（农业昆虫与害虫防治专业论文）家蝇cecropin基因在昆虫细胞中的表达.pdf

家蝇c e m , r 血基因在昆虫细胞中的表达 摘要 家蝇抗菌肽具有理化性质稳定、抗菌谱广、特异性强等特点，在当前许多抗 生素产生抗药性、开发新型抗生素困难的形势下，对家蝇抗菌肽的研究在农业、 医药、食品等领域具有重要的科学意义。由于抗菌肽在家蝇的正常组织中含量很 少，分离纯化难度较大，而化学合成的成本又十分昂贵，因此通过基因工程技术 来获得抗菌肽成为首选方法。 本文利用大肠杆菌侵染家蝇三日龄幼虫，通过提取其总r n a ，以c d n a 为 模板，扩增c e c r o p i n 基因的带有信号肽的序列，将其克隆到p m d l 8 - t 载体上， 经序列测定与g e n b a n k 中的c e c r o p i n 基因一致，成功获得含有信号肽的开放阅 读框( o r f 为1 9 2 b p ) 的p m d l 8 一t - c 。该载体为进一步将家蝇c e c r o p i n 基因在不 同的表达系统中表达奠定基础。 采取了b a ct ob a c 表达系统，对c e c r o p i n 基因进行重组表达，该系统具有高 效表达、翻译后修饰、无内毒素污染等优势。将c e e r o p i n 基因克隆至杆状病毒转 移载体p f a s t b a c h t a ，将重组质粒p f a s t b a c h t a c e c 转化大肠杆菌d h l 0 b a c 感 受态细胞，发生体内重组，获得杆粒b a c m i d c e c 。杆粒d n a 在脂质体l i p o f e c t i n 介导下侵染粉纹夜蛾t r i c h o p l u s i an i 细胞( t n 5 8 1 4 ) ，获得含c e c 基因的重组杆 状病毒，重组病毒感染t n 细胞后，表达目的蛋白。s d s p a g e 分析和w e s t e r nb l o t 显示，目的蛋白成功表达。 将c e c r o p i n 基因亚克隆到果蝇的转座子载体p 因子，在脂质体l i p o f e c t i n 介 导作用下，将p c n 和含有转座酶的h e p l e r 转入果蝇s 2 细胞，进行瞬时表达， 通过细胞r t - p c r 的方法检测表明c e c r o p i n 基因能够在果蝇s 2 细胞中表达，这 一结果作为在转基因果蝇中表达c e c r o p i n 基因的体外检测，同时确定了g 4 1 8 对 s 2 细胞的最佳筛选浓度8 5 0 i t g m l ，为果蝇的s 2 细胞稳定表达家蝇c e c r o p i n 基因 提供依据。 关键词：家蝇抗菌肽c e c r o p i n 基因；b a ct ob a c 表达系统；s 2 细胞 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 a b s t r a c t a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sf r o mh o u s e f l yh a v es t a b l ep h y s i c a la n dc h e m i c a l p r o p e r t i e s ，ab r o a da n t i m i c r o b i a ls p e c t r u ma n dn l e yo n l yi n h i b i t t h eg r o w t ho f p a t h o g e n sw i t h o u tn e g a t i v ee f f e c t si nn o r m a lc e l l s w i t ht h ec o n t i n u a le m e r g e n c eo f n e w d i s e a s e ，b a c t e r i a lr e s i s t a n c eh a sb e c o m eag r o w i n gt h r e a tt oh u m a nh e a l t h d u e t o 廿l e i r b r o a d s p e c t r u m o fa n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e s t h ea n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sf r o m h o u s e f l yw e r ec o n s i d e r e dt ob ee x c e l l e n tc a n d i d a t e sf o rp o t e n t i a ln o v e la n t i b i o t i c a g e n t s h o w e v e r ，i s o l a t i o no fa n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sf r o mn a t u r a ls o u r c e si si n e f f i c i e n t a n dt i m e - c o n s u m i n g , w h i l ec h e m i c a ls y n t h e s i so fp e p t i d e si sc o s t l y t od a t e ，g e n e t i c e n g i n e e r i n gt e c h n i q u e sh a v eb e e nc o n s i d e r e da b e t t e rm e t h o d t h r e e d a y - o l dh o u s e f l yl a r v a ew e r ei m m u n i z e db yec o l i a n dt h et o t a lr n a w e r ee x t r a c t e da f t e r2 4h o u r s c e c r o p i ng e n ew i t hs i g n a lp e p t i d es e q u e n c e sw a s a m p l i f i db yr t - p c r ，a n dt h e nc l o n e di n t op m d 18 一tv e c t o r a f t e rs e q u e n c i n g ，t h e c e c r o p i ng e n ew a si nl i n ew i t hg e n b a n k t h ep m d l 8 一t cv e c t o rc o n t a i n i n gt h eo p e n r e a d i n gf r a m e ( 19 2 b p ) o fc e c r o p i nw i l lb eu s e dt ob ee x p r e s s e di nd i f f e r e n te x p r e s s i o n s y s t e m si nt h ef o l l o w i n gs t u d y t h eb a et ob a cb a c u l o v i r u se x p r e s s i o ns y s t e mw a su s e dt oe x p r e s sc e c r o p i n g e n e t h i se x p r e s s i o ns y s t e mi se f f i c i e n tf o rp r o d u c i n gr e c o m b i n a n tb a c u l o v i r u sf o r e x p r e s s i o nt e s t i n g i n i n s e c tc e l l sw i t hh i 曲e x p r e s s i o n , e a s ys c r e e n i n g ，e x a c t m o d i f i c a t i o na f t e rt r a n s c r i p t i o na n dn oe n d o t o x i nt o x i c i t y f i s t l y , c e c r o p i ng e n ew a s c l o n e di n t ot h ep f a s t b a c h t av e c t o r , a n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e d i n t om a xe f f i c i e n c y d h10 b a c t mc o m p e t e n te c o l it og e n e r a t ear e c o m b i n a n t b a c m i d t h er e c o m b i n a n tb a c m i dd n aw a st r a n s f e c t e di n t ot h ei n s e c te e l l1 i n e ( t r i c h o p l u s i an lt n 一5 b1 4 ) t og e n e r a t ear e c o m b i n a n tb a c u l o v i r u sw i t hl l i p o f e c t i n a f t e ra m p l i f y i n g ，t h eb a c u l o v i r a ls t o c kw a su s e dt oi n f e c tt nc e l l st oe x p r e s st h e r e c o m b i n a n tp r o t e i n t h ee x p r e s s e dr e c o m b i n a n tp r o t e i n sw e r ec o n f i r m e db y s d s p a g ea n dw e s t e r nb l o t a n a l y s i s h o w e v e r , r e c o m b i n a n tm d c e ew a s h t s u c c e s s f u l l ys e c r e t e di n t ot h ec u l t u r es u p e r n a t a n t s ，w h i c hd i d n ti n h i b i tt h eg r o w t ho f e ，c o l ik 1 2 d 3 1 c e c r o p i n 基因在昆虫细胞中的表达 i nt h i s s t u d y ，c e c r o p i ng e n ew a ss u b d o n e di n t ot r a n s p o s o nv e c t o rf r o m d r o s o p h i l ap f a c t o r t h e n p f a c t o ra n dh e p l e r ( c o n t a i n i n gt r a n s p o s a s e ) w e r e t r a n s f e c t e di n t oi n t od r o s o p h i l as 2c e l l s 、析t l ll i p o f e c t i n a f t e rr t p c ra n a l y s i so f t h et r a n s f e r e dc e l l s ，i th a sb e e nd e t e r m i n e dt h a tc e c r o p i ng e n ec a l lb ee x p r e s s e di ns 2 c e l ll i n ew i t hp f a c t o r t h i sr e s u l tw a sc o n s i d e r e da sav i t r ot e s t i n gf o rc e c r o p i ng e n e e x p r e s s i o ni nt r a n s g e n i cd r o s o p h i l ae g g s i na d d i t i o n ，t h es e l e c t i n gc o n c e n t r a t i o no f g 418f o rs 2c e l lw a s8 5 0 r t g r r d ，w h i c hp r o v i d e sb a s i sf o rc e c r o p i ng e n es t a b l y e x p r e s s i n gi ns 2c e l l s k e yw o r d s ：c e c r o p i ng e n e ；b a ct ob a cb a c u l o v i r u se x p r e s s i o ns y s t e m ；s 2c e l l l i n e i i i 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 缩略语 昭 山 姗 a m p a m 咿s b p c d n a d d t d e p c h 2 0 羽帅 e b e d l ：a g - g + h i p t g k b k d a 。 m d c e c m g m i l l m l o d p b s p c r r t - p c r s d s s d s p a g e s e c t r i x - g a l 缩略语表 英文全称 m i c r o g r a m m i c r o l i t r e a n t i f u n g a lp e p t i d e s a m p i c i l l i n a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a 1 4 - d i t h i o t h r e t o d i e t h y lp r o c a r b o n a t e d e i o n i z e d w a t e r d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e m i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a - a c e t i ca c i d e g r a mn e g a t i v eb a c t e r i a g r a mp o s i t i v eb a c t e r i a h o u r i s o p r o p h y l t h i o - p d - g a l a c t o s i d e k l i o b a s e l d i o d a l t o n m u s c ad o m e s t i c ac e e r o p i n m i l l i g r a m m i n u t e m i l l i l i t e r o p t i c a ld e n s i t y p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r 目v e r s et r a n s c r i p t - r c r s o d i u md o d e c y ls u l f s a t e s d s p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s s e c o n d 嘶s ( h y d r o x y m e t h l e ) a m i n o m e t h a n e 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y p d - g a l l v 中文全称 微克 微升 抗真菌的小肽 氨苄青霉素 抗菌肽 碱基对 互补d n a 1 , 4 二硫苏糖醇 焦碳酸二乙酯 去离子水 脱氧核糖核苷三磷酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌 小时 异丙基硫代p d 半乳糖苷 千碱基 千道尔顿 家蝇天蚕素 毫克 分钟 毫升 光密度 磷酸缓冲盐溶液 聚合酶链式反应 反转录p c r 十二烷基硫酸钠 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 秒 三( 羟甲基) 氨基甲烷 5 溴- 4 氯一3 一吲哚p - d 半乳糖甘 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密否 如需保密，解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：同铂 时间： 伊7 年 月以日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定 ，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的f g 届l l 版和 电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位做作者躲同秀娟 翩繇卞长涪 签名日期：伽7 年月膨日 签名日期：扣7 年6 月f 日 家蝇e e e r o p i n 基因在昆蝴胞中的表达 1 1 引言 第一章文献综述 家蝇m u s c ad o m e s t i c av i c i n a 是一种重要的媒介昆虫。近年来，对其体内外 抗菌活性物质的研究受到了广泛的关注。在家蝇抗菌物质的种类、性质，尤其在 家蝇抗菌肽的结构特点、生物活性、作用机理与分子生物学、应用等领域都有不 同程度的研究。 家蝇抗菌活性物质，尤其是抗菌肽具有理化性质稳定、抗菌谱广、只作用于 病原物而对人正常细胞无副作用的选择性特点，在当前许多抗生素产生抗药性、 开发新型抗生素困难的形势下，对家蝇抗菌活性物质的研究在农业、医药、食品 等领域具有重要的意义。如何提高抗菌肽的生产效率，降低成本，是应用抗菌肽 所必需解决的问题。 由于抗菌肽在家蝇的正常组织中含量很少，分离纯化难度较大，而化学合成 的成本又十分昂贵，因此通过基因工程技术来获得抗菌肽成为首选方法。自上世 纪7 0 年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个 领域。 昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全，表达量高， 目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。杆状病毒表达系 统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用苜蓿银纹夜蛾杆状病毒 ( a c n p 作为表达载体。在a c n p v 感染昆虫细胞的后期，核多角体基因可编码 产生多角体蛋白，该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体。核多角体基因启动子具有 极强的启动蛋白表达能力，故常被用来构建杆状病毒传递质粒。克隆入外源基因 的传递质粒与野生型a c n p v 共转染昆虫细胞后可发生同源重组，重组后多角体 基因被破坏，因而在感染细胞中不能形成包涵体，利用这一特点可挑选出含重组 杆状病毒的昆虫细胞。 转座子介导的昆虫转基因技术的研究与应用是当前的热点领域之一。自上世 纪8 0 年代初首例转基因果蝇问世以来的二十多年间，已经在该领域取得了从方 法、技术到应用等多个方面的重要突破和进展，并显示出了巨大的开发应用潜力。 近年来，该技术被用于生产高附加值蛋白，而且，无论在操作技术上，还是在开 发应用前景上，转座子介导外源基因的表达都存在明显优势。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 2 天然抗菌肽的研究进展 自然界中大多数多细胞生物都生活在与病原微生物经常接触的环境中，这些 生物的生存依赖于体内多种成分参与宿主防御体系( b a l s ，2 0 0 0 ) 。 宿主防御系统有两种类型：天然免疫( i n n a t ei m m u n i t y ) 和获得性免疫 ( a c q u i r e di m m u n i t y ) ( h o f f m a n ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。昆虫等无脊椎动物与脊椎动物不 同，宿主防御仅仅依赖于天然免疫( b u l e te ta 1 ，2 0 0 4 ) 。天然免疫是指在受到微 生物感染后立即启动，快速限制入侵的病原体的扩散，为更高效的获得性免疫的 产生提供时间保证。 天然免疫的一个主要机制是为在生物体内组成性或诱导性表达一些内源肽， 它们构成了机体防御病原体的快速而有效的手段，这些肽称为抗菌肽 ( a n t i m i c o b i a lp e p t i d e s ，a m p s ) ( r e d d ye ta 1 ，2 0 0 4 ) 。抗菌肽在植物、昆虫、高等 动物等真核生物中广泛存在，在一些微生物中也有发现( l u d e r se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。抗 菌肽具有分子量小、等电点高、热稳定好、抗菌活性高等特点。几十年来，各国 学者围绕抗菌肽的分离与纯化、氨基酸序列分析、蛋白质构型与功能、抗菌肽的 作用机理、应用基因工程方法表达抗菌肽基因、改造合成抗菌肽基因以及动植物 的转抗菌肽基因工程等方面做了大量工作。 1 2 1 抗菌肽的分类 对抗菌肽的分类有很多种方法。根据抗菌肽的来源，可将其分为哺乳动物抗 菌肽、水生动物抗菌肽、两栖动物抗菌肽、昆虫抗菌肽、植物抗菌肽等。根据所 带静电荷，可分为阳离子抗菌肽和阴离子抗菌肽。根据抗菌肽的序列、结构和抗 菌特性等，将动物来源的阳离子抗菌肽分为三大类( b u l e te ta 1 ，1 9 9 9 ) ：( 1 ) 不 含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素( c e c r o p i n ) 、马盖宁( m a g i n i n ) 等；( 2 ) 具有半胱氨酸的环型抗菌肽( 亦称防御素类) ，如昆虫防御素( i n s e c td e f e n s i n s ) 等；( 3 ) 富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包含富含脯氨酸的抗菌肽，如 意大利蜜蜂素( a p i d a e c i n s ) 和黄蜂素( a b a e c i n s ) ，以及富含甘氨酸的抗菌肽， 如蚕蛾素( g l o v e r i n s ) 和攻击素( a t t a c i n s ) 等。也有人将后一种抗菌肽分为两类， 分别称为富含脯氨酸抗菌肽和富含甘氨酸的抗菌肽( c h e ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 随着核磁共振技术在研究抗菌肽结构上的应用，人们对已知抗菌肽的三维 结构有了深入的了解。目前，根据对抗菌肽核磁共振分析的三维结构数据，将抗 2 家蝇嘶基因在昆虫细胞中的表达 菌肽分为5 类( r e d d y e ta 1 ，2 0 0 4 ) ：( 1 ) q 一螺旋抗菌肽，如m a g i n i n s 、c c e r o p i n s 等；( 2 ) 富含半胱氨酸抗菌肽，如d r o s o m y c i n 、h n p 1 ；( 3 ) 1 3 一折叠抗菌肽， 如t a c h y p l e s i n 和t h a n a t i n ；( 4 ) 富含某种氨基酸的抗菌肽，如p r o ，t r p ，a r g 和 h i s 抗菌肽，如h i s t a i n 富含h i s ，c a n t h d i c i d i n s 富含p r o ，i n d o l i c i d i n s 和t r i t r i p t i c i n 富含t r p 等；( 5 ) 含稀有被修饰氨基酸的抗菌肽，这类抗菌肽大多是从微生物中 发现的，如格氏乳球菌l a c t o c o c c u sl a c t i s 中的n i s i n 、串珠菌l e u c o n o s t o cg e l i d u m 中的l e u c o c i na 等。这类抗菌肽的一些氨基酸经过特殊修饰，如3 甲基羊毛硫 氨酸、脱氢丙氨酸和脱氢丁酸甘油酯等。 1 2 2 抗菌肽的活性 抗菌肽不仅抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌，对病毒、肿瘤细胞和某 些原生生物包括寄生虫等也表现出很强的活性。 1 2 2 1 抗微生物活性 抗菌肽的主要活性是抗菌。用来自人和兔的d e f e n s i n s 以及猪白细胞的 p r o t e g r i n z 进行的体外试验表明，它们可使结核分枝杆菌m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s 的集落形成单位( c o l o n yf o r m i n gu n i t s ，c f u ) 减少9 9 ( m i y a k a w a e ta 1 ， 1 9 9 6 ) 。但不同抗菌肽表现出的抗菌谱不同，大多数抗菌肽能抗革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌，有的只对其中一种有活性，有的对二者都有活性，如果蝇中的 c 冶c r o p i n s 既能抗革兰氏阳性菌又抗革兰氏阴性菌，甚至对真菌也有活性 ( e k e n g r e na n dh u l t m a r k ，1 9 9 9 ) ，而d e p t e r i c i n s 和a t t a c i n s 仅对革兰氏阴性菌有活 性。同一种抗菌肽对不同菌株的活性是不同的，如从蝎子中分离出的a n d r o c t o n i n 对细菌和真菌有相当强的抑制活性，它对革兰氏阳性菌绿色气球菌a e r o c o c c u s v i r i d a n s 、滕黄微球菌m i c r o c o c c u sl u t e u 和枯草芽孢杆菌b a c i l l u ss u b t i l i 的最小抑 制浓度( m i c ) d , 于3 1 x m ，对金黄色葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 和密执安棍状杆 菌c l a v i b a c t e rm i c h i g a n e n s i s 的活性次之( m i c 3 0 0 m ) ，而对蜡状芽孢杆菌b a c i l l u s c e r e u s 和苏云金芽抱杆菌b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s 在3 0 洲浓度下还没有抑制活性； 对一些革兰氏阴性菌，如丁香假单孢菌p s e u d o m o n a ss y r i n g a e 的最小抑制浓度小 于3 叫( e h r e t - s a b a t i e re ta 1 ，19 9 6 ) 。 抗菌肽也表现出广泛的抗真菌的活性。i i j i m a 等从麻蝇幼虫血淋巴分离出一 种抗真菌的小肽a f p ( a n t i - f u n g a lp e p t i d e ) ，该肽抑制白色假丝酵母c a n d i d a a l b i c a n s 的生长( i i j i m ae ta 1 ，1 9 9 3 ) 。来自天蚕的c e c r o p i na 和b 以及猪肠道蛔虫 3 华中农业大学2 0 0 9 届硕上学位论文 的c e c r o p i np1 具有抑制和杀死酵母白色念珠菌c a n d i d aa l b i c a n s 的能力( a n d r ae t a 1 ，2 0 0 1 ) 。c e c r o p i n s 在浓度2 5 10 0 1 x g m l 已经表现出对曲霉a s p e r i g i l l u s s p e c i e s 和镰刀霉f u s a r i u ms p e c i e s 的杀真菌活性( d e l u c e ae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。源自南美树蛙的 d e r m a s e p t i n s 抗新型隐球菌c r y p t o c o c c u sn e o f o r m a n 而不溶f i l l ( d el u c c aa n dw a l s h , 1 9 9 9 ) 。 1 2 2 2 抗肿瘤细胞活性 抗菌肽不仅抗微生物而且具有抗肿瘤细胞的活性。目前有关抗茵肽抑杀肿瘤 细胞的研究已经有了大量报道，但主要集中于具有双亲a 一螺旋结构域的天蚕素 c e c r o p i n s ( m o o r ee ta 1 ，19 9 4 ) 、马盖宁m a g a i n i n s ( b a k e re ta 1 ，19 9 3 ) 和蜂毒素 m e l i t t i n ( s h a r m a , 1 9 9 3 ) 上。己经证明这三类抗菌肽对多种肿瘤细胞和移植瘤具有 抑杀活性，它们抑杀肿瘤的原理为触发凋亡( 砌s s 0a e ta l ，2 0 0 2 ) 或形成离子通道 ( c r u c i a n ie ta 1 ，1 9 9 1 ；y ej se ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 1 2 2 3 抗病毒活性 一些研究关注到了抗菌肽的抗病毒作用。从经过刺激的红头丽蝇c a l l i p h o r a v i c i n a 幼虫血淋巴中分离到的阳离子抗菌肽a l l o f e r o n 对人类感冒病毒a ，b 均表 现出良好的抗一 生( c h e m y s he ta 1 ，2 0 0 2 ) 。人的q d e f e n s i n s1 3 在艾滋病病毒 ( h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s ，h r v ) 感染中对由c d 8t 细胞分泌的c d 8 抗病 毒因子的抗h i v - 1 活性有贡献( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。体外试验中，兔的- d e f e n s i n n p 一1 能够阻止单疤疹病毒h s v - 2 进入细胞和在细胞内扩散( s i n h ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 通常被接受的抗病毒机理为抗菌肽直接与病毒被膜作用，导致被膜穿透，最终病 毒颗粒裂解，类似于抗菌活性的孔形成模型。对天蚕素和蜂毒素抗h i v 病毒的 研究证明，抗菌肽可通过抑制h i v - 1 长端重复基因表达而抑制病毒繁殖 ( w a c h i n g e re ta 1 ，19 9 8 ) 。 1 2 2 4 抗原生生物 一些抗菌肽还具有抗原生生物的活性。m a g a i n i n s 和c e c r o p i n s 能够中断蚊子 中疟原虫孢子体的发育( g w a d ze ta 1 ，1 9 8 9 ) 。对天然抗菌肽天蚕素b 进行改造， 人工合成的新肽增强了抗菌活性，而且可以杀死恶性疟原虫p l a s m o d i u m f a l c i p a r u m 和克氏锥虫t r y p a n o s o m ac r u z i ( j a y n e se ta 1 ，19 8 8 ) 。 1 2 2 5 避孕 少数抗菌肽表现出了避孕潜力。m a g a i n i n s 的体内杀精子试验表明， 4 c e c r o p i n 基因在昆虫细胞中的表达 m a g a i n i n a 导致1 0 0 的精子固定的浓度为5 0 i _ t g ( 大鼠) 、4 0 0 p g ( 兔) 、8 0 0 p g ( 猴 和人) ( r e d d ye ta 1 ，1 9 9 6 ) 。体内试验表明，阴道内给药m a g a i n i n - a2 0 0 9 9 ( 大鼠) ， 和l m g ( 兔和猴) 抑制受孕( r e d d ye ta l ，19 9 6 ；r e d d ya n dm a n j r a m k a r , 2 0 0 0 ) 。对n i s i n 在体内外的避孕功能的研究表明，n i s i n 对精子的活动力表现出时间和剂量依赖 性，在体外3 0 0 4 0 0 烬m l 的浓度2 0 s 内足以抑制人的精子能动力，在兔阴道内 给药l m gn i s i n 使精子完全停止活动，处理后的动物无一受孕( a r a n h ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 1 2 3 抗菌肽的应用前景 由于抗菌肽具有广谱的抗菌活性，被认为是解决病原微生物对抗生素不断增 强的抗性问题的最佳选择。因此，人们对于将抗菌肽应用于临床医疗方面的研究 产生了广泛兴趣。己经证实口服人的l a c t o f e r r i nb 和其衍生物对用晟c o l i 诱导的 小鼠尿道感染和肿胀有效( h a v e r s o n e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。而梭菌f u s o b a c t e d u ms p e c i e s 和 念珠菌c a n d i d as p e c i e s 对人的c a t h e l i c i d i n s ( ! t hs m a p 2 9 和c a p 1 8 ) 的敏感性增强 了c a t h e l i c i d i n s 对口腔菌的治疗潜力( g u t h m i l l e re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。目前，少量抗菌肽 已经进入了临床试验，例如牛中性粒细胞肽i n d o l i c i d i n 的类似物m b i 5 4 9 处于用 于治疗痤疮感染的i i 期临床试验( f e l l aa n dh a n c o c k ，1 9 9 7 ) ，人的唾液腺肽h i s t a t i n 的一个衍生物p 1 1 3 正在进行用于治疗免疫缺陷病人的口腔念珠菌病的i 1 1 期临 床试验( p a q u e r ee ta 1 ，2 0 0 2 ) ，由m a g a i n i n 衍生来的p e x i g a n a n 处于治疗糖尿病人 的足部感染溃疡的i i i 期临床试验( g i a c o m e t t ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 。随着研究的深入，抗 菌肽将在人类抵抗病原菌感染的斗争中发挥重要作用。 一些抗菌肽还表现出了抗肿瘤、抗病毒的应用潜力。c e c r o p i n s 、m a g a i n i n s 和m d i r i n 等一些抗菌肽都表现出了抗肿瘤活性。d e f e n s i n s 能够中和单疮疹病毒 ( h e r p e ss i m p l e xv i r u s ，h s v ) 、水泡性口膜炎病毒( v e s i c u l a rs t o m a t i f i sv i r u s ，v s v ) 和 流感病毒( d a h c re ta 1 ，1 9 8 6 ) t a c h y p l e s i n s 和p o l y p h e m u s i n s 具有抗v s v 、流感病 毒a 和艾滋病病毒的活性( t a m a m u r ae ta 1 ，1 9 9 6 ) 。对这些抗菌肽的研究一方面可 能寻找出新的抗肿瘤、抗病毒药物，另一方面也为合成新药提供了新思路。一些 抗菌肽，如m e l i t t i n s 和c e c r o p i n s ( w a c h i n g e re ta 1 ，19 9 8 ) ，表现出了抗h i v 的活性， 越发展示了抗菌肽研究的吸引力。 除抗h i v 外，抗菌肽在治疗其它性传播疾病方面也展现出了潜力。兔模型 实验中，d e f e n s i n s 部分地抑制梅毒螺旋体t r e p o n e m ap a l l i d u m 的侵入( b o r e n s t e i ne t a 1 ，1 9 9 1 ) 。低微摩尔浓度的p r o t e g r i a s 具有高的抗淋病奈瑟菌n e i s s e r i a 5 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 g o n o r r h o e a e 的活性( q ue ta 1 ，19 9 6 ) 。两个合成的c c c r o p i n 肽d 2 a 21 和d 4 e 1 具 有抗沙眼衣原体c h l a m y d i at r a c h o m a t i s 的活。i 生( b a l l w e b e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 抗菌肽在预防和治疗寄生虫传染病方面也有重要价值。一些抗菌肽的抗寄生 虫活性在“抗菌肽的活性”章节中已有描述。 抗菌肽还可以用作其它药物的载体。许多抗菌肽表现出了对细菌和肿瘤细胞 的选择性亲和力，而对普通真核细胞无毒性。这使得这些抗菌肽或者其肽的一部 分能够成为抗菌或抗肿瘤药物的载体，从而进行靶向治疗，以缓解或减少药物对 正常细胞的毒性。另外，抗菌肽具有很好的细胞穿透性，作为载体，能够使一些 不能或不易进入细胞的药物穿透细胞，达到治疗的目的。富含脯氨酸并且有很强 膜穿透能力的阳离子抗菌肽被认为是一类很好的潜在的药物载体( r a p p o c c i o l o ， 2 0 0 4 ) 。 抗菌肽在农业生产中也具有重要的应用价值。将抗菌肽基因转入动物和植 物体中己经成功地防治了一些病害的发生。将小鼠i l 2 基因与合成的c e c r o p i n 抗菌肽s h i v al a 基因和s v 4 0 多腺苷酸化剪接信号连接构建的融合基因转入小 鼠，增强了转基因小鼠对布鲁氏杆菌b r u c e l l aa b o r t u s 的抑制作用( r e e de ta l ， 1 9 9 7 ) 。将m a g a i n i n 修饰后的产物m y p 3 0 转基因至烟草，显著地降低了烟草对霜 霉真菌p e r o n o s p o r at a b a c i n a 的感染( l ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。从微生物中分离到的抗菌肽 还可被用于食品的保鲜与储藏( ( p a p a g i a n n i ，2 0 0 3 ) 。 此外，人们对于抗菌肽的广泛研究还促进了人们对于先天性防御系统的认 知。抗菌肽的发现为我们了解机体尤其是无脊椎动物的先天免疫机制打开了一个 视野。对无脊椎动物免疫系统的认知已经使人们对传统免疫系统的观念产生了重 大改变。目前，有关先天免疫的研究正方兴未艾。 1 2 4 家蝇抗菌肽 家蝇泓d o m e s t i c a ) 属昆虫纲、双翅目、蝇科，在世界各地都有分布。家蝇为 全变态昆虫，一生分为卵、幼虫、蛹和成虫四个发育阶段。相对于模式生物果蝇 d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 而言，我们对家蝇体内的抗菌肽的了解还知之不多。己 知果蝇的基因组至少编码8 个主要家族的3 4 个抗菌肽( h u l t m a r k , 2 0 0 3 ) ，这些抗 菌肽包括主要抗真菌的d r o s o m y c i n 和m e t c h n i k o w i n ，抗革兰氏阴性菌的a t t a c i n s 、 e e c r o p i n s 、d i p t e r i c i n s 和d r o s o c i n ，以及抗革兰氏阳性菌的d e f e n s i n ( n a i t z aa n d l i g o x y g a k i s ，2 0 0 4 ) ，另一类为广谱的溶菌酶。但是，至今我们从家蝇体内仅克隆 6 家蝇唧i i l 基因在融细胞中的表达 到三条抗菌肽基因，分别为家蝇防御素d e f e n s i n ( w a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 和家蝇攻击素 a t t a c i n ( g e n ge ta 1 ，2 0 0 4 ) 以及家蝇天蚕素c e c r o p i n ( l i a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 相比而言，家蝇与人类的关系比果蝇更密切。家蝇从幼虫到成虫均生活在杂 菌丛生的环境里，是许多病原体的携带者，约一百多个引起人类和动物疾病的病 原体与家蝇有关，包括伤寒、霍乱、杆菌性痢疾、肺结核、炭疽热、婴儿腹泻， 以及一些寄生虫病等。由于家蝇自身不受这些病原微生物的感染，推测家蝇体内 具有独特的免疫防御机制，可能产生活性较强的抗菌肽。因此，研究家蝇体内的 抗菌肽具有广泛的理论意义和应用价值。 1 2 5 用基因工程方法表达家蝇c e c r o p i n 基因的研究现状 采用传统方法从家蝇体内直接提取天然抗菌肽成本高、产率低，运用基因工 程来生产抗菌肽，可能是一种更为理想的途径。许多学者分别采用的不同的表达 系统尝试去表达家蝇抗菌肽基因，虽然有的获得比较理想的结果，但是仍然存在 一些问题。 l i a n g 等利用原核表达系统( e c o l i ) 表达了家蝇成虫的天蚕素基因( l i a n ge t a 1 ，2 0 0 6 ) ，徐建华等同样将家蝇幼虫抗菌肽天蚕素基因在大肠杆菌中融合表达， 纯化后，具有较强的抗菌活性( x ue ta 1 ，2 0 0 7 ) ；另外，x u 等也在e c o l i 表达系 统中高效表达了c e c r o p i n a ( 1 8 ) 一m a g a i n i n 2 ( 1 - 1 2 ) 融合蛋白( x u e t a l ，2 0 0 7 ) 。原 核表达系统虽然操作简便，表达水平较高，但抗菌肽本身具有抗菌活