（微生物学专业论文）红树林沉积物细菌多样性分析及其功能基因筛选.pdf

摘要 红树林是自然分布于热带、豫热带海岸的潮间带的木本植物群落，通常生长 在港湾河口地区的淤泥质滩涂上，是海滩上特有的森林类型。红树林沉积物具有 强还原性、强酸性、高含盐量、营养丰富等特征，其微生物资源既丰富又不失特 色。然而，至今对树林的研究绝大多集中在植物学、生态学、造林学等领域，在 微生物学领域的研究甚少。研究红糖栋漉积物的微生耪组成及其活性物质、功能 基因鲶筛选鸯重大理论实践意义。 本论文以福建龙海浮富红树林沉积物样晶必研究对象，采用宏基因组技术， 克服土壤中绝大部分微生物不可培养的弊端，通过1 6 s r d n a 文库的构建，分析 了浮宫红树林沉积物中细菌的多样性和结构组成；并且，以p u c l 9 为载体构建 了3 1 0 k b 小片段宏基因组文库，筛选有纤维素酶活性的功能基因。获得的主要 结果弼下： 重。梅建了红树林沉积物昭1 6 s r d n a 文库，研究其缨菌群落组戒。r f l p 分 型表爨文库中存在丰富麓细蘸多样性，有3 e 种撬势蘧。对3 9 种优势菌靛 1 6 s r d n a 序列测序结果表明i 优势菌中变形缨菌缁( p r o t e o b a c t e r i a ) 占优势( 7 0 。0 ) 。其中，q p r o t e o b a c t e r i a 占3 3 ：y p r o t e o b a c t e r i a 占2 6 7 ；6 p r o t e o b a c t e r i a 占1 0 0 ：8 p r o t e o b a c t e r i a 占3 0 0 。除了变形菌外，还检测到未可培养，性 质以及分类尚不清楚的细菌，占2 0 ；浮霉菌纲( p l a n e t o m y e e t a c i a ) 、 b a c t e r o i d e t e s ( 拟秆蔼门) 和疣微菌n ( v e r m c o m i c r o b i a ) ，分别占3 3 。 2 。以红搪棒沉积物样燕隽材料，戡p u c l 9 质粒茭载体，d h 5 疆秀宿主菇梅 建了3 1 0 k b 小片段宏基毽组文库p u c l 9 - h s e d i m e n t 。文库含有4 5 0 0 0 个克隆子， 平均插入片段为5 4 k b ，包含了约4 5 0 m b 的沉积物样品d n a 。 3 从该文库筛选到3 个含有不同插入片段( 6 。4 k b 、2 6 k b 、1 2 k b ) 的具有 胞外纤维素酶活性的克隆子。对克隆子插入序列的分析工作正在进行当中。 上述结果揭示了红树林沉积物中蕴藏着丰富韵新微生物潦源。宏基因组技术 在环境微生物资源的开发上是个有力工具。 关键试：红树林沉积物；宏基因组技术；纤维素酶 a bs t r a c t m a n g r o v es w a m p sa r eu n i q u ei n t e r - t i d a lw e t l a n de c o s y s t e m sf o u n di ns h e l t e r e d t r o p i c a la n ds u b t r o p i c a ls h o r e s ，a n dr e p r e s e n tr i c ha n dd i v e r s el i v i n gr e s o r r c e s s p e c i a lm a n g r o v es e d i m e n t n i c h e s p o s s e s sv a l u a b l em i c r o b i a l r e s o u r c e s u n f o r t u n a t e l y , v e r yf e wr e s e a r c h e sw e r ec a r r i e do u to nt h em i c r o b i a lc o m m u n i t i e s c o m p a r i n gt om u c ha c h i e v e m e n to nt h es t u d yo f p l a n t si nm a n g r o v ee c o s y s t e m 。s of a r , t h e r ei sv e r yl i t t l ek n o w l e d g eo nt h em a n g r o v es o i lm i c r o b i a lc o m m u n i t i e s i t su r g e n t a n ds i g n i f i c a n tt oi n v e s t i g a t et h em i c r o b i a lc o m m u n i t i e sa n de x p l o r ei t sp o t e n t i a l r e s o u r c e s i nt h i sr e s e a r c h , u s i n gt h em e t a g e n o m i cs t r a t e g y , a1 6 s r d n a g e n el i b r a r yw a s c o n s t r u c t e dt oi n v e s t i g a t et h eb a c t e r i a ld i v e r s i t yi nt h em a n g r o v es e d i m e n tc o l l e c t e d i nf u g o n g , l o n g h a i ，f u j i a np r o v i n c ea n dam e t a g e n o m i cl i b r a r yw a sa l s oc o n s t r u c t e d t os c r e e nt h ec e l l u l o l y t i cg e n e s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h eb a c t e r i a ld i v e r s i t yi nt h em a n g r o v es e d i m e n tw a sc h a r a c t e r i z e db y a n a l y z i n gt h e16 s r d n ag e n el i b r a r y 2 0 0c l o n e sw i t hd i f f e r e n tr f l pp a t t e r n ss h o w e d a b u n d a n tb a c t e r i a ld i v e r s i t yi nt h es e d i m e n t 。a m o n gt h e m ，3 0c l o n e sr e p r e s e n t i n gt h e d o m i n a n ts p e c i e sw i t hr f l pp a t t e r n so c c u r r e df r e q u e n t l yw e r es e q u e n c e da n d p h y l o g e n e t i c a l l y i d e n t i f i e da s b e l o n g i n gt o t h ep r o t e o b a c t e r i a ( 7 0 ) ，u n k n o w n b a c t e r i a ( 2 0 ) ，p l a n c t o m y c e t a c i a ( 3 3 ) b a c t e r o i d e t e s ( 3 a m , v e r r u c o m i c r o b i a ( 3 。3 ) 2 u s i n gt h em a n g r o v es e d i m e n ts a m p l e , t h et o t a ld n aw a si s o l a t e dd i r e c t l y f r o me n v i r o n m e n ta n dam e t a g e n o m i cl i b r a r yw a sc o n s t r u c t e du s i n gt h ep u c 19 p l a s m i d a sv e c t o ra n de c o l i d h 5 aa sh o s t t h el i b r a r yw a sn a m e da s p u c l 9 一h s e m i d e n t i tc o n t a i n e d4 5 ，0 0 0c l o n e sw i t ha v e r a g ei n s e r ts i z e so f5 4 k b ， c o v e r i n g4 5 0 m bg e n o m i cd n a i nt h es e d i m e n t 3 u s i n gt h ef u n c t i o n - d r i v e ns c r e e n i n gm o d e l ，3c l o n e sw i 镛e x t r a c e l l u l a r c e u u l o l y t i ca c t i v i t yw e r es c r e e n e d 。强e yh a v ei n s e r t s o f6 4 k b ，2 6 k b ，1 2 k b r e s p e c t i v e l y 。t h es e q u e n c ea n a l y s i so ft h e s ei n s e r t si so n g o i n g c o n c l u d e df r o mt h er e s u l t s ，i ts h o w st h a tt h em a n g r o v es e d i m e n th o l d sg r e a tn e w 珏 m i c r o b i a lr e s o u r c e sa n dt h em e t a g e n o m i es t r a t e g yc a nb ep o w e r f u le x p l o i t i n gt h e p o t e n t i a lm i c r o b i a lr e s o u r c e sf r o mt h ee n v i r o n m e n t k e y w o r d s ：m a n g r o v es e d i m e n t ；m e t a g e n o m i cl i b r a r y ；c e n u l o l y f i ca c t i v i t y i i i 厦门大学学位论文原创性声明 兹星交的学位论文，是本入在导师指导下独立完成的研究成果。本人在 论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。 本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责在。 声明人( 签名) ：节、影于t 一7 年7 月2 7 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用 予非赢利舀的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的 内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的 学位论文在解密羼适用本规定。 本学位论文属于 1 保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 不保密( ( 请在以上相应括号内打“4 ) 7 月 7 月 7 日 7 日 1 年年期期 凄 斟铲 丐 名名签签者师怍导 覆门大学硕士论文：红树林沉税物细繁多样悭分析及其功黥基因筛选 1 前言 1 。1 红树林区微生物资源概况 1 1 1 红树林区的特点 红树林是自然分布于热带、亚热带海岸的潮间带的木本植物群落，通常生长 在港湾河口地区的淤泥质滩涂上，是海滩上特有的森林类型f l 】o 红树林在热带， 亚热带的海岸潮闻带构建了片美丽的海上森林，虽然它占据的陆地面积不到全 球陆地面积的千分之一，却以相当于亚马逊热带雨椿的高生产力与珊瑚礁、上升 流、海滨沼泽湿地组成了四大海洋高生产力生态系统【2 l 。我国现有红树林1 5 1 2 2 公顷，海南、广东、广疆是主要分布区，三个地区红树林面积约占全国纽树林总 面积的9 5 。我国共有红树植物1 2 科2 7 种，由南部的海南到北部的浙江，红 树林植物种数从2 5 种降为1 种，随纬度的提高，红树植物种类数明显减少。海 南是我国红树植物种类最多、红树林生长最好的地方。 目前，大多数学者认为红树林在以下方面有主要作用( 林鹏等，1 9 9 5 ；林鹏， 1 9 9 7 ) ( 1 ) 过滤陆地径流和内陆带出的有机物质和污染物，吸收与吸附污染物以净 化环境。 ( 2 ) n 用植物本身的生产物，包括木材、薪炭、食物、药材和其他化工原料 等。 红树林沉积物具有强还原性、强酸性、高含盐量、营养丰富f 3 】等特征。因此， 这里的微生物资源既丰富又不失特色，主要类群为细菌、真菌、放线菌、微型藻 类等。在热带红树林中，微生物的组成大致为：缨蔼和真菌占微生物资源总量的 9 1 ，藻类和原生动物分别占7 和2 f 4 1 。 1 1 2 红树林区微生物资源研究进展 红树林独特的生态环境和丰富的生物多样性引起了科学工作者的关注。但是 绝大多数的研究集中在植物学、生态学、造林学等领域，在微生物学领域的研究 很少。国内对红树林区的微生物学研究始于2 0 世纪8 0 年代末期，同其它方面相 眈，微生物学研究起步较迟，研究褥较为薄弱。在有关红树林研究文献中，红树 林的微生物学研究文献所占份额极少。这种研究状况与红树植物种类和蔼积分布 不相称。面在现有的红树林微生物学研究中，多数研究仍集中于红树林的真菌学 厦门大学硕士论文：红树林沉积物细菌多样性分析及其功能基因筛选 研究孛，包括真菌分类学研究和真菌区系。在世界红树林区，对缨菌类群的研究 较少【5 1 ，但已报道的结果表明，各地细菌属的组成在沉积物( 或土壤) 中有一定的 相似性，即均以芽孢杆蘸占优势。s h o m e 等溺研究表明，在印度南a n d a m a n 红 树林凋落物及其下表面沉积物的细菌区系中，芽孢杆菌属占5 0 的比例；胡承 彪等1 7 l 的研究也发现芽孢杆菌属是红树林沉积物中的优势属。而对于其他细菌种 类的了解也相对较少。由此可见，红树林的微生物学研究很有必要进一步拓宽研 究地域和研究范围，充实研究队伍。 目前对微生物研究较为活跃研究领域有红树林微生物区系研究r 7 】；凋落物分 解过程中的微生物学研究红树林的根际放线菌研究唑红树林区微生物污染 生态学研究【10 1 。通过对红树林微生物的不断了解，近年来又形成了一个科研热 点，那就是红树林微生物酶资源的研究。 1 1 3 红树林沉积物微生物纤维素酶酶系研究 纤维素是世界上最大的、可褥生的有机碳源l n 】。自然界大部分的纤维素是由 藻类和高等殖物合成，全世界每年的植物体生成量高达1 5 0 0 亿吨干物质其中纤 维素及半纤维索的总量为8 5 0 亿吨。但是由于纤维索本身的结构特点，造成了纤 维素在自然界、人工环境里分解上的困难( 图1 1 ) f 1 2 】。目前人类还没有合理的方 法对这些巨大的资源进行综合利用，很大部分的纤维素是作为废弃物处理。 o e l l u l o m sm o l e c u l a r p r o t o f i b r i l s m i c m f i b r i lc e l h d o f i b e r 强i 。i 纤维素的结构 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo fc e l l u l o s e 纤维素的生物降解涉及到一组复合的纤维素酶系，酶系由三种作用方式不 厦f 了大学硕士论文：红树拣沉积物细菌多样健分析及其功能麓因筛选 同，但相互协同催化水解纤维素的酶组成：内切葡聚糖酶( e n d o 。l ，4 1 3 d 。g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 ，这类酶作用于纤维素分子蠹部的非结晶区，随机水解 b 1 ，4 糖苷键产生大量短纤维素链；外切葡聚糖酶( e x o 。1 ，4 1 3 d g l u c a n a s e ， e c 3 2 1 9 1 ) ，这类酶作用于纤维素长链的末端，水解伊l ，4 糖萤键，每次从长链 上切下一个纤维二糖分子； 葡萄糖苷酶( 1 3 。g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 。l 。2 1 ) ，这类酶 将纤维二糖水解成葡萄糖分子【1 3 】。在三类纤维索酶的协同作用下才能降解纤维 素。 在红树林内，凋落物非常丰富，在凋落物分解过程中微生物产生鲶酶以纤维 素分解酶、木质素分解酶为主。实验表明，红树林区绝大多数真菌都能产生用于 降解木质素、纤维素和其他植物成分的酶 1 4 , 1 5 , 1 6 , 1 7 l ，某些地区的放线菌也能产生 纤维素酶网。例如，在台湾淡永河瑟的红树林囊菌、敖线菌大部分均能产生纤 维素酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶、琼脂糖酶1 1 8 1 。还有人从台湾海峡红树林沉 积物中分离到一株产纤维素酶的短小芽孢杆菌s 2 2 7 ，该菌只产生葡聚糖肉切酶 f 潮。在印度果阿的红树林中，异养细菌具有纤维素水解、采胶水解、淀粉水解 和蛋白质水解活性【2 0 1 ，而红树植物的降解真菌具有果胶酶、蛋白酶、淀粉酶活 性并具有降解木质纤维素化合物的能力【b 】。红树林内微生物产酶多样化，这些 酶类物质在医药卫生、工农业生产、生活资料加工上也都有着广泛的用途。纤维 素酶的用途就极为广泛，可在纺织正业中作为生物整理剂( 如靛蓝牛仔服的酶洗 和棉、t e n c e l 、粘胶、黄麻、亚麻及其混纺织物的生物整理) 、饲料生产中作舞 生物添加剂、果蔬加工中提高果汁或药物的萃取率、另外，在石油开采、发酵工 业、造纸、中成药加工、洗涤剂、工业垃圾治理等方面，纤维素酶和木质素酶都 有着非常广泛的用途。因此，大力开发红树林微生物纤维素酶资源对生产生活具 有重要意义。 1 2 环境微生物宏基因组研究 l 。2 。1 宏基因组概念的提出 传统的微生物技术是通过实验室筛选、分离、纯培养微生物，对其进行生理 生化、分子鉴定，再利用分子生物学技术克隆纯培养的微生物的基因。但是经用 1 6 s r d n a 探针及纯培养技术研究发现，存在于自然界约董百万捌l 千万狰微生 物中，有将近9 9 无法在试验室实现人工纯培养。甚至在目前认定的3 6 个门的 厦门大学硕士论文：红拷拣沉积物纲萤多样性分析及其功能基因筛选 微生物中有1 3 的f j 仍然没有任何代表菌可在实验室实现纯培养( 图1 2 ) t 2 n 。这就 意味着由于对未培养豹微生物缺乏研究f 2 2 1 ，数量如此众多的未培养微生物含有 的臣大的基因资源也就无法被人们所剥用。对未培养微生物进行研究，不但能促 使人们了解它们不能培养的原因，更能使人们获得蕴藏在这些未培养微生物中的 巨大基因资源【2 3 1 。对未培养微生物进行研究成为微生物学研究的个重要研究 方向。 图1 2 目前己知及假定的细菌各门的进化树 ( 空行的箭头代表该门来有菌能被纯培养，熊色的箭头表承该门醴有代表菌能被纯培养) f i g1 2e v o l u t i o n a r yd i s t a n c et r e eo ft h eb a c t e r i a ld o m a i ns h o w i n g c u r r e n t l yr e c o g n i z e dd i v i s i o n sa n dp u t a t i v ed i v i s i o n s ( d i v i s t i o n sw h i c hh a v ec u l t i v a t e dr e p r e s e n t a t i v e 叠摊s h o w ni nb l a c k ；d i v i s i o n sr e p r e s e n t e do n l yb y e n v i r o n m e n t a ls e q u e n c e sa l es h o w ni no u t l i n e ) 由于人类对未培养微生物的生理知识的缺乏，对未培养微生物进行可培养研 究的进展缓慢。对未培养微生物进行可培养研究集中在原位培养f 瓣1 、培养条件 的优化湖、单细胞的微操作嘲等方面，这些研究需要特殊的环境或仪器设备而 且对数量众多的未培养微生物进行单个的纯培养耗时耗力。 基前研究褥最多的是从1 6 s r d n a 和1 8 s r d n a 的焦度对未培养微生物进行 微生物的生态区系研究。这些研究采用的方法是根据微生物的1 6 s r d n a 和 1 8 s r d n a 的保守序列设计特异的引物，对从环境中提取的总d n a 进行p c r 扩 4 覆门大学硕士论文；红树林沉软物细菌多样健分析及箕功能基戮筛选 增，根据扩增的1 6 sr d n a 和1 8 sr d n a 基因的差异可以了解不同环境中微生物 的不同分布 2 7 1 。髓h a n d e l s m a n 在1 9 9 8 年提出的建立未培养微生物的 m e t a g e n o m i cl i b r a r y 的设想把对未培养微生物的研究推进到个新的层次 2 8 1 。 “m e t a g e n o m e 是患h a n d e l s m a n 等在1 9 9 8 年提出的新名词，其定义为“t h e g e n o m e so f t h et o t a lm i c r o b i o sf o u n d i nn a t u r e 壮，霹生境中全郝徽小生物遗传物 质的总和。国内学者将其翻译为“宏基因组，文献中常见“c o l l e c t i v eg e n o m e s 、 “e n v i r o n m e n t a lg e n o m e s ”等，现已普遍采用“m e t a g e n o m e ，般主要指环境样 品中的纲蓠帮真菌的基因组总寝。宏基因组文瘁既包含了可培养的又苞含了来可 培养的微生物基因，避开了微生物不可分离培养的问题，极大地扩展了微擞物资 源的剥雳空间，增加了获褥新的生物活性物囊的枫会。 薹。2 。2 宏基因组技术酌原理瑟其要素 宏基因组学的基本方法是分析微生物在环境中的基鼹组集会，直接分离未培 养土壤微生物基因组d n a ，克隆到可培养微生物中，最后筛选所需的结果宠隆。 圈1 3 2 9 展示了宏基鼹缀技术麴基本原理程过程。全过程包括熙个步骤：( 妨环境 样品中的d n a 分离( 从微生物环境、土壤、沉积物或实验室富集物中) ( b ) 构建d n a 文库r 获取感兴趣静宠隆或净列垂曲累积想要的d n a 序列帮基嚣。简单地说就是 是：d n a 的提取、将d n a 克隆到合适的载体中、将克隆转化到宿主细胞建立 d n a 文疼、环境基因组文痒的分析。 直接从环境中克隆d n a 的构思最初是有p a c e 提毖来的【3 0 】，随即由s c h m i d t 等人加以实施，拖将双海东群瑟提取爨酶基西组d n a 构建成一个天噬菌体文瘁， 并对其1 6 s r d n a 基因进行了检测【3 1 】。d e l o n g 等人将他这种方法进行了改进， 将胰海水样晶进行克隆提并为睦缝群燕【竭。土壤中惫含有缀多撩制酶活性秘克 隆反应的物质，由予士壤d n a 提取方法的限制，从土壤样品巾分析环境基因组 的发震鞍漫，近来在越方面已经获 | 譬显著的进步。构建基因组文岸可以提离人们 对壤微生物种群功能的了解，近来来由于研究技术的进步，使人们在此领域的 研究院剐开始的时候簧便剥褥多，入稍在环境基嚣组研究上爆发极大兹兴趣。测 序技术的提高拓展了研究方法，通过研究环境基因组，使人们得到了大量的信息。 d n a 提取释纯纯嚣嚣要采雳合适的载体鞠宿主菌掩建d n a 文疼。以往插入 厦门人学硕上论文：红树林沉积物细菌多样性分析及其功能基冈筛选 i 薯 t h ei d e n t i f i c a t i o no fn o v e lg e n e sa n dt h ea n a l y s i so fc o m p l e t em e t a g e n o m e s f r o mm i c r o b i a lc o m m u n i t i e s a n a l y s e so fc o m p l e t em e t a g e n o m e si n v o l v e sa tl e a s t f o u rm a jo rw o r k i n gs t e p s ： ( a ) d n ai s o l a t i o nf r o mm i c r o b i a ln i c h e s ( i ) s o i l s ， ( i i ) s e d i m e n t s ， o r ( i i i ) l a b o r a t o r ye n r i c h m e n t s ； ( b ) c o n s t r u c t i o no fd n al i b r a r i e s ；( c ) m i n i n gf o rc l o n e sa n dd n as e q u e n c e so fi n t e r e s ta n d ； ( d 1a c c u m u l a t i o no fd e s i r e d c l o n e sa n dd n as e q u e n c e s m e t a g e n o m i c st h e r e b yp u r s u e st w om a j o rg o a l s ：t h e i d e n t i f i c a t i o no fn o v e lb i o c a t a l y s tg e n e sa n di n c r e a s i n go u ru n d e r s t a n d i n go n m i c r o b i a le c o l o g y 图1 3 宏基因组技术的基本原理和方法 f i g 1 3t h ep r i n c i p l eo fm e t a g e n o m i ct e c h n o l o g y 6 厦门大学硕士论文：红树林沉积物细菌多样性分析及其功能虢因筛选 小片段( l o k b ) 做为载体和导入e s c h e r i c h i ac o l i 的方法【3 3 1 不适合检测大的基因 簇帮操纵。为了解决这个目题，研究人员构建了含有较大插入片段约d n a 文痒。 例如c o s m i d d n a 文库( 通常采用p w e l 5 载体) ，插入片段为2 5 3 5 k b t 3 4 1 ，细菌 人造染色体( b a c ) 文库，插入片段为2 0 0 k b 3 5 3 6 1 。近来已经有人报道采用4 0 k b 的外源基因构建了f o s m i d 文库蹦。研究中通常采焉e c o l i 作为环境基因组克隆 基因表达的宿主菌，近来有少数采用s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s 作为宿主菌【3 8 】。有一 些实验室采用新的革兰氏阴性细菌作为表达的宿主菌以提高表达的效率。 对所得到的克隆可以通过系统发育方法分析诸如1 6 s r r n a 和r e e a 基因，利 用已知的基因通过杂交或多重p c r 的方法分析、表达其特殊性质，得出具有活 性的抗体或者酶，抑或对所得基因组进行随机测序。每一种方法都有它的长处秘 短处，将这些方法结合起来可以提离我们对未知环境中原核生物的了解。 综上所述，宏基因组技术包含了几大要素：足够片段大小和少含杂质的环 境总d n a ；适合大小的载体；囝合适的表达宿主；高效的筛选模型。 1 。2 。2 。1 环境总d n a 的提取及其纯化 1 ) 总d n a 的提取 通过构建环境基因组文库来如实地反映环境中微生物的种类，首先要褥到环 境中全部微生物的基因组，这就要求建立麸环境样品中提取基因组有效的方法。 对于如水体等环境的m e t a g e n o m i cd n a 的提取难度比较小，一般是直接过滤水 中的微生物，然后按实验室通常处理纯培养微生物的方法提取总d n a ，这样得 到的总d n a 纯度足以构建文库1 3 9 删。丽对于如土壤、堆艟等环境的微生物，由 于土壤颗粒与微生物紧密结合，加之环境中各种抑制物与d n a 的共提取，造成 了这些环境里d n a 提取与纯化的瞰难【4 1 4 2 】。 到疆前为止，已经发展建立了多种从不同环境中提取微小生物基因组的方法 【4 3 御 4 5 1 。这些方法大致可以分为两类：一种是间接法，即先从环境中分离目的类 群的微生物细胞，秀提取其中的基嚣组。v e n t e r 等附1 在构建基因缌文库时，采用 特定孔径的滤膜去除了真核细胞，从而提高了环境基因组文库中原核微生物基因 所占的比率：此外，还可以通过富集培养基富集特定类群的微生物，如在培养基 中添加纤维素可以有效地得到与纤维素降解相关的微生物基因组。焉及壤中用 闻接法提取总d n a 一般是先把微生物从土壤等物质中分离出来，再裂解微生物 7 厦门大学硕士论文；红树抟沉积物细菌多样性分析及其功能基因筛选 细胞提取d n a 。这种方法是利用梯度离心的原理：首先把壤等样品与缓冲液 混合，加入玻璃珠等振荡，把细胞与土粒打散开，然后在低速5 0 0g - 1 0 0 0g 离心 力下离心2 1 5 分钟来除去如土粒、真菌等大皇勺颗粒，跟着用高速1 2 ，0 0 0 2 0 ，0 0 0 9 离心沉淀上清中的细胞。沉淀的细胞块按处理纯培养细胞的方法进行裂解提取 d n a 4 7 - 4 9 。也有利用离心介质如p e r c o l l ， m e t r i z a m i d e ，n y c o d e n z 等来分离细 胞：把打散的土壤悬液与离心介质混合后，经在1 0 0 0 0 x g 离心力下离心后，细 胞处于离心介质与液体之间，而土壤等固体杂质则位于离心介质之下，这样就可 以把细胞与杂质分开1 蚓。用离心介质的方法比用梯度离心方法得到的细胞污染 物少，但细胞回收率也低f 剐。 从环境样品中提取基因组的另神方法直接提取法：它是不经过微生物的分 离，直接从样品中提取微生物的基因组【5 l 】。此法不预先把细胞从土壤中分离出 来，直接在土壤中裂解细胞释放d n a 。土壤中的微生物是和各种土壤胶体紧密 吸附的，因而直接在土壤中裂解往往会造成细胞破裂的不完全，裂解后的d n a 与土壤胶体紧密吸附，使d n a 的丢失率达到了7 5 到9 0 吲，所以如何破裂 细胞使土壤中所有类型的微生物细胞破裂又不使d n a 发生丢失是个难题。a s a 认为研磨是最有效的裂解所有类型微生物细胞方法，但是染色体d n a 发生断裂， d n a 片段大小分布在2 0 至0 2k b 闻【5 2 】。z h o u 等认为联会使用研磨、冻融和s d s 裂解的方法可以使很多革兰氏阳性菌裂解，同时d n a 分子的断裂并不严重。因 此对于提取d n a 用于p c r 扩增的实验，应该把研磨、冻融和s d s 裂解联合使 用，这样就能最大程度地裂解土壤中各种类型的微生物，同时d n a 片段断裂也 不严重，足以作为p c r 反应的模板箨弱。c h e r y l 发现使用s d s 裂解加上玻璃珠研 磨，可以破裂难于破裂的革兰氏阳性菌，磊且对予孢子的破裂效果也很好，d n a 片段大小在1 5 2 4 妯闻，这个方法简便，适会予大批量p c r 快速分析环境微生 物区系组成肼】。两像用于构建c o s m i d 或b a c 等大片段d n a 文库的d n a 的提 取，则只能使用冻融加s d s 裂解的方法，这样也能够使革兰氏阳性细菌的细胞 裂解而又尽可能的避免d n a 发生断裂 5 3 5 5 l 。 两种方法相比：因为间接法破碎条件温和，所以得到的基因组分子量较大， 且纯度较高，适合较大片段文库的构建；但此方法获得的基因组一般仅为原核生 物来源且量较少l 熨】；而利用直接法得到更有广泛代表性的样品，所以箕应用比 8 厦门大学硕士论文：红树棒沉积物细菌多样住分析及其功能基因筛选 较广泛，但因为该方法破碎细胞条件较剧烈，容易引起基因组的断裂，且得到的 样品容易污染一些抑制酶切反应的物质如腐殖酸等，因此需要进一步的纯化来满 足文库构建要求。由于环境样品中的不同微生物有机体对各种细胞裂解方法具有 不同的敏感性，所以获得的基因组能否最大程度地反应样品中微生物的多样性， 在一定程度上受到基因组提取方法的影响，这也需要将来对各种提取方法进行系 统的比较研究。 2 ) 总d n a 的纯化 壤中存在的抑制性物质常觅的主要有腐殪酸、酚类化合物、重金属等。其 中腐殖酸的抑制作用最为明显。腐殖酸化合物的苯酚基团可与氨类基团结合，而 使腐殖酸共价结合于d n a 或蛋白质上，同时使生物分子变性或被氧化成醌。腐 殖酸还可以鳌合镁离子丽抑制t a qd n a 聚合酶的活性，使p c r 效率降低，1 0 r i g 的腐殖酸就可以完全抑制p c r 反应【4 7 】。腐殖酸不仅抑制d n a 聚合酶的活性， 还抑制裂解酶和内切酶的活性、d n a 杂交及感受态细胞的转化等【铝彤l 。不管是 闻接法还是直接法提取土壤中的d n a 都不可避免污染壤中的各种杂质，因此 在土壤d n a 分离的研究中，纯化非常重要。 目前有关纯化d n a 构建文库的报道不多。常见的方法主要有以下几种： ( 1 ) 商品化的羟基磷灰石柱或硅胶柱和葡聚糖凝胶柱。z h o u 认为腐殖酸会干 扰d n a 与w i z a r d 柱的结合，因而w i z a r d 柱只能用在电泳分离纯化步骤后来纯 化d n a 5 4 1 。r i c h a r d 把d n a 粗提液经过s e p h a d e xg 7 5 分部收集矗，使用p r o m e g a 公司的w i z a r d 柱纯化两次得到的d n a ，纯度足够作p c r 反应及杂交反应渺l 。 ( 2 ) 电泳分离法，z h o u 认为电泳分离法纯化的d n a 纯度足以进行p c r 反应，但 如果用电泳分离加上d n a 吸附柱的方法纯化d n a 效果更好【删。丽根据m i c h e l l e 的研究，d n a 经过用低溶点琼脂糖进行电泳分离纯化就可以建b a c 文库，但这 个结果和其他人的研究有矛盾之处，在m i c h e l l e 后有人尝试用这个方法纯化d n a 来构建文库但没有成功，这可能是不同壤样品污染物的不同导致无法得到通用 的纯化方法1 3 6 ，4 n 。比如p l a m a r a 根据z h o u 的文章使用电洗脱纯化得到的d n a 无 法建立文库，再在电泳分离法的基础上使用w i z a r d 柱( p r o m e g a 公司) 纯化d n a 得到的d n a 质量也缀低，无法使用来构建文痒l 矧。 ( 3 ) c t a b 和p v p p 。z h o u 的研究发现c t a b 和p v p p 都能去除d n a 中的腐 9 厦门大学硕士论文：红辩抟沉积物细菌多样性分辑及其功能纂困筛选 殖酸，但是p v p p 会吸附d n a ，导致d n a 的损失 5 4 1 。 综上所述，有关土壤等环境提取的总d n a 的纯化方法各异，没有形成统一， 对比不同的文献报道，可能还有矛盾之处。针对不同的材料样品，应该摸索采用 不同的纯化方法，甚至几种方法联用。 1 2 2 2 载体的选择 根据研究目的，环境基因组文库可以被分成两类：克隆于质粒载体中小片段 文库( 插入片段 4 0 k b ) s t l 。对载体的选择取决于获得的基因组d n a 的质量，所构建文库中 插入片段的大小，载体拷贝数的要求以及所用宿主及筛选策略等。小片段文库一 般适于筛选分离单个编码基因或小操纵子。丽基于c o s m i d 、f o s m i d 和b a c 的 大片段文库则适合筛选获得由较大基因簇编码的复杂代谢途径或能够表征环境 中未培养微生物基因组的较大基因片段 5 8 2 9 1 。无论构建上述何种环境基因组文 库，其中个无法回避的问题是所构建的文库能最大程度地涵盖样品的所有微生 物有机体。根据分析，如果所构建的文库要最大程度地反应土壤样品中分布稀少 微生物( l ) 的基因组的存在，则文库必须包含1 0 0 0 g b 的土壤d n a 6 0 1 。虽然许 多已经报道的文库远没有达到这一推测的标准，但它们已经为人们了解某些特定 的生态环境提供了许多有价值的信息。 载体的选择主要是针对有利于感兴趣的目标基因的扩增、表达及在筛选细胞 毒类物质时表达量的调控等【6 。很多微生物活性物质是其次生代谢产物，代谢 途径由多基因簇调控，尽量插入大片段以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必 要的。舀前多采用细菌人工染色体( b a c ) 和粘粒( c o s m i d ) 载体，前者插入片段大 ( 可达3 5 0 k b ) ，僵克隆效率低，后者插入片段中等( 2 0 - - 4 0 k b ) ，克隆效率高。b a c 和c o s m i d 载体在宿主细胞中的稳定性高，但拷贝数低，宏基因的扩增网难，表 达量低。为了提高宏基因的表达便于重组克隆子活性检测，有研究者直接利用表 达载体构建宏基因组文库。表达载体可插入的宏基因片段一般小于1 0k b ，适合 于筛选单一基因或小的操纵子产物。外源基因的表达受宿主细胞的遗传类型、细 胞基质、细胞的生理状态及初级代谢产物等的影响，利用穿梭载体扩大宿主范围 有利于健使和提高外源基因的表达。为提高和调控外源基因的拷贝数与表达量， 常需构建不同类型的载体，如h a n d e l s m a n 实验室构建的s u p c r b a c x 载体系列， 1 0 覆门大学嫒士论文：红树棒沉积魏缩蔷多样饿分辑及箕葫魏蒸因筛选 以p b e l o b a c i i 为骨架，添加各种复制原点，调控其拷贝数及宿主范围，利于外 源基因的表达及调控其表达量l 翻。 1 2 2 3 宿主的选择 选择适合的宿主细胞是重组基因高效克隆和表达的前提之一【6 3 l 。宏基因组 文痒多以缨蓥、酵母、链霉蓥为文霹的宿主蓥株。蕊抹簏选择主要考虑转化效率、 重组载体在宿主细胞中的稳定性、宏基因的表达、目标性状( 如抗菌) 缺陷型镣。 研究经验表聪，不同微生物种类所产生的活性物质类型有明显差异，不同的研究 霹标痘选择不翼豹宿主菌抹，魏弼静抗生素来源予敖线慧，如戮寻找抗藏抗 肿瘤活性物质为目标，选择链霉菌为宿主较理想，而筛选新的酶则采用大肠杆菌 为宣f 删。 宿主菌株鲶选择考虑其转纯效率，麓否茭相关功麓基因援供毖需酶转录表达 体系，以及是否对异源表达基因产物有较强的相容性等【6 5 1 。太肠杆菌是自然界 中人们最必熟识的原核生物，并且其遗传操作简单，能在廉价的培养基中快速生 长。因j 琏：，大多已经报道翡琢境基霆组文库都激大肠括菌作为瘩主。僵是，巍然 界中并非所有的基因都可以在大肠杆菌中表达，比如有些含量高的基因启动予无 法被识别褥起始转录，或是宿主缺少合成某种物震( 懿抗生素) 的中闻体；有的 基嚣麴表达产物对宿主的生长有抑制或毒害终耀，竣是表达产物无法分泌刘细胞 外，这些问题的存在限制了通过环境基因组学手段发现新的功能产物，也使得发 展、建立新的替代宿主系统成为必要。已经有研究报道构建了可以在大肠枵菌帮 链霉菌或瑕单孢萤润攘合转移c o s m i d 帮b a c 和载俸，从而可以把在大肠耔菌 中构建的基因组文库转移到链霉菌域假单孢菌中，以实现对某些特定功能基因的 筛选5 默。m a r t i n e z 等【删以大肠杆菌隽宿主，梅建了环境基因维文库，通过穿梭质 粒( f o s m i d ) 静接合律瘸，继两梅建了戳s t r e p t o m y c e s l i v i d a n s 和p s e u d o m o n a s p u t i d a 为宿主的表达文库。 嚯2 。2 。4 宏基因组文库的分析 对环境基嚣组文库分析有三辩选：以功能为基础的筛选、以序列为基础的筛 选以及最近提出的底物诱导基因表达分析( s u b s t r a t e i n d u c e dg e n e e x p r e s s i o n s c r e e n i n gs i g e x ) 。 i ) 以功能为基础的筛选( f u n c t i o n a l - b a s e ds c r e e n i n g ) 厦门大学硕士论文：红树林沉积物细莹多样性分析及其功能麓因筛选 以功能为基础的筛选最初是从文库中选择克隆以表达想褥到的特性，此后用 于分子生物学和生物化学分橱描述表达活性的克隆。这些鉴别克隆的方法在新药 的发现上有潜在的应用价值。所获取豹有活性的蛋白质在工业和农业上也具有一 定的用途。采取这种方法可以从环境基因组文库中迅速找到产生具有直接应用于 工业的产物的克隆。此外，它也能用于检测产生编码已知生物产物序列d n a 序 列。这种手段的缺陷是它要求在宿主细胞中表达所想要的功能和要求了解表达该 功能的基因联系起来。它同样需要建立库容大的文库使人们便利和有效地筛选对 含有人们感兴趣的特性的克隆。因为获取所需的克隆数量很少，为了克服这些困 难，人们使用了很多