（有机化学专业论文）人参果胶—阿霉素复合物的制备和抗肿瘤活性.pdf

摘要 阿霉素是一种葸环类抗生素，具有广谱的抗肿瘤活性。但是，它具有骨髓抑 制作用，并对心脏及其它正常组织有较大毒性。因此，在癌症治疗中受到很大限 制。 本论文通过肽链将阿霉素连接在人参果胶分子上，通过人参果胶的亲和作用 使药物定向到病变部位。然后，连接药物与多糖的肽链被蛋白水解酶逐步水解， 释放出阿霉素，达到缓释的效果，从而降低阿霉素毒副作用。 本论文首先从人参提取分离人参果胶，然后合成6 种连接药物与果胶的小肽 链，再将小肽链连接到阿霉素分子上，最后将阿霉素肽复合物中肽链的氨基与 人参果胶的羧基偶联形成6 种人参果胶阿霉素复合物。制备的六种人参果胶邛可 霉素复合物的连接链分别为一个氨基酸、二肽和三肽。所用的人参果胶的结构为 a 一( 1 4 ) 聚半乳糖醛酸。通过1 h n m r 、b c n m r 和u v 等确定了人参果胶一阿 霉素复合物以及中间产物。这六种人参果胶一阿霉素复合物的载药量( 按阿霉素 质量百分含量计算) 分别为1 6 1 、1 5 3 、1 0 3 、1 4 2 、0 7 8 和0 9 7 。人 参果胶一甘氨酰甘氨酰甘氨酸一阿霉素复合物对l 9 2 9 细胞的抑制率高于阿霉素， 其它人参果胶一阿霉素复合物对l 9 2 9 和h 7 4 0 2 细胞的抑制率均低于阿霉素，高于 人参果胶。 关键词：人参果胶；阿霉素；药物载体 a b s t r a c t d o x o r u b i c i n ( d x r ) ，aw e l lk n o w na n t i c a n c e rd r a g ，i sam e m b e ro ft h e a n t h r a c y c l i n er i n ga n t i b i o t i c sw i t ha b r o a ds p e c t r u mo fa n t i t u m o ra c t i v i t y h o w e v e l i tp r o d u c e ss i d ee f f e c t ss u c ha sm y e l o s u p p r e s s i o n c a r d i o t o x i c i t ya n do t h e rt o x i c i t i e s t od e c r e a s et o x i c i t ya n di n c r e a s et h ee f f e c t i v e n e s sa g a i n s tc a n c e ld x rh a s b e e nc o n n e c t e dw i t hg i n s e n gp e c t i nt h r o u g has h o r tp e p t i d ec h a i n d x ri sc o u p l e dt o ap e p t i d et og i v ead x r p e p t i d ec o m p l e x ，i ti sd e l i v e r e dt ot u m o rt i s s u et h r o u g ht h e a f f i n i t yi n t e r a c t i o no fg i n s e n gp e c t i na n dm a l i g n a n tc e l l t h el i n k e rs h o r tp e p t i d eo f g i n s e n gp e c t i na n dd x r i sh y d r o l y z e db ye l a s t a s et og i v ead e l a y e dr e l e a s eo f d x r i nt h i st h e s i ss i xg i n s e n gp e c t i n d x rc o m p l e x e sw e r es y n t h e s i z e d t h el i n k e r s u s e dt oc o n n e c t ed x rt og i n s e n gp e c t i nw e r eo n ea m i n oa c i d ，d i p e p t i d ea n d t r i p e p t i d e r e s p e c t i v e l y g i n s e n gp e c t i n u s e di nt e s tw a sc o n s i s t e do f 旷( 1 4 ) 一d g a l u a ( g a l a c t o s e u r o n i ca e i d ) t h ec o m p l e x e sa n di n t e r m e d i a t e s i nt h e r e s e a r c hw o r kw e r ec h a r a c t e r i z e dw i t h1 hn m r 1 3 cn m ra n du v h lt h ec o m p l e x e s ， t h ed x rc o n t e n tw a sf r o m0 7 8 t o1 6 1 t h ei n h a b i t a t i o nr a t i oo fl 9 2 9a n d h 7 4 0 2o fo n eg i n s e n gp e c t i n - d x rc o m p l e xi sb e t t e rt h a nt h a to fd x ri t s e l f , b u ta l l o ft h es i xc o m p l e x e sa r eb e t t e rt h a ng i n s e n gp e c t i n k e yw o r d s ：g e s e n gp e c t i n ；d o x o r u b i c i n ；d r u gc a r r i e r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：址日期：丛2 ：叠：堕 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电 邮 话： 编： 略 短槲 第一章前言 糖类在自然界分布广泛，是一类重要的生命物质。糖类在生物体内的功能： ( 1 ) 能量物质和结构组成成分生物体以葡萄糖，果糖为直接能量物质，淀 粉或糖元为储能物质，以甲壳素，纤维素，硫酸软骨素和果胶等为结构组成成分。 糖类化合物是构成生命的基础物质“。( 2 ) 多种生物活性糖链是生命科学中 除了肽链和核酸链之外具有重要意义的第三种链式结构。随着对糖和糖复合物分 离纯化和结构鉴定技术的发展。1 ，人们开始认识到糖的结构比核酸和蛋白质的结 构复杂得多，它比肽链和核酸链含有更多的生物信息。寡塘、多糖以及它们与蛋 白质、脂类结合形成的糖复合物涉及到生命的全部过程。糖类作为信息分子参与 了细胞的各种识别过程。1 ：传递生物信息，参与机体免疫调节与细胞分化、受精、 胚胎发育、血液系统、感染、癌变和衰老的众多生命过程“。与蛋白质连接的 糖类还具有稳定蛋白质构象的功能，还能够防止蛋白质水解，影响蛋白质的折叠 和溶解度，从而影响蛋白质的生理功能。 i 糖类化合物在药学上的应用 1 1 糖类化合物作为药效基团的药物 糖类化合物是一类重要的药物，目前已有大量的糖及糖的衍生物用于治疗和 辅助治疗。市场上使用的糖类药物包括各种抗生素、核苷、多糖、糖脂和糖蛋白 等。糖类药物包括单糖、寡糖、多糖及其衍生物、糖苷和糖复合物。 1 1 1 单糖及其衍生物类药物 长期以来，葡萄糖、果糖等单糖一直作为机体的能量物质和营养物质。但是， 近年来，有些单糖及其衍生物已经被作为治疗型药物应用于临床。 l ，6 一二磷酸果糖是由美国q u e s t c o rp h a r m a c e u t i c a l s 公司开发上市的一个单 糖结构的药物，适用于心脏的再灌注损伤，中风及器官的保护。通过注射给药， 1 ，6 一二磷酸果糖能够提高缺血组织的a t p 水平，用于镰刀型细胞性贫血的治疗。 图1 1 ，6 一一二磷酸果糖 托吡酯( t o p i r a m a t e ) 是由单塘化合物衍生而开发的一种新型抗癫痫药物，用 于控制间歇性癫痫的发作。托吡酯水溶性好，口服后能够被机体快速吸收和高效 利用【1 0 1 。 幽2 托毗酯 1 1 2 寡糖及其衍生物类药物 寡糖作为一类先导化合物，在临床中已经被用于多种疾病的治疗。寡糖类药 物的研究开发结合固相合成技术和高通量筛选技术，已经取得很大进展“1 。“1 。 在肿瘤治疗中，肿瘤疫苗是一类高效低毒的药物，加拿大b i o m i r a 公司开发 的几种寡糖类肿瘤疫苗具有很强的免疫原性，已经用于乳腺癌、结肠癌和胰腺癌 的三期临床实验“”1 。 在糖尿病治疗药物中，阿卡波糖( a c a r b o s e ) 是一个与麦芽四糖类似的碳环化 合物，作为蔗糖酶与a 一淀粉酶的竞争性抑制剂，控制血糖浓度。 图3 阿卡波糖 2 hn o i s i o 罗布寡糖对h i v 病毒有很好的抑制作用，k a n a l t l ek a t s u r a y a 等合成了由4 6 个磺酸化葡萄糖残基组成的罗布寡糖衍生物，并发现增加单糖数目，提高磺 化度，将有利于提高抗h i v 活性1 2 0 。 r r = s 0 3 n a g 戈h ；m = 2 ，3 ，4 图4 罗布寡糖 1 1 3 多糖及其衍生物类药物 多糖类药物来源广泛，各类植物、动物，细菌和真菌类多糖具有多种多样的 生物活性。随着分离和合成技术的发展，多糖的结构从不同层次被确定，发现其 具有各类生物活性，如抗凝血、抗病毒、抗菌、抗炎和抗肿瘤的功能，使其在临 床中显示出广阔的前景“1 。 肝素是硫酸化多糖，能够与多种蛋白质结合而具有多种生物活性。肝素在临 床中主要用作抗凝血类药物，肝素通过与a t ( i i i ) 酶的一个赖氨酸富集区结合来 调节a t ( i i i ) 酶的活性，达到抑制凝血因子的作用。4 。 硫酸葡萄糖、硫酸木聚糖等多糖衍生物制剂对h i v 病毒有抑制作用。许多病 毒的岁卜壳被一层祷蛋白荚膜包被，其上的氨基酸残基带正电，与硫酸多糖的负电 荷作用，以阻止病毒与宿主细胞黏附。许多硫酸酯化的多糖都具有抗病毒作用， 例如，夏枯草多糖的硫酸酯具有抑制h i v 病毒的作用，牛膝多糖抑制乙型肝炎 病毒的活性。壳聚糖对各种细菌由抑制作用，当p h = 5 5 时，壳聚糖对大肠杆菌、 金黄葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌等的抑制作用十分明显。 此外，有些病菌的外壳被一层有若免疫原性的多糖包被，部引起宿主的免疫 反应，基于这各事实设计而成的多糖疫苗使蛋白与多糖结合，而提高多糖的免疫 活性。例如，p a s t e u rm e r i e u xc o n n a u g h t 公司的t y p h i m v i 多糖疫苗，可以抵抗 伤寒杆菌s a l m o n e l l at y p h i a 引起的伤寒病”1 。 乙酰甘露聚糖是部分乙酰化的b 一( 1 ，4 ) 一d 一甘露聚糖，它通过激活巨噬细胞上 的甘露糖受体。提高其吞噬能力，以提高免疫力，主要用于外伤治疗基溃疡性肠 炎8 例。 人参是中国传统要用植物，为五加科人参属。除了人参皂苷以外的另一重要 成分就是人参多稽。人参多蓿主要有人参淀粉和人参果胶两类物质组成，其中 8 0 是人参淀粉，活性药理成分是人参果胶。人参多糖具有免疫调节功能，可以 增强巨噬细胞的吞噬功能。其次，人参多糖具有抗肿瘤作用，通过诱导产生肿瘤 坏死因子t n f ，来杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤转移，对正常组织无细胞毒性。人 参多糖对实验小鼠的肿瘤有明显的抑制作用，对艾氏腹水瘤的瘤重抑制率为4 0 一6 0 。 多糖与相关药物的研究分为两类，一类是以基质作为非特异性治疗成分，通 过体内消化代谢，调节生理功能。口服多糖属于此类，被肠道分解为双糖吸收， 具有独特的药理作用，不同于消化道外进入体内的多糖。另一类是作为信息分子 迸入机体，发挥补充调节或抑制的作用。目前国内外大量的多糖类药物属于第一 类，例如，酵母多糖、螺旋藻多糖和卡介菌多糖等。 多糖的抗肿瘤作用机制包括：对肿瘤细胞的直接抑制，改变肿瘤细胞膜的生 长特性，影响肿瘤细胞的信号转导，抑制肿瘤细胞的核酸与蛋白质的合成以及改 变肿瘤的超微细结构等。但有些多糖对肿瘤并无直接抑制作用，而是通过增强机 体的功能发挥其抗肿瘤作用的3 0 1 。它作为机体的免疫调节剂通过促进l a k ( 淋 巴因子激活的杀伤细胞) 和n k ( 自然杀伤细胞) 的活性，诱导巨噬细胞产生肿瘤 坏死因子，来增强机体免疫力，间接抑制或杀死肿瘤细胞。但牛膝多糖、刺五加 多糖等少数多糖，则是具有细胞毒性，直接杀死肿瘤细胞。 1 1 4 糖苷类药物 糖苷是环状结构的半缩醛糖或半缩酮糖的半缩醛羟基与醇、酚等含羟基的化 合物脱水形成的缩醛结构。糖及糖的衍生物部分称为糖基，非糖部分称为苷元。 糖苷类药物的活性不但取决于苷元的种类，糖链和糖苷键型对药物活性也有很大 影响。 ( 1 ) 糖链对药物活性的影响 4 糖基化修饰可以提高药物活性和降低病原体的耐药性，例如，阿霉素糖基上 4 一位羟基的构型发生变化时，就成为表阿霉素，对于耐阿霉素的肿瘤细胞表现 出很好的抑制活性。此外，阿霉素的二糖衍生物使药物增强活性，对于耐阿霉素 的乳腺癌细胞有很强的抑制作用【3 1 】。但对于相同苷元的不同糖基化修饰产物的 活性可能相差巨大。例如，皂苷类化合物o l a x o s i d e 具有抗炎和缓泻的作用，但 当它的葡萄糖醛酸的羧基被甲基化或苷元c 一2 8 位失去葡萄糖，活性都会消失。 ( 2 ) 糖苷键型对药物活性的影响 天然存在或人工合成的d 型糖的糖苷大多数是一构型的，1 3 一构型的糖苷 性质更稳定。与糖苷键型对应，存在a 一糖苷酶和1 3 一糖苷酶，特异地使某种键 型的糖苷水解，释放出具有生物活性的苷元。因此，不同键型的糖苷类天然产物 的活性在很多情况下取决于糖苷酶的种类。 除了以上几类单糖、寡糖、多糖和糖苷类药物，还有祷复合物类药物，是含 有糖结构的复合分子，包括糖肽类和糖脂类，结构复杂，活性多样，是糖类药物 开发的又一前沿。 1 2 糖类化合物作为药动基团的药物 糖苷类化合物中的糖，不但可以作为药效基团，使药物具有新的药理作用， 还可以作为药动基团，参与导体内药物的吸收、分布、代谢和排泄过程。 ( 1 ) 提高水溶性 糖类是多羟基物质，大部分易溶于水，糖基化修饰的化合物大多溶解性提高， 易于为人体吸收，提高生物利用度。用于临床的抗生素类抗癌药物多含有糖基部 分，例如，阿霉素、表阿霉素和博来霉素等都是糖缀合物，它们除了具有脂溶性 的结构，还具有水溶性的糖基，因此具有两亲性，有利于吸收。 ( 2 ) 增加稳定性 一些不稳定药物经过糖基化修饰，其糖苷的挥发性降低，稳定性增加，有利 于维持血液中的药物浓度。糖苷类药物作为前药摄入体内，药物达到病变肿瘤细 胞周围时，糖苷键被酶解断裂，释放出活性母体药物，以克服药物在血液中的快 速降解。例如，黄酮和类黄酮类化合物为多酚类物质，易被氧化，在天然产物中 多以稳定的糖苷形式存在，摄入体内后1 3 一糖苷键发生酶解而释放出苷元，发挥 生物活性。 ( 3 ) 降低副作用 糖类是亲水性物质，生物体内的膜结构为磷脂构成，药物形成糖苷后，其膜 通透能力下降。药物在细胞表面和细胞间质发挥作用，降低细胞内的毒副作用。 例如，对镇痛药吗啡进行糖基化修饰，制成6 一葡萄糖酸吗啡，它具有比吗啡更 强的镇痛作用，并且成瘾性明显下降。 1 3 糖类化合物作为药物寻靶和药物运输基团的药物 糖类药物或糖苷类药物中的不同的糖，决定了与不同的抗原决定簇作用，从 而对某些细胞特异性识别，通过多价效应于某种细胞表面的多个受体作用，而在 其表面积累，从而选择性杀伤病变细胞且提高靶向性。所谓的抗体介导的酶一前 药策略( a c e p t , a n t i b o d yd i r e c t e de n z y m ep r o d r u gt h e r a p y ) 是新近发展起来的肿 瘤靶向治疗方法。a d e p t 策略中使用的药物是疗效明确的抗肿瘤药物，制成低 毒的前药，抗体一酶复合物在体内积累在产生特异性抗原的肿瘤细胞的表面。前 药在肿瘤细胞表面被酶解释放出高毒性的抗癌药物，达到靶向性治疗的目的，降 低对正常组织的副作用。而糖基是一种无毒且溶解性好的前药修饰基团，例如， 以葡萄糖醛酸作为修饰集团，合成的葡萄糖醛酸一表阿霉素前药，细胞学检测表 明，与表阿霉素相比毒性降低了2 0 0 倍【j 。 有时，细胞表面的受体会促进药物的转运，提高药物在细胞内的浓度。例如， 脑啡肽的糖基化修饰，能够改善其在体内的转运，并提高对作用受体亚型的选择 性。但是，糖基化修饰是否影响药物透过血脑屏障的讨论仍未得出明确结论。 2 肽合成方法 2 1 肽合成的原理 + + x 7 x ：氨基保护基 y ：活化基团 q ：羧基保护基 6 h n f x ： q p c 认 o c h 3 o c h 2 c h 3 ( i ：b z ) - - o - - ”c 电 彦 图5 肽台成反应原理 虽然氨基酸在高温或长期放置时会生成聚合物，在温和反应条件下，肽键的 形成是通过活化一个氨基酸的羧基部分，第二个氨基酸则亲核进攻活化的羧基部 分而形成二肽。如果羧基部分的氨基酸未保护，肽键的形成则不可控制，可能形 成线性肽和环肽等副产物，与目标化合物混合在起。要合成具有一定顺序的多 肽，就要采用逐步缩合的定向合成方法。把不参加反应的氨基和羧基先暂时、可 逆的保护起来，防止副反应的发生，再进行偶联反应，以保证合成特定顺序的肽 链。氨基酸一般难溶于有机溶剂，保护基的另一个作用就是增加氨基酸在有机溶 剂中的溶解度。进行偶联反应的羧基活性一般很低，为了增强羧基的反应活性， 7 先将羧基与一强吸电子基团( y ) 作用，它使羧基活化而有利与另一氨基酸的自 由氨基被活化的羧基碳原子发生亲核反应生成酰胺键。根据合成反应的需要可以 应用最大保护策略或最小保护策略。此后，脱去氨基与羧基的保护基就得到了自 由肽。 2 2 氨基的保护 2 2 1 芴甲氧羰基( f m o c ) 芴甲氧羰基是一类烷氧羰基保护基，在酸性条件下稳定，这一氨基甲酸酯型 保护基可在温和的碱性条件下脱除。 早早 h 2 n 夕丫h 掣o 丫h 管 h 十 。f m o c d 节 o o 。 图6 氩基的芴甲氧羰墓( f m o c ) 保护 保护：f m o c c 1 或f m o c 0 s u ( 9 芴甲基- - n - - 丁二酰亚胺基甲酸酯) 的二氧六环 溶液与氨基酸的n a 2 c 0 3 溶液反应，控制p h = 8 9 ，得到f m o c 一氨基酸。 脱保护：a 浓氨水 b 二氧六环一甲醇- - 4 n 的n a o h ( 3 0 ：9 ：1 ) c 哌啶、乙醇胺、环己胺、吗啉、吡咯烷酮、d b u 等胺类的5 0 d c m 溶液 + h n r r 图7 f m o c 保护氨基酸的脱保护机理 在这些条件下，不管是c b z 、b o c 还是其它氨基保护基都不受影响。在肽缩 合条件下，为防止保护基过早脱除，建议加入酸性的1 一羟基苯并三唑。有报道 指出，加入氯化钙能延长f m o c 的寿命，因此含有需要皂化脱除测的c 端酯基或 连接臂的f m o c 保护的肽片段，也可以用此方法合成。但常规催化氢化条件下， f m o c 并非完全惰性。f m o c 保护基对酸性条件的稳定及其温和的碱性脱除条件， 在固相肽合成中，可以使用对酸性敏感的叔丁基型保护基对侧链进行半永久性保 护。 2 2 2 叔丁氧羰基( b o e ) 叔丁氧羰基也是一类烷氧羰基保护基，在碱性条件下稳定。叔丁氧羰基作为 氨基保护基，能防止肽键形成时的消旋，被广泛的应用在肽合成中，特别是固相 合成【3 3 】。 b o c 2 0 o h - t - t - + 图8 氨基的叔丁氧羰基( b o c ) 保护 保护：b o c c i 、b o c 2 0 、b o c o s u 在碱性条件下与氨基酸反应，得到b o c 氨基酸。 b o c - n 3 是种很好的酰化试剂，在叔胺、氧化镁或以2 m o l l 4 到4 m 6 1 l 4 氢氧化钠控制p h 的条件下，它与氨基酸盐在水和二氧六环混合溶剂中反 应，得到b o e 保护的氨基酸，它也可以在吡啶中与氨基酸酯反应。氨基 酸盐可在含有助溶剂如二氧六环或四氢呋喃的水溶液中反应。 脱保护：a h b 删o a c 9 t 妒_ 。 q ! c n h 一 扩- 。 f二 b i f a c 2 nh c i 有机溶剂 d 0 1 0 0 5 nh c 埘c o o h e0 4 mb f 3 c h 3 c o o h g f c h 3 ) 3 s i c l o d c 6 h 6 关于改良的叔丁氧羰基类似物已有许多报道，如a ，a 一二甲基一3 ，5 一二甲氧基 苄氧羰基( d d z ) 、联苯异丙氧羰基( b p o c ) 和2 一氰基叔丁氧羰基( c y o e ) 等。 2 2 3 苄氧羰基( c b z ) 苄氧羰基也是一类烷氧羰基保护基，s c h o t 和b e r g m a r m 于1 9 3 2 年发现并应 用于氨基保护，直到今天仍被广泛应用阱3 研。 制夕y h 等 f 图9 氨基的苄氧羰基( c b z ) 保护 保护：c b z c 1 与氨基酸，在氢氧化钠、碳酸氢钠或氧化镁存在下，在含水的有 机溶剂中激烈搅拌，得到c b z 氨基酸。若为氨基酸酯则可在氯仿中转变 成c b z 保护的衍生物。 脱保护：a 酸解脱除 h b r h o a c 、h c i c h c l 3 、h c i h o a c 、t o s o h 、热t f a b p d c 催化氢解和n a n h 3 还原 催化氢解的氢供体是氢气或环己二烯和甲酸 脱保护基时，除了游离肽外只有甲苯和二氧化碳生成，该脱保护反应常以二 氧化碳的逸出或氢气的消耗来检测。 2 2 4 三苯甲基f r r t ) 三苯甲基是一类烷基保护基，于上世纪5 0 年代起应用于多肽合成，在碱性 条件下稳定。 1 0 v 。 一 k t r t - c i , 异丙醇 l 帮t r t h n 图9 氨基的三苯甲基保护 保护：( c 6 h 5 ) 3 c c 1 在异丙醇一水体系中，在- - 7 , 胺作用下，与氨基酸反应，得 到t r t 氨基酸 脱保护：a h o a c b h a a c 5 0 9 6 水溶液等 虽然三苯甲基可在温和的酸性条件下脱除，但三苯甲基保护氨基酸的活化因 其立体位阻而非常复杂。 2 3 羧基的保护 在多肽合成中，目前主要采用酯化来保护羧基，根据脱除条件的不同分为以 下三类：( 1 ) 可以在碱性条件下脱除的酯；( 2 ) 可以在酸性条件下脱除的酯：( 3 ) 除了可以在碱性条件和酸性条件下脱除，还有其它脱除方法的酯。 2 3 1 甲酯( m e ) 或乙酯( e t ) hm e o h 或e y o h 1 - r h c i o j s o c l 2 ，0 c r c h o m e ( e 0 h c i h 2 n 7 y f l o 图1 1 羧基的甲基( m e ) 或乙基( e t ) 保护 保护：a 将氨基酸悬浮于甲醇或乙醇中，通入无水氯化氢至h 饱和，到氨基酸溶 解，得到氨基酸甲酯或乙酯的盐酸盐。 b 将氯化亚砜与无水甲醇或乙醇在低温下反应，加入氨基酸，得到氨基 酸甲酯或乙酯的盐酸盐。 脱保护：a 1 - - 2 n n a o h ( 或k o h ) 的甲醇、乙醇、丙酮、二氧六环、d m f 、d m s o 溶液或有机水溶液在室温下皂化去酯。 b 酶解 2 3 2 苄酯( b z l ) h b z l o l c c l 4 - - - - - - i t o s o h t o s o h h z n 图1 2 羧基的苄基( b z l ) 保护 保护：氨基酸悬浮在苯甲醇中，加入稍过量的对甲苯磺酸、氯化氢，苯磺酸或多 聚磷酸，加热回流，得到氨基酸苄酯的对甲苯磺酸盐【3 6 翊。 脱保护：a 。皂化去酯 b p d c 催化氢化 c h b r h o a c 饱和溶液 d 8 f ( 液) e n a n h 3 ( 液) 2 3 3 叔丁酯( b u ) 异丁烯 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 二氧六环h 2 s 0 4 r c , h 3 o c c h 3 c h 3 图1 3 羧基的叔丁基( b u ) 保护 保护：将氨基酸悬浮与二氧六环一硫酸中，通入异丁烯气体到饱和，密封反应， 得到氨基酸叔丁酯【3 8 】。也可以与乙酸叔丁酯发生转酯反应。 脱保护：a 。h c i 有机溶剂 b h b r ，h o a c c t f a d h f ( 液) e b f 3 ：e t 2 0 h o a c ( 2 5 u ) 2 4 肽的合成 在室温下，羧酸与胺反应的产物时铵盐，而不是酰胺。为了使生成肽键的偶 联反应能够发生，羧基需要活化，氨基作为亲核试剂进攻活化羧基的碳原子。在 1 2 肽键合成的各种方法中，主要有碳二亚胺法、混合酸酐法、活化酯法、叠氮化物 法、n 一羧基内酸酐法和酶促合成法等。 2 4 1 碳二亚胺法 1 9 5 5 年，s h e e h a n 和h e s s 首先开始用碳二亚胺法合成多肽1 3 9 1 。n 保护氨基 酸同d c c 反应生成活化中间体o 酰基脲，该活性中间体与氨基酸酯反应生成肽 键，并产生一分子的n ，n 二环己基脲( d c u ) 。 r + 图1 4 用碳二亚胺法合成肚键 1 9 6 6 年w i i n s c h 和d r e s s 在碳二亚胺法中加入n 一羟基琥珀酰亚胺( h o s u ) ， 大大提高了多肽的产率，从而形成了复合缩合剂。此后，又有h o b t 等联合碳二 亚胺法使用。 苯并三氮唑酯的胺解速度比琥珀酰酯或相关酯快达三个数量级。因此，有效 的抑制了重排，环化和对称酸酐的形成。 2 4 2 混合酸酐法 w i e l a n d 将n 一保护氨基酸在低温下和叔胺混合后，同氯甲酸乙酯反应生成 碳酸乙酯的混合酸酐，生成的混合酸酐在同氨基组份反应生成肽。后来人们用具 有更大体积的氯甲酸异丁酯代替了氯甲酸乙酯，抑制了副反应的发生。 + r 1 z 、n c h h + r h n ， = 。 r 图1 5 用氯甲酸异丁酯合成股键 为了形成混合酸酐，将n 保护的氨基酸或肽分别溶于二氯甲烷、四氢呋哺、 二氧六环、乙腈、乙酸乙酯或d m f 中，用等当量的三级碱( n 一甲基哌啶、n 一甲基吗啉、n 乙基吗啉等) 处理。然后，在一1 5 一5 剧烈搅拌的同时加入 氯甲酸烷基酯以形成不对称酸酐( 活化) 。经过短时间活化后，加入亲核氨基酸 组分。如果作为铵盐使用，必须避免碱的过量。如果严格按照以上反应条件，混 合酸酐法很容易进行，是最有效的缩合方法之一。 2 4 3 活化酯法 甲酯，乙酯和苄酯的活性太低，需要过量的氨基组份，这样造成原料回收的 麻烦。1 9 5 1 年w i e l a n d 和s h o f e r 采用硫代苯酯用于多肽合成，提高了酯的活性。 活化酯法使产物易于分离，并且性质稳定：以硫代苯酯、氰甲酯、对硝基苯酯和 五氟苯酯为开端，进一步发展了多种活泼酯。l 一羟基苯并三氮唑( h o b t ) 和n 一羟基琥珀酰亚胺( h o s u ) i 柏4 1 l 可以与羧基组份反应生成活化酯，是肽合成中的 常用试剂。 r 1 o + 州_ r 2 一r ，足n r 2 h 图1 6 用活化酯法合成肽键 通过酯胺解形成肽键的过程类似于酯的皂化。氨基化合物对羰基进行亲核进 攻形成四面体中间体，它也是这个反应的限速步骤，吸电子基团有利于中间体的 形成。肽键的形成速率则与离去基团的离去能力相关，例如强酸的共轭碱是一种 良好的离去基团。在肽键形成过程中，被诱导效应和过渡态效应所稳定的离去基 团阴离子，能促进肽键的形成。 除此之外，还有酰基叠氮化物法i 4 2 1 、酰基卤化物法、磷籀盐法、脲筠盐法、 n 一羧基内酸酐法和酶促合成法等。 1 4 h n i o 甲洲 n h j ， z + 心 r v o i c 3 阿霉素载体的研究现状 药物与载体的研究主要集中在靶向运输和缓释作用上，以降低副作用。从药 物与载体的结合方式来看，一类是简单混合，即药物与载体并未通过化学键连接。 例如，羧甲基纤维素一阿霉素复合物、羟丙基纤维素一阿霉素复合物等。另一类 是药物与载体通过化学键连接，例如羧基葡聚糖一丝裂霉素c 复合物、甘露聚 糖丝裂霉素c 复合物及甘露聚糖一博来霉素复合物等。 从药物载体的成分来看，可分为多糖类载体、肽及蛋白类载体、脂质体类载 体和磁性材料载体等。 3 。1 糖类载体一阿霉素复合物 多糖一阿霉素载体复合物一般通过纳米粒子给药，药物被包封在纳米粒子 中，不直接与组织接触，能明显降低毒副作用，并具有缓释作用。任何材料达到 纳米级以后，性质都会发生改变。以纳米颗粒为载体，多耱及其衍生物通过与细 胞表面受体特异性结合，在细胞摄取作用下进入细胞，实现安全有效的靶向给药 治疗。 例如，k y e o n g s o o np a r k 等以肝素一脱氧胆酸复合物作为阿霉素的载体，将 阿霉素分散到两亲的肝素一脱氧胆酸复合物中，通过制备纳米微粒的缓释剂型和 提高药物含量来提高抗肿瘤作用。实验动物为正常c 3 h h e n 鼠，通过体重分析， 发现应用肝素一脱氧胆酸复合物为载体进行阿霉素给药的c 3 h h e n 鼠的体重高 于直接进行阿霉素给药的c 3 h h e n 鼠。结果表明，肝素一脱氧胆酸复合物为载 体的阿霉素副作用较小，安全性高于无载体的阿霉素m 。 图1 7 肝素一脱氧胆酸复合物的结构 阿霉素一葡聚糖复合物以脱乙酰几丁质为载体制成纳米水溶胶，具有良好的 生物降解性和生物相容性，并能够降低阿霉素的心脏毒性。s m i t r a 等人应用荷 巨噬细胞瘤的b a l b e 鼠为试验对象，应用以脱乙酰几丁质为载体的阿霉素一葡 聚糖复合物b a l b c 鼠的平均瘤体积明显小于应用无载体阿霉素组“。 d a l eh r e c z u k - - h i r s t 等用1 5 和3 4 酯化度的糊精琥珀酸酯与阿霉素反 应，合成了糊精一阿霉素复合物。这类阿霉素复合物具有更好的稳定性和更高的 分子量。可以通过控制糊精的酶解来调节糊精的降解速度，并使寡糖一阿霉素特 异性的释放在肿瘤细胞表面，是一种可控制的靶向缓释药物 图1 8 糊精一阿霉素复合物的结构 除了以上所涉及的多糖- - n 霉素载体复合物，还有很多其它种类的多糖载 体，例如，硫酸皮肤素“、7 , - - 醇脱乙酰几丁质等“”。 图1 9 硫酸皮肤素的结构 m 3 2 肽及蛋白类载体一阿霉素复合物 j u nfl i a n g ，v i c t o rcy a n g 合成的细胞渗透肽r 一阿霉素复合物具有不同 于阿霉素的细胞内分布形式和细胞杀伤活性。细胞渗透肽州r 一阿霉素复合物对 于有抗药性的细胞也具有很强的渗透能力，并且能够有效的杀死具有抗药性的肿 瘤细胞。 爹 图2 0 细胞渗透肽俐r 一网霉素复合物的结构 为了降低阿霉素骨髓抑制的毒副作用， g e n elb i d w e l li i i ，i z a b e l af o k t 等将 类弹性蛋白类多肽作为靶向运输载体，合成t a t e l f g f l g - d o x 。其中，t a t 是 h i v - 1 中的t a t 蛋白类似的多肽，有利于细胞吸收。e l p 是一种具有热效应的靶 向多肽。g f l g 是一种可以降解的多肽，在人工发热器作用下，e l p 使 t a t e l p g f l g ，d o x 对m e s s a 子宫瘤细胞抑制率提高2 0 倍“”。 。尹。，。l 、，、了 州嘏洲啪期潮咿帅a 甜、4 v 甜、。，”| v 耐6 、芎。舶 口 、v ，7 & 。 b t a t 铷蜊黼 g f l g 懈j 雄曲c 社_ 臆蝴 删舢州胄t g p 唧畔蝴#瀚啦m 抽( ：t r k j删埘端t 啪 胂咖j 妇t h l b * n 怕l “q 蝴哦嘲 o “幽m 惦h 岫 汹9 * 叼， 图2 1 t a t - e l p - g f l g - d o x 的结构 阿霉素除了形成多肽- n 霉素复合物，还可以以蛋白质为载体伽圳，其中最 重要的应用就是抗体治疗。抗体是目前最明确的特异性靶向药物，已经拥有巨大 1 7 市场，有8 种全长抗体用于肿瘤治疗。t s u z a w a 用聚l - - 醇链将阿霉素与肿瘤 特异性单克隆抗体连接，聚乙二醇链可以被某些肿瘤过度表达的酶降解，从而降 低阿霉素的毒副作用。“。 3 3 脂质体载体一阿霉素复合物 脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层形成的薄膜中，制成超微球体，因 为以磷脂、胆固醇等类脂质膜材料，具有类细胞膜结构，故能作为药物载体，并 能被单核吞噬细胞系统吞噬。增加药物对淋巴组织的指向性和靶组织的滞留性。 阿霉素一脂质体复合物将改变阿霉素在体内的药动力学作用。 y a s u y u k i s a d z u k a 等将阿霉素通过聚乙二醇链与不同的脂质体连接，使其在具有优良脂溶 性的同时，也可以在体内水环境运输。实验结果表明，e h r l i c h 腹水瘤细胞对聚 乙二醇一脂质体复合物为载体的阿霉素的吸收效果，明显高于阿霉素单体，从而 在肿瘤细胞内具有更好的毒性。“。 o a f i 蚋h i f 圈2 2 聚乙二醇一腊质体复合物的结构 肿瘤细胞的动脉作为一个重要的靶向识别点，已经在肿瘤治疗药物设计中得 到广泛应用。j u nw u 等人基于阳离子型类脂体易于被肿瘤内皮细胞选择性吸收 的事实，以d d a b ( - - 甲基二十八烷基溴化铵) 阳离子类脂体与阿霉素形成复合 物。实验结果表明，d d a b 阳离子类脂体一阿霉素复合物造成口腔癌细胞和淋巴 细胞白血病细胞的死亡率明显高于对照组聚乙二醇一类脂体一阿霉素复合物，具 有更好的细胞内毒性”1 。 3 4 磁性材料载体一阿霉素复合物 磁性靶向性治疗是将某种抗癌药物和磁性材料共同吸附于特定的载体上，通 过血管介入选择性运输并在足够强的体外磁场引导下定位于肿瘤组织，在局部缓 释高浓度药物，从而发挥高效低毒的抗肿瘤作用。此外，生物磁学研究表明，磁 场具有抑制肿瘤的作用，与抗癌药物有协同作用临1 。 钱军等人通过将s e l d i n g e r 导管超选择性插入肿瘤供血动脉，以脉冲给药的 方式注入磁导向载体阿霉素，按照w h o 标准进行评价，发现磁导向载体一阿霉素 复合物介入治疗原发性肝癌靶向性特别好，疗效明显且心脏毒性轻微”1 。 sr a n a 等人通过将超永磁性镍铁纳米粒子与聚乙烯醇、聚环氧乙烯及聚甲 基丙基酸分别形成高分子为磁性载体，再与阿霉素形成复合物，结合外加磁场的 作用下，该阿霉素载体药物将成为潜在的靶向抗肿瘤药物“”。 除了以上几种阿霉素载体，还有很多其它生物小分子或有机高分子类阿霉素 载体的研究。阿霉素其本身具有较强的抗肿瘤作用，成为抗肿瘤药物修饰的热点 对象之一。通过与各类载体形成复合物，降低了阿霉素的毒副作用，并具有缓释 作用。 4 。论文选题依据 阿霉素具有广谱的抗肿瘤作用，它作为一种周期非特异性抗肿瘤化疗药物， 对各期细胞均有作用，但对s 期的早期最为敏感，m 期次之，而对g 。s 和g ：期 有延缓作用。其作用机制是解开d n a 的双螺旋链，改变d n a 的模板性质，抑制 d n a 聚合酶从而抑制d n a 和r n a 的合成。此外，阿霉素具有形成超氧基自由基的 功能，并有特殊破坏细胞膜结构和功能的作用。 阿霉素多经由静脉注射，用于急性自血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵 巢癌、胃癌和肝癌等。但是，阿霉素具有抑制骨髓、心脏毒性和刺激消化道反应 等副作用，所以需要对阿霉素进行修饰，以提高它的治疗作用，降低副作用。因 此如何降低阿霉素的毒副作用，提高它的疗效长期以来成为人们研究的课题。 在已有的阿霉素载体研究中，阿霉素的定向和缓释作用不理想。本论文拟通 过肽链将阿霉素连接到人参果胶分子上，在体内，人参果胶中的半乳糖醛酸与肝 细胞产生较强的作用，使阿霉素定向到肝部，在蛋白酶的作用下释放出阿霉素， 以达到提高药物利用率，降低毒副作用的目的。 第二章人参果胶一阿霉素复合物的制备 1 仪器与试剂 1 1 仪器 d e 一5 2 a a 旋转蒸发仪 s h b b 9 5 a 型循环水式多用真空泵 9 0 - 3 恒温双向磁力搅拌器 层析硅胶( g f 2 5 4 ) 一薄板( 铝片基) t l c 层析板( 玻璃) z f 型紫外透射反射分析仪 k q - 2 5 0 d b 型数控超声波清洗器 核磁共振i n o v a 一5 0 0 ，6 0 0 6 0 1 0 紫外一可见分光光度计 d h g 一9 0 3 0 型电热恒温鼓风干燥箱 f d l 冷冻干澡箱 m d f u 3 2 v ( - 8 6 ) 超低温冰箱 电子分析天平 透析袋( 唧c o = 3 5 0 0 ) 1 2 试剂 甘氨酸 丙氨酸 n 一芴甲氧羰基苯丙氨酸 n 一羟基琥珀酰亚胺 n ，n - 二环己基碳二亚胺 芴甲氧羰酰氯 哌啶( 四氢吡啶) 上海亚荣生化仪器厂 郑州长城工贸有限公司 上海振荣科学仪器有限公司 浙江台州市路桥四甲生化塑料厂 青岛海洋化工厂分厂 上海嘉鹏科技有限公司 昆山市超声仪器有限公司 美国v a r i a n 公司 惠普上海分析仪器有限公司 上海一恒科学仪器有限公司 北京博医康技术有限公司 s a n y o 电器有限公司 o h a u s 有限公司 上海绿鸟科技发展有限公司 2 0 上海惠氏生化试剂有限公司 上海惠氏生化试剂有限公司 f l u k a a l d r i c h f l u k a 上海m e d p e p 有限公司 国药集团化学试剂有限公司 人参根粗多糖 柠檬酸 二氧六环 四氢呋喃 n ，n - 二甲基甲酰胺 甘油 1 一乙氧羰基一2 一乙氧基 一1 ，2 一二氢喹啉 其余试剂为国产分析纯 2 人参果胶钠盐的制备 吉林省宏久公司 北京化工厂 北京北化精细化学品有限公司 天津天泰精细化学品有限公司 天津天泰精细化学品有限公司 北京北化精细化学品有限公司 a l d r i c h 2 1 脱淀粉 将2 4 0 9 人参根粗多糖配成5 的水溶液，搅拌溶解，3 5 0 0 r m i n 离心1 5 m i n 。 上清液加入淀粉酶，3 7 c 水浴过夜，加入等体积8 0 的乙醇沉，3 5 0 0 r m i n 离心 1 5 m i n ，上清液中加入等体积8 0 的乙醇沉，3 5 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，沉淀用无 水乙醇和乙醚洗涤，干燥后得到脱淀粉的人参多糖8 3 9 ，得率为3 4 5 8 。 2 2 脱蛋白 取脱淀粉的人参多糖8 0 9 配成1 0 的水溶液，加入四倍体积的s e v a g e 溶 液( v 正丁醇：v 氯仿= 1 ：4 ) ，充分振荡，3 5 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，水层继续用 s e v a g e 法脱蛋白，重复几次至两相界面无白色蛋白氯仿络合物。水层加入等体 积8 0 7 , 醇沉，沉淀用无水乙醇和乙醚洗涤，干燥后得到7 8 9 9 脱蛋白的人参粗 i 多糖，得率为9 8 6 - 5 。 2 3 人参果胶的分离 将脱蛋白的人参粗多糖以5 的浓度溶于l m o l l 1 的n a c l 溶液，3 5 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，沉淀p 再次溶于l m o l l - 1 的n a c l 溶液，3 5 0 0 r m i n ，离心1 5 m i n ， 2 l 沉淀溶于水后用4 倍体积8 0 的乙醇沉，反复三次，沉淀用无水乙醇和乙醚洗 涤，干燥后得到人参果胶的个级份5 l | 3 9 ，得率为5 9 2 。 2 4 人参果胶的结构分析 2 4 1h p l c 测定单糖组成 图2 3 人参多耱所得级分的h p l c 图 表l 人参多糖所得级分的h p l c 数据 峰名 保留时间相对保留峰高峰面积峰面积比 时间 p m p 7 8 3 21 0 06 8 5 1 4 0 8 61 6 7 0 9 3 5 8 7 5 m a n9 8 8 21 2 64 6 0 7 8 7 59 6