（微生物学专业论文）固体发酵黑曲霉产单宁酶的研究.pdf

中文摘要 单宁酶全称是单宁酯酰水解酶( t a n n a s e ，e c3 i 1 2 0 ) ，它可以水解没食子酸单宁中 的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。单宁酶用途广泛，主要来源于微生物，目前研 究得较多较为深入的是青霉和黑曲霉。本论文利用紫外诱变的方法选育到一株产单宁酶的黑 曲霉菌株，对该菌株固体发酵产单宁酶的发酵工艺条件及发酵培养基进行了优化，研究确立 了固体发酵所产单宁酶的酶活检测方法，论文还对产单宁酶的黑曲霉菌株发酵产单宁酶的固 定化进行了研究。 本研究采用紫外诱变的菌种选育手段进行黑曲霉菌株的诱变，用在平板培养基中加入微 量的的溴酚蓝( 0 0 0 4 ) ，利用黑曲霉生长形成的变色圈大小对菌株进行筛选，成功的选育 到了一株产单宁酶达9 2 u m l 的黑曲霉高产菌株。它的单宁酶活性较原始出发菌株提高了l 倍多。 论文首先研究和建立了适合固体发酵所产胞外单宁酶活性的检测方法。此方法是根据没 食子酸( 单宁酶催化没食子酸丙酯水解产生) 与甲醇绕丹宁之间形成色团物质的方法来测定 单宁酶的活性，没食子酸丙酯做底物显色明显，选择5 2 0 n m 波长下检测，成功的避开了干 扰物质的吸收峰波长，减小了误差，该方法对底物纯度要求低，常规实验室的仪器就能进行 检测，具有简便直观、灵敏准确、重复性好的特点。 对选育的产单宁酶黑曲霉菌株进行固体发酵产单宁酶研究，结果表明产单宁酶的最适氮 源为n h 4 她，对发酵培养基进行单因素优化结果表明：每5 9 培养基基质含1 n h 。n g ：0 1 n a c l ；0 1 m g s o | ；8 五倍子；9 0 麸皮。对发酵条件的单因素优化后得到：初始水分含 量5 0 ，初始p h 6 0 ，温度3 0 0 c 为最佳产酶条件 利用响应面方法对显著影响产单宁酶的培养基及培养条件因素进行优化，得到固体发酵 黑曲霉诱变株最佳产单宁酶酶条件为：五倍子含量为9 5 ；氮源n l h 添加量为2 3 ；温度 为3 2 0 c 在此最佳发酵条件下发酵产单宁酶达21 9 4 u m l 。 对发酵产单宁酶进行固定化研究，以海藻酸钠为固定化单宁酶的载体，采用交联一包埋一 交联的方法对单宁酶进行固定化。对前交联戊二醛浓度，前交联时间、温度，海藻酸钠浓度， c a c l 2 浓度，硬化时间，后交联戊二醛浓度，后交联时间、温度等固定化工艺进行研究，对 固定化单宁酶的性质进行了初步研究。 关键词：单宁酶黑曲霉固体发酵单宁酶固定化 a b s t r a c t t h ef u l ln a m eo ft a u n a s ei st h et a n n i ne s t e ra c i dr a d i c a lh y d r o l t y i c 唧e ( t a n n a s e ，t h ee c 3 1 1 2 0 ) ，b y w h i c h e s t e r k 影a n ds h r h l k p h e n o l c a r b o x y l i c k e y o f t h e g a l l i ca c i d t a n n i nc o u l db e h y d r o l y z e di n t ot h eg a l l i ca c i da n dt h eg l u c o s e t h et a n n a s em a i n l yp r o d u c e db ym i c r o b i o l o g y w a su s e dw i d e l y , e x i s t i n gi na n do u t s i d et h ec e l l a tp r e s e n tt h ep e n i c i l l i u ma n dt h ea s p e r g i l l u s n i g e ra r cs t u d i e dm o r et h a no t h e r s a na s p e r g i l l u sn i g e rs t r a i np r o d u c i n gt a n n a s ch i g h l yw a s s e l e c t e db yu l t r a v i o l e tm u t a f a c i e n tm e t h o di nt h i sp a p e r m e a s u r e m e n ta b o u tt h e a c t i v i t yo f t a n n 雠i nt h es o l i df e r m e n tw a ss t u d i e da n de s t a b l i l s h c d o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n a n dt h ec u l t u r em e d i u mw a sc a r r i e d0 1 1i nt h i sa s p e r g i l l u sn i g e rs t r a i np r o d u c i n gt a m l a s eh i g h l y t h r o u g hs o f i df e r m e n t , b yw h i c he n z y m ea c t i v i t yw a si n c r e a s e d f i n a l l yi m m o b i l i t yo ft a n n a s e 啊b a l s os t u d i e d e f f e c t i v e l yi n i t i a ls i e v em e t h o dw a su s e di nt h i ss t u d ya sf o l l o w t h et i n yt c t r a b r o m o p h e n o l s u l f o n p h t h a l e i n ( o 0 0 4 ) w a sa d d e di n t ot h ed u l lc u l t u r em e d i u m ，a s p e r g i l l u sn i g e rs t r a i nw a s i n d u c e db yu l t r a v i o l e tt os e l e c to t l es t r a i nh i g h l yp r o d u c i n gt a n n a s e9 2 u m l s u c c e s s f u l l ya f t e rt h e i n i t i a ls e l e c t i o no fs t r a i n sw i t hc o l o r - c h a n g i n gl o o pb yg r o w i n go fa s p e r g i l l u sn k j e rw h o s e a c t i v i t yo fw e n h a n c e dm o r et h a n1t i m e t h i sr e b u i l d i n gm e a s u r e m e n to ft a n n a s ca c t i v i t yw a ss i m p l e , s e n s i t i v e , d i r e c ta n dg o o da t d u p l i c a t i o n t h i se x a m i n a t i o no fa c t i v i t yo ft a n n a s ep r o d u c e dt h r o u g ht h es o l i df e r m e n t a t i o n o u t s i d eo ft h ec e l lh a dt h ec h a r a c t e ro fh i g he f f e c t i v i t ya n d 瓢：c i 粥* e x a m i n a t i o np e r f o r m e d u n d e rt h e5 2 0 h mw a v el e n g t l lh a ds u c c e s s f u l l ya v o i d e dw a v el e n g l ho fa b s o r p t i o np e a ko ft h e d i s m r b a n m a t e r i a lt ol e d u c et h ea 埘：t h e 翻嚏o fc o n t r o lt u b ea n db l a n kt i l _ b ec o u l de l i m i n a m i n f h l e n o ft h eg a l l i ca c i da n dt h et a n n i ca c i di nt h et h i c ke n z y m ef l u i d t h eg a l l i ca c i dp r o p y l e s t e ra st h es u b s t r a t ec o l o r e do b v i o u s l y , w h i c hw a sr e q u e s t e dl o w l yi nt h ep u r i t yo fs u b s t r a t es o t h a tt h ec o n v e n t i o n a li n s t r u m e n ti nt h el a b o r a t o r y 伽1c a r r yo i lt h ee x a m i n a t i o n t h o u g ht h es t u d yo ft a n n a s ep r o d u c e db ys i e v e da s p e r g i l l u sn j 9 e r , t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t t h em o s ts u i t a b l en i t r o g e ns o u i v a ，o ft a n n a s ew a sm t 4 n 0 3 ，a n de a c h5 9c u l t u r em e d i u mm a t r i x c o n t a i n si n h 4 n o s ；o p d q a c l ；0 i m g s o ( ；8 g a nn u t s ；b r a n t h ei n i t i a lm o i s t u r ec o n t e n t 5 0 i n i t i a lp h 6 0 3 0 01 2i nt h et e m p e r a t u r e 触t h eb e s tc o n d i t i o nw 啪g a m e db yt h e o p t i m i z a t i o no ft h es i n g l ef a c t o ro ff e r m e n tc o n d i t i o n ，a n dt h ea c t i v i t yo ft s l n a s ec o u l db e e n h a n c e dh i g h l yb ya d d i n g8 g a l ln u t si n t om e d i u m t h u sw ek n e wt h a tt h eb e s tc o n d i t i o no f p r o d u c i n gt a n n a s eb ys o l i df e r m e n t a t i o nw a s9 5 驷1 ln u tc o n t e n t ；2 3 n i t r o g e ns o u r c e r e c r u i t m e n t ；3 2 0 ci nt h et e m p e r a t u r e t h ea c t i v i t yo f t a n n 撇w a s2 1 9 4 u m lb yt h ec o n f i r m a t i o n e x p e r i m e n ta c c o r d i n gt ot h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n t h es 髓a l g i n i ca c i d8 0 d i mh a db e e nc h o s ea st h ec a r r i e ro ft h ei m m o b i l i t yo ft a n n a s eb yt h e m e t h o do fl i n k i n g e m b e d d i n g c r o s s i n gl i n k i n g w es t u d i e di n f l u e n c eo fr e t u r n s - r a t i o no f t a m l 勰ea c t i v i t yb yt h ed e n s i t yo ft h eg l u t a r i cd i a l d e h y d e ，t h et i m e ，t h et e m p e r a t u r e ，d e n s i t yo f t h e $ c aa l g i n i ca c i ds o d i u m ，t h ec a c ld e n s i t ya n dt h ef i r mt i m eb e f o r et h ec r o s s 髓l i n k i n ga n dd e n s i t y o ft h eg h t a r i cd i a l d c h y d e ，t i m ea n dt e m p e r a t u r ea f l e rt h ec r o s s e sl i n k i n g f i n a l l yw es t u d i e dp a r t l y t h en a t u r eo f t a l l n a , q ei m m o b i l i z e d k e y w o r d s ：t a n n a b c a s p e r g i l l u sn i g e rs o l i df e r m e n t a t i o ni m m o b i l i t yo ft a n n a s e 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究曾做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：钮塑 日 期：2 鲤簦生立旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名忽翌导师签名： 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 1 引言 第一章文献综述 单宁酶全称是单宁酯酰水解酶( t a n n a s e ，e c3 i 1 2 0 ) ，它可以水解没食子酸单宁中 的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。单宁酶在自然界中分布相当广泛，较早的有关 单宁酶的报道可以追溯到上世纪二十年代，f r e u d e n b e r g u l 在进行黑曲霉培养时发现在其菌 丝中含有单宁酶，以后又发现各类微生物，包括真菌、酵母、细菌都能产生单宁酶；单宁酶 还存在于一些植物材料中，例如茶叶提取物。单宁酶不仅分布广，而且用途也较多，但单宁 酶的研究开始都围绕着茶叶加工业展开，日本和美国在这方面的研究开展较早，并取得了很 多成果。我国2 0 世纪9 0 年代才开始了单宁酶的研究，由于单宁酶的应用日趋广泛，因此对单 宁酶的深入研究变得十分迫切 单宁酶用途广泛，但是由于生产提纯过程复杂、产量很小所以市场价格昂贵这样就使 单宁酶的应用受到限制。单宁酶属于诱导酶，主要利用微生物发酵生产，发酵方法有液体发 酵和固体发酵两种，国内对单宁酶发酵生产主要以液体发酵研究为主，迄今为止，所有的单 宁酶研究和生产中都将单宁酸或含有没食子单宁的原料作为发酵培养基中必需的组分 p k l e k h a 和b 1 【l o n s n e1 2 在对黑曲霉d k l l 0 4 进行液体表层发酵、液体深层发酵和固体发 酵比较实验时发现，固体发酵与液体发酵不同，固体发酵黑曲霉所产的单宁酶几乎全部都是 胞外酶，而且比液体发酵在缩短一半的培养时间的同时，酶产量可分别提高1 8 倍和2 5 倍，固体发酵方法较液体发酵法有许多优越性。而国内绝大多数研究者采用液体发酵法研究 单宁酶的生产，所得到的胞内单宁酶活性都较低。国外有一些固体发酵生产单宁酶的研究报 道，九s a b un 1 等利用罗望子果实棕榈果仁作为培养基基础，进行固体发酵黑曲霉产单宁酶 的研究，得到单宁酶的酶活力最高为1 2 7 1 j g 干基。b t r e v i n o - c u e t oh 1 等用富含单宁酸的 沙漠植物作为培养基基础对黑曲霉进行固体发酵，所得到的酶活力为9 2 u g 干基。 纵观近5 0 年来单宁酶研究领域中的相关文献报道，单宁酶研究的发展趋势主要为：( 1 ) 采 用基因工程技术，构建出高产单宁酶基因工程菌，为单宁酶的工业化生产和大规模应用提供 优良的菌种。( 2 ) 进一步完善产单宁酶发酵工艺，提高酶生产效率，降低生产成本。( 3 ) 尝试 构建出更为适合工业化的单宁酶提纯技术，进一步降低酶生产的成本。( 4 ) 在单宁酶的应用 中，采用固定化酶技术甚至是固定化细胞技术来克服游离酶自身的缺陷，满足单宁酶在各工 业领域的应用需求( 5 ) 在单宁酶原有应用领域的基础上，开拓其在其它更广泛领域中的应 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 用前景，充分发挥其潜在的应用价值。 1 2 单宁酶的性质 1 2 1 单宁酶的理化性质 纯单宁酶在紫外光区2 8 0 珊处，有一个最大吸收峰，在浓度为1 0 ，比色皿为i c mxl c w 条件下，吸光系数a y 9 1 1 8 ，2 6 0i m 处吸光度与2 8 0 棚处吸光度之比为0 5 1 1 ，s a d a a k i i i b u c h i 阳1 ，c h a es o o - k y u 啪分别用凝胶过滤法测定出它们各自选育的菌种单宁酶相对分 子质量都为2 0 0 0 0 0 。o s a oa d a c h i 嗍等分别用沉降法和电泳法测定黄曲霉单宁酶相对分子 质量，分别是1 9 4 ，0 0 0 和1 9 2 ，0 0 0 。b a r t h o m e u fc 嘲等测出黑曲霉l c f 8 单宁酶相对分子质量 为1 8 6 ，0 0 0 ，其等电点在4 左右。b a r t h o m e u fc 和c h a es o o - k y u 等在对各自提纯的酶进行 s d s 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时发现，单宁酶分子由2 种亚基组成，但这个结果与k e n j i h o k ip 1 对酵母单宁酶结构分析的结果有所不同。后者用同样的方法，只得到一条电泳蛋白 带。 1 2 2 单宁酶的酶学性质 多数菌株单宁酶的活性p h 稳定范围都在3 0 - - - 8 0 2 ：问，最适p h 值为4 0 - - - 6 0 ，热稳定范 围在6 0 7 0 以下最适温度为3 0 6 0 y a m a d ah 等( 1 9 6 8 ) 报道的黄曲霉单宁酶活性的 p h 稳定范围最窄，为5 0 5 5 c h a es o o - k y u - 等口1 ( 1 9 8 3 ) 报道的曲霉a n 一1 1 菌株所产单宁酶 活性的p h 稳定范围为5 o 6 5 来源于不同菌株的单宁酶动力学性质稍有区别y a m a d ai i 等n ( 1 9 6 8 ) 就底物浓度对黄 曲霉单宁酶的影响进行研究，测出妯( 以单宁酸为底物) 为0 5 x1 0 4 m o l l ：k m ( 以葡萄糖一l 一没食子酸为底物) 为1 4 1 0 叫m o l l ；l 【m ( 以没食子酸甲酯为底物) 为8 6 x 1 0 4 h t 0 1 l r a j a k u m a rg s 等n n ( 1 9 8 3 ) 澳i 得产黄青霉所产的单宁酶以单宁酸为底物时，其l ( n l 为0 4 8 1 0 4 m o l l 。f a r i a sg 蔓等n 羽( 1 9 9 4 ) 测得c r y p h o n e c t r l ap a r a s i t i 阳所产的单宁酶以 单宁酸为底物时，其l 【m 为0 9 5 x1 0 2 m o l l ；以栗木单宁为底物时，其l 【m 为5 0 7 x1 0 一s m o l l t 而以没食子酸为底物时，其l ( m 高达1 1 0 - 1 3 1 1 0 一 m o l l ，故没食子酸是单宁酶底物中最 具竞争性抑制的底物之一。由此他们得出结论，单宁酶对特定的单宁底物的相对酶活可能是 与该底物中酯键和缩酚羧键的数量有关。s h a r m as h w e t a 等n 3 3 ( 1 9 9 9 ) 测得黑曲霉所产的单宁 酶的l 【匝为0 2x1 0 3 m o l l 有关各种金属离子以及e d t a 对单宁酶活性影响的报道结论不一 k e n j ia o k i 等悖1 ( 1 9 7 6 ) 研究表明z n c l 2 ，c u s o ，c o c l 2 和n i s o 等不同的金属离子对单宁酶酶活 力无影响，而e d r r a 对酶活力影响不明显。相反，r a j a k u m a rg s 等m 1 ( 1 9 8 3 ) 研究表明c f + ，z n v ， 2 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 f e 2 + 甚至是m 9 2 + 等不同的金属离子均对单宁酶酶活力有着显著的抑制效应。同样，s a d a a k i l i b u c h i 等呻1 ( 1 9 6 8 ) 研究表明任何金属盐均不能激活单宁酶，z n c l ：和c u c l 2 ：则会抑制酶活力 或使酶失活此外，e d t a 溶液也会使单宁酶完全失活。郭鲁宏等n 钔( 1 9 9 9 ) 研究发现除了m n 2 + 和f e 2 + 抑制单宁酶酶活之外，其它金属离子则对酶活均无明显的激活作用或抑制作用。 1 3 单宁酶分离纯化及菌株筛选 单宁酶主要是由微生物生产的，能够产生单宁酶的菌种十分丰富，除了传统的青霉、曲 霉、酵母，还有巴斯德菌、寄生内座壳菌、绿色木霉和茄形镰刀菌等，单宁酶既存在于细胞 内，又存在于细胞外。但是目前研究得较多较为深入的还是青霉和曲霉。1 9 7 7 年s b r a d o o 等建立了一种利用平板筛选单宁酶的方法。其平板培养基由1 的单宁加上3 的琼脂，将 要筛选的菌种点种在平板上适宜温度下培养4 8 h ，以菌落周围的透明圈直径与菌落直径的比 值为筛选标志。郭鲁宏等n 耵在此基础上对培养基作了一些改进，在培养基中加入了溴酚蓝。 由于五倍子单宁被分解成没食子酸，培养基的p h 值由4 5 左右降为3 左右，这与溴酚蓝的变色 范围基本一致，因此培养基由紫色变为黄色，而且少量的溴酚蓝( 0 0 0 4 ) 不会对黑曲霉 的生长及单宁酶活性造成不利影响，用这样的培养基进行初筛非常直观，而且准确高效 单宁酶既存在于细胞内，又存在于细胞外，通常发酵液中的单宁酶，一般采用硫酸铵盐 析或加入丙酮、乙醇等有机溶剂使之沉淀，然后过滤，得到粗酶。l i b u c h i 等n 刀在发酵液 中加入硫酸铵达到0 8 饱和度，放置1 5 4 , 时后，用加有助滤剂硅藻土5 3 5 的漏斗过滤，再将沉 淀溶于水中，离心后得到粗单宁酶液，进一步用d e a e - - s e p h a d e x a s o 离子交换，s e p h a d e x g - 1 0 0 凝胶过滤，获得了纯化的单宁酶，并进行了性质研究。p a r t h a s a r a t h y 等n 盯用s e p h a d e xg 一2 0 0 凝胶过滤，再用o e a e - - s e p h a d e x a 2 5 柱作离子交换层析纯化粗单宁酶。a o k i 等n 钔使用 e c t e o l a - 纤维素、s e p h a r o s e6 b 和s e p h a d e xg 一2 0 0 纯化假丝酵母单宁酶。王征等啪3 采用 4 0 的硫酸铵和8 0 硫酸铵两部盐析法沉淀单宁酶，经过透析，睨a e 一纤维素阴离子交换层 析，s e p h a d e x g - - 1 5 0 柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，单宁酶达到电泳纯，经过上述酶纯 化过程，提纯倍数达到11 5 ，酶回收率为2 1 单宁酶的提纯技术正在从复杂的实验室提纯 向工业化生产过渡。对于菌丝体中的单宁酶要先进行细胞破壁，研究者们探索了很多细胞破 壁的方法，有利用超声波、石英砂研磨、渗透压法等经典方法破壁的，也有研究者探索一些 新的酶得率更高的方法，如法国学者利用冻融法，再加入伴7 j _ v 球蛋白( 凝集素) 破壁口， 效果不错 3 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 4 单宁酶的酶活力测定 单宁酶的活力检测一般用单宁酸来作为酶活力测定底物，其基本原理是单宁酸在3 1 0 r i m 处的吸光值可因酶促反应的发生而改变，这样就可根据改变量计算酶活。但用单宁酸作为底 物的不足之处是底物单宁酸对产物没食子酸的光吸收有很大的干扰。现在有些研究者已尝试 用别的底物替代单宁酸。研究人员为了满足各自研究的需要，选用不同的底物、不同的测定 参数，以底物的减少或产物的增加甚至是p h 值改变等作为测定对象，构建出各具特色的单宁 酶酶活力测定方法。这些测定方法大致归类为滴定法、紫外分光光度法、比色法和高效液相 色谱法等。 ( 1 ) 紫外分光光度法。s a d a a k ii i b u c h i 等恤1 于1 9 6 7 年建立了紫外分光光度法。基本 原理是根据底物单宁在3 1 0 h m 处吸光度的变化求酶活力。大多数研究者都采用这个方法，此 法简单快捷，且误差在l 3 之间，但此法底物对产物没食子酸的光吸收有很大的干扰，对 底物单宁纯度要求非常高。也有研究者尝试用其他底物来替代单宁，如甲基没食子酸，没食 子酸丙酯。如王征等啪1 采用了没食子酸丙醋( p g ) 作为单宁酶底物，取得了较好的效果。 这种底物浓度允许范围较广，有利于酶活力的测定。并且在2 7 0 r i m 波长下底物p g 的浓度变化 可通过吸收值的明显变化而被灵敏的测定出来，避免了产物没食子酸光吸收的干扰 ( 2 ) 滴定法。由于单宁在单宁酶作用下分解生成游离的没食子酸，可用碱对之进行滴定， 确定底物单宁的减少量而测得酶活力但是，因为缓冲液对碱的缓冲力以及单宁本身的褐 色干扰了滴定终点，再者，随溶液p h 值增高，单宁会逐渐发生水解，将影响测定结果的稳 定性与准确性吻1 ( 3 ) 视读法。澳大利亚科学家o s a w e r 劓1 于1 9 9 3 年，建立了细菌单宁酶活力测定方法，其 根据有两点：单宁可水解生成游离的没食子酸：没食子酸在空气中暴露被氧化，颜色从 绿色变成褐色通过比色求其变化量而测得酶活力。 ( 4 ) 高效液相色谱法1 9 9 4 年，法国的c h a n t a lb a r t h o m e u f 等用高效液相色谱法 连续测定反应过程中产物没食子酸变化量，直接测定出酶反应的初速度，此法迅速准确， 但对仪器要求较高 ( 5 ) 气相色谱法。1 9 8 1 年j e a n d 2 叼等以没食子酸甲酯为底物，采用气相色谱法连续测定 酶促反应过程中没食子酸的变化量直接求出酶促反应的初速度，该方法准确，但操作繁琐且 实验仪器要求很高，为非常规测定方法 4 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 5 单宁酶的固定化 1 5 1 固定化酶的方法和特性 固定化酶的制备方法分为四类：吸附法、包埋法、共价结合法和交联法。吸附法分为物 理吸附法和离子吸附法瞰1 。酶被载体吸而固定化的方法称为物理吸附法。离子吸附法是将酶 与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。包埋法可分为网格 型和微囊型两种。前者是将酶包埋于高分子凝胶细微网格内；而后者是将酶包埋在高分子半 透膜中制备成微囊型。共价结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合的方法，此法研究较 为成熟交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，是酶分子和双功能试 剂或多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网状结构，除了酶分子之间发生交联外， 还存在一定的分子内交联。 酶经固定化后，活力大部分下降，这是因为：酶活性部位的重要氨基酸与水不溶性载 体相结合；当酶与水不溶性载体相结合时，它的结构起了变化；酶被固定化后，酶与底 物的相互作用受到空间位阻的影响。固定化酶的稳定性一般要比游离酶提高很多，有利于工 业生产热稳定性对工业应用极为重要多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，这体现在 其反应最适p h 范围变宽。固定化酶在操作中可以长时间保留活力，半衰期在一个月以上即有 工业应用价值。 1 5 2 单宁酶的固定化 单宁酶能够水解单宁的酯键，生成没食子酸和葡萄糖，没食子酸可以作为医药中间体， 又可作为食品、化妆品及饲料的抗氧化剂，近年来还用作感光树脂的原料，应用广泛。单宁 酶价格昂贵、使用寿命较短，其应用受到一定限制，固定化单 。酶既能保持酶的活性，专一 性强，又具有可反复使用、贮藏性好、p h 值与温度范围宽的特点，因此研究者对单宁酶进行 固定化研究 w e e t a l li lh 等汹3 对单宁酶的固定化进行了探索，将单宁酶用一定孔径的多孔玻璃 珠固定，同时，他还对固定化的单宁酶的p h 范围、热稳定性及半衰期进行了研究。 程琦剐用自制的壳聚糖固定单宁酶，测定固定化单宁酶表观l ( m 值( 以没食子酸丙酯为 底物) 、最适p h 值以及稳定活性p h 范围，并将之应用于酯型几茶素水解反应中，可水解茶多 酚提取物中9 6 以上的酯型儿茶素，但此项技术尚未见应用于生产的报道。 龚加顺等咖1 利用海藻酸钙包埋固定单宁酶在水相中水解没食子单宁生产没食子酸，并 5 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 利用聚乙烯醇一戊二醛法制备的固定化单宁酶在有机相中生产没食子酸丙酯。 王征等口妇讨论了聚阳离子聚2 一羟基一n ，n 二甲基氯丙胺对固定化酶的影响，p h 值对固 定化酶的影响及固定化酶的稳定性。采用聚阳离子复合物加固对酶的包埋程度，防止了使用 过程中酶的渗漏，可使该酶延长使用寿命并提高稳定性。 肖琳等恤1 人比较几种固定化载体，确定以壳聚糖为载体，用戊二醛作交联剂制得固定 化单宁酶，固定化酶活回收率可达7 3 。 单宁酶经固定化后热稳定性、p h 稳定性及最适温度均有所提高。英国专利报道随堋， 单宁酶用硅藻土固定( 2 5 m g 单宁酶g 硅藻土) ，在p h 5 5 ，4 0 条件下处理“冷后浑”，效果 很好。现在，纽约开发公司己开始批量生产该固定化单宁酶。日本专利报道，将单宁酶固定 在聚砜中空纤维超滤膜上，然后用这种膜将茶汁趁热过滤，可避免。冷后浑”而得到澄清的 茶汁。n i c o l a sp 瞄1 等报道，将固定化单宁酶应用在2 0 6 5 下浸提茶叶，该单宁酶可实 现流化床操作。程琦等研究表明，采用壳聚糖来固定单宁酶，龚加顺等叫采用微孔吸附 面积大的沸石固定化单宁酶，并应用于茶汤中。冷后浑”转溶研究，发现当茶汤浓度为1 0 5 ， 温度为4 0 时，茶汤的澄清度最高可达4 1 5 ，且茶饮料的口感品质已有显著改善和提高 程启坤涵1 报道，日本农林水产省蔬菜茶叶试验场掘江秀树等将固定化单宁酶装入一定体积的 酶反应器中，作为生物传感器用于测定茶汤中酯型儿茶素，可大大缩短分析时间。 1 6 单宁酶的应用 1 6 1 应用于食品工业 利用单宁酶防止茶饮料中的“冷后浑”，效果非常好。在液态茶和速溶茶的生产中，由 于茶汤中多酚类、咖啡碱、蛋白质等物质通过分子间氢键与疏水作用形成络合物，可在低温 时沉淀，形成所谓的“冷后浑”，需要采取物理、化学或酶处理法来消除或使其变成可溶物， 即。转溶”工艺。单宁酶就是酶法转溶的专一酶。它能断裂儿茶酚与没食子酸间的酯键，使 苦涩味的酯型儿茶素水解，释放出的没食子酸阴离子又能与茶黄素、茶红素竞争咖啡碱，形 成分子量较小的水溶性短链物质，从而降低茶汤的混浊度啪1 ，浑浊度由8 0 降至8 。单宁酶 在茶饮料业中的应用越来越广泛深入 单宁酶应用于红茶、绿茶、乌龙茶深加工中，不仅可以提高茶叶品质、产量，而且能使 茶叶中可溶性金属元素含量增加。l a u r e ns 等啪1 报道，用单宁酶处理红茶，茶汤中可溶性 铁、钙的含量分别增加了2 3 与1 5 。若在绿茶加工中使用单宁酶，可使离子铁和高铁的含量 均提高1 蹦，并部分消除夏春茶的苦涩味。提高茶品质。p r o c t e r 及g a m b l ec o 嘞( 1 9 8 5 ) 对红 6 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 茶进行单宁酶处理，结果发现速溶茶完全溶于冷水，而且滋味良好，而无酶处理的茶的固形 物和浸提物产量均低于酶处理的茶。单宁酶还可用以辅助茶叶抗氧化剂来对抗食品氧化。m a i j m 1 等报道用单宁酶处理的红茶水浸出物抗氧化能力增强。 此外，单宁酶可应用于啤酒和果汁的澄清、防止果酒和果汁中酚类引起的变质、咖啡风 味的软饮料生产、麦芽多酚的稳定处理、葡萄酒风味的改进以及作为测定天然没食子酸酯类 结构的一种灵敏的分析探针h 。 1 6 2 制革工业 在皮革生产中，单宁能与动物皮层中的蛋白质结合形成沉淀，从而将生皮鞣制成难以透 水、致密而柔软的革。 1 6 3 饲料工业 来源于植物的饲料往往含有单宁，它可以使植物蛋白以及家畜自身所分泌的消化酶蛋白 凝固沉淀，从而减少家畜对摄入蛋白的消化率和增加粪便排泄中的氮源m 1 因此，在饲料加 工过程中如用单宁酶进行相应处理，将大大提高家畜对植物蛋白的利用和吸收率，降低畜牧 业的生产成本。 1 6 4 化妆品工业 由于单宁酶具有水解单宁酸中酯键的性质，放在化妆品生产中也已得到应用。为了适应 人们回归大自然的心态与爱美的追求，许多化妆品公司争相开发具备滋养、祛斑、纺晒、生 发等多种功效的产品，这些产品普遍加入一些植物提取物。当加入某些含有单宁的植物提取 液时，会使化妆品出现混浊或者结块现象。因此，事先如果用单宁酶对这些植物添加剂进行 相应处理，那么上述情况就可望避免旧1 。 1 6 5 精细化工与制药工业 没食子酸是单宁酸水解产物中的主要化工产品，是食品抗氧化剂没食子酸丙酯和制药工 业中甲氧苄胺嘧啶( t r i m e t h o p r i 髓) 化学合成所必需的一种重要原料，近年来还可用作半导 体感光树脂的原料m 1 。目前，没食子酸大多是由单宁酸经硫酸水解而成洲，其产率约为6 5 。 由于硫酸水解法生产没食子酸存在着严重污染环境和对设备损耗大等问题，微生物单宁酶水 解法应运而生。郭鲁宏等h 鲫采用海藻酸钙包埋来源于黑曲霉的单宁酶。并将此固定化单宁酶 应用于制备没食子酸，3 次实验中没食子酸产品的平均产率达到6 1 ，与目前工业生产中所采 用的硫酸水解法基本相当，具有潜在的工业开发价值。同年，l i a rb 等m 在印度当地分离获 7 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 得一株单宁酶高产的米根霉菌株，以富含单宁的云实( c a e s a i p j n j ad i a n a ) 豆荚粉作为原 料，分别进行固体发酵、深层液体发酵和改进的固体发酵，将单宁生物转化成没食子酸，转 化率分别可达3 0 5 ，2 7 5 和9 0 9 。 没食子酸酯类是没食子酸的重要衍生物之一，能促进纤维蛋白和血栓的溶解、扩张血管、 增加冠动脉血流量及有效抑制血小板的凝集，广泛地应用于治疗心脑血管疾病同时，没 食子酸酯类还可清除体内的氧自由基，对炎症、病毒性疾病、细菌感染性疾病、胃溃疡、辐 射损伤、过敏及老年性痴呆等均有一定的治疗和防治作用鲫1 ，在医药领域中具有广泛而重 要的应用前景其中没食子酸丙醋( p r o p y lg a ll a t e ，p 6 ) 表现得尤为突出p g 是f a o 髓o 组织 批准的油溶性合成食品抗氧化剂，对人体无任何毒副作用，是国际上通用的食品抗氧化剂璐 p g 的医药商品名为。通脉酯”，是治疗心脑血管疾病的一类新药，具有抗血小板聚集、增强 纤维蛋白和血栓溶解、扩张血管及增加冠动脉血流量等疗效嗽嘲。同时它还能清除体内氧 自由基、预防乳腺癌，对l r e w i s 肺癌具有抑制和抗转移作用酬。 1 7 本课题立题意义和研究内容 1 7 1 本课题的立题意义 单宁酶是一种用途相当广泛由微生物发酵产生的酶类，可用在食品加工业上。是消除茶 叶冷后浑的专一酶类，另外单宁酶还可用在制革业、精细化工行业以及制药行业等，单宁酶 的市场需求量大但由于利用微生物液态发酵产量少，精制提纯的过程复杂，市场售价相当 昂贵，国产的粗单宁酶每5 0 9 售价为7 5 0 y ，而日本产的精制纯单宁酶市场售价高达每2 3 2 0 ￥2 5 0 m g 。我国对单宁酶的研究起步较晚，国内还没有大规模的单宁酶工业生产我国在 诱变育种、发酵、提纯、固定化等各个方面的研究都还不太完善，诸多因素制约了单宁酶的 生产和应用。世界上其他一些国家在单宁酶的研究开发上远远走在我国的前面。 通过生物技术来进行黑曲霉的诱变育种获得单宁酶高产菌，采用固体发酵的方法对该菌 产单宁酶的条件进行研究，增加酶产量、提高酶活、缩短发酵时间。采用海藻酸钠为固定化 单宁酶的载体应用交联一包埋一交联法的固定化方法对固体发酵提取的粗单宁酶液进行固定 化，固定化单宁酶使单宁酶温度、p h 最适范围增大，酶活稳定性增加，有利于酶分子抵御外 界环境的变化。本课题的研究为工业化规模开发应用单宁酶莫定了理论基础。 1 7 2 本课题的研究内容 本课题通过紫外诱变选育手段筛选到一株单宁酶高产茵，建立了一种快速简便的固体发 3 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 酵单宁酶活力检测手段，解决了固体发酵产酶酶活难检测的问题，进行了固体发酵黑曲霉产 单宁酶的研究，对培养基及培养条件进行了单因素实验研究，采用五倍子为诱导物添加于培 养基中大大提高了单宁酶的活力，同时采用响应面方法优化了固体发酵产酶的工艺条件。另 外本论文还探索了了固定化单宁酶的方法和条件，利用海藻酸钠作为载体采用交联一包埋一 交联的方法对固体发酵提取的粗酶液进行固定化，并对固定化酶的性质进行了初步研究 本课题的创新之处体现在两方面，一方面是建立了一种胞外单宁酶活力检测方法，解决 了胞外单宁酶活难检测的问题；另一方面进行了利用五倍子固体发酵黑曲霉产单宁酶的研 究，在固体发酵黑曲霉产单宁酶方面国内还未见报道。 9 贵州大学2 0 0 8 届硕士学位论文 2 1 前言 第二章产单宁酶黑曲霉菌株的诱变及筛选 单宁酶主要是由曲霉属真菌产生，其中以黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 研究和应用得最为 广泛。黑曲霉作为单宁酶的产生菌，国内外学者对其理化特性、菌种选育、菌株生长条件等 诸多方面进行了长期大量的研究，但其产酶性能均不甚理想，直接从自然界筛选获得的野生 黑曲霉产酶能力无法满足实际生产的需要。另外，通过基因克隆菌株大量生产微生物单宁酶 的技术也尚未完善。因此，在产单宁酶的野生黑曲霉菌株的基础上，采用诱变育种的方法来 提高单宁酶活性和产量，不失为一种简单、快捷、经济的可行方法。诱变育种一般是针对微 生物细胞进行的。微生物细胞经过物理和化学方法处理后易发生突变，尤其对于黑曲霉等丝 状真菌特别适用。我们借鉴郭鲁宏有关紫外诱变选育黑曲霉高产单宁酶的经验，通过设计特 殊筛选培养基，利用紫外诱变方法对黑曲霉产单宁酶菌株进行诱变，旨在选育黑曲霉单宁酶 高产菌。 2 2 材料与设备 2 2 1 菌种 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 菌株由贵州大学食品实验室提供2 株，贵州大学真菌资 源研究所提供3 株。 2 2 2 培养基 2 2 2 1 单宁酸培养基 蔗糖3 9 ：n a n 0 30 6 9 ：k 2 h p 0 40 2 9 ；m g s 0 4 7 1 - 1 2 0 0 1 9 ：f e s 0 40 0 0 2 9 ：琼脂6 9 ：单宁 酸5 9 ；自来水2 0 0 m l 2 2 - 2 2 初筛平板培养基 上述单宁酸培养基中加入0 0 0 4 的溴酚兰。 2 2 2 3 复筛培养基 基本培养基( 察氏培养基+ 2 单宁酸) 单宁酸2 0 9 6 ，蔗糖1 o ，n a n 0 30 3 0 i , ，i g h p o 0 1 ，k c l0 0 5 ，m g s o 7 1 1 2 00 0 5 ， f e s 0 40 0 0 1 ，自然p h 值。 1 0 贵州大学2 0 0 8 届硕士