（动物学专业论文）淡水白鲳细胞寒害致死机理初步研究.pdf

序言y 互0 3 i1 9 9 8 年宁波市政府为了加强科技力量，加速培养高层次人材，组织实施了“4 3 2 1 ”工程，其中关于选送优秀中青年人才赴重点高校、科研院所攻读硕士学位的通知，使本人有幸成为该项目的第批成员，在浙江大学学习三年。在三年学习期间得到了浙江大学生命科学学院、宁波市人事局、宁波市水产局、宁波市水产研究所等有关单位领导的支持。在此深表感谢!在我的科研工作上大家都给予了极大的帮助，在此特别感谢我的导师张铭教授和李亚南副教授给予的无私的关心和指导。同时，感谢李德葆教授、赵小立副教授、邵建忠教授的热情指导和帮助。还要感谢陈衢工程师、杜英老师、洪健教授、项黎新副教授以及刘军、徐德立、严文静等同学的帮助。在此，谨向所有给予我指教和帮助的老师和同学致以最诚挚的感谢!我家人给予我的支持，是我完成学业的基础。在这三年里我对病巾的父亲、成长中的女儿的关心极其有限，对此深表歉意。虽然完成了硕士阶段的学习，但对我而言这只是科学研究的另个起步，学无止境，我将继续学习、学习再学习。最后再次衷心感谢各位给予的无私奉献!前言淡水白鲳细胞寒害致死机理初步研究+研究背景淡水白鲳属脂鲤鱼目( c h a r a c i f o r m e s ) 、脂鲤科( c h a r a c i d a e ) 、巨脂鲤属( c o l o s s o m a ) ，其学名为短盖巨脂鲤( c o l o s s o m ab r a c h y p o m u m , c u v i e r ，1 8 1 8 ) 。主要分布在中南美洲和非洲，是- - 1 4 热带鱼类。我国于9 0 年代初引进淡水白鲳进行养殖、育苗试验，由于该品种不耐寒，因此在我国两广以北的广大地区不能自然越冬，每年需花费大量资金和人力解决越冬问题或进行种苗调运。1 。地理条件的限制使白鲳养殖得不到大面积推广。培养耐寒、速生的喜温性鱼新品种成为国内外鱼类遗传育种研究的热点。”。“8 6 3 ”计划曾安排罗非鱼抗寒课题，因未能建立罗非鱼细胞系而停止。以后一些鱼类遗传育种学家通过转移鲤鱼d n a 来提高鲮鱼耐寒性“，转移抗冻蛋白基因来提高鱼的耐寒性“3 、采用混精受精方法来提高鲮鱼抗寒性，均没有取得突破性的进展”，其重要原因是因为对鱼类寒害的机理尚不清楚，这方面的研究比较少，使得鱼类抗寒育种缺乏正确的理论指导。喜温性鱼个体寒害致死是一个十分复杂的生理生化过程。研究者分别从冷休克及其死亡的某些生化因素，越冬对脂肪酸组成变化”，线粒体膜流变性”3 ，同工酶活性、脑乙酰胆碱酯酶活性等进行分析，并发现了一些与抗寒有关的r a p d 扩增带“，为认识寒害的机理提供了一定的线索。然而，从不同鱼，不同组织所获得的资料仍不能得到较为统一的认识，不能说明各自复杂生化过程之间的相互关系。极需有一个研究模型把问题集中，简化到一个层面，即在细胞水平上来研究寒害的生理生化过程、认识原初反应和信号传导的分子机制。近年来国际上对寒害研究已从膜脂组成成分、结构“”1 ；冷击蛋白“、冷诱导基因表达1 、抗冻蛋白作用“5 逐渐进入到程序化调控，即细胞凋亡的诱发和控制机制“。这方面研究在哺乳动物的肿瘤细胞上发展很快“”，研究比较集中在氧自由基( r o s ) 对d n a 、膜蛋白的伤害与膜不饱和脂肪酸的影响及其相关的超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶、谷胱甘肽酶、细胞色素c “”2 “，以及低温对m r n a 表达影响等“、小鼠肝细胞对低温的应答反应。”等等。 注：本研究为国家基金资助项目，编号3 0 0 7 0 5 8 3 项目名称：淡水白鲳细胞寒害机理研究1鱼类细胞凋亡的研究1 逐渐在细胞毒性、热休克蛋白和冷诱导作用方面展开m ，研究的目的是阐明寒害的分子机制和寻找抗寒的有效措施。鱼s o d 是鱼类对逆境应答的一项重要指标，目前已对地中海箭鱼、佛罗里达箭鱼3 特性及低温下生活的深水鱼的s o d 特性”进行研究，发现低温生活的鱼其s o d 与哺乳动物有显著不同。这一发现为我们的研究提供了线索。淡水白鲳生长水温在2 0 c 以上，其适宜的生长水温为2 1 - - 2 76 c ，水温低于2 0 c 会影响鱼的摄食和生长，淡水自鲳耐低温能力较差，低温临界温度为l o，在水温9 一i o c 时呈异常并侧卧，8 开始死亡，7 全部死亡。为了研究淡水自鲳寒害机理，筛选耐寒细胞系进行抗寒细胞工程育种，1 9 9 0 年体外培养淡水白鲳胚胎细胞成功。先后又建立淡水白鲳的胚胎、尾鳍、臀鳍和吻端等组织的细胞系。”，至今有的已传百代，生长十分稳定。淡水白鲳细胞系的温度生长特性与白鲳个体饲养条件下温度生长特性十分吻合，即2 6 - 3 7 。c 均能正常生长，1 6 2 0 生长缓慢，1 2 。c 以下不能生长而逐渐死亡，这些现象表明白鲳寒害有其不同的细胞学机理。因此，这些细胞系是非常好的研究寒害的模型。我们的前期工作已经发现白鲳细胞在受寒害后生物发光、s o d 等有明显的改变，它显示的r o s 变化与目前在肿瘤细胞凋亡等方面的前沿研究有共同点。初步研究表明”白鲳细胞寒害致死主要不是细胞膜的完整性急性受损，而是一种程序性死亡。为了进一步确定白鲳细胞寒害死亡的性质，本研究借鉴已有研究方法和研究成果对淡水白鲳细胞系进行低温处理，采用荧光检测法、d n a 电泳法、电镜观察法、流式细胞仪、细胞内游离钙离子浓度测定等细胞凋亡检测手段检测细胞活性，观察淡水白鲳细胞死亡过程中的形态、生化特性等的变化，集中研究细胞死亡的细胞组织学等过程，希望能从理论上说明淡水白鲳细胞寒害的细胞学机理。本研究用白鲳c b t 细胞作为材料，为了能更好地说明问题，我们将广温性的草鱼胚胎细胞系c p 作为参照，对它们在3 和i o4 c 低温短时间处理和长时间保存后引起的生理生化变化进行比较。草鱼属广温性鱼类，通常草鱼细胞系能在i o c t 保存2 3 个月甚至更长时间，但是恢复培养的成活率随时间延长而下降，细胞死亡率增高。其原因是什么? 对此也进行了一些探索。重金属离子镉在一定浓度和处理时问能引起多种细胞凋亡。“3 “，凋亡细胞在荧光显微镜下可见典型的细胞内核碎片。由于在预备实验中未能观察到寒害条件下淡水白鲳细胞核或细胞质内浓染致密的d n a 荧光碎片，因此，我们用重金属离子对淡水白鲳细胞进行处理，作为低温处理的对照。环境条件的突然或短期的改变并不一定引起d n a 或其表达的改变。为了适应这种环境变化，通常，生物体首先调节体内各部位各种酶的活性。在正常生化过程中，常有1 左右的0 ：误入歧途，变成化学性质极其强烈的( a c t i v eo x y g e n ) 。而s o d 是体内唯一以自由基为底物的酶，能够清除活性氧，保护机体。s o d 属于金属酶，其性质不仅取决于蛋白质部分，而且还取决于结合到活性部位的金属离子。按照结合的金属离子种类不同，s o d 有c u z n s o d 、b t n s o d 和f e s o d 三种。三种酶都可催化0 ：。一岐化为h 2 0 ：与0 。但其性质有所不同，f e s o d 的氨基酸序列与m n s o d 类似，但与c u z n - - s o d 差别很大。m n s o d 对热比较敏感。在p h 7 0 时与c u z n s o d 催化速率常数一样，但在碱性条件下明显减小。f e s o d 在高p h 活性降低，不能被氰化物抑制，其催化活性比其它s o d 低。动物、植物、藻类以及某些原核生物体内都存在c u z n s o d 。该酶活性不仅决定于酶蛋白，而且还决定于c u ”、z n ”。在一般的实验条件下，该酶颇为稳定“”。有研究表明冷敏感植物在冷胁迫条件下，细胞中活性氧的产生加速，而清除活性氧的能力下降，导致活性氧水平的提高。冷害条件下活性氧所引起的伤害也是冷害的重要原因之一。另一方面，有研究证明冷驯化提高了细胞内抗氧化两活性和内源抗氧化剂含量，相应也削弱了由冷害引起的膜蛋白和膜脂过氧化，提高了植物的抗冷力。另外，植物不同的抗冷力也是与其细胞内具有不同水平的抗氧化酶活性和内源抗氧化剂含量相关，抗冷植物比冷敏感植物具更高水平的抗氧化能力”。由上可见s o d 与抗寒密切相关。为了证明s o d 与c b t 细胞寒害的关系，我们研究了c b t 细胞在低温条件下s o d 活性变化情况。同时，为了进一步了解低温对整体鱼的影响情况，我们对成体淡水白鲳在不同温度下各组织s o d 的变化以及淡水白鲳低温生物学也进行了初步研究。一淡水白鲳细胞寒害致死机理初步研究论文摘要本研究利用已建立的丛拙童& _ 细胞系，从细胞生物学水平对j ! 塑窒鱼耋淡水白鲳细胞在低温下死亡的机理进行分析。( 样品处理方法：淡水白鲳细胞在3 7 。c 下培养作为参照组，对照组细胞从3 7转到1 0 。c 或3 c 中培养，处理时问分别为3 h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 。淡水白鲳成体鱼在不同温度下培养6 h ，再进行解剖取不同组织提取测定。r 厂一本研究采用的主要实验方法：通过荧光显微观察、电镜超微结构观察确定c b t ( 淡水白鲳臀鳍细胞) 和c p ( 草鱼胚胎细胞) 在低温处理后的显微与超微结构的变化。应用d n a 电泳分析细胞d n a 在低温处理后的断裂现象。用荧光探针p i ( 碘化丙碇) 、i n d o - 1 及r h o d a m i n l 2 3 分别检测细胞在低温度处理后d n a 含量、，、7细胞内钙离子浓度和线粒体膜电位。n b t 法测定细胞内超氧阴离子o z j ；采用邻苯三酚自氧化的方法测定低温下c p 、c b t 细胞系s o d 活性以及不同温度下淡水白鲳成体不同组织s o d 活性。厂【结果表明：( 1 ) c b t 在低温协迫下，细胞圆缩，细胞核变形，染色质浓缩且边位，细胞质空泡状；细胞死亡率随处理时间的增加而增加；细胞内钙离子浓度随处理时间延长而递增；线粒体膜电位差在低温处理早期急速上升，随后一直下降；细胞内超氧阴离子( 0 2 、) 在低温处理前期出现商峰，接着呈下降趋势；细胞内s o d 活性在低温处理前期减弱，接着上升，然后持续下降。经低温处理的c b t 细胞d n a 电泳并未出现表征凋亡的“d n al a d d e r 梯带。( 2 ) c p 细胞系在1 0低温下细胞死亡率与时间成正比，1 2 0 d 的细胞具典型的凋亡现象，即细胞核固缩、染色体边集在核膜内侧；细胞体积变小：琼脂糖凝胶电泳上显示特征性的“梯状”带。在低温3 协迫下，c p 细胞线粒体膜电位差呈下降趋势，钙离子浓度则呈上升态。( 3 ) 从所测的每尾鱼的各种组织细胞总的s o d 活性可见：随着温度的升高，鱼整体的s o d 水平也随着上升。成体淡水白鲳随着温度下降，不同组织的s o d 活性变化略有不同，脑部s o d 的活性随着养殖水温的下降先升高，而后下降。从整体鱼分析，s o b 主要分布在脑、肝、肾、肌肉及鳃组织。( 4 ) 从实验中可见低温( 1 1 ) 使鱼体色变深，突然升温导致鱼体色变自，随着养殖时间延长，3 天后又恢复原来的体色。从解剖中看到，当温度下降到1 7 c 、i j ，淡水白鲳的脑腔内脂类呈半流动状态，随着温度的下降滞流现象更为严重，j。l h 一结论：( 1 ) 初步研究认为淡水白鲳细胞在低温下的死亡可能属于非凋亡形式的程序性细胞死亡。( 2 ) 细胞凋亡是c p 细胞在i o 。c 保存时间过长导致细胞不能在正常生长温度下恢复生长的根本原因。( 3 ) c b t 和c p 低温致死机制有所不同。( 4 ) 随着温度的升高，鱼整体的s o d 水平也随着上升，表明淡水白鲳新陈代谢水平随温度升高而提高，生命活动旺盛。低温协迫导致淡水白鲳脑部缺氧，s o d活性持续上升。p r e li m i n a r ys t u d yo nc o l d s t r e s si n d u c e dc e l1d e a t ho fe el isf r o mc o l o s s o m ab r a c h y p o m u ma b s t r a c t ：ac e llli n eo fc o o s s o m ab r a c h y p o m u m ( c b t ) ，w h ic hh a sn o n t o l e r a n to fc o l d - s t r e s s ，w a su s e dt os t u d yt h ed e a t hm e c h a n i s mu n d e rl o wt e m p e r a t u r e sa tt h e1 e v e lo fc y t o b i o l o g y m e t h o d ：c b tc u l t u r e di n3 7 w e r eu s e da sc o n t r 0 1 f o rt h ee x p e r i m e n t a lc e l l s ，w a sc b te x p o s u r e dt o1 0 o r3 f o r3 h ，6 h ，1 2 h ，2 4 ，4 8 ho f7 2 hr e s p e c t i v e l y t h ea d u l tf i s h e so fc o l o s s o m ab r a c h y p o m u mw e r ea l s or a i s e di nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sf o ra tl e a s t6 h r s ，t h e nw e r ed i s s e c t e df o rad e t a il e de x a m i n a t i o no ra n a l y s is t h ea p p r o a c h e su s e di nt h es t u d yi n c l u d e d ：o b s e r v i n gt h em i c r o s t r u c t u r ea n du l t r a s t r u c t u r eo ft h ec e l l1 i n e o fc o l o s s o m ab r a c h y p o m u m ( c b t ) a n dt h ec e l ll i n eo fc a r p ( c p ) s t r e s s e dl o wt e m p e r a t u r e su n d e rf l u o r o s c o p ya n dt e m ；a n a l y s i so fd n ad a m a g ei nt h ec u l t u r e dc e l l su n d e rt e m p e r a t u r e ss t r e s sb yd n ag e le l e c t r o p h o r e s i s d n ac o n t e n t i n t r a c e l l u l a rc a ”a n dm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a li nc u l t u r e dc b to rc pw e r ea n a l y z e d 0 2 一c o n t e n tw a su s e i n gn b tm e t h o d ，a c t i v i t yo fn o dw a sd e t e r m i n e db a s e do na u t o o x i d a t i o no fp y r o g a l l 0 1 r e s u l t ss h o w e d ：( 1 ) c b tc e l ld e a t hi nl o wt e m p r a t u r e si sa c c o m p a n i e db yc h a r a c t e r i s t i cc h a n g e s ，s u c ha s ，r e d u c e dc e l ls l z e ，d is t a r t e dn u c l e u s ，5c h r o m a t i nc o n d e n s a t i o na n dm a r g i n a t i o na n dc e i l ( c y t o p l a s m i c )v a c u 0 1 i z a t i o n ：c e l im o r t a l i t ya n dc a 2 c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s ea l o n gw i t ht i m ep a s s e di nl o wt e m p e r a t u r e m it o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a la n d0 2 一i n c r e a s e da tf i r s t ，a n dt h e nd e c r e a s e d a c t i v it i e so fs o dd e c r e a s e da tf i r s t ，f o l l o w e db ys i g n i f i c a n ti n c r e a s i n ga n df i n a l l yd e p r e s s e d n od n al a d d e rw h i c hd e n o t ea p o p t o s i ss h o w e d ( 2 ) t h em o r t a l i t yo fc pc e l li n1 0 cw e r ei n c r e a s i n gd i r e c t l yr e l a t e dw i t ht h et i m ei nt h el o wt e m p e r a t u r ea f t e r1 2 0 ds o m ec pc e l l sd i e di nt h ew a yo fa p o p t o s i s m o s tn u c l e u so fc e l l sw e r ec o n d e n s e d ，a n dc h r o m o s o m ew a sm a r g i n a t e db e s i d et h en u c l e u si n n e rm e m b r a n e ，c e l ls i z e sw e r er e d u c e d ，d n al a d d e rs h o w e di nd n ag e le l e c t r o p h o r e s i s ( 3 ) a c t i v i t yo fs o di nb r a i n ，l i v e r ，k i d n e y ，m u s c l ea n db r a n c h i ao fc u l t u r e df i s hc o o s s o m 8b r a c h y p o m u m t h et o t a l1 e v e lo fa c t i v i t i e so fs o di nt h ef i s hr i s e dw i t ht e m p e r a t u r er i s i n g t h ed a t ai n d i c a t e dt h a ts o da c t i v i t yi nb r a i nb e c o m es t r o n g e ra te a r l yt i m ew h e nt h et e m p e r a t u r ef a l1d o w n ，a n dt h e nd e c r e a s e d ( 4 ) t h ec o l o ro ft h ef i s h e si nl o wt e m p e r a t u r eb e c o m ed a r k e r ，t h e nc h a n g e db r i g h tw h e nw et r a n s f e r r e dt h ef i s h e si nh i g ht e m p e r a t u r e a f t e rt h r e ed a y s ，t h ec o l o ro ft h e s ef i s h e sr e c o v e r e d t h el i p o i di nt h ef i s h e s b r a i nh a db e e nv i s c i d w h e nt h et e m p e r a t u r ea t17 a n db e c o m em o r es o lidw it ht h et e m p r a t u r ew e n td o w mu n c e a si n g l y c o n c l u s i o n s ：( 1 ) t h er e s u l t si n d i c a t et h a tc e l ld e a t ho ft h ec e l ll i n ef r o mc o l o s s o m ab r a c h y p o m u mu n d e rc o l d s t r e s si sl i k e l yt ob ean o n a p o p t o t i cp r o g r a mc e l ld e a t h ( 2 ) t h ec pc e l l sc o n s e r v e di ni o cf a i1t or e c u l t u r eb e c a u s eo fa p o p o t o s i so fc p ( 3 ) t h e r ea r ed i f f e r e n tm e c h a n i s m so fd e a t hi nl o wt e m p e r a t u r e s ( 4 ) t h ea c t i v i t yo fs o di nt h ef i s h e sw e n th ig h h e rw h e nt h ec u l t u r et e m p e r a t u r er o s e i ti n d i c a t e dm e t a b o l i s mo ft h ef i s h e sw a si n c r e a s e dw i t ht e m p e r a t u r er i s i n g l o wt e m p e r a t u r e sm a yr e s u l t e di nf i s hh y p o x i ai nb r a i n ，s h o w e de n h a n c e ds o da c t i v i t y 61 材料与方法1 1 材料1 1 1 细胞系：淡水白鲳c b t 细胞系( 张铭等，2 0 0 i ) ，草鱼c p 细胞系( 浙江省淡水水产研究所张念慈、杨广智赠送)1 i 2 培养基和试剂t c l 9 9 培养基为美国g i b c o 公司产品，核糖核酸酶a 、蛋白酶k 、胰蛋白酶、d n am a r k 、碘化丙啶( p i ) 、h o c h e s 3 3 2 5 8 ，均为s i g m a 公司产品，超级小牛血清( 灭活，无支原体) 为杭州市四季青生物工程材料公司产品，其它试剂均为国产分析纯。1 1 3 主要仪器和用具透射电镜( j e m 一1 2 0 0 e x 型日本) 、电泳仪( s c r 一3 型国产) 、相差倒置荧光显微镜( n i k o n ) 、7 2 2 型紫外分光光度计、8 5 0 型日立荧光分光光度计、酶标仪( d g 3 0 2 2 国产) 、c o 。细胞培养箱( d - 6 3 4 5 0 ，h a n a u 德国) 、电子天平( b s i i o s 德国) 、超净台、超净水器、超低温冰箱、液氮罐、冷冻离心机、低速离一c , $ j t 、细胞培养瓶、试管、离心管、移液管、移液枪等等。1 2 方法1 2 1 冷冻细胞恢复及传代培养n 盯1 2 1 1 主要试剂及配制：1 9 9 培养液：l 包t c1 9 9 粉剂溶解于1 0 0 0 m l 无离子水；加链霉素和青霉素，终浓度分别为l o o u m l ；加碳酸氢钠2 5 m g ，完全溶解，无菌抽滤，4 c 保存。细胞培养使用前加1 5 小牛血清。用5 6 n a h c o 。溶液或1 mh c i 溶液调节p h 值至7 0 7 2 。平衡盐溶液p b s 和d u l b e c c o ：p b sd u l b e c c on a c l8 98 9k c l0 2 90 2 9c a c l20 1 9m g c i2 6 h 2 00 1 9n a 2 h p o j h , o1 5 6 9n a 2 h p 0 4 2 h 2 01 4 2 9k h ：p o 0 2 90 2 9酚红0 0 2 9上述药品依序溶解在l o o o m l 双蒸水中。分装于盐瓶中，高压蒸气消毒，1 5磅2 0 m i n ，4 贮存。0 ，2 5 胰蛋白酶液胰蛋白酶0 2 5 9p b si o o m充分溶解后用0 2 2 u m 微孔滤膜过滤，一2 0 。c 保存。1 2 1 2 操作步骤玻璃器皿经高压蒸气( 2 0 磅2 0 m i n ) 或高温( 1 6 0 。c ，2 h r ) 干燥灭菌。培养瓶或试剂瓶外表用新吉尔灭( 终浓度0 1 ) 擦洗后进入无菌室。从液氮罐中按编号取出冻存管，每管细胞约2 1 0 6 个管，迅速放入4 0 c 水中，不断搅动，直至冻存管内细胞液全部解冻。用0 1 的新吉尔灭消毒冻存管外表，进入无菌室，将细胞悬液移入离心管，1 5 0 0 r m p ，离心3 m i n ，小心去上清液，加完全培养液1 2 m l ，用移液管移入6 孔克隆板中，置于3 7 。c 恒温5 c 0 z培养箱中静止培养。同时，取少量细胞用台盼兰染色，在显微镜下计活细胞与死细胞数。第二天在倒置相差显微镜下观察其生长情况，更换培养液，继续培养。细胞恢复培养3 5 天后即长成单层，此时进行传代培养。将培养液弃去，再加入适量预热的液消化液。当大多数细胞开始变圆但未离壁时。去消化液，用加入培养液吹打，使细胞离壁，根据细胞量分瓶培养，一般l o o m l 细胞瓶每瓶加5 m 培养液。3 7 c 恒温培养箱中静止培养。每天观察细胞生长情况，至细胞长满壁，再传代，周而复始。1 2 2 低温和镉离子( c d ”) 处理。”细胞经传代培养，3 4 天后选生长情况良好，指数生长期的细胞，将细胞分别放入1 0 v 和3 c 培养箱内培养，分别处理6 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 。1 0 0 氯化镉( c d c l ：) 贮存液0 i m m o l l ：0 0 1 9 3 9c d c i 。+ l o m l 去离子水，经高压灭菌。在5 m l 培养液中分别加0 0 5 m l 、0 1 m l 、0 2 m l 的氯化镉贮存液，使培养液中c r 终浓度分别为5 x 加一m m o l l 、1xi 0 m m o l l 、2 1 0m m o l l ，继续培养3 h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 。1 2 3 台盼蓝染色检测细胞膜完整性。”0 4 台盼蓝工作液：称取0 4 9 台盼蓝，加少量双蒸水研磨，然后加p b s 定容至l o o m l ，滤纸过滤，4 保存。贴壁细胞可直接染色。或消化离心收集细胞，加台盼蓝工作液制成细胞悬液，一般1 1 0 6 细 g n m l 。3 分纠呐在显微镜观察，记录。显微镜下可见死细胞被染成深色，膜完整的细胞拒染。1 2 4 荧光染色观察细胞“删在荧光显微镜下，可染色活细胞的核呈弥散均匀荧光，凋【二= 细胞的细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒或块状荧光，如果在一个细胞内见到3 个或3 个以上的d n a 荧光碎片被认为是凋亡细胞。1 2 4 i 吖啶橙( a o )吖啶橙工作液：l m g 吖啶橙橙溶解于1 0 0 m lp b s 中，滤过，4 避光保存。消化、离心收集细胞，p b s 洗2 次。离心去上清。加1 2 滴吖啶橙工作液，滴片，直接加盖玻片，荧光显微镜观察摄录。选用激发滤片b v 或u ，阻断滤片用4 7 5 n m 或5 1 0 n m ( 以下同) 。1 2 4 2h o c h e s t 3 3 2 5 8h o e c h s t 3 3 2 5 8 工作液：用去离子水配成l o o u g m l ，4 c 避光保存。培养细胞或细胞爬片。培养细胞消化、离心。p b s 洗2 次。离心，去上清液。加h o e c h s t 3 3 2 5 8 染色液，l o m i n 。盖上盖玻片，荧光显微镜观察。爬片取出后用p b s 洗1 次。加滴h o e c h s t 3 3 2 5 8 染色液，染色l o m i n ，加盖玻片，荧光显微镜观察。1 2 4 3a o 与h o c h e s t 3 3 2 5 8 双染在制成的细胞玻片上先加】滴h o e c h s t 3 3 2 5 8 工作液，l o m j n 内荧光显微镜观察，再加1 滴a o 工作液，从盖玻片边缘渐渗入，直接在荧光显微镜下观察。1 2 4 4 碘化丙啶( p i ) 与h o c h e s t 3 3 2 5 8 双染p i 工作液：将p i 溶于p b s ( p h 7 4 ) 中，终浓度为】o o u g m l 。棕色瓶4 c 避光保存。在制成的细胞玻片上先加1 滴p i 工作液，l o m i n 内荧光显微镜观察，再加i滴h o c h e s t 3 3 2 5 8 工作液从盖玻片边缘渐渗入，5 m i n 后在荧光显微镜下观察。1 2 5 透射电镜形态观察1 2 5 1 主要试剂配制固定液( 2 5 戊二醛磷酸缓冲液) ：0 2 m o l l 磷酸缓冲液5 0 m l ，2 5 戊二醛水溶液1 0 m l ，双蒸馏水4 0 m l ，p h7 4 ，44 c 冰箱保存。1 锇酸( o s o 。) 固定液：a 溶液l o m l ，b 溶液l o m l 。a 溶液( 2 锇酸) ：锇酸1 9 溶于5 0 m l 双蒸馏水中。b 溶液( o 2 m o l l 磷酸缓冲液) ：磷酸二氢钠2 6 9 ，磷酸氢二钠2 9 9 ，双蒸水加至5 0 0 m l 。置于4 。c 冰箱内避光保存。( 1 周后才能使用)1 2 5 2 电镜制片操作步骤琼脂离心管的制各：l o o m l 双蒸水加2 9 琼脂，加热溶解，配成2 浓度琼脂。在一个l o m l 的锥形离心管中央竖放一根下端尖细的竹棒，灌入溶化的琼脂，凝固后抽出竹棒，备用。收集细胞，置离心管中离心1 0 0 0 r p m ，8 m i n 。用p b sl m l 重悬细胞。将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。离心，1 5 0 0 r p m ，5 m i n ，使细胞成团。去上清，加入2 5 戊二醛固定液固定细胞团，以免细胞团散开。取出离心管内的琼脂，仔细切下尖槽内含细胞团的琼脂块。将其投入含戊二醛固定液的小瓶中，4 c 固定。2 h 后离心去上清，用p b s 缓冲液洗1 次。】锇酸后固定3 0 6 0 m i n 。然后用乙醇梯度( 从5 0 至1 0 0 ) 脱水，s p u r r s 低粘度环氧树脂包埋后，用r e i c h e r t j u n gu l t r a c u te 型超薄切片机切取0 0 7um 超薄切片，并粘贴在预先覆有支持膜的铜网上，最后经醋酸双氧铀和柠檬酸铅各染色1 5 m i n ，在透射电镜下观察细胞核或细胞的形态特征。1 2 6 流式细胞仪测定细胞凋亡百分率。7 3 “收集细胞约l 1 0 6 个m l ，经p b s 离，凸冲洗2 次，以7 0 乙醇固定过夜，以p b s 离心冲洗去乙醇，加入核糖核酸酶a ( 终浓度6 0ug m 1 ) ，摇匀，3 7 c 温育3 0 m i n ，加入p i ( 终浓度5 0 u g m 1 ) ，4 暗染3 0 m i n ，用c o u l t e re p i c sx l 型流式细胞仪测定p i 荧光强度，以s u b g l 峰的细胞百分率为凋亡百分率1 2 7d n a 电泳1 2 7 1d n a 提取取2 t 0 6 个细抱m l ，2 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，去上清，加t e 缓冲液洗涤后，细胞在离心管内悬浮于l m l 内含1 0m m o lt r i sh c l ( p h 8 0 ) 、3 m m o le d t a 、l o m m 0 11 0n a e l 、1 s d s 的d n a 抽提缓冲液中，再补充2 0 u gr n a a s e 及l o o g 蛋白酶k ，用玻棒轻搅使溶液至粘稠状，置于3 7 。c 温箱中1 2 h 。待d n a 抽提缓冲液冷却至室温后，加入等容积饱和酚溶液，温和地上下转动离心管混匀两相，1 2 0 0 0 离心l o m i n ，小心吸出上层粘稠水相，移至一干净e p p e n d o r f 离心管内，加入等体积饱和酚溶液再抽提一次后，然后再用l ：l 的氯仿：酚溶液抽提次后，将上层水相移入新e p p e n d o r f 管内，加入0 3 m o l 乙酸钠一乙醇溶液沉淀d n a ，轻轻反复翻转离心管后，准确加入2 倍容积的冰冷无水乙醇置冰格中3 0 m i n ，随即在4 c 下，1 2 0 0 0 离心l o m i n 收取d n a ，弃去无水乙醇后，用7 0 乙醇混匀漂洗3次开盖，室温放置1 5 m i n 让乙醇挥发，加入l m m o le d t a 、l o m m o lt r i s h c i ( p h 7 8 ) t e 缓冲液，使d n a 溶解，置4 冷藏。1 2 7 2d n a 琼脂糖凝胶电泳取i o “l 提取的d n a 样品( 含1ugo n a 量) 与0 2 5 溴酚兰和4 0 蔗糖溶液混匀后，加入1 5 琼脂糖凝胶( 内含0 5ug m 1 溴乙锭) 样品槽内，电泳缓冲液l m m o l le d t a ( p h 8 0 ) 和4 5 m m o l lt r i s 一硼酸，5 0 v 电泳i 5 h后，取出电泳胶块在紫外灯下观察d n a 条带，并用d n a 凝胶电泳摄像系统记录。1 2 8 线粒体膜电位测定”若丹明1 2 3 ( r h l 2 3 ) 贮存液：l o u g m l ( p b s 配成) ，棕色瓶4 c 避光保存。收集细胞1 1 0 6 ，用新鲜培养液重悬，加入r h l 2 3 ( 终浓度5ug m 1 ) ，3 7 。c温育2 0m i n ，预冷p b s 洗3 次，用荧光分光光度计测定细胞荧光强度( 入e x = 5 0 5n m ，入e m 一5 2 4n m ) ，以r h l 2 3 荧光强度表示线粒体膜电位。1 2 9 细胞内游离钙离子测定“荧光染色液：先配制1 o m m o l l 的荧光探针i n d o - - 1 - - a m 贮存液。用二甲亚砜将该荧光探针溶解后，将其贮存于低温冰箱中。正式测试前，取出贮存液，让其自然溶化，用0 2 m o l l 磷酸缓冲液( p h7 4 ) 将其稀释到l u m o l l 的浓度，即荧光探针染色液。取培养好的细胞1 1 0 5 ，先把培养液弃去，用0 2 m o l l 磷酸缓冲液洗2 次，用无血清1 9 9 培养液制成单细胞悬液，通过计数，使细胞密度为1 0 6 个m 1 。取1 5 m l 上述细胞悬液，加入2 0 pm o l l 的i n d o l - a m 0 jd m s o 配制) 0 5 m l ，即使其终浓度为5um o l l 。然后于3 7 度保温4 0 分钟。再用p b s 洗2 次。用流式细胞仪测定细胞荧光强度( 入e x = 3 4 8 8 n m ，入e m = 4 0 5 n m ) ，以荧光强度表示胞内游离钙含量1 2 1 0 细胞内超氧阴离予自由基( o 。) 的测定”c b t 细胞经低温胁迫处理后，转移到9 6 孔培养板，1 1 0 3 细胞孔，各加n b t( 1 m g m i ) 1 0 0ul 孔，3 7 。c 培养l h r ，3 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，去上清，另甲醇2 0 0l al 孔固定，用p b s 洗细胞3 次，离心去上清后加2 m o l l 的k o h 液1 2 0ul 孔和d m s 0 1 4 0 “1 孔，立即混匀，6 3 0 h m 波长测0 ) 值，同时设p b s 空白组。以o d 6 3 0 n m来表示0 ：、的水平。1 2 1 ls o d 活性测定“2 “”1 2 1 1 1 淡水白鲳成体不同组织s o d 活性试剂配制：邻苯三酚溶液：用0 0 5 m o l lt l c l 配制4 5 m m o l l 邻苯三酚。反应缓冲液：用l v n o l l 二乙三氨五乙酸配制4 0 m m o l 巴比妥钠一h e lp h8 6反应终止液：5 0 9 l 维生素c粗酶液提取解剖鱼体取各组织( 脑、肝、肾、肌、鳃、鳍、心) 各若干克，按定比例( 通常1 ：l l ：3 ) 加入磷酸缓冲液p h 7 8 ，2 6 、3 0 。c 常温下研磨，1 5 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清液。测定步骤实验前将已配制的试剂置于2 5 c 水浴保持恒温。在整个实验中反应过程保持在2 5 ( 2 恒温条件下。空白对照液：在2 0 m l 试管中加入9 m l 反应缓冲液，5 u l 反应终止液，作为对照，将7 2 2 分光光度计4 2 0 h m 波长处的吸光度调为0 。底色测定：在2 0 m l 试管中加入9 m l 反应缓冲液，加入f o u l 的粗酶液，测定4 2 0 n m 波长处的吸光度a s 。自氧化率测定：在2 0 m l 试管中加入9 m l 反应缓冲液，加入f o u l 邻苯三酚溶液的同时准确计时3 m i n ，立即加入5 0 u 1 的反应终止液。随即倒入3 c m 比色杯，测定4 2 0 n m 波长处的吸光度a 。酶活性测定及计算在2 0 m l 试管中加入9 m l 反应缓冲液，加入5 0 u i 的粗酶液。然后在加入 o u l 邻苯三酚溶液的同时准确计时3 m i n ，立即加入5 0 u l 的反应终止液。随即倒入3 c m比色杯，测定4 2 0 n m 波长处的吸光度 s 。酶活性( u r a g ) = a o - ( a s - a s ) 笪三18a ov31 2 儿2 培养细胞s o d 活性测定取1 6 支试管分为8 组，每一组2 支试管，按下表加入试剂。、虽组空白自氧常温6 h1 2 h2 4 h4 8 h7 2 h试剂( m l y 化1 0 0 m mt r i s h c l4 54 54 54 54 54 54 54 5缓冲液p h 8 2去离子水4 24 23 23 23 23 23 23 2酶液1 01 01 01 o1 o1 01 0 m mh c l0 3，?ff2 5 。c 水浴中2 0 分钟3 州邻苯三酚( 预?o 3o 3o 3o 30 3o 3o 3热)总体积9 09 09 09 ，09 09 o9 09 0然后以空白管为对照调零，在3 2 5 n m 紫外处测定各组0 d 3 2 5 n m 值，并绘出邻苯三酚自氧化速率以及常温及低温处理的培养细胞中s o d 对邻苯三酚自氧化的抑制情况。每1 0 7 细胞中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达5 0 的酶量定义为一个酶单位。s o d 酶活力( 1 u m 1 ) 计算公式为：( o b a o d b ) o d av inv 11 0 0 v 2反应液总体积( m 1 ) ，为9 o m lv 2 一一测定样品体积( m 1 ) ，为2 o m ln 一参加反应的细胞数为7 7 3 l 1 0 7 2 , - - 5 = 3 0 9 2 4 1 0 7i 2 1 2 低温对淡水白鲳生活生长的影响淡水白鲳成鱼。养殖水温从3 0 8 ，每天下降2 ，每一温度点误差为l 。每一温度点试验时间为1 0 天。常规的养殖管理。水温从2 2 下降至1 5 c ，3 5 m i n ，1 5 。c4h ，然后将2 尾鱼直接放回2 2 c 。其余2 尾鱼从1 5 。c 自然升温到1 8 c ，1 5 h 。观察形态变化、活动情况，并进行解剖观察。2 结果2 1 相差显微镜观察细胞生长情况图2 ：c p 细胞：i o c 。1 2 0 d 。( 1 0 倍)c b t 细胞个体显著大于c p 细胞。在同样培养条件下c b t 细胞生长速度较c p慢，通常一传二需要5 6 天才能爬满瓶壁，而c p 细胞3 4 天即滴瓶。2 2 台盼蓝染色检测细胞的活性图3c b t 细胞检活：a ：冻存恢复细胞，b ：1 0 ( 2 ，4 8 h ，c ：7 2 h ，i o cc b t 细胞冻存恢复时经台盼兰染色计算细胞成活率为8 6 。经低温1 0，4 8 h 处理c b t 细胞成活率约为7 0 ，7 2 h 后成活率降至5 0 以下。图3 中b 和c 为低温处理后离壁离壁细胞，但仍为台盼兰拒染。2 3 荧光染色观察低温下细胞及其核的变化图4 荧光染色显示i o c 下不同时间c b t 细胞及其核的变化。a ：正常c b t 细胞h o e c h s t 3 3 2 5 8染色( 滤片4 7 5 n m ) ，2 0 倍；b ：正常c b t 细胞，b o e c h s t 3 3 2 5 8 与a 0 染色，2 0 倍；c ：2 4 h的离壁细胞，a o 染色，1 0 倍d ：3 6 h 的离壁细胞，a o 染色2 0 倍。e ：7 2 h ，b o e c h s t 3 3 2 5 8染色( 滤片5 1 0 n m ) 2 0 倍图5 ：荧光染色显示c b t 在3 c 下不同时间细胞核的变化a ：正常c b t 细胞核4 0 倍，b ：2 h4 0 倍，c ：4 h4 0 倍，d ：6 h4 0 倍。e ：1 2 h4 0 倍，f ：2 0 h4 0 倍。1 6通常贴壁生长的细胞