（动物学专业论文）硫化物对中华绒螯蟹（eriocheir+sinensis）雌性亲体胁迫效应的研究.pdf

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高而降低，且随暴露时间的延长，各处理组中c c o 活性不断下降；血糖浓度和 血淋巴中乳酸含量迅速升高。慢性胁迫下，血淋巴中氧合血蓝蛋白含量下降，导 致机体携氧能力降低。 抗氧化能力方面，硫化物胁迫在短期内可使河蟹血淋巴和鳃组织中超氧化物 歧化酶( s o d ) 活性升高，表现出“毒物兴奋效应”。随着暴露时间延长至1 0 d ， 这种兴奋效应逐渐消失，血淋巴中s o d 活性均逐渐下降。高浓度硫化物胁迫抑 制血淋巴s o d 活性，使机体对超氧阴离子的清除能力下降，从而在一定程度上 降低了机体的免疫力。血淋巴中丙二醛( m d a ) 含量随硫化物胁迫浓度的升高 而升高，且随胁迫时间的延长在组织中的累积量增大，说明硫化物胁迫使机体脂 质过氧化程度加剧。 卵巢发育方面，不同p h 条件下各处理组的g s i 在3 0 d 时均低于对照组，其 中h s 组显著低于对照组( p o 0 5 ) 。在各取样时间点，所有处理组蟹卵巢的l v 含量均低于对照组，且m s 和h s 组在前2 0 d 显著低于对照组，但这种差异将随 时间的推移而逐渐减小。各处理组蟹的卵巢l v 总含量始终低于对照组，且这种 中文摘要 差异随时阃的推移而逐渐增大。h s 组肝胰腺中胆固醇含量有明显的下降趋势。 结果表明，硫化物胁迫对河蟹卵巢发育的影响有两方面原因，其一，硫化物破坏 了机体正常能量代谢和物质的合成、积累，进而干扰卵黄磷蛋合成和积累，影响 河蟹的卵巢发育；其二，硫化物胁迫造成机体胆固醇积累减少，抑制性腺发育相 关激素合成的，从而使河蟹的卵巢成熟滞后。相比之下，弱酸条件下水体中硫化 物的毒性作用有所增强。 环境胁迫除了可影响机体的生理生化反应外，还会在细胞水平上引发一系列 变化。采用w e s t e m b l o t t i n g 法研究硫化物胁迫对河蟹鳃组织中h s p 7 0 表达影响 的结果表明，河蟹经硫化物急性胁迫3 h 时便急剧上升，继续上升至6 h 时h s p 7 0 蛋白的表达量达到最大值，为对照组表达量的3 倍以上，随后出现下降趋势，但 整体仍保持在较高水平；低浓度硫化物对河蟹h s p 7 0 表达的影响仅表现在胁迫 初期，1 2 h 后恢复到正常水平，而且m s 组和h s 组河蟹h s p 7 0 的表达量始终远 高于对照组和l s 组。因此应激蛋白能在生物体受到严重危害前，作为早期的预 警标志应用于机体生理状况的评价中。 关键词；中华绒螯蟹；硫化物；胁迫；半数致死浓度；细胞色素c 氧化酶； 血糖；乳酸；血蓝蛋白；超氧化物歧化酶；丙二醛；卵巢发育；卵黄磷蛋白；热 应激蛋白7 0 - - 2 s t u d i e so rt h es t r e s se f f e c to fs u l f i d eo na d u l tc h i n e s e m i t t e n - h a n d e dc r a b e r i o c h e i rs i n e n s i sf e m a l e a b s t r a c t a sat o x i c a n t , s u l f i d em a yi n f l u e n c et h eh e a l t h , s u r v i v a l ，p r o d u c t i v i t ya n d d i s t r i b u t i o no fa q u a t i co r g a n i s m s u n d c rn a t u r a lc o n d i t i o n si ti sp m d u e e db yt h e a n a e r o b i cd e c o m p o s i t i o no fo r g a n i cm a t e r i a l si nt h es e d i m e n t s h o w e v c r , t h et o x i c i t y o fs u l f i d et ot h ec h i n e s em i t t e n - h a n d e dc r a b , es i n e n s i s , w h i c hi se c o n o m i c a l l y i m p o r t a n tc r u s t a c e a n , h a sn o tb e e nf u l l ye v a l u a t e d h e n c e ，a na t t e m p tw a sm a d et o s t u d yt h et o x i ce f f e c to f s f l f i d eo nc r a b 砒a d u l ts t a g e ，i n c l u d i n gt h ea c u t et o x i ce f f e c t ， e f f e c t so n r e s p i r a t i o nm e t a b o l i s m , a n t i o x i d a n ta b i l i t y , o v a r ym a t u r ea n dc e l l u l a r c h a n g e s t h ep u r p o s e i st o p r o v i d em o r eb a s i c i n f o r m a t i o nf o ra q u a t i ca n i m a l t o x i c o l o g ya n dr e f e r e n c e s f o re s t a b l i s h i n g t h e s y s t e mo fs t r e s s e v a l u a t i o ni n c r u s t a c e a n ，w h i c hc o u l db o o s tt h es u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n to f c r u s t a c e a na q u a c u l t u r e t h er e s u l t so fa c u t et o x i c i t yt of e m a l ea d u l te s i n e m i ss h o w e dt h a tt h e2 4 h ， 4 8 h - ，7 2 h - ，a n d9 6 h - l c 5 0o f s u l f i d ew e r e1 2 5 1 ，6 7 3 ，5 6 6 ，3 0 9m g lr e s p e c t i v e l y t h es a f ec o n c e n t r a t i o n o f s u l f i d ew a so 3 1m 班一 b a s e do nt h er e s u l to f9 6 h l c 5 0 ，t h r e et r e a t m e n t so fs u l f i d e ( c o n t r o l ，0 1 0 - ， o 3 3 - a n d1 0 一m g r l ) w e r ed e s i g n e di na c u t es t r e s se x p e r i m e n ta n ds a m p l e da t3 h ，6 h , 1 2 h a n d2 4 h t h e r ea l es i xt r e a t m e n t s ( l s l ( i s 】0 i m g r lp h 6 5 ) ，m s l ( i s 】o 3 3m g c l p h6 5 ) ，h s l ( s 】1 0 m g l p h 6 5 ) ，l s 2 ( 【s 】0 1 m e e t , p h8 5 ) ，m s 2 ( 【s 0 3 3 m g lp h8 5 ) a n dh s 2 ( 【s 】1 0 m g ，lp h8 5 ) ) a n do n ec o n t r o lg r o u p i nc l l r o m cs t r e s s e x p e r i m e ma n ds a m p l e da t4 d ，1 0 d ，2 0 da n d3 0 d r e s e t ss h o w e dt h a tt h ec c oa c t i v i t yi ng i l lt u r n e dd o w nw i t ht h ei n c r e a s eo f s u l f i d ec o n c e n t r a t i o ni na c u t es t r e s sa n dt h ei td e c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht i m ee l a p s e d ， s ot h ee n e r g yw a sp r o d u c e db ya n a e r o b i cm e t a b o l i cr o u t e s ，w h i c hc o u l dl e a dt ot h e e l e v a t i o no fg l u c o s ea n dl a c t a t el e v e l si nh a e m o l y m p h c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l ，t h e l e v e lo fo x y h e m o c y n i ni nh a e m o l y m p hd e c r e a s e db yc h r o n i cs u l f i d ee x p o s u r e ，a n d t h e nl o w e r e dt h eo x y g e n - c a r r y i n gc a p a c i t yi i lh a e m o l y m p h a st ot h ea n t i o x i d a n ta b i l i t y ，t h ea c t i v i t yo fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) i n h e p a t o p a n c r e a sa n dg i l lw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da f t e rl o w e rc o n c e n t r a t i o n o f a m b i e n ts u l f i d ee x p o s u r ei ns h o r tt i m e , w h i c he x h i b i t e dt h ep h e n o m e n o no f p o i s o n - i n t o x i c a t i o n - e f f e c t w i mt i m ee l a p s e d , t h ei n t o x i c a t i o np h e n o m e n o nw a s 一3 一 d i m i n i s h e dt h es o da c t i v i t yg r a d u a l l yd e c r e a s e d h o w e v e rt h es o da c t i v i t yw a s d e c r e a s e db yh i g h e rc o n c e n t r a t i o no fa m b i e n ts u l f i d ee x p o s u r e ，w h i c hc o u l dd e p r e s s t h ea b i l i t yo fs c a v e n g i n gs u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l sa n dd e p r e s s e dt h e a b i l i t yo f i m m u n i t ya ts o m ed e g r e e f u r t h e r m o r e ，t h ea c c u m u l a t i o no f m a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) i nh a e m o l y m p hw a si n c r e a s e dw i t ha m b i e n ts u l f i d ei n c r e a s e da n dw i t ht i m ee l a p s e d ， w h i c he x a c u l a t el i p i dp e r o x i d a t i o n i n p r e s e n ts t u d y ，e l i s aw a su s e d t om e a s u l 吧t h eo v a r i a n l i p o v i t e l l i n c o n c e n t r a t i o n r e s u l t sh a v es h o w e dt h a to v a r i a ni i p o v i t e l l i nc o n c e n t r a t i o na n do v a r i a n t o t a ll i p o v i t e l l i nc o n t e n ti nu l lt r e a t m e n t sw e r el o w e rt h a nt h o s ei nc o n t r o la ta l l i n t e r v a l s as i g n i f i c a n td e c r e a s e ( p 0 0 5 ) o fg s iw a sr e g i s t c r e di nh sa t3 0 d , a n da s i g n i f i c a n td e c r e a s e ( p 9 0 ，硫化氢 1 0 ，$ 2 - 0 0 1 ，而海底空隙水附近p h 约为6 0 6 5 ，硫化物 三种形式中h s 一 7 0 ，几乎不存在。 硫化氢各组成形式都有着重要的作用，h 2 s 不带电荷，能透过细胞膜，进入 组织造成动物体潜在的伤害；h s 一是硫化氢转化的中间体，控制着各组分的平衡； s 2 一造成黑色硫化物沉积于水体底质，这是去除水体中硫化物的策略之一。 图2 淡水中不同p h 下硫化物的组成比例 f i g 2s p e c i a t i o no f h y d r o g e ns u l f i d ea saf u n c t i o no f p hi nf r e s h w a t e r o 鑫 f r a c t i o n p m i m n t0 6 o _ 酬，k 4曩70口1 01 1 21 3t 4 o h 一8 一 前言 三、硫化物的毒性 1 对机体的整个影响 对于硫化物毒性机理的研究发现，鱼类中硫化物急性毒性首先是刺激呼吸和 循环系统，致使两者功能都衰退( t o r r a n s1 9 8 2 ，b a g a r i n a o1 9 8 9 ) 。2 0 0 c 条件下斑 点叉尾鲴l c t a l u r u s p u n c t a t u s 暴露于硫化物为1 6 u m 的水体中，l m i n 内心率从每 分钟8 8 次升至1 2 8 次，随后呼吸率逐渐减缓，从每分钟1 4 0 次降至1 2 8 次，但 是呼吸强度增加：5 分钟后，心率降至每分钟6 6 次，呼吸率减缓至每分钟8 8 次， 呼吸变弱并无规律；7 分钟后呼吸停止( t o r r a n s1 9 8 2 ) 。进一步研究发现，硫化 物对淡水鱼生理效应的影响是多方面的，包括：( 1 ) 低浓度硫化物( o 0 2 0 4 u m ) 暴露下，由于硫化物的抗菌作用而增强动物的存活率和生长；( 2 ) 硫化物浓度超 过0 4 5 u m 。动物存活率和生长降低；( 3 ) 游泳持久力下降；( 4 ) 组织发炎和坏 死；( 5 ) 食物消耗率和转化率降低；( 6 ) 抑制产卵和减少产卵量；( 7 ) 卵的存活 率下降，卵径缩小，幼体致畸率提高( a d e l m a n1 9 7 0 ，o s e i d1 9 7 2 ，s m i t h1 9 7 4 ， 1 9 7 6 ，r e y n o l d s1 9 8 0 ) 。在印度恒河中的研究发现，性成熟的鲫鱼c y p r i n u s c a r p i o 暴露于2 8 u m 硫化氢下3 0 d ，肝功能失调导致肝体指数下降( k u m a r1 9 8 8 ) 。 2 生化水平的毒性效应 硫化物先在细胞分子产生影响，而后才导致硫化物对机体整体水平的效应。 k h a n ( 1 9 9 0 ) 划分了硫化物在动物体内生化效应；( 1 ) 初级效应，抑制细胞色 素c 氧化酶和氧化磷酸化作用，导致组织缺氧和能量损失：( 2 ) 次级效应，酶 活性、代谢物及相关因子的改变导致代谢损伤；同时还将产生超氧阴离子和改变 细胞膜渗透性，导致器官功能紊乱。 硫化物抑制c c o 活性是由于直接干扰其中的金属离子。h s 一能与氧化型细 胞色素c 氧化酶的f d + 结合而阻碍其还原为含f e z + 的还原型细胞色素c 氧化酶， 对线粒体电子传递链中的细胞色素c 氧化酶产生可逆性抑制( n i c h o l l s1 9 7 5 。 p e t e r s e n1 9 7 7 ，d e g n1 9 8 1 ) 。细胞色素c 氧化酶是线粒体电子传递链的最后一环， 也是合成a t p 的必要组分。h s 一对细胞色素c 氧化酶的抑制活性极强，甚至高 于氰化物，在浓度为l u m 时即可对5 0 的细胞色素c 氧化酶产生抑制，从而使 好氧生物线粒体的a t p 合成停止( n i c h o l l s1 9 7 5 ) 。鱼类在硫化物暴露下各种组 织中c c o 活性显著降低( t o r r a m1 9 8 2 ，b a g a r i n a o1 9 8 9 ，1 9 9 1 ) 。微量硫化氢能抑 制不同组织c c o 活性，详见表l 。c c o 位于细胞线粒体膜上，而硫化物对线粒 体呼吸也有较强的抑制作用，详见表2 。由于细胞线粒体存在一定的防御机制， 能有效地氧化低浓度的硫化氢，使抑制线粒体呼吸所需的硫化氢浓度高出c c o 活性被抑制浓度2 3 个数量级。 表1 不同物种c c o 活性抑制的硫化物浓度 ! ! ! ：! ! ! ! ! i 坐! ! ! ! ! ! ! 堕! ! 竺! 些i ! ! ! 翌! ! 1 2 竺! ! 竺翌! ! 竺! ! 箜! i ! 翌! ! ! 坚! 匹! i ! ! ： 物种酶的来源 抑型i ：；：勰硫 参考文献 表2 不同物种硫化氢提纯的线粒体的抑制和激活 ! ! ! ：坚四翌量竺! 型! ! 堂! 竺! ! 坐型i ! 竺! ! ! ! ! ! ! 型! ! i ! ! ! 堂i 墨i 坦! ! ! 鲤塑! 垫翌：i ! 坚! 匹! i 墅 物种 硫化氢浓度( u m ) 抑制激活 参考文献 硫化物的另一毒性是能够改变机体氧传递蛋白的结构。在哺乳动物和鱼类 中，高浓度硫化物导致硫合血红蛋白以及硫合肌红蛋白的产生，这是由于硫化物 共价结合于毗咯环( c a r r i c o1 9 7 8 ，p a r k1 9 8 6 ，b a g a r i n a o ，1 9 9 1 ) 。硫合血红蛋白会丧 失氧结合功能( c a r r i c o1 9 7 s ) 。然而，硫化物中毒的哺乳动物和鱼类血液中几乎不 含有硫合血红蛋白，氧传递的损伤似乎不是硫化物急性毒性的主要方面( n a t i o n a l r e s e a r c hc o u n c i l1 9 7 9 ，c u r r y1 9 8 7 ，b a g a r i n a o1 9 9 1 ) 。b a g a r i n a o ( 1 9 9 1 ) 发现除非硫 化物浓度达到1 - 5 m m ，否则鱼类的血红蛋白不会转变为硫合血红蛋白，因而依 然保持氧传递功能。硫合血红蛋白的形成与硫化物浓度、作用时间和p h 有关， 这可能能够解释鱼类活体中没有硫合血红蛋白形成。一些海洋生物对于硫化物有 一i o 较强的耐受性，海洋多毛环节动物a r e n i c o l am a r i n a 和a b a r e n i c o l aa f f i n i s 以及蠕 虫足p a c h y p t i l a 不转化血色素形成硫合血红蛋白，反之，它们的血色素还能起到 稳定和氧化硫化物的作用( w e l l s1 9 8 0 ，a r p1 9 8 5 ，1 9 8 7 ) 。 3 神经毒性 硫化物的神经毒性主要针对于脊椎动物，尤其是哺乳类。硫化氢能作用于神 经系统、眼睛和呼吸系统，视暴露时间和浓度不同，中毒症状也不同( n 1 r i s ， 1 9 7 4 ) 。这类作用主要是因为h s 一能抑制突触传导，改变离子通道活性。进一步 研究证明h s 一甚至能抑制r n a 合成，从而阻碍相关的神经介质的合成和神经细 胞的发育。硫化氢毒性作用的主要靶器官是中枢神经系统和呼吸系统，亦可伴有 心脏等多器官损害，对毒性作用最敏感的组织是脑和粘膜接触部位( b e e k1 9 8 3 ， k o m b i a n1 9 8 4 ，b e a u c h1 9 8 4 ) 。硫化氢对哺乳动物的神经毒性尤其是呼吸系统的 停滞在细胞水平上由以下三个过程：( 1 ) 脑干中氨基酸神经递质含量急速变化 ( k o m b i a n1 9 8 8 ) ；( 2 ) 抑制一元胺代谢酶一单胺氧化酶的活性，导致儿茶酚胺 和5 羟色胺上升( w a r e n y c i a1 9 8 9 ) ；( 3 ) 中断二硫键和改变膜蛋白结构从而中断 动作电位和钠通道( b e c k1 9 8 3 ，w a r e n y c i a1 9 8 9 ) 。在对甲壳动物的研究中发现，硫 化物可能破坏甲壳动物的中枢及外周神经从而影响其平衡力( j a y a m a n n e1 9 8 6 ) 。 四、本研究的目的和意义 有关硫化物对水生动物影响的研究大部分集中于急性毒性，研究对象有虹鳟 s a l m og a i r d n e r i 、北美白鲤c a t o s t o m u sc o m m e r s o n i 、鲫鱼c a r a s s i u sa u r a t u s 、鲤 鱼c y p r i n u sc a r p i o 、遮目鱼c h a n o sc h a n o s 、北美底鲻f u n d u l u s p a r v i p i n n i s 、大盖 巨脂鲤c o l o s s o m am a c r o p o m u m 、褐虾c r a n g o nc r a n g o n 、罗氏沼虾m a c r o b r a c h i u m r o s e n b e r g i i 、邓杰内斯蟹c a n c e r m a g i s t e r 等( d o u d o r o f f1 9 5 0 ，b a g a r i n a o1 9 9 3 ， 1 9 9 9 ，t h e e d e1 9 6 9 ，c a l d w e l l1 9 7 5 ，b e n t1 9 9 6 ，j a y a m a n n e1 9 9 2 ，k a n g1 9 9 4 ) 。 另一部分集中于对硫化物有耐受性的水生动物的研究，包括对北美底鲻f u n d u l u s p a r v i p i n n i s ( b a g a r i n a o1 9 9 3 ) 、滨岸护胸鲶h o p l o s t e r n u ml i t t o r a l e ( a f f o n o s o2 0 0 4 ) 、 大盖巨脂鲤c o l o s s o m am a c r o p o m u m ( a f f o n s o2 0 0 2 ) 、褐虾c r a n g o nc r a n g o n ( h a g e r m a n1 9 9 5 ) 的研究。但是，有关甲壳动物硫化物慢性胁迫的相关研究领 域则基本上是空白。 中华绒螯蟹( e r i o c h e 扣s i n e n s i s ) 俗称河蟹，是我国的一种重要经济蟹类。 河蟹营底栖穴居生活，长期处于养殖水体底层这一硫化物积累的主要场所。精养 模式下，由于养殖密度的提高和投饵量的增加，大量的残剩饲料、死亡生物体以 及生物的排泄物等有机废物无法被及时分解，被不断沉积而形成淤泥，过多的淤 泥沉积会增大有机耗氧，造成下层水和底质长期缺氧。缺氧环境下，有机废物中 的含硫氨基酸会被厌氧菌降解为硫化物。硫化物的胁迫对河蟹生长、发育和成熟 有何不良影响，迄今尚无相关的研究报道。 本研究以河蟹雌性亲体为对象，在急性毒性试验的基础上，从生理生化和细 胞水平两方面，探讨甲壳动物对硫化物胁迫的应答机制，以期为河蟹的集约化健 康养殖提供必要的参考。 一1 2 一 第一章硫化物对雌性中华绒鹜蟹亲体急性毒性研究 第一章硫化物对雌性中华绒螯蟹亲体急性毒性研究 引言 在自然条件下，硫化氢由水体底质的有机物经厌氧分解产生，工业制造业污 水也是硫化氢的来源，诸如造纸厂、炼油厂和化工厂( v a nh o r n1 9 4 9 ，d o n i s1 9 6 0 ， e l l i s1 9 3 7 ) 。在养殖水体，残剩饲料和有机物分解也产生硫化氢。 已有研究证明，硫化氢对鱼类的有很强的毒性效应( a d e k a a n1 9 7 0 ) ，即使很 低浓度的硫化氢对鱼卵、鱼苗和幼体有很强的毒害作用( c o l b ya n ds l l l i t h , 1 9 6 7 ； a d e l m a na n ds m i t h ，1 9 7 0 ；a n ds m i t ha n do s e i d ，1 9 7 2 ) 。长期暴露于硫化氢亚致死 浓度下，鱼类会出现低生长、低存活和低产卵率现象。目前，硫化氢对大型甲壳 动物的急性毒性研究较少，对中华绒螯蟹es i n e n s i s 仅有其蚤状幼体的急性毒性 研究。本研究旨在探明硫化物对中华绒螯蟹雌性亲体的急性毒性，为后续进一步 开展胁迫试验积累资料。 1 材料与方法 1 1 试验用蟹 试验用河蟹雌性亲体购自上海市铜川路水产市场，选择附肢完整、活力强的 健康个体为试验用蟹，平均体重8 0 2 2 8 ：l 6 2 7 0 9 。 1 2 暴露试验 试验于2 0 0 5 年8 月于华东师范大学生物系水生动物实验室内进行。将1 0 0 余只试验用蟹置于1 2 只5 0 c m x 6 7 c m x 3 5 c m 的无毒聚乙烯塑料箱中驯养2 周。 试验用水为曝气自来水，养殖水体积约为4 0 l ，水温2 5 2 c ，整个实验在自然 光照下进行，间歇充气，溶氧量保持在5 m g l 以上，每日换水，每日投喂新鲜 螺肉和河蚌。两周后开始正式实验，实验前2 4 1 1 停止投喂，试验期间不投喂。 毒性试验采用9 6 h r 半静态试验法。以【s 】k 兄酌硫化钠溶液为贮存液调节水 体硫化物浓度，硫化物浓度的测定采用n ，n 一对氨基二乙基苯胺比色法( 陈佳荣 1 9 9 6 ) 。 暴露试验容器为1 0 0 l 聚乙烯塑料缸，试验水体4 0 l 。试验时每箱随机放养 9 只蟹，每个浓度共2 个平行，每6 h 添加一次母液以达到所设表观浓度，每2 4 h 第一章硫化物对雌性中华绒螯蟹亲体急性毒性研究 更换一次试验溶液，更换前测定对照组缸中水质( 温度、p h 、溶解氧) ，观察中 毒症状和记录死亡数目( 用玻璃棒触及触角和附肢无任何反应者即为死亡) ，并剔 除死亡动物。根据预试验结果按等对数间距设计6 个浓度组，硫浓度分别为0 、 2 0 0 0 、2 8 3 0 、4 0 0 0 、5 6 5 6 、s 0 0 0 i _ t g l 。以上所有浓度俱为表观浓度。 安全浓度( c ) 的计算公式( s p r a g u e ，1 9 7 1 ) ：c = 0 1x 9 6 hl c s o 1 3 统计方法 数据统计采用s p s s1 4 0 分析软件，用p r o b i t 法( f i n n e y1 9 7 1 ) 计算半数致 死浓度( l c 5 0 ) 值和9 5 置信区间。 2 结果与讨论 2 1 水质测定结果 暴露试验中水质结果见表2 一l 。在试验过程中，永质参数无明显的变化，平 均温度为2 5 9 + 0 4 0 c ，p h 平均值为7 3 4 _ d ：0 0 7 ，溶解氧为5 3 3 士0 1 2 m g l 。 表2 一l 试验用水的理化参数 时间 d u r a t i o no f e x p o s u r e ( h ) t e m p e r 温度a t u r e ( 。c ) p h ( 。) 溶解氧 d i s s o l v e do x y g e n ( m e l ) 2 2 中毒后的反应状况 经硫化物暴露中毒后，河蟹运动减少；反应迟缓；随着时间的延长，蟹的行 动不稳定，甚至失去平衡力；附肢僵直，抽搐，身体翻转，最终死亡。硫化氢能 作用于神经系统、眼睛和呼吸系统，视暴露时间和浓度不同，中毒症状也不同 ( n t i s 1 9 7 4 ) 。j a y a m a n n e ( 1 9 8 6 ) 认为硫化物可能破坏甲壳动物的中枢及外 周神经从而影响其平衡力。本试验中观察到河蟹失去平衡，这一现象也表明硫化 物对河蟹神经系统造成了损伤。 2 3 急性毒性 不同时间点硫化物暴露下河蟹的死亡率结果见图2 1 。不同硫化物处理组， 河蟹在2 4 h 均出现死亡。最高浓度处理组河蟹在4 8 h 死亡过半，9 6 h 死亡率达8 3 ， 苎二童堕些塑翌些堡主兰苎鳘堡墨竺墨丝妻丝堕塞 此时其他处理组的死亡率按照硫化物浓度由低到高依次为4 4 、3 9 、6 1 和 6 7 。整个试验过程中，对照组河蟹未出现死亡。 图2 1 不同时间点硫化物暴露下河蟹的死亡率 f i g 2 1p e r c e n tm o r t a l i t yo f e s i n e n s i si nr e l a t i o nt oe x p o s u r et i m e s 表2 2 河蟹雌性亲体的硫化物半数致死浓度 r l b 2 2l c s ov a l u e so f s u l f i d ee x p o s u r et of e m a l ees i n e n s i s 暴露时间l c 5 0 9 5 置信区间 e x p o s u r et i m e ( h ) ( 【s 1t o g a ) 9 5 c o n f i d e n c el i m i t e s ( i s lm 醣0 2 4 h1 2 5 l 、 4 8 h 7 2 h 6 7 3 5 6 6 4 0 2 1 1 2 7 3 1 8 ，1 0 0 6 9 6 h3 0 9 1 9 8 4 8 1 一1 5 一 第一章硫化物对雌性中华绒螯蟹亲体急性毒性研究 图2 2 河蟹暴露时间与硫化物半数致死浓度回归分析 f i g 2 2l i n e a rr e g r e s s i o na n a l y s i so f l c 5 0a n de x p o s u r et i m e o f f e m a l ees i n e n s i se x p o s e dt os u l f i d e 硫化物对河蟹雌性亲体的急性毒性试验结果见表2 2 。随着暴露时间的增加， l c 5 0 值逐渐减小。2 4 h l c 5 0 值为硫浓度1 2 5 1 m g l ，但9 5 置信区间过大。9 6 h l c 5 0 为总硫浓度3 0 9 m g l 。硫化物对河蟹雌性亲体的安全浓度为硫浓度0 3 1 m g l 。经回归分析发现，河蟹硫化物半数致死浓度与暴露时间的对数呈密切的 线性相关。回归方程为f ( x ) = 6 5 2 2 5 l n ( x ) + 3 2 9 0 9 r 2 ；0 9 7 0 7 。 环境条件对硫化物的毒性有一定的影响( a d e l m a n1 9 7 2 ，b o y d ，1 9 9 0 ) 。研 究表明，遮目鱼c h a n o sc h a n o s 的硫化物9 6 h l c 5 0 为1 9 m g l ( b a g a r i n a 0 1 9 9 8 ) ， 北美底鲻f u n d u l u sp a r v i p i n n i s 的9 6 h l c 5 0 贝j j 达到2 2 4m g l ( b a g a r i n a o1 9 8 9 ) ， b a g a r i n a o ( 1 9 9 8 ) 认为上述两者除了物种差异之外，对硫化物急性毒性的差异部 分原因在于实验的水温和溶解氧含量的不同，前者的实验在水温2 6 - 3 0 0 c 、溶解 氧含量5 6m g l 的条件下进行，后者的实验在水温1 4 1 9 0 c 、溶解氧含量1 0 1 2 n 虮的条件下进行，硫化物的毒性随温度的升高而增强，随溶解氧的减少而增 强( a d e l m a n1 9 7 2 ，b o y d ，1 9 9 0 ) 。本实验养殖环境水温在2 5 2 6 0 c 之间，溶解氧 含量在5 2 5 5 m g l 之间，都类似于遮目鱼实验条件，因而得到河蟹的9 6hl c 5 0 为3 0 9 m g l ，而远低于b a g a d n a o ( 1 9 8 9 ) 的实验结果。 不同发育时期个体的硫化物耐受性差异很大，b o n n ( 1 9 6 7 ) 研究发现斑点 叉尾鲴i c t a l u r u s p u n c t a t u s 幼鱼硫化氢2 4 hl c 5 0 为0 5 3 0 8m g l ，远低于d o u d o r o f f ( 1 9 5 0 ) 的报道范围。c a l d w e l l ( 1 9 7 5 ) 发现不同发育时期的邓杰内斯蟹c a n c e r m a g i s t e r 对硫化氢的耐受性不同，大眼幼体9 6 h l c 5 0 为o 5 m g l ，后期幼体则为 一1 6 一 第章硫化物对雌性中华绒罄蟹亲体急性毒性研究 ! o m g l 。本研究针对已完成蜕皮的河蟹雌性亲体，因而其耐受性相对较高。 c a l d w e l l ( 1 9 7 5 ) 对6 种海洋无脊椎动物的研究发现，软体动物的双壳类 m a c o m ab a l t h i c a 对硫化物耐受性最高，甲壳动物的片脚类a n i s o g a m m a r u s c o n f e r v i c o l a 和c o r o p h i u ms a l m o n i s 耐受性最低，而蟹类c a n c e rm a g i s t e r 介于两 者之间，推断根据生物体自然生活环境不同，它们对硫化物的耐受性不同。相对 与海水生物而言，淡水生物接触硫化物的机会较小，因此对硫化物的耐受性也低 得多，从表3 中也可以发现，淡水鱼l u x i l u sc o r n u t u s 和p i m e p h a l e sp r o m e l a s 对 硫化物的耐受性远低于生活在盐碱沼泽中的北美底鲻。河蟹成体在产卵前都生活 于淡水环境中，因而其对硫化物的耐受性较低。 对于硫化物急性毒性实验主要集中于鱼类。d o u d o r o f f ( 1 9 5 0 ) 报道虹鳟s a l m o g a i r d n e r i 、北美白鲤c a t o s t o m u sc o m m e r s o n i 、鲫鱼c a r a s s i u sa u r a t u s 、鲤鱼c y p r i n u s c a r p i o 等鱼类在硫化氢浓度1 - 6m g ，l 时出现死亡。p e t u r i y a w a t e ( 1 9 8 2 ) 报道蟾 胡子鲶c l a r i a sb a 舶a c h u s4 8 hl c 5 0 为5 3 1m g ，l 。j a y m n a n n e ( 1 9 9 2 ) 报道罗氏沼 虾m a c r o b r a c h i u mr o s e n b e r g i i9 6 hl c 5 0 为2 5 7 4 2 0 m g r l 。以上研究结果均接近 于本实验获得的河蟹的9 6 hl c 5 0 。研究表明，除了生活于硫化物丰富生境的物 种之外，绝大多数水生动物对硫化物耐受性较低。 1 7 - 第一章硫化物对雌性中华绒螯蟹亲体急性毒性研究 表2 3 硫化氢对水生生物的急性毒性 t a b 2 3a c u t et o x i c i t ys t u d i e sf o rs o d i ms u l f i d eo na q u a t i co r g a n i s m s 蜘l 猷i f e s黻lage喋黑e莲鞋，r豺efere嫡ncesspecies 7 一p 篙：“，：羔嘉、 m a c r o b r a c h i u mr o s e n b e r g i i 7 2 5m i l l 1 5 0 8n u l l 片脚类 a n i s o g a m m a r u sc o n f e r v i c o l a 片脚类 c o r o p h i u ms a l m o n i s 片脚类 e o h a u s t o r i u se s t u a r i e s 片脚类 r h e p o x y n i u sa b r o n i u s 俄勒冈球水虱 g n o r i m o s p h a e r o m ao r e g o n e n s i s 鱼类f i s h 遮目鱼 c h a n o se h a n o s 北美底鳓 f u n d u l u s p a r v i p i n n i s l u x i l u sc o r n u t u s 唐鱼 t a n i c h t h y sa l b o n u b e s 肥头鲤 p i m e p h a l e sp r o m e l a s 贝类m o l l u s c s 太平洋牡蛎 c r a s s o s t r e ag i g a s 白樱蛤 m a c o m ab a l t h i c a 幼体 3 - 8g 5 7 5e m 成体 成体 9 6 9 6 9 6 9 6 4 8 4 8 9 6 9 6 9 6 9 6 4 8 4 8 9 6 9 6 2 5 7 0 j a y a m a n n e1 9 9 2 4 2 0 0 2 0 0 1 0 0 0 3 3 2 0 1 6 0 0 5 2 0 0 0 1 9 2 0 2 2 4 0 0 1