 应用不同的展开方式有利于难分离物质对的分离；( 6 ) 在同一色谱上可根据被分 离化合物的性质选择不同显色剂进行定性。 在薄层上被分离的斑点，根据比移值( r f ) 及斑点本身的颜色或显色后的颜 色与对照品进行比较定性。本章建立了4 1 种染料成分的定性方法，为快速鉴定 染发剂的染料成分提供了一个良好的选择，尤其是对无能力购买昂贵仪器的染发 剂生产企业不失为一种简便快速的定性方法。 1 实验方法 1 1 实验器材 薄层板为f 2 5 4 硅胶板，2 0 c m x 2 0 c m ，购于德国m n 公司；展开槽为玻璃缸， 2 3 e m ( 长) x 1 0 c m ( 宽) x 2 5 c m ( 高) ；1 0 9 l 注射器；喷雾器；数码相机，购于 日本佳能公司。 1 2 主要试剂 l o 中国疾病预防控制中心硕：i ：学位论文 9 5 乙醇溶液、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、甲醇、二氯甲烷、丙酮、氯仿、甲 苯、异丙醚、异丙醇、冰乙酸、浓盐酸溶液、氨水、磷钼酸、碘、亚硫酸氢钠， 均为分析纯，购于北京市化学试剂公司；对二甲基氨基苯甲醛、正硝基苯重氮盐 购于美国s i g m a 公司；实验用水均为二次蒸馏水，自制；染料标准品，见附录 表1 ；本实验所用显色剂包括埃里克试剂、磷钼酸试剂和重氮试剂，配制方法如 下：( 1 ) 埃里克试剂3 9 对二甲基氨基苯甲醛溶于6 0 m l 甲醇中，再加入2 0 m l 浓盐酸溶液，混匀；( 2 ) 磷钼酸试剂1 9 磷钼酸溶于1 0 m l 水中，再加入9 0 m l 乙醇，混匀；( 3 ) 重氮试剂5 m g 正硝基苯重氮盐溶于1 0 0 m l 水溶液中，混匀。 1 - 3 分析步骤 1 3 1 标准溶液的配制 称取约1 0 m g ( 精确至l m g ) 的染料标准品溶于9 5 乙醇溶液中，定容至 1 0 m l 。加入亚硫酸氢钠至过饱和，4 。c 冰箱避光保存一个月【18 1 。 1 3 2 样品前处理 称取约0 5 9 样品( 精确至l m g ) ，用9 5 乙醇溶液定容至1 0 m l ，超声提取 15 m i n ，2 0 0 0 r p m 离心10 m i n ，取上清液待测。 1 3 3 点样、展开及显色 距薄层板边缘l c r n 处用1 0 1 t l 注射器点样1 - 2 1 a l ，将板置于展开剂饱和的 展开槽中，展开8 c m 时，取出薄层板，风干后喷以显色剂进行显色，与标准比 较进行定性。 1 3 4 薄层色谱条件 薄层板采用f 2 5 4 硅胶板；展开剂为乙酸乙酯、乙酸乙酯+ 冰乙酸= 2 0 + 1 、甲 醇、二氯甲烷+ 乙醚= 5 + 1 共4 套展开体系；显色剂为埃里克试剂和磷钼酸试剂。 2 条件试验 2 1 展开剂的选择 参考文献资料( 1 8 1 们，分别采用丙酮+ 氯仿+ 甲苯= 3 5 + 2 5 + 4 0 、异丙醚+ 异丙醇 + 甲苯= 3 7 + 2 6 + 3 7 、乙酸乙酯作为展开