（微生物学专业论文）高大毛霉液体发酵应用研究及腐乳安全性评价.pdf

贵州大学硕士研究生学位论文 摘要 高大毛霉是腐乳酿造的一株优良菌株，主要用于传统固体发酵法生产腐乳， 而在液体培养条件下的生长特性及应用研究未见报道。为了改进腐乳生产菌种制 种工艺，本研究对高大毛霉液体培养条件进行研究。 依据微生物培养基选择和配制工业发酵生产原则，利用豆腐生产工艺中的副 产物黄泔水为溶剂，通过单因素实验和正交实验，在2 8 、2 0 0r p m 摇瓶培养下， 确定m h c 7 最佳培养基为黄豆粉3 、可溶性淀粉o 4 、硫酸镁0 2 、磷酸 二氢钾0 2 、蔗糖0 3 和黄泔水。培养基中碳氮比为1 5 左右，最适接种量为 6 时，最适起始p h 值为6 0 ，通过生物量测定，液体发酵在3 6h 达到最大值 ( 1 3 6 3 9 1 0 0 m 1 ) 。 通过对腐乳发酵过程中酶活力及化学组分变化规律进行研究。结果表明： m h c 7 摇瓶发酵培养最佳时间是3 4 3 8h ，在1 9l 发酵罐扩大培养条件下的最佳 发酵时间是3 0h ，生物量达2 2 8 9 l o o m l ( 菌体湿重) 。腐乳前发酵周期缩短4 8h 。 m h c 7 在豆坯上发酵培养最佳时间是3 2 3 4h 。在腐乳后发酵4 5d 左右，各种酶 活力不断下降，而谷氨酰胺酶酶活力持续增长使瘸乳鲜味一直增长。当谷氨酰胺 酶( 7 6 5 g ) 、总酸( 1 0 ) 、游离氨基态氮( o 4 5 ) 及粘度( 2 1 0 5m p a s ) 时可以作为判断腐乳成熟的标准。 为了提高腐乳的安全性，针对贵州省内生产的腐乳中可能感染的黄曲霉毒素 b l 、伏马毒素b 1 、赭曲霉毒素a 、杂色曲霉毒素及葡萄球菌肠毒素的进行测定， 以此对腐乳作出安全评价，实验结果表明我省几家大型腐乳厂生产的几种腐乳中 毒素含量低于国家标准最低检测限，完全符合国家食品安全方面的要求。市场上 散装腐乳中毒素含量高于国家标准。 关键词：高大毛霉( m h c 7 ) ；液体培养；酶活力；化学成分；粘度； 毒素 贵州大学硕上研究生学位论文 a b s t r a c t m u c o rm u c e d o ( l 。) f r e s i s ，a l le x c e l l e n ts t r a i n sb r e w e di ns u f u ，m a i n l yf o rt h e p r o d u c t i o no fs u f ub yt h et r a d i t i o n a lm e a n s ，s o l i df e r m e n t a t i o n , b u ti th a dn o tb e e n r e p o r t e dg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c sa n da p p l i c a t i o ni nt h el i q u i dc o n d i t i o n s i no r d e rt o i m p r o v eo nt h et r a d i t i o n a lt e c h n i q u e so fs t r a i n f e r m e n t a t i o ni n t h ep r o d u c t i o no f f e r m e n t e ds u f u , t h el i q u i dg r o w t hc o n d i t i o n so fm h c - 7i ss t u d i e d a c c o r d i n gt ot h ep r o d u c t i o np r i n c i p l eo f t h es e l e c t i o na n dc o m p o u n do fm i c r o b i o l o g i c m e d i u m ，u s i n gy e l l o ws w i l l ，t h eb y p r o d u c ti nt h ep r o d u c t i o no ff e r m e n t e dt o f u , 硒t h e s o l v e n t , v i at h es i n g l ee l e m e n ta n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t , t h eo p t i m u mm e d i u mi s d e t e r m i n e d ：s h a k i n g 诵t l l2 8 c ，2 0 0r p m ，3 s o y b e a np o w d e r , 0 4 s o l u b l es t a r c h , 0 2 m a g n e s i u ms i - t l f a t e ，0 2 p o t a s s i u md i h y d r o g e np h o s p h a t e ，o 3 s u c r o s ea n d s o y m i l l 【n 圮a d e q u a t ec nr a t i oi nm e d i u mi sa b u a t1 5 t h ei n i t i a lo p t i m a li n o c u l u m i s6 a n dp hi s6 t h r o u g hb i o m a s sd e t e r m i n a t i o n , t h ef e r m e n t a t i o ni nl i q u i dr e a c h e d t h em a x i m u mv a l u ei nt h e3 6h o u r ( 1 3 6 3 9 1 0 0 m 1 ) t h i se x p e r i m e n tc o n c e n t r a t e do nt h ec h a n g er u l e so ft h ee n z y m ea c t i v i t ya n d c h e m i c a lc o m p o s i t i o nd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o n 1 1 1 er e s u l t ss h o w ：t h eb e s t f e r m e n t a t i o nc u l t i v a t i o nt i m eo fm h c 7i s3 4 h 38 h t h eb i o m a s so fm h c 7w a sa b l e t or e a c hr e s p e c t i v e l y2 2 8 9 10 0 m l ( w e tw e i g h to fm y c e l i a ) a t3 0 hi nt h e19 lg e n e r a l f e r m e n t o r t h i sm e a n st h ef e r m e n t a t i o nc y c l eo ft h es u f ui ss h o r t e n e db y4 8 h ，n l e b e s tf e r m e n t a t i o nt i m eo fm h c 7i nt h eb e a n sb i l l e ti s3 2 3 4 h w i t h i nt h el a t e4 5 f e r m e n t a t i o nd a y so fs u f u , a l lk i n d st h ea c t i v i t yo fe n z y m ef a l l i n g ，b u tg l u t a m i n a s e w e r ed e c l i n i n ga st h et i m ei n c r e a s i n g c o n v e r s e l yt h eg l u t a m i n a s ea c t i v i t yw a s g r o w i n gc o n t i n u o u s l y ，r e s u l t i n gi nt h eg r o w t ho f t h ef l a v o ro fs u f u s ow h e nt h e c o n t e n tb e c o m e 嬲t h i s ：g l u t a m i n a s e ( 7 6 5 眺) ，t o t a la c i d ( 1 0 ) ，a n dv i s c o s i t y ( 2 10 3 m p a s ) ，t h i ss u f ui sm a t u r eo nt h ew h o l e i no r d e rt oe n h a n c et h es a f e t yo ff e r m e n t e ds u f u ，w ed e t e r m i n ea f l a t o x i n b1 ， o c h r a t o x i n a ，s t e r i g m a t o c y s t i n , f u m o n i s i n b 1a n ds t a p h y l o c o c c a le n t e r o t o x i n ，w h i c h m a y b eb ei n f e c t e di nt h ep r o d u c t i o no ff e r m e n t e ds u f ui ng u i z h o up r o v i n c e ，a n dt h e s a f e t ye v a l u a t i o no fs u f u 1 1 l er e s u l t ss h o wt h a tt h ec o n t e n to ft o x i np r o d u c t e di n g u i z h o up r o v i n c ew e r eb e l o wt h em i n i m u md e t e c t i o nl i m i to ft h en a t i o n a ls t a n d a r d i t w a sf u l l yc o n s i s t e n tw i t hn a t i o n a lf o o ds a f e t yr e q u i r e m e n t s b u tt h ec o n t e n to ft o x i n o ft h eb u l ks u f uo nt h em a r k e te x c e e d e dt h es t a n d a r d 2 k e yw o r d s ：m u c o rm u 品d o ( l ) f r e s ，l i q u i df e r m e n t a t i o n ，a c t i v i t yo fe n z y m e ， c h e m i c a lc o m p o s i t i o n ，v i s c o s i t y ；t o x i n s 贵州大学硕士研究生学位论文 学位论文原创性声明和关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究在做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：友 菊 e l 期： 2q q 墨生芏月 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：五孝 导师签名：日期：2q q 星生叁角 贵州大学硕士研究生学位论文 1 1 引言 第章绪论 高大毛霉( m u c o rm u c e d o f z jf r e s ) ( 刑来君等，1 9 9 9 ) 隶属于接合菌门 ( z y g o m y c o t a ) ，接合菌纲( p h y c o m f l c e t e s ) ，毛霉目( m u c o r a l e s ) ，毛霉科 ( m u c o r a c e a e ) ，毛霉属( m u c o rm i c h e l ie xf r i e s ) ，是我国当前腐乳生产应用中的优 良菌种之一。 高大毛霉分布很广，多出现在兽畜的粪便上，在培养基上的菌落初期呈白色， 老后变为淡黄色，有光泽，菌丝长达3 1 2c m ，孢囊梗直立，不分枝，长度同菌 丝的高度，直径3 0 6 0 岬，壁光滑，无色。孢囊壁有草酸钙结晶。该菌能产生 3 羟基丁酮、脂肪酶，还能产生大量的琥珀酸，对甾族化合物有转化作用。 高大毛霉m h c 7 ( 以下简称m h c 7 ) 是酿造腐乳的微生物，它与腐乳的生产 密切相关。下面就毛霉与腐乳的相关研究作出总的概述。 1 2 传统大豆发酵食品腐乳生产的发展与研究 中国是大豆的故乡，中华民族食用大豆的悠久历史，大豆作为我国的传统食 品，在中华民族的繁衍生息中起到了极其重要的作用。 大豆食品具有丰富的营养价值和保健价值。中华民族发明了种类繁多的大豆 食品，形成了根深蒂固的豆制品文化。在中国人所发明的传统大豆食品中，最具 代表性的就是腐乳，腐乳是利用微生物发酵的方式改变植物蛋白风味的大豆制 品，它起源于民间，植根于民间，以独特的工艺、细腻的品质、丰富的营养及鲜 香可口的风味深受广大群众的喜欢。 1 2 1 中国腐乳的悠久历史与文化 豆腐乳又名腐乳或乳腐，英文名有s u f u ，f u s u ，f u - r u 等十几种之多( w a n g ， h l e ta 1 ，1 9 7 0 ) ，是我国独有的民族传统发酵豆制食品之一，系用豆浆的凝状物， 经微生物发酵后所制成的一种奶酪型产品。在同本，腐乳被叫做t o f u y o ，n y u f u 4 贵州大学硕士研究生学位论文 或缸n y u 。在越南叫做c l l a 0 ，菲律宾人称腐乳为协h u r i ，而泰国人则把腐乳叫做 t a o h u - y i 。( h a r tb z e ta 1 2 0 0 1 ) 。 腐乳生产是我国首创的，生产已有悠久的历史。由豆腐制成腐乳起源于一千 五百年前的北魏末年，当时古书中就有记载“干豆腐加盐后为腐乳”。而在本草 纲目拾遗中又有“豆腐又名椒乳，以豆腐腌过酒槽或酱制者，味咸甘心”。在此 以后，特别是清朝，有关腐乳的记载和报道更是越来越多，例如清袁枚在随园 食单中提到的有“广西白腐乳”；而关于腐乳的全面和有参考价值的记载是清李 石亭的醒园录，书中详细写有“酱豆腐乳法”两例。 腐乳的制作最初只是豆腐盐藏的一种手段。然而我国劳动人民却在有意识地 抑制有害微生物的同时无意识的利用了有益微生物，从而产生出腐乳这一全新的 不同于豆腐的发酵食品。 1 2 2 腐乳的分类 我国腐乳的分类可以从两个方面来划分，一是从生产工艺划分，它是根据豆 腐坯是否有微生物繁殖而分为腌制型和发霉型两大类，发霉型则又分为天然接种 和纯种培养两种。根据豆腐坯培菌的菌种不同，还可分为毛霉型、根霉型和细菌 型；二是从产品的种类划分，例如可以分为红腐乳、白腐乳、青腐乳、酱腐乳和 花色腐乳等等，具体见表1 1 。一 襄1 - 1 腐乳的分类 t a b l e1 1s o x t so fs u f u 鼹广工艺类型 r 腌制腐乳 l 培茵腐乳 ，堕量蚺耋裂、 一产品类型之青腐乳 i 白腐乳 厂红腐乳 ( 按产品类型分 。一。l 三蔷i 花色腐乳 二：三毛霉根霉 贵州大学硕士研究生学位论文 。 1 2 3 腐乳生产工劳 腐乳生产经历了由原始生产工艺，传统生产工艺到现行生产工艺，由豆腐坯 生霉发酵到利用天然微生物发酵，最后实现了纯种微生物培养发酵。 目前腐乳生产的基本工艺流程为： 大豆一摄泡磨浆一滤浆一煮浆一过筛一点浆 一撇浆_ 上榨一压榨一划块一豆腐坯一摆架 一接种一前发酵一搓毛一腌坯一装瓶一后发酵 一成熟腐乳 腐乳生产是物理化学与生物化学变化的综合过程。从大豆的浸泡到白坯的制 成，是一个物理化学过程从接种培菌到成品，则是一个生物化学过程。后者称 之为发酵，又分前发酵和后发酵。 腐乳生产的前发酵，亦称培菌过程，它包括处理坯、摆架、接种培养、搓毛 等操作。其目的是要求毛霉在白坯上生长，繁殖与代谢，白坯由菌丝包裹成形， 以便代谢产物如蛋白质酶、n 淀粉酶、脂酶和a 半乳糖苷酶等水解酶。在后发酵 时将大分子物质分解并酯化成香，从而得到细腻绵柔，昧美色佳的块形成品。 1 2 4 腐乳生产工艺研究 1 9 8 2 年，魏岩寿、祝汝佐首先对生产腐乳所用毛霉菌进行了研究。1 9 4 2 年， 我国发酵行业老前辈方心芳先生对几种四川的霉菌进行了分离鉴定，为腐乳培菌 前发酵的科学化、规范化奠定了基础。6 0 年代研究人员又提出了纯种制造腐乳 及其成熟期间生物化学变化过程的报告。尤其从8 0 年代以来，在腐乳生产上进 行了许多研究及工艺的改革，腐乳的产量质量都有了显著提高。目前，我国腐乳 白坯的生产，从浸泡、洗选、滤浆、压制切块，基本上已实现了机械化或半机械 化，而且正在朝着自动化的方向发展。腐乳生产的前发酵绝大多数已改传统的自 然发酵为纯菌种接种发酵工艺，并根据纯菌种的生物学特性，科学地控制环境( 温 度、湿度、通风条件等) ，有效地提高了生产效率和产品质量。在后发酵方面， 1 9 9 0 年北京市腐乳厂研制出腐乳直接装后酵工艺，缩短了发酵周期，提高了成 品完整率，包装也趋于多样化和精美化。 6 贵州人学硕士研究生学位论文 为了缩短腐乳发酵的周期，研究人员进行了多方面的尝试。李幼筠等通过自 行分离诱变的高大毛霉制毛坯，利用酶制剂协同作用，盐腌与装瓶同时进行，控 温发酵，使发酵周期由半年以上缩短为两个月左右。张远琼等采用加大人工接种 量的方法，接种8 2 0 的毛霉菌种( 一般发酵工业中接种为1 5 ) ，把生产周 期缩短到1 5d 。随着技术的不断发展，腐乳的生产周期会大大的缩短。 1 2 5 腐乳的营养 腐乳是营养丰富的大豆发酵食品，通过微生物发酵，大豆的苦腥味、含有的 胀气因子、抗营养因子等不但全被克服，同时还能产生多种具有香味的有机酸、 醇、酯和氨基酸。腐乳的营养成分见表1 2 。 衰1 - 2 腐乳营养成分 t a b l e1 - 2n u t r i t i o n a lc o m p o s i t i o n so fs u f u 此表引自( 袁振远，1 9 8 5 ) 表1 - 3 腐乳中氟基酸的含量及f a 0 推荐的氨基酸含量 t a b l e1 - 3 c o n c m t m t i o no f a m i n oa c i di ns u ma c c e p t a b l ed m l y n e e do f a m i n oa c i ds u g g e s t e d 蚵f a 0 氯基酸 n cl 眦 l y sm e t + t y r p h e + t y rt t l r 、u1 - 印 腐乳中氯基酸含量m 1 0 0 9 5 1 07 0 06 1 07 0 09 7 05 1 06 4 09 0 此表引自( 李理，1 9 9 9 ) 由表1 2 和表1 3 说明，腐乳中蛋白质含量在1 2 - 1 7 之间，8 种氨基酸齐 全，腐乳中营养丰富，每l o o g 腐乳提供的必须氨基酸含量基本可供成人日的 需要量。 7 贵州大学硕士研究生学位论文 由于微生物所分泌的蛋白酶的水解作用，发酵原料中的蛋白质大部分己降解 为小分子的多肽，这些多肽有的被证实具有多种生理功能，有的被分离纯化，并 已确定对发酵产品的风味有重要影响。研究表明：成熟后的腐乳中，不存在完整 的蛋白质，蛋白质的分子量低于9 9 2 1k d ，这一方面有助于消化吸收，提高了大 豆蛋白质的营养性，并降低蛋白质的抗原性，防止高蛋白食物的过敏反应；另一 方面，产生的肽种类丰富，可能成为重要的生理活性肽的资源库。 1 2 6 毛霉在腐乳生产中的作用 腐乳的生产是一个复杂的生物化学过程，其中微生物起着极其重要的作用， 尤其我国腐乳生产中使用的一些优良菌种，诸如王致和毛霉a s 3 2 5 、鲁氏毛霉、 雅致放射毛霉a s 3 2 7 7 3 等，它们具有以下作用。 ( 1 ) 毛霉的菌丝粗壮，质地致密，粘而韧，长达1c m 以上，可以在腐乳的 表面均匀的覆盖一层0 2m m 厚的皮膜，可包被其细腻的内含物，对保持腐乳的 形态起主导作用，同时，其菌丝洁白，不产生深色孢子，酿制的毛坯色泽纯净亮 丽，相对于根霉来讲，毛霉的菌丝更为致密，柔软，对皮膜的形成和产品的质量 更为有利。 ( 2 ) 毛霉生长迅逮；繁殖快，抗杂菌能力强，并可产生较高活力的蛋白酶， 能保证大豆蛋白质的适度的分解，并具有a 淀粉酶，脂肪酶，a 半乳糖苷酶，谷 氨酰胺酶等多种酶系，在腐乳特有的色、香、味的形成中起极其重要的作用。 ( 3 ) 毛霉培菌的毛坯有一种特殊的香气味，是其它霉菌不能代替的。 1 3 国内外研究概况 1 3 1 腐乳液体发酵的研究 近几年来，毛霉被用于液体培养的研究越来越多，特别是雅致放射毛霉，除 了对其本身的研究以外，已经把该毛霉应用于腐乳工业化生产，并表现出了良好 的效果。 河北大学王谦等人对雅致放射毛霉a s 3 2 7 7 8 进行了较为深入的研究，该项 研究尝试了毛霉a s 3 2 7 7 8 的液体深层培养及工业规模发酵液体毛霉菌种应用于 8 贵州大学硕士研究生学位论文 腐乳生产的研究，并对毛霉a s 3 2 7 7 8 在液体培养条件下的生长特性、发酵条件、 蛋白酶活性等进行了较为全面的探讨。证明了雅致放射毛霉a s 3 2 7 7 8 在黄豆粉 为原料的培养基中，2 8 、2 0 0r p m 摇瓶条件下可以生长得很好。在前2 4h 内， 菌丝体大量积累，生物量逐渐增大，3 6 4 0 h 进入稳定期，碳氮比为1 ：2 左右可 以得到较高的蛋白酶活力。最适起始p h 为6 ，在3 6h 达到产酶高峰期。检测表 明滤液中的蛋白酶活一般可以达到1 0 2 0 幽m 。液体种发酵周期在1 6 2 4h ，菌丝 湿重在2 0 9 1 0 0 m l 以上，菌液稀释2 倍时，可以显示出比生产用菌种明显的优势， 使前发酵周期缩短6 8h 。研究结果证实，以工业化液体深层发酵方式培养雅致 放射毛霉液体菌种应用于腐乳生产完全可行。 中国农业大学的孙君社、刘建立等人研究了在液体培养条件下雅致放射毛霉 产蛋白酶特征和蛋白酶的酶学性质，并对雅致放射毛霉蛋白酶在新型腐乳生产中 的应用进行了探讨，其结果表明了在温度2 8 、初始p h 值8 5 、摇床转速2 2 0 2 5 0 r p m 的条件下有利于雅致放射毛霉a s 3 2 7 7 8 蛋白酶的生产。通过均匀设计方法 优化了毛霉蛋白酶的产酶培养基。菌体的生长符合l o g i s t i c 模型，毛霉蛋白酶的合 成符合l u e d e k i n g p i r e t s 方程。( 孙君社， 2 0 0 5 ) 1 3 2 腐乳成熟度的研究 腐乳生产的后酵是一个比较长且复杂的生化过程，是腐乳特有风味形成、蛋 白质降解的主要阶段。有关腐乳成熟度的报道比较少。余若黔等( 余若黔等，2 0 0 1 ) 研究腐乳后酵过程中可溶性蛋白质及氨基酸含量的变化直观地反映了腐乳的成 熟情况，当可溶性蛋白质含量在18 2 0 ( 干基) ，氨基酸态氮大于o 4 5 时腐乳 基本成熟。 1 3 3 腐乳安全性研究 食品安全其实只是相对的安全。食品的相对安全是指一种食品或食品成分在 合理食用和正常食用量情况下不会导致对健康的损害。只要食品的感官、理化、 微生物和毒理学指标符合国家标准，我们就可以认定其是安全的。以下几类因素 影响了食品的安全：( 1 ) 微生物( 致病菌、病毒和寄生虫) ：( 2 ) 生物毒素；( 3 ) 农药、兽药残留；( 4 ) 化学物质( 主要为重金属污染) ：( 5 ) 物理因素；( 6 ) 食品 9 贵州大学硕士研究生学位论文 添加剂；( 7 ) 食品包装材料；( 8 ) 转基因植物；( 9 ) 新物质等。 毒素污染的主要对象是粮食、食品和饲料，而这些与人类生命健康息息相关， 也对畜禽产品有重大影响。因此，我们要不断地深入进行毒理研究，为维护人类 健康和挽回粮食及畜禽产品的经济损失提供解决方法和依据。 不同种类的毒素有其各自的特点，因此其毒性作用的差别也很大，取决于其 摄入水平、暴露时间、动物种属、身体状况以及饲料或食物中同时存在的毒素之 间的协同作用等。主要的毒性作用包括致癌作用、遗传毒性、致畸作用、肝细胞 毒性、中毒性肾损害、生殖紊乱和免疫抑制( 吴艳平等，2 0 0 1 ) 。 近年来在大豆及大豆制品中有关毒素污染的情况都有报道，但有关腐乳中污 染毒素的情况及测定都没有相关报道，所以通过选取腐乳的生产原料( 大豆) 及 加工过程中容易感染的黄曲霉毒素( a f l a t o x i n s ，a f ) ，赭曲霉毒素( o c h r a t o x i n a ， o t a ) ，杂色曲霉毒素( s t e r i g m a t o c y s t i n ，s t ) ，伏马毒素( f u m o n i s i n ，f m ) 及 一种细菌毒素葡萄球菌肠毒素( s t a p h y l o c o c c a le n t e r o t o x i n ，s e ) 几种毒素进行测 定。本文主要对贵卅i 省生产的几种腐乳的毒素进行测定，对其作出安全评价。下 面就几种毒素致病机理作简单介绍。 1 3 2 1 黄曲霉毒素( a f ) 这是一类毒性极强的物质，尤其是a f b l ，其毒性是氰化钾的1 0 倍，具有强 致癌性和强免疫抑制性，即使在含量极低时仍具有很大的毒性( 官春波等，2 0 0 4 ) 。 a f 中毒症状主要为发热、呕吐、食欲减退、黄疸，严重的出现腹水、下肢浮肿、 肝脾肿大。急性中毒主要损害肝脏，表现为肝细胞坏死和胆管上皮细胞增生等； 慢性中毒则表现为发育迟缓、肝细胞变性甚至肝硬化等。 1 3 2 2 赭曲霉毒素a ( o t a ) o t a 是一种较强的肾脏毒( 李凤琴等，2 0 0 3 ) 。用免疫荧光技术对喂养o t a 的大鼠各脏器的分析结果表明，肾、肝、脾、心肌、肌肉、肠管等组织中均含有 o t a ，其中以肝细胞和肾小管基底膜残留较多。除特异性肾毒性作用以外，o t a 还对免疫系统有毒性，并有致畸、致突变和致癌作用。 1 0 贵州大学硕上研究生学位论文 1 3 2 3 杂色曲霉菌素( s t ) s t 在自然界中广泛存在，因结构与a f b i 相似，且可以转化为a f b i ，因此 其毒性和致癌性受到世界各国的高度重视。s t 急性中毒的病变特征是肝、肾坏 死；亚急性与慢性毒性中毒特征性病变是皮肤和内脏器官高度“黄染”，马属动物 “黄肝病”实质就是s t 中毒。许多试验已经证明，s t 是继a f 之后具有较强致癌 作用因子。据调查，在肝癌高发区居民的食物中，s t 污染较为严重( 赵宝玉等， 1 9 9 7 ) 。 1 3 2 4 伏马毒素( f b ) f b 是一类细胞毒，也是致癌物质，其中f b l 毒性最强，是一种较强的肝脏、 肾脏毒，但作用机制尚不明确。f b l 通过抑制髓鞘醇酰基转移酶的活性而破坏鞘 磷脂的代谢，它还具有抑制一些细胞酶活性的作用，其后果是抑制了鞘磷脂、蛋 白和尿素的代谢。其致癌机制则是髓鞘样碱基的堆积导致d n a 的非时序性合成 ( 李群伟等，2 0 0 1 ) 。另外，被f b 污染的粮食常常伴有另外一种非常重要的霉 菌毒素一黄曲霉毒素的存在，这更增加了对人和牲畜危害的严重性。 1 3 2 5 葡萄球菌肠毒素( s e ) s e 是一种典型的细菌外毒素，主要是由金黄色葡萄球菌在特定的生长条件 下合成的，其生物学本质是一类低分子量蛋白质及多肽。根据其抗原性可将其分 为5 个血清型：s e a 、s e b 、s e c 、s e d 和s e e 。在众多微生物毒素中，金黄色 葡萄球菌肠毒素被认为是第二大细菌毒素( b u z b yj c e ta l ，1 9 9 7 ) 。有资料报道， 在每1 0 0g 食物中含有不足1 8 岭的肠毒素便能引起金黄色葡萄球菌食物中毒症 状。另一方面，金黄色葡萄球菌肠毒素又是一种外原性超级抗原( s a g ) 。极微量 的s e 即能高效地刺激哺乳动物及人的t 细胞增殖。体外细胞水平和动物体内水 平的研究结果表明，s e 能产生强大的杀伤或抑制肿瘤细胞的效应( a 1 e x a n d e rr 等，1 9 9 8 ) 。 贵州大学硕士研究生学位论文 1 4 本课题研究的意义及内容 1 4 1 本课题研究的意义 尽管在毛霉，特别是雅致放射毛霉的固体、液体发酵上均有一些相关的研究， 而对高大毛霉的研究极少，该菌种经贵阳南明老干妈风味食品有限公司使用表 明，高大毛霉m h c 7 生产性能明显优于其它菌种。但是贵州地区的风味食品企 业应用于前发酵的毛霉菌种均采用的是传统固体菌种发酵方式，本研究在立足于 制备液体种应用于生产中的基础之上，研究了m h c 7 在液体深层培养条件下的 生长特性、产酶特征等，并对腐乳生产过程中的生化指标进行动态分析及对我省 生产腐乳进行安全性评价。以便于全面地了解m h c 7 的特性，为液体菌种发酵 生产提供理论指导，为腐乳生产工艺的改进和调控提供有力的证据，进一步促进 腐乳行业的发展。 1 4 2 本课题研究的内容 1 4 2 1m h c 7 液体培养条件的研究 在腐乳的生产中，所用毛霉菌种起着极为关键的作用。除了进行菌种选育提 高菌种的质量之外，在制种方式上的改进也是一条切实可行的途径。目前应用于 前发酵豆腐坯培菌的毛霉大都采用固体菌种。固体发酵的菌种由于稳定性差、易 污染、菌丝活力低、易老化、接种量不均匀、原料利用率低、生产周期长等因素 的影响。而液体发酵菌种纯度高、菌龄一致、菌丝活力高、菌种质量佳、生产周 期短，生产效率高，便于机械化生产和管理、腐乳感染其它杂菌的几率大大降低， 腐乳品质稳定均一、减少劳动强度、降低成本，增加经济效益。 尽管液体菌种的生产和应用已经有一些研究( 贾新成等，1 9 9 1 ) ，但在贵州 地区的腐乳生产上一直未能得到实际应用，m h c 一7 液体培养制取菌种技术还未 见报道。因此，本项研究在保证腐乳产品风味品质基础之上，以腐乳厂废弃物 黄泔水为液体培养基基础原料，利用正交试验筛选适宜的液体发酵培养基；尝试 用液体深层发酵工艺代替原始的固体制种工艺，为实现腐乳工业化生产提供依 据，并大力提高腐乳生产的高技术含量。一方面使毛霉菌种纯度、质量提高，另 1 2 贵州大学硕士研究生学位论文 一方面满足腐乳生产过程中对毛霉菌种的大量需求，以降低成本，减少劳动强度， 增加经济效益，为进一步扩大生产，出口创汇创造条件。 1 4 2 2m h c 7 在发酵过程中酶活力、化学成分变化及粘度变化的研究 腐乳的发酵过程是一个复杂的生物化学过程，其反应机理以及在发酵过程中 发生的变化至今尚未完全明了。但不可否认的是腐乳的发酵过程与酶系的作用密 切相关，而对腐乳发酵过程中酶活力的研究却不够深入。m h c 7 菌株在液体发 酵生产腐乳中酶活力的研究至今未见任何报道。腐乳发酵分为前发酵和后发酵， 前发酵里包括生产菌种发酵和豆坯上发酵。本文应用筛选获得的液体发酵培养基 对m h c 7 菌株在腐乳生产前发酵与后发酵过程中酶活力的变化研究，探索适合 本省的工业化生产工艺，通过放大培养并发酵腐乳，确定最适宜的发酵条件。通 过对同一批m h c 7 腐乳样品在不同发酵时间的酶活力的跟踪测定，分析获得了 腐乳前、后发酵过程中酶系变化的规律。 化学成分与腐乳的感官及风味也有密切关系，影响腐- 孚l # b 观及口感的主要因 素为水溶性蛋白和盐分。各种游离氨基酸、还原糖、有机酸及盐分共同构成腐乳 的独特滋味，对腐乳的风味有重要影响。此外，盐分也是影响腐乳品质的重要因 素。盐的存在不仅能够抑制微生物生长，起到保藏的作用，同时赋予腐乳咸味。 本文采用工业生产工艺及配方，对自制m h c 7 腐乳样品进行跟踪检测，测定其 盐分、粗蛋白、粗脂肪、游离脂肪酸、总酸、游离氨基态氮、还原糖测定。得到 m h c 7 液体发酵腐乳生产过程中化学成分的变化规律，从而为进一步掌握腐乳 发酵过程的一些动态变化，完善腐乳的酿造机理及生产中对腐乳成熟度的控制提 供一定的理论依据。 腐乳的质量评价，可以通过感官检验来确定，由于个体因素差别大。感官检 验的结果也彼此差别大，重现性不佳，因而在生产质量管理上缺乏统一标准，不 利于产品质量的稳定和提高。随着现代科技的发展，用仪器测定来量化表示食品 品质是国际食品科学发展的一大趋势，仪器测定的特点是把食品的特征如粘度的 大小等通过仪器测量用客观的数字表达出来，重现性好。在此之前，没有人针对 腐乳进行过系统的研究，对腐乳发酵过程中粘度的变化规律缺乏细致的研究和阐 述。粘度较大、弹性较强的豆腐白坯到质地细腻、入口无渣的腐乳，腐乳的发酵 贵州大学硕1 ：研究生学位论文 过程是物理性质发生巨大变化的过程当然，粘度的变化与白坯的品质及腐乳发 酵体系中酶系密切相关：前期培菌产生了大量的酶系，在后发酵过程中分解豆坯 里的化学物质，从而使得豆腐坯向腐乳的转变得以完成。本文通过对m h c 7 腐 乳在发酵过程中粘度进行研究，掌握腐乳发酵过程中的粘度变化规律，寻找粘度 与腐乳成熟度的关系并以次作为腐乳成熟的辅助指标，为实际生产提供理论依 据。 1 4 2 3 对贵州省内生产的腐乳成品进行安全评价 腐乳中容易被几种生物毒素污染。生物毒素污染主要包括细菌毒素和霉菌毒 素两个方面。细菌毒素可直接引起细菌性食物中毒，如金黄色的葡萄球菌产生的 葡萄球菌肠毒素；霉菌毒素主要包括黄曲霉毒素b l 、赭曲霉毒素a 、杂色曲霉 毒素、伏马毒素b 1 等。由于目前腐乳尚无系统安全评价指标，本研究依据我省 腐乳生产工艺及状况，针可能存在的几种毒素污染情况进行检测，初步掌握腐乳 污染状况，以期建立腐乳成品毒素安全评价体系，解决我省在腐乳安全检验方面 的迫切需求i 保证人们的安全与健康，对推动我省腐乳业发展具有重要的意义。 1 4 贵州大学硕士研究生学位论文 2 1 引言 第二章m h c 7 液体深层培养及基本生理条件的研究 本研究目的在于改进腐乳生产的传统工艺，将现代发酵工程技术应用于腐乳 生产，实现用高大毛霉液体深层培养技术取代传统的固体及浅盘式液体培养技 术。在前期研究基础上，以影响m h c 7 生长主要因素c 源和n 源为基础，通过正 交试验筛选适宜m h c 7 的液体生长发酵培养基，研究m h c 7 液体摇瓶生长规 律及特点，优化m h c 7 液体培养条件，为进一步研究腐乳发酵过程中化学成分及 产酶变化提供基础。 2 2 材料与方法 2 2 1 供试菌种 高大毛霉( m u c o rm u c e d o ( l ) f r e s ) m h c 7 购自成都调味品研究所。 2 2 2 试剂 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 果胶 乳糖 干酪素 三氯乙酸 硫酸镁 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 无水乙醇 酵母膏 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 天津市北方天医化学试剂厂 天津市化学试剂六厂三分厂 北京奥博星生物技术有限责任公司 天津市科密欧化学试剂开发中心 上海试剂二厂 上海化学试剂采购供应站 天津市大茂化学仪器供应站 重庆川江化学试剂厂 天津市化学试剂六厂三分厂 天津市化学试剂六厂三分厂 贵阳高新技术开发区华通化学试剂厂 北京双旋微生物培养基制品厂 贵州大学硕士研究生学位论文 牛肉膏 蛋白胨 琼脂 三氯化铝 淀粉 黄豆粉 麸皮 2 2 3 实验设备 微量移液器 高压灭菌锅 空气恒温振荡器 光学显微镜 电热恒温鼓风干燥箱 电子恒温水浴锅 超净工作台 电子天平 电热恒温培养箱 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 北京双旋微生物培养基制品厂 北京双旋微生物培养基制品厂 福建省莆田县平海琼脂厂 成都化学试剂厂 中国上海华东师范大学化工厂 购于市场 贵阳市粮食局 w k y 型1 0 0 5 0 0 1 d g m s ) o _ 2 8 0 型 t h z 一8 2 a 型 x s z g g z x g f 1 0 1 2 d k 9 8 1 s w c j 1f j a 2 0 0 3 h h 、b h 4 2 0 上海求精生化试剂仪器有限公司 北京市永光明医疗仪器厂 金坛市富华仪器厂 泰克仪器有限公司 上海跃进医疗仪器械厂 北京长安科学仪器厂 苏州安泰空气技术有限公司 上海天平仪器厂 天津市实验仪器厂 2 2 4 培养基 ( 1 ) p d a 蛋白胨培养基：土豆2 0 0g ( 只取滤汁) ，葡萄糖1 5g ，琼脂1 5g ， 蛋白胨5g ，补水至1 0 0 0m l 。 ( 2 ) 查氏培养基：蛋白胨5g ，葡萄糖1 0g ，磷酸二氢钾1g ，硫酸镁0 5g ， 琼脂2 0g ，补水至1 0 0 0m l 。 ( 3 ) 黄豆粉培养基：黄豆粉3 0g ，麦芽糖5g ，硫酸镁2g ，磷酸二氢钾2g ， 酵母膏1g ，补水至1 0 0 0m l 。 ( 以上培养基灭菌条件：o 0 7m p a1 1 4 3 0m i n ) ( 4 ) 麸皮培养基：麸皮1 0g ，水1 1m l ，装入2 5 0m l 三角瓶中，搅拌，灭 1 6 贵州大学硕士研究生学位论文 菌后及时摇散备用。 - ( 5 ) p d a 培养基：土豆2 0 0g ( 只取滤汁) ，葡萄糖1 5g ，琼脂1 5g ，补水至 1 0 0 0m l 。 ( 以上培养基灭菌条件：o 1m p a1 2 1 ，2 0m i n ) 2 3 方法与步骤 2 3 1m h c 7 的活化与保藏 2 3 1 1 菌种活化 m h c 7 原始菌种用无菌操作取菌1 环接入查氏培养基斜面，或用无菌水稀 释法接种，2 8 保温培养7 2h ，取出，备用。 2 3 1 2 菌种保藏 将已经分离活化的毛霉在无菌条件下接种在已预先准备好的p d a 蛋白胨斜 面培养基中( 共接8 支保种) ，2 8 恒温培养约7 2h 后，取出放入冰箱4 保藏。 2 3 2m h c 7 的固体培养 首先将预先准备好的p d a 蛋白胨培养基倒入预先灭菌的3 个直径为1 2c m 的平皿中，每个约为3 0m l ，然后取出一支保种的m h c 7 接种在此三个平皿中， 2 8 恒温培养7 2h 。 2 3 3m h c 7 的液体培养基的设计 2 3 3 1m h c 7 在黄豆粉培养基中不同传代数生物量的测定 首先制作黄豆粉培养基，每瓶1 0 0m l ，将保种的第一代m h c 7 斜面菌块1 c m 2 接种到黄豆粉培养基中，2 8 、2 0 0r p m 恒温培养约7 2h ，以后每代按照6 的量接种。每次作两个平行样，每代毛霉发酵好后，用蒸馏水反复冲洗干净，静 置1 0m i n ，称菌丝湿重，然后置5 0 恒温箱内烘干至恒重后称量。 1 7 贵州大学硕士研究生学位论文 2 3 3 2 不同碳源对m h c 7 茵丝体生物量的影响 在培养基中分别添加l 的麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖作为 碳源，其他成分与黄豆粉培养基相同，接种后在2 8 、2 0 0r p m 条件下摇瓶培 养7 2h 。发酵好后，将菌丝用蒸馏水反复冲洗干净，静置1 0m i n ，称菌丝湿重， 然后置5 0 恒温箱内烘干至恒重后称量，测定生物量。 2 3 3 3 不同氮源对m h c 7 菌丝体生物量的影响 在培养基中分别添加以1 黄豆粉、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、麸皮为碳源， 其他成分与黄豆粉培养基相同，2 0 0r p m 条件下摇瓶培养7 2h 。生物量测定方法 同上。 2 3 3 4 不同无机盐对m h c 7 菌丝体生物量的影响 在培养基中分别添加以o 2 n a c i 、m g s 0 4 、k h 2 p 0 4 、c a s 0 4 ，其他成分与 黄豆粉培养基相同，2 0 0r p m 条件下摇瓶培养7 2h 。生物量测定方法同上。 2 3 3 5 发酵培养基正交实验 表2 - 1 黄泔水的成分 t a b l e2 - 1c o m p o s i t i o n mo fs o y m i l k 此表引自( 王瑞芝，1 9 9 8 ) 在前期研究的基础上，以蔗糖、淀粉作为碳源，黄豆粉、黄泔水作为氮源， 硫酸镁和磷酸二氢钾作为无机盐，按b ( 3 4 ) 设计三水平四因素实验。九个组合， 三次重复，采用1 0 0m l 摇瓶培养。2 8 ，2 0 0r p m 恒温培养约7 2h ，按照6 的 1 8 贵州大学硕士研究生学位论文 量接种。发酵好后通过测定菌丝干重来确定最佳培养基。( 黄泔水主要成份见表 2 1 ) a b l e 2 2 t e s t i n gf a c t o r sa n dl e v e l s 表2 - 3 培养基正交实验结果及极差分析( t a b l