（微生物学专业论文）复合红曲血制红色素的开发与应用.pdf

、 黑龙江大学硕士学位论文 i i i i i i i i i i i _ ti l l _ 一 i ii i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i a b s t r a c t t h eb l o o do fl i v e s t o c ka n dp o u l t r yi so n eo ft h em a i nb y p r o d u c t si ns l a u g h t e r i n g a n dp r o c e s s i n gi n d u s t r i e s ，b u tt h eu t i l i z a t i o nr a t eo fa n i m a lb l o o di sv e r yl o w , a n dm o s t o ft h el i v e s t o c ka n dp o u l t r yb l o o dh a sb e e nd i s c a r d e d p i g m e n tp r o d u c e df r o mt h e u t i l i z a t i o no fl i v e s t o c ka n dp o u l t r yb l o o dc a nb eu s e di nf o o da n dm e d i c i n ei n d u s t r i e s w h i c hc a nc r e a t eg r e a ts o c i a la n de c o n o m i cv a l u e s b l o o d - d e r i v e dp i g m e n t sc a nn o t o n l ys t a i n i n gt h ep r o d u c t s 晰t 1 1d e s i r e dc o l o r ，b u ta l s oi m p r o v et h en u t r i t i o n a lv a l u e u pt on o w , n oh e m o c h r o m eh a sb e e nm a r k e t e db e c a u s eo ft h ep o o rs t a b i l i t y , w e a k c o l o r a t i o ns t r e n g t ha n do t h e rs h o r t c o m i n g s t h es t a b i l i t ya n dc o l o r a t i o ns t r e n g t ho f m o n a s c u sr e dp i g m e n ta r eg o o d ，b u tt h e i rn u t r i t i o n a lv a l u ei sn o tr i c h t h ea i mo ft h i s s t u d yi st od e v e l o pc o m p o u n dr e dp i g m e n t sw h i c hc o m b i n et h ea d v a n t a g e so ft h e h e m o e h r o m e 、析t l lt h o s eo fm o n a s c u sr e d t h i sp i g m e n tm a yh a v eg r e a te c o n o m i ca n d s o c i a lv a l u e ，w i t hb r o a dm a r k e t p r o s p e c t s t h er e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sw a su s e dt oo p t i m i z et h et e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r s f o rt h eb l o o d d e r i v e dh a e m a t o c h r o m ep r o d u c t i o n , w h i c hs h o w e dt h a tt h eo p t i m u m c o n d i t i o nf o r t h ep r e p a r a t i o no fb l o o d d e r i v e dh a e m a t o c h r o m ei s ：0 3 9 8 9 10 0 m l s o d i u mn i t r i t e ，0 4 0 9g lo o m lv i t a m i nca q u e o u ss o l u t i o na n dt h e r m a lt r e a t m e n tf o r 2 6 4 m i n t h e nt h eb l o o d - d e r i v e dh e m o c h r o m ew a sc o m b i n e dw i t hm o n a s e u sr e dp i g m e n t ， a n dag o o dp r o t o c o lw a sd e t e r m i n e db ym e a s u r i n gr e dv a l u e c o n s i d e r i n gt h e c o l o r a t i o nv a l u e ，h u ea n de c o n o m i cc o s t ，t h er a t i oo fm o n a s c u sr e dp i g m e n tw a s d e t e r m i n e da s3 ，a tw h i c hl e v e lt h es o l u b i l i t ya n ds t a b i l i t yo fr e dp i g m e n tw e r eg o o d , c o m p a r e d 诵t l lt h er e dp i g m e n to fr e db l o o ds y s t e m f i n a l l y ，s o m ep r o p e r t i e so f c o m p o s i t er e dp i g m e n t sw e r es t u d i e da n dt h e s ep i g m e n t sw e r ea p p l i e dt ot h e r e d s a u s a g e 、舫t l lo p t i m a lu s a g e a t0 8 9 k g k e yw o r d ： m o n a s c u sr e dp i g m e n t ；b l o o ds y s t e mo fr e dp i g m e n t ；c o m p o s i t er e d - a b s t r a c t p i g m e n t ；n i t r o s o h e m o g l o b i n i h 黑龙江大学硕士学位论文 目录 摘i i l 罢i a b s t r a c t i i 第1 章前言1 1 1 复合食品色素简介1 1 2 血制红色素的研究概况。2 1 2 1 血制红色素的反应机理2 1 2 2 血制红色素的国内外研究进展2 1 2 3 血制红色素存在的问题和发展趋势4 1 3 红曲红色素简介6 1 4 本研究的目的和意义7 第2 章复合红色素的制备工艺的研究9 2 1 实验材料9 2 1 1 实验原料一9 2 1 2 实验试剂。9 2 1 3 仪器1 0 2 2 实验方法一1 0 2 2 1 血制红色素的制备试验1 0 2 2 - 2 复合红色素的制备试验1 2 2 3 结果与分析1 3 2 3 1 血制红色素的制备工艺条件优化试验1 3 2 3 2 复合红色素的制备2 3 2 4 小结2 4 第3 章复合红色素稳定性研究。2 6 3 1 材料2 6 3 1 1 原料2 6 i 3 3 1 低温保藏对复合红色素稳定性的影响2 8 3 3 2 光照对复合红色素稳定性的影响2 9 3 3 3 温度对复合红色素稳定性的影响2 9 3 3 4 金属离子对复合红色素稳定性的影响3 0 3 3 5p h 对复合红色素稳定性的影响3 0 3 4 小结3 l 第4 章复合红色素在肉制品( 红肠) 中的应用研究3 2 4 1 材料3 2 4 1 1 原料3 2 4 1 2 培养基及主要试剂3 2 4 1 3 主要仪器3 2 4 2 试验方法3 3 4 2 1 红肠的制作工艺3 3 4 2 2 复合红色素应用于红肠中的各种指标的测定方法3 4 4 - 3 结果与分析一3 5 4 3 1 复合红色素对红肠的颜色的影响3 5 4 3 2 复合红色素对红肠中的亚硝酸钠残留量的影响3 7 4 3 3 红肠的感官评定3 7 一 一 黑龙江大学硕士学位论文 4 4 小结3 8 结论3 9 参考文献。4 0 致j 射4 7 攻读学位期间发表的学术论文4 8 - 第1 章前言 第1 章前言 1 1 复合食品色素简介 复合食品色素是将两种或者两种以上的色素或色素与其他的添加剂按适当的 比例复合在一起而形成的一种复合产品n 1 。 复合食品色素的复合形式主要有以下几种： ( 1 ) 两种或两种以上食品色素进行复合。单一的食品着色剂不可能把所有颜色 都表现出来，需要将一些基本色的色素进行二次、三次调配嘲。现在许多食品色 素生产商将一些基本色的色素复配调成人们所需要的颜色，减少了使用者的操作 程序，方便使用。 ( 2 ) 食品色素与其他食品添加剂进行复合。施春权等口1 就是利用猪血来制备的 亚硝基血红蛋白与防腐剂复合使用，应用于红肠中，这样使得色素的功能更加的 完备，除了具有传统的食品着色剂的功能外，还具有防腐剂的功能。 与单一的食品色素相比较，复合食品色素有着十分显著的优点： ( 1 ) 协同互补、功能齐备、效果显著。不同的物质，由于其化学组成和结构的 不同而具有不同的性质，当不同物质同时存在时，往往因为相互之间的作用和影 响而使其性质在不同程度上发生改变h 1 。通过复合，可以使色素之间相互协同或 相互增效作用，扩大食品色素的使用范围和功能，解决一些单一的色素无法解决 的问题。 ( 2 ) 降低食品色素的使用量及成本，增加食品的安全性旧。通过复合，利用食 品添加剂的协同增效，可以降低每一种色素的使用量，降低生产的成本，而又能 够达到令人满意的效果，从而使食品色素的副作用尽量降低，保障消费者的健康。 ( 3 ) 改善产品的性能，满足人们对产品的性能的要求。单一的食品色素往往存 在很多物理化学性能上的缺陷，通过将单一的食品色素进行复合，往往可以改善 其性能，达到人们对产品的要求哺1 。 ( 4 ) 方便储藏、运输和使用。采用复合食品色素，可以简化运输、储藏和使用 黑龙江大学硕士学位论文 过程中的操作程序，实现食品色素的“傻瓜化”，更加方便快捷，同时避免了在使 用过程中出现的偏差，使食品添加剂更加的安全可靠n 1 。使用者如使用复合食品 色素，一次性的进行投放，避免了因使用单一食品色素的多次称量、多次溶解的 繁琐工序，简化了操作程序，而且能避免因多次称量和溶解而造成的食品质量的 波动。 1 2 血制红色素的研究概况 1 2 1 血制红色素的反应机理 血制红色素( b l o o ds y s t e mo f r e dp i g m e n t ) ，也有人称腌肉色素，其主要成分是 亚硝基血红蛋( n i t r o s o h e m o g l o b i n ) ，呈粉红色口3 。它是利用亚硝酸盐( n 0 0 与血红 蛋白( h b ) 进行反应得到的。血红蛋白与肌红蛋的结构很相似，均是以血红素为辅 基的蛋白质，血红蛋白和亚硝酸盐的反应机理与亚硝酸盐和肌红蛋白的反应机理 伽是一样的，只不过肌红蛋白对n o 。的结合能力大于血红蛋白嗍。采用亚硝酸盐在 一定条件下先同血液中血红蛋白相结合生成血制红色素( 亚硝基血红蛋白， h b n o ) 。将血制红色素加到肉制品中，亚硝基血红蛋白便会与肌红蛋白接触，但 因n o 。与肌红蛋白的结合力更强，所以n o 立即被处于饥饿状态的肌红蛋白抢去 n 町，形成稳定的亚硝基肌红蛋白( m b n o ) ，使肉制品呈鲜亮的红色n u 。而剩余的 n o - 与会与血红蛋白结合，从而使肉制品中n o 。残留量大大的降低了。其化学反 应过程为n 铂： n a n 0 2 + c h 3 c h o h c 0 0 h 一卸n 0 2 + c h 3 c h o h c o o n a 2 h n 0 2 _ n c n 0 2 + h 2 0 h b 年n o h b n o h b n o + n 0 2 + m b - m b n o + h b n o + h b 1 2 2 血制红色素的国内外研究进展 1 2 2 1 国外血制红色素的研究进展 国外血制红色素的研究比较早，1 9 6 2 年，t a r l a d g i s n 由丙酮提取腌肉色素进 一 一 - 第1 章前言 行光谱分析，提出该色素为二亚硝基血红素。在1 9 6 6 年f o x n 卜1 5 3 就认为肉的颜色 主要由血红蛋白和肌红蛋白呈现，在肉中加入亚硝酸盐后腌肉发色，腌肉在加热 时肌红蛋白( m b ) 与一氧化氮形成了亚硝基亚铁血色原，即呈现粉红色。1 9 8 6 年， l e e 和g a s s e n s n 6 1 实验证明血制红色素的化学结构是二亚硝基亚铁血色原( d n f i - i ) 。 1 9 8 4 年，s h a h d i 和r u b i n 等n 7 。1 8 1 以牛血中的血红素为原料合成制取了血制红色素 ( 亚硝基血红蛋白) ，他们是先采用乙酸盐法和丙酮酸法从牛血中制备高铁血红素， 然后利用n o 进行合成，或者利用亚硝酸钠在还原剂的存在下发生反应，但利用 这种方法所生产的色素极其不稳定。1 9 8 7 年，s m i t h 与b u r g en 叼将原卟啉添加 到肉中，但是却不能再现亚硝酸盐作为肉制品发色剂所赋予的肉制品的粉红色泽。 1 9 9 1 年，s h a h i d i 啪1 直接采用血红蛋白和亚硝酸钠进行合成血制红色素( 亚硝基血 红蛋白) ，这种方法不再使用大量的有机溶剂和n o ，从而使操作步骤简化，并且 降低了操作的危险性。1 9 9 6 年c h a s e o 掣2 1 1 人报道了在香肠加工过程中腌肉色素 的形成过程。 1 2 2 2 国内血制红色素的研究进展 国内，血制红色素的研究起步较晚，从上世界八十年代才开始逐步发展起来 的。1 9 9 5 年，张坤生嘲还报道了用亚硝酸钠与血红蛋白合成亚硝基亚铁血色原的 研究，对其合成的色素与s h f l i d i 等人用纯氯化血红素在还原剂作用下与一氧化氮 反应所制的亚硝基亚铁血色原吸收光谱相比较，得出二者的吸收光谱一致。1 9 9 7 年，曹稳根等报道了以新鲜畜禽血为原料，经化学提取、合成及酶解等步骤制 成亚硝基血红色素，并对这种色素的进行了成分分析，得出这种产品是一种无毒 副作用的理想食品着色剂，并增加了食品的营养成分。1 9 9 8 年，张坤生阻1 等通过 加入抗坏血酸调节反应液的p h ，然后用一氧化氮和血红蛋白反应合成亚硝基血红 蛋白。2 0 0 1 年，马美湖嘲用乳酸调节p h ，加入异v c 、尼克酰胺、亚硝酸钠进行 加热反应，制得血制红色素。2 0 0 6 年，黄群等啪1 研究了亚硝基血红蛋白的稳定性 和溶解性，结果表明：亚硝基血红蛋白对热不敏感，但对光照、氧化剂、二价铁 离子敏感；p h 值的改变对亚硝基血红蛋白有一定的降解作用；食品辅料、大部分 金属离子对亚硝基血红蛋白没有不良影响。2 0 0 8 年，施春权防刎等对亚硝基血 黑龙江大学硕士学位论文 红蛋白的起泡性、持水性、溶解性、乳化性、以及对其在肉制品中的应用进行了 研究。2 0 0 9 年郑丽红晒3 等以新鲜猪血为原料，分离得到血红蛋白溶液后，不先制 备血红素，而以维生素c 作还原剂，亚硝酸钠作发色剂，直接制备半干固体亚硝 基血红蛋白( h b n o ) 。 1 2 3 血制红色素存在的问题和发展趋势 色价是衡量色素指标的重要标注之一，目前血制红色素的色价还不是很高， 如何提高血制红色素的色价就成为研究的一个热点。如去除杂蛋白的影响，提高 血红蛋白的纯度，从而减少亚硝酸钠与血红蛋白反应时杂蛋白对色价的影响。郑 立红剀等采用o 9 的生理盐水进行洗涤红血球，去除了血清中的杂蛋白，提高血 红蛋白的浓度。着色力是指该色素在使用中对食品的着色能力。着色力越强，使 用量小且色泽不退，否则，用量大且受外界影响色泽易退色嘞1 。所以应该尽量的 降低色素的使用量，提高色素在使用时的稳定性，使其不受外界的影响仍保持较 好的色泽。 困扰着血制红色素的应用的另一个问题就是稳定性较差。1 9 8 5 年，s h a h d i n 阳 对这种色素的稳定性进行了研究，发现血制红色素极其不稳定，容易褪色。血制 红色素( 亚硝基血红蛋白) 是n o 结合了血红蛋白上的血红素而形成的一种大分子 物质，而光能加速n o 与血红素的分离，当二者发生分离时，n o 和血红素中的 f e 2 + 便会分别被空气中的氧氧化，使得色素发生褐变n 司。 为此，许多研究者利用各种办法来延缓这种氧化的发生：方面是通过避光 密封保存，阻断色素与光和空气接触，从而延缓n o 与血红素的分离，避免了n o 和f e 2 + 被氧化。p e g g 口订等研究表明将血制红色素暴露在空气中仅能保持一天，如 用填充n o 气体的试管中密闭保存，见光下能保存3 周，避光保存只能保存5 周， 所以血制红色素应该尽量避光密闭保存。另一方面是从抗氧化方面进行的研究。 ( 1 ) 在反应体系中加入抗氧化剂，常用的有抗坏血酸、异v c 钠、柠檬酸钠等。李 胜华嘲等对抗氧化剂的类型进行了比较，发现异v c 钠较好。( 2 ) 进行糖基化反 - 第1 章前言 应。k a t oa 1 等发现，蛋白质和多糖在蛋白质变性温度下加热发生糖基化反应， 反应所形成的复合物具有良好的稳定性和乳化性，因此许多人将糖基化反应运用 到血制红色素的制备过程中，旨在提高色素的稳定性和分散性。1 9 9 5 年m a t s u d o m i 等口叼报道了通过将猪的血浆蛋白与半乳甘露聚糖进行美拉德反应，生成的共价复 合物具有良好的乳化性质。其美拉德反应产物中的褐变产物正好可作为着色剂。 杨锡洪嘲研究了糖基化亚硝基血红蛋白，得出结论，采用壳聚糖与亚硝基血红蛋 白形成的复合物最为稳定。邢绍平等1 对添加蔗糖和不添加蔗糖的这两种不同的 条件下的血制红色素进行了稳定性进行了比较，结果表明添加蔗糖的血制红色素 较未添加蔗糖的稳定性好。( 3 ) 利用微胶囊化在色素外面包一层保护膜，避免色素 与空气中的氧接触而发生氧化。s h a h i d i 等d 刀对其进行了微胶囊化处理，使其保质 期延长到1 8 个月或更长时间；0 b o y l e 汹1 等分别对血制红色素微胶囊化干燥工艺 进行了研究；钟耀广嘲利用微胶囊法包埋亚硝基血红蛋白，包埋后色素的热稳定 性和光照稳定性均有所提高。但是这种方法并不理想，被包埋的色素的溶解性和 分散性均变差，而且色素的稳定性提高不是很大，色素的包埋率也不高，生产成 本也相应的提高了，实际意义不大。 血制红色素因为存在着以上这些缺点，至今血制红色素仍没有被大规模的生 产，应用到食品药品中。所以如何改进血制红色素的生产工艺，提高其色价、稳 定性和着色力问题，成为解决其应用的主要研究方向。笔者认为未来利用畜禽血 制备红色素的研究从两方面着手：一方面从其制备的工艺着手，改进其工艺流程， 优化生产条件；另一方面可以与其他色素进行复合，利用其他红色素的自身的一 些优点弥补血制红色素的缺点，提高其稳定性和着色力，使得其能有效的运用到 食品和药品当中。现在获得批准使用的红色素主要有红曲红、高梁红、胭脂红、 苋菜红等，其中苋菜红、胭脂红属于人工合成色素，红曲红色素和高粱红色素属 于天然色素。因为人工合成色素存在着一些安全上的问题，目前已经不提倡使用 人工合成色素，所以在选择与血制红色素复合的红色素的时候，着重从高粱红色 素和红曲红色素进行考虑。高梁红色素的红度值与血制红色素相近，当二者进行 复合时，对血制红色素的红度值的提高并没有太大的帮助，所以选择了着色效果 黑龙江大学硕士学位论文 好、性质稳定的红曲红色素作为复合的对象。 1 3 红曲红色素简介 红曲红( m o n a s c u sr e d ) 另s j 名红曲色素，是红曲霉的次生代谢产物，属于酮类色 素，主要含有六种主要成分，即红色素( 红斑素、红曲红素) 、紫色色素( 红斑素、 红f h j 红胺) 和黄色色素( 红曲素、红曲黄素) n 一。 q 捌【o 曲a 叫锄崎m = 3 8 2 m o n a s c o r u b r a m i n e1 d - - 3 8 1 a n k d l | 临t 性3 8 6 图卜1 红曲红色素主要成分结构 f i g l 1t h es t r u c t u r eo f t h em a i nc o m p o n e n t so f m o n a s c u s 红曲红为深紫红色液体或呈粉末状，略带异臭。熔点介于1 6 5 1 9 0 之间。 不溶于油性和非极性溶液，易溶于中性或者偏碱性水溶液，极易溶于乙醇、丙二 醇、丙三醇及他们的水溶液嘲。 与其他天然食用色素相比，红曲红色素对p h 稳定，耐光性、耐热性都很强， 几乎不受金属离子、氧化还原剂的影响，对蛋白质的着色性极好，一经染色后， 即使用水洗也会不褪色1 。 近年来，随着国内外学者对红曲红色素不断深入的研究，红曲色素被广泛应 用于酒类、酱油、豆制品、面制品、肉制品和腌制蔬菜等方面，除了起到着色和 防腐的作用外，还具有保健等功能州。经研究表明，红曲色素能具有清除自由 基、降低体内的低密度脂蛋白、胆固醇和甘油三酯的水平，改善紊乱的脂质代 谢、防止动脉硬化等保健功能h 7 刮；经小宾清弘、迁启介h 町研究，发现红曲具有 降血压的作用；红曲色素还具有杀菌或抑菌作用蚋订及抑制突变的作用删。 红曲红色素是一种安全性较高的天然食用色素嘲1 ，他不含黄曲霉毒素；动物 性试验表明，急性、亚急性、慢性毒性试验及致突变性试验，都无毒性，也无致 突变作用嘲1 。但是，经研究发现，某些红曲霉菌株在发酵晚期，容易产生次级代 谢产物桔霉素一l 它对肾脏有毒害和致畸作用。所以许多国家制定了红曲中桔霉 素含量标准，桔霉素也限制了红曲红色素的发展。 1 4 本研究的目的和意义 以畜禽血为原料生产的食品红色素是充分利用畜禽血资源和降低肉制品中亚 硝酸盐残留量的有效途径。国内外已经有大量的针对血制红色素的合成工艺进行 的研究，但是血制红色素仍存在着色价不高、稳定性差、着色力不强的特点，到 目前为止还未能实际地应用于食品中。因此，本论文的工作具有重要的实际应用 意义和学术价值。 1 、有效的利用畜禽血资源。 我国是个农业大国，畜禽养殖很发达，作为生产血制红色素的原料一畜禽 血来源广泛。1 9 9 5 - - 2 0 0 6 年1 0 年时间，年出栏商品猪增2 4 亿头嗍。2 0 0 6 年底， 我国出栏商品猪6 2 亿头；2 0 0 7 年全国生猪出栏量为5 6 5 0 8 3 3 万头；2 0 0 8 年全年 生猪出栏6 0 9 6 0 万头嘲；2 0 1 0 年初至今，全国生猪存栏量4 6 9 亿头。屠宰一头毛 猪大约可收集3 k g 左右血液，全国一年的畜禽血资源是极其丰富的，提高畜禽血 的利用率迫在眉睫。 但是畜禽血的利用率确不高，利用率尚不到1 嗍，除了少部分用作菜肴食 用、加工成饲料1 1 和提取成生化药物和生化试剂的外幻，大部分的猪血被遗弃， 造成了大量的浪费，而且还污染环境。因此，利用猪血来生产血制红色素在经济 上是可行的，而且还可以减少环境的污染。 2 、猪血营养价值丰富，利用其生产的色素将会是一种多功能的色素。 猪血的营养极其丰富，含有较高的蛋白质，全血含有1 7 - 2 1 的蛋白质旧1 ， 以及丰富的微量元素，与猪瘦肉相当，故有“液态肉”之称帆矧。另外，猪血中含 有较高的血红素铁，含量超过4 0 m g l o o m l ，而瘦猪肉中仅含有1 6 m g l o o g 的血 黑龙江大学硕士学位论文 红素铁嘲1 。猪血中的血红素铁是f e 2 + ，吸收率约为1 5 - 2 5 ，无一般补铁剂的 肠胃刺激作用嘲1 ，易被人体吸收，是一种极其重要的补铁剂。猪血中的血红蛋白 有着良好的乳化性和起泡性，被广泛的应用于肉制品加工中，提高产品的保水性、 切片性、弹性、粒度、产品率等旧1 。因此，以猪血为原料制备的血制红色素加入 到肉制品中，不仅能作为着色剂外，还能提高营养价值、改善产品质地等，因此 血制红色素将会是一种多功能的食品添加剂。 3 、有效地提高色素的色价、稳定性和着色力。 目前利用畜禽血生产的血制红色素由于其稳定性差着色力不强的缺点，限制 了其在实际中的应用。由于血制红色素是一种大分子物质，色素中的f e 2 + 又极易 被氧化，虽然采用添加抗氧化剂、进行糖基化反应、采用色素包埋等手段来提高 色素的稳定性，但是仍不能达不到色素作为商品应用的要求。所以，笔者除了对 血制红色素的生产工艺进行优化，还要通过复合红曲红色素，来生产出一种色价 高、稳定性好、着色力强、经济价值高的产品。这种复合的红色素兼具了单一的 血制红色素和红曲红色素的优点，不仅能弥补血制红色素色素色价不高，稳定性 不好的缺点，而且能提高红曲红色素的营养价值，降低色素的成本，方便使用， 因此这种复合色素的市场前景极其广阔。 i 第2 章复合红色素的制备工艺的研究 第2 章复合红色素的制备工艺的研究 2 1 实验材料 2 1 1 实验原料 新鲜猪血：由雨润集团提供； 红曲霉：由哈尔滨商业大学提供。 2 1 2 实验试剂 亚硝酸钠、抗坏血酸、蔗糖、氢氧化钠、9 5 乙醇等均购于哈尔滨市德美生 物试剂公司，均为分析纯，其它的试剂均为实验室常用化学纯试剂。具体见方法。 红曲红色素的制备： 红曲霉的培养 菌种活化嘲：n a n 0 3 0 3 k c l 0 0 5 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 0 0 1 f e s 0 40 0 0 1 ， m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 ，蔗糖3 ，p h 为5 4 ，3 0 ( 2 、16 0 r r a i n 摇瓶培养6 d 。 种子培养基幻：玉米粉5 ，豆饼粉2 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 0 0 1 ， m g s 0 4 7 h 2 0 1 5 ，p h 为5 4 ，3 0 ( 2 ，2 0 0 r r a i n 摇瓶培养7 2 h 。 发酵摇瓶培养基嘲：淀粉3 ，硝酸钠0 1 5 9 6 ，k h 2 p 0 4 0 1 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 1 ， p n 为5 5 6 0 ，3 0 ，2 0 0 r r a i n 的条件下培养7 2 h 。 红曲红色素的提取 过滤发酵液，将湿菌体置于8 0 干燥箱中烘干2 4 h ，然后加入9 5 乙醇浸提 1 h ，过滤，然后将滤液进行真空浓缩，回收酒精，浓缩液置真空干燥箱中干燥即 得红曲色素成品，作为实验的原料备用。 对反应得到的红曲红色素溶解，稀释5 0 0 倍，后用色差计测量其红度值a ， 得到该红色素的红度值为5 8 3 5 黑龙江大学硕士学位论文 2 1 3 仪器 l r h 2 5 0 生化培养箱上海一恒科技有限公司 l d z m 7 5 型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂 s w - c j 2 f d 型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司 b c d - 2 3 1 w b 冰箱青岛海尔电器股份有限公司 t d l 5 台式低速离心机上海安亭科学仪器厂 d k - s 2 6 电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司 电子天平上海精密科学仪器有限公司 b - 2 9 0 型小型喷雾干燥器瑞士布奇公司 p h s - 3 c 精密p n 计上海精密科学仪器有限公司 d h g 9 1 4 0 型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司 s c 8 0 型全自动色差计北京康火仪器有限公司 2 2 实验方法 2 2 1 血制红色素的制备试验 2 2 1 1 血制红色素的制取 ( 1 ) 血制红色素的制备工艺流程 新鲜猪血预处理- 冷发色_ 离心、收集红细胞_ 破壁_ 热反应一离心去沉淀 _ 糖基化一喷雾干燥一血制红色素 ( 2 ) 血制红色素的制备方法 预处理：向新鲜猪血中加入一定量的v c 抗凝抗氧化处理。 冷发色：将预处理的猪血加入一定量的亚硝酸钠，于4 c 冰箱中反应一段时 间进行冷发色。 离心、收集红细胞：将发色后的全血用离心机以3 0 0 0 r m i n 的速度离心g r o i n ， 弃去上清液。 破壁：加入等体积的v c 水溶液，然后于4 。c 冰箱中存放3 0 m i n ，使红细胞 第2 章复合红色素的制备工艺的研究 胀破。 热反应：再将反应液置于电热恒温水浴锅中加热反应一段时间，期间间歇 搅拌。 离心去沉淀：以3 0 0 0 r r a i n 的速度离心8 m i n ，弃去沉淀。 糖基化：向上清液中加入蔗糖，置于电热恒温水浴锅中进行糖基化。 喷雾干燥：将糖基化后的反应液进行喷雾干燥。喷雾干燥条件：进口温度 1 9 0 ，出口温度7 0 - - 8 5 。 2 2 1 2 影响血制红色素红度值的单因素试验 ( 1 ) 不同的亚硝酸钠添加量的试验 向猪血中加入o 5g l o o m l 的抗坏血酸( v c ) 进行抗凝抗氧化处理，然后选择 0 jg l o o m l 、0 2g l o o m l 、0 3g l o o m l 、0 4g l o o m l 、0 5g l o o m l 、0 6g l o o m l 、 o 7g l o o m l 、0 8g n o o m l 八个浓度梯度添加亚硝酸钠，冷反应3 h ，然后6 0 c ， 加热3 0 m i n ，离心后进行糖基化，蔗糖浓度3g l o o m l ，6 5 加热2 0 r a i n ，后经喷 雾干燥，利用色差计测定所得样品的红度值。 ( 2 ) 不同的v c 的添加量试验 选择0 1g l o o m l 、0 2g n o o m l 、o 3g l o o m l 、0 4g l o o m l 、0 5g l o o m l 、0 6 g lo o m l 、0 7g lo o m l 的浓度梯度添加v c 进行抗氧化，然后添加0 5g lo o m l 的亚 硝酸钠，其余步骤同上，测定所得样品的红度值。 ( 3 ) 不同的冷反应时间试验 对冷反应时间进行实验，加入o 4g l o o m l 的亚硝酸钠，o 5g l o o m l 的抗坏血 酸，选择l h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h 、6 h 、7 h 、8 h 的时间梯度进行冷反应，6 0 加热3 0 m i n ， 然后对反应液进行糖基化反应，糖基化反应条件为3 的蔗糖，6 5 加热2 0 m i n ，然 后进行喷雾干燥，测定所得样品红度值。 ( 4 ) 不同的v c 水溶液的浓度试验 对v c 水溶液浓度进行实验，选择0 1g n o o m l 、0 2g l o o m l 、0 3g l o o m l 、0 4 g l o o m l 、0 5g l o o m l 、0 6g l o o m l 、0 7g l o o r n l 的浓度梯度，其他反应条件同 黑龙江大学硕士学位论文 上，对所得样品进行红度值测定。 ( 5 ) 不同的热反应时间试验 对热反应时间进行试验，加热温度为6 0 ，选择加热时间分别为1 0r a i n 、2 0 m i n 、3 0m i n 、4 0m i l l 、5 0m i n 、6 0m i n ，其他条件同上，对所得样品进行红度值 测定。 ( 6 ) 不同的热反应温度试验 对加热条件进行实验，加热温度分别为4 5 。c 、5 0 、6 0 、6 5 、7 0 。c ，分 别加热2 0 m i n 。其他条件同上，对所得样品进行红度值测定。 ( 7 ) 不同的蔗糖浓度试验 添加浓度分别为1 0g l o o m l 、2 0g 0 0 m l 、3 0g 1 0 0 m l 、4 0g 1 0 0 m l 、5 0 g 1 0 0 m l 、6 0g 1 0 0 m l 的蔗糖以后，6 5 加热2 0 r a i n ，其他条件同上，对所得样品 进行红度值测定。 ( 8 ) 糖基化反应时间试验 添加蔗糖后，糖基化的反应时间选择5 m i n 、 0 m i n 、1 5 r a i n 、2 0 m i n 、2 5 r a i n 、 3 0 m i n 、3 5 r a i n ，其他条件同上，对所得样品进行红度值测定。 ( 9 ) 糖基化反应温度试验 加入3g 1 0 0 m l 的蔗糖，然后分别在5 0 c 、5 5 。c 、6 0 。c 、6 5 c 、7 0 0 c 条件下 加热2 0 m i n ，进行糖基化反应，后经喷雾干燥，用色差计测其红度值。 2 2 1 3 血制红色素制备工艺的优化试验 根据以上单因素试验确定的最佳条件，进行b o x b e n h n k e n 试验。选择因素 时主要选择单因素试验中对响应值有显著影响的因素。采用s a s 9 1 对试验数据 进行回归分析，优化血制红色素的生产工艺。 2 2 2 复合红色素的制备试验 将利用2 2 2 方法制备的血制红色素，在喷雾干燥前，分别称取不同质量的 红曲红色素溶于血制红色素液态样液中，搅拌均匀，然后进行喷雾干燥。复配方 案如下，即按红曲红色素占血制红色素液态样液的o 5 、1 o 、1 5 、2 o 、 第2 章复合红色素的制备工艺的研究 2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、4 5 、5 o 的浓度梯度( 即为每lo o m l 血制红色素 反应液中加入0 5 9 、lg 、1 5g 、2g 、2 5g 、3 卧3 5g 、4g 、4 5g 、5g 红曲红 色素) 进行复配，搅拌均匀后，然后进行喷雾干燥。然后用色差计分别测定所得 样品的固态的红度值a 幸。 2 3 结果与分析 2 3 1 血制红色素的制备工艺条件优化试验 2 3 1 1 血制红色素的制备过程中单因素的影响 ( 1 ) 亚硝酸钠最适添加量对血制红色素红度值的影响 针对对亚硝酸钠的添加量进行实验，选择0 1g 10 0 m l - - o 8g l o o m l 浓度范 围添加亚硝酸钠，对所得色素红度值进行比较，结果如图2 - 1 所示。 4 2 4 1 0 4 0 趔3 9 簧3 8 3 7 3 6 oo 10 2o 30 4o 50 6o 7o 80 9 亚硝酸钠添加量( g l o o m l ) 图2 - 1 亚硝酸钠添加量对红度值( a ) 的影响 f i 9 2 - 1e f f e c t so fs o d i u mn i t r i t ec o n c e n t r a t i o no nc h r o m o g e n i cr a t e ( a ) 由图2 1 可知，n a n c h 添加量影响着红色素的红度值，随着n a n 0 2 添加量增 大，色素的红度值越高，在0 4 9 l o o m l 时达到最高，此后红度值呈下降趋势， 0 6 9 1 0 0 m l 之后趋于稳定。因此，n a n 0 2 添加量选择0 4 9 1 0 0 m l 。 ( 2 ) v c 的添加量对血制红色素红度值的影响 v c 具有抗氧化和助发色作用，和亚硝酸钠结合使用，可防止亚硝胺的产生。 对添力i a v c 的量进行实验，在o 1g 1 0 0 m l - - o 7g l o o m l 的浓度范围内添加v c ，测定 黑龙江大学硕士学位论文 所得样品的红度值，所得结果如图2 2 。 4 2 4 1 ，、4 0 * 03 9 寒3 8 嗣3 7 3 6 3 5 00 10 20 30 40 50 60 70 8 v c 的添加量( g l o o m l ) 图2 - 2v e 添加量浓度对红度值( a + ) 的影响 f i g2 - 2e f f e c t so tv ec o n c e n t r a t i o no nc h r o m o g e n i er a t e ( a - ) 由图2 2 可知，v c 的添加量影响着红色素的红度值，随着抗坏血酸添加量增大， 色素的红度值也越高，在o 5g l o o m l 时达到最高，此后红度值呈下降趋势。为此， 第一次抗坏血酸添加量选择0 5g n o o m l 。出现这样的结果主要可能是由于v c 一方 面起到抗氧化抑制氧化变性的功能；另一方面v c 与亚硝酸钠会发生反应将亚硝酸 钠还原一氧化氮，在该反应中，v c 的添加量较大，则会使n 2 + 被还原成低价态的n 2 0 或n 2 ，造成没有足够量的n o 与血红蛋白反应嘲。因此抗坏血酸添加量会影响着血 制红色素的红度值。 ( 3 ) 冷反应时间对血制红色素红度值的影响 对冷反应时间进行实验，加入o 4g no o m l 的亚硝酸钠，o 5g lo o m l 的抗坏血 酸，选择l h 一- 8 h 的时间梯度进行冷反应，然后对反应液进行糖基化反应，糖基化 反应条件为3g l o o m l 的蔗糖，6 5 c 力1 i 热2 0 m i n ，然后进行喷雾干燥。对所得样品 进行红度值测定，所得结果如图2 3 。 0123456789 冷反应时间( h ) 图2 3 冷反应时间浓度对红度值( a ) 的影响 f i 醇- 3e f f e c t so fc o l dr e a c t i o nt i m eo nc h r o m o g e n i cr a t e ( a ) 由图2 3 可知，随着反应冷时间的增加，色素的红度值也越高，在6 h 时达到 最高，此后红度值呈下降趋势，这可能是由于反应时间增加会使血红蛋白发生一 定程度的氧化。 ( 4 ) v c 水溶液的浓度对血制红色素红度值的影响 由于在第一次离心的时候v c 部分已经随上清液弃掉了，v c 的量随之减少，则 v c 的抗氧化的能力也相应的减弱，所以采用v c 水溶