（微生物学专业论文）杜氏盐藻gfp表达载体的构建及电转化.pdf

摘要 本实验扩增了r r - g f p 和g 咖片段，并分别与含有盐藻强启动子的载体连接，构 建了2 种带有g 彩报告基因的新型质粒表达载体p 2 1 5 t 和p 1 1 5 t ，质粒酶切电泳结果从 分子水平证明载体构建成功。质粒载体转化e s c h e r i c h i ac o l im c 4 1 0 0 a 细胞，探讨了 外源基因g 章在原核宿主中的表达。用p 2 1 5 t 和p 1 1 5 t 分别转化大肠杆菌，翻p 基因在 原核宿主中实现了表达，但荧光蛋t 3 产物在宿主细胞中的分布有所不同。用p 2 1 5 t 转 化细菌细胞，转化子荧光在细胞周围形成一个光圈或分布在两极。在p 2 1 5 t 中，g d p 基因上游存在r r - 信号肽序列，信号肽介导荧光蛋白在细胞内发生了转运。p 1 1 5 t 中 不存在信号肽序列，荧光均匀分布于转化细胞。 本实验采用电击法将质粒载体转化d u n a l i e l l as a l i n a 细胞，对藻龄、电击缓冲液 以及电场强度3 种电转参数分别进行了探讨，确定了本实验条件下的最佳转化条件。 实验证明，选择藻龄为7 d 的细胞，电击缓冲液组分为1 0 m m o l l “h e p e s + 0 5 m 0 1 l “ 甘油，电场强度为6 k v c m - 1 进行转化可获得本实验条件下最佳转化效果，载体p 2 1 5 t 和p 1 1 5 t 的最高转化率分别为1 0 0 o 和1 0 2 o 。 由于缺乏细胞壁，盐藻细胞对于渗透压十分敏感。在电击转化过程中，维持细胞 渗透压是提高转化效率的有效方法。本实验通过添加甘油改进电击缓冲液成分，讨论 了甘油对于提高转化前细胞存活率的作用，同时研究了不同浓度甘油对于盐藻细胞生 长的影响。实验证明，用含有o 5m o l l 1 甘油的h e p e s 缓冲液处理转化前细胞可获 得最高存活率，约8 6 。当甘油被添加到盐藻培养基时，实验发现低浓度甘油能够 促进细胞恢复生长，高浓度甘油对于细胞生长具有毒害作用；培养基中含有5 m m o l l o 甘油对于维持细胞生活力、促进总生物量的积累具有最佳效果。电击转化效 果和甘油生理实验均表明， o 5m o l l o 甘油可作为盐藻电击转化过程中种良好的 稳渗剂。 用质粒载体p 2 1 5 t 和p 1 1 5 t 分别转化杜氏盐藻细胞，报告基因g 加均能成功在藻 细胞中实现表达，d p 将成为盐藻基因工程中一种良好的筛选标记。镜检结果显示， 用p “5 t 转化盐藻细胞，转化子荧光亮度更高，且均匀分布；用p 2 1 5 t 转化盐藻细胞， 转化子荧光亮度稍低，少数细胞的形态和荧光均出现异常现象，初步推断可能与r r - 信号肽有关。 本实验所得结果将为建立新型杜氏盐藻生物反应器提供了良好的实验参数，有助 于推动盐藻转基因研究。 关键词：质粒载体报告基因咖d u n a l i e l l as a l i n a 电击转化 转化率甘油绿色荧光r r - 信号肽 a b s t r a c t t w o f r a g m e n t sw e r ea m p l i f i e da n dc l o n e di np l a s m i dv e c t o r sw i t ht h es t r o n g p r o m o t e ro f d u n a l i e l l as a l i n ar e s p e c t i v e l y t h e r e f o r et w op l a s m i dv e c t o r sw i t hg r p ，n a m e d a sp 2 1 5 t a n dp 1 1 5 t ，w e r ec o n s t r u c t e d i n t h i se x p e r i m e n t t h e i d e n t i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d sb ye n d o n u c l e a s ed i g e s t i o np r o v e dt h es u c c e s s f u lc o n s t r u c t i o ni nm o l e c u l a r b i o l o g y i no r d e rt oe x p l o r et h ee x p r e s s i o no f e # g e n ei np r o k a r y o t i ch o s t ，p l a s m i d sw e r e t r a n s f o r m e di n t oc e l l so f e s c h e r i c h i ac o l im c 4 1 0 0 a 卯g e n ee x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi n s t r a i nm c 4 1 0 0 a ，h o w e v e r , t h ep r o d u c t so f g f ps h o w e dd i f f e r e n td i s t r i b u t i o ni nh o s tc e l l s t h ef l u o r e s c e n c ea p p e a r e da sah a l oo rap o l a rl o c a l i z a t i o ni nc e l lw i t hp 2 1 5 t i np 2 1 5 t ， t h e r ei sa r r s i g n a lp e p t i d es e q u e n c ei nt h eu p s t r e a mo f 妨g e n e ，w h i c hc a nh e l pt o t r a n s p o r tt h eg 印p r o t e i nt ot h ep e r i p l a s m i cs p a c e w i t hp l l 5 lt h ef l u o r e s c e n c ei n t r a n s f o r m e dc e l lw a su n i f o r mb e c a u s eo f t h el a c ko f r r - s i g n a l p e p t i d es e q u e n c e t h em e t h o de l e c t r o p o r m i o nw a sa d o p t e dt ot r a n s f o r mt h ep l a s m i d si n t od s a l i n ac e l l s t h r e ep a r a m e t e r so fe l e c t r o p o r a t i o n ，t h a ti sc e l l a g e ，b u f f e ra n de l e c t r i c - f i e l di n t e n s i t y , w e r et e s ti no r d e rt of i n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o no fe l e c t r o p o r a t i o nf o rd s a l i n a t h er e s u l t s s h o w e d7 d a y s c e l la g e ，1 0 m m o l l 1h e p e s + 0 5 m o l 。l g l y c e r o la n d6k v - c l t i 1w a st h e o p t i m a lc o n d i t i o nf o rh i g h e re x p r e s s i o n t h eh i g h e s tr a t e so fe l e c t r o p o r a t i o nw e r e1 0 0 o a n d1 0 2 f o rp 2 1 5 ta n dp l l 5 t r e s p e c t i v e l y b e e a u s eo ft h el a c ko fw a l l ，c e l l so fns a l i n aa r es e n s i t i v et oo s m o t i cp r e s s u r e t h e r e f o r em a i n t a i n i n gt h eo s m o t i cp r e s s u r em a yb ea ne f f e c t i v ew a yt oi m p r o v et h er a t eo f e l e c t r o p o r a t i o n a sa no s m o t i cs t a b i l i z e r , g l y c e r o lw a sa d d e dt oh e p e sb u f f e r t w oe f f e c t s o fg l y c e r o lw e r ei n v e s t i g a t e dt oi m p r o v et h es u r v i v a lr a t eo fc e l l sb e f o r ee l e c t r o p o r a t i o n a n dt op r o m o t et h eg r o w t ho ft h ec e l l s h i g h i s ts u r v i v a lr a t e ，a b o u t8 6 ，w a sa b t a i n e d w h e nh e p e sb u f f e r 谢mo 5 m o l l - 。g l y c e r o lw a su s e dt ot r e a tc e l l sb e f o r ee l e c t r o p o r a t i o n w h e na d d e dt ot h ea l g a lm e d i u m ，g l y c e r o ls t i m u l a t e dt h eg r o w t ho fc e l l si nl o w e r c o n c e n t r a t i o n ，a n di n h i b i t e dc e l l sg r o w t h si nh i g h e rc o n c e n t r a t i o n 5m m o l l 。g l y c e r o lw a s a d v a n t a g et oh o l d i n gt h eh i g h e s tn u m b e ro f a c t i v ec e l l sa n dt op r o m o t i n gt h ea c c u m u l a t i o n o ft o t a lb i o m a s s t h e r e f o r e0 5m o l l “g l y c e r o lm i g h tb eas u i t a b l eo s m o t i cs t a b i l i z e rf o r e l e c t r o p o r a t i o no f d s a l i n a g e n ej pe x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi nns a l i n ac e l l s ，a n di se x p e c t e dt ob e c o m eab e t t e r s e l e c t i n gm a r k t h ef l u o r e s c e n c ef r o mt r a n s f o r m a n t sw a su n i f o r ma n db r i g h t e rw i t hp l15 t ， w h i l et h ef l u o r e s c e n c ew a sal i t t l ed i mw i t hp 2 1 5 t ，s e v e r a lu n u s u a lc e l l sw e r eo b s e r v e di n t h et r a n s f o r m e ds a m p l ew i t hp 2 1 5 t a n di tw a sd e d u c e dp r e l i m i n a r i l yt h a tr r - s i g n a l i i p e p t i d em i g h tr e s p o n s i b l ef o rt h ep h e n o m e n o n t h i se x p e r i m e n tm a y p r o v i d eu s e f u lp a r a m e t e r sf o re s t a b l i s h i n gan e w b i o - r e a c t o ro f d s a l i n aa n dd e v e l o p i n gt h et r a n s g e n e t i cs y s t e mo f d s a l i n af u r t h e r k e yw o r d s ：p l a s m i dv e c t o rr e p o r t e rg e n e 曲d u n a l i e l l as a l i n a e l e c t r o p o r a t i o n r a t eo fe l e c t r o p o r a t i o n g l y c e r o l g r e e nf l u o r e s c e n c e r r - s i g n a l p e p t i d e i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 面使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名时间：2 0 0 6 年6 月1 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩目j 或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 蟑 磊铲内 时问：2 0 0 6 年6 月1 日 时间：2 0 0 6 年6 月1 只 缩写 a m p b p b s a c a t c d n a c k c m d d n a d s m 最c o t i e d l a e g f p f a c s 0 d p g f p g l y g u s h h e p e s i p t g k b k d k v m l n m j m l n o l 缩略词 英文全称 a m p i c i l l i n b a s ep a i r s b o v i n es e r u ma l b u m i n c h l o r a m p h e n i c o la c e t y l t r a n s f e r a s e c o m p l e m e n t a r yd n a c o n t r o l c h l o r a m p h e n i c o l d a y d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d u n a l i e l l as a l i n am e d i u m e s c h e r i c h i ac o l i e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ea c i d e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i ng e n e f l u o r e s c e n c ea c t i v a t e dc e l ls o r t e r g l y c e r o l - 3 一p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g l y c i n e p - g l u c u r o n i d a s e h o u r s n 一 2 一h y d r o x y e t h l p i p e r a z i n e - n 一 2 一v e t h a n e s u l f o n i ca c i d 】 i s o p r o p y l - d d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k i l ob a s ep a i r s l d l o d a l t o n k i l o v o l t m i n u t e s m i l l i l i t r e m i l l i m o l e 中文译名 氨苄青霉素 碱基对 牛血清白蛋白 氯霉素乙酰转移酶 互补d n a 对照 氯霉素 天 脱氧核糖核酸 杜氏盐藻培养基 大肠杆菌 乙二氨四乙酸 增强型绿色荧光蛋白基因 荧光激活细胞分选器或流 式细胞仪 3 一磷酸甘油脱氢酶 绿色荧光蛋白 甘氨酸 b 一葡萄糖酸苷酶 小时 n 双( 2 - 羟乙基) 哌嗪一n 。 ( 2 - 乙磺酸) 异丙基b d 硫代半乳糖 苷 千碱基对 千道尔顿 千伏特 分钟 毫升 毫摩尔 m u g m n o d p c r r e g r n a s e r p m r r s d s s e r 1 a e t a t t e t v r u x g l u c “1 4 - m e t h y l u m b e l l i f e r y l d - d - g l u c u r o n i d e n a n o m e t e r o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e s o r u f i n d d - g l u c u r o n i d e r i b o n u c l e a s e r o u n d sp e rm i n u t e t w i n a r g i n i n es i g n a lp e p t i d e s o d i u md e d e c y ls u l f a t e s e r i n e t r i s a c e t i ca c i de l e c t r o p h o s i sb u f f e r t w i n a r g i n i n et r a n s l o c a t i o n t r i s e d t ab u f f e r t y r o s i n e u n i t 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 - i n d o l y l - b d g l u c u r o n i ca c i d m i c r o l i t e r 2 4 - 甲基伞形酮葡糖苷酸 纳米 光密度 聚合酶链反应 9 一羟基3 异盼恶唑酮葡糖 苷酸 核糖核酸酶 每分钟转数 双精氨酸信号肽 十二烷基磺酸钠 丝氨酸 醋酸电泳缓冲液 双精氨酸转运系统 t r i s e d t a 缓冲液 酪氨酸 单位 5 - 溴- 4 一氯3 吲哚葡糖苷酸 微升 文献综述 杜氏盐藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 是一种广泛分布于海洋、盐湖等盐度较高地区的 单细胞真核绿藻，1 8 3 7 年首次由法国人d u n a l 发现于地中海沿岸的盐池中，属绿藻 门、绿藻纲、团藻目、杜氏藻科、杜氏藻属【i j 。杜氏藻属约有3 0 个种，其中以杜 氏盐藻应用最为广泛，最具有代表性。杜氏盐藻形态和衣藻( c h l a m yd o m o n a s ) 十 分相似，但盐藻无细胞壁，原生质膜外仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的薄而富有 弹性的外被【2 】。藻体通常呈卵圆形、椭圆形或梨形，具有2 条等长的鞭毛，藻体后 端有一杯状载色体，载色体内的色素主要是叶绿素和类胡萝h 素( 以b 一胡萝p 素 为主) ，藻体后部中央含有一淀粉核【3 j 。 盐藻是一种在食品、医药保健、化工和养殖业中有独特经济价值的微藻。在一 定的生长条件下，藻体细胞内可大量积累d 胡萝h 素，其含量可高达干重的1 0 以 上【3 , 4 1 ，在自然界所有生物中含量最高。d 胡萝h 素不仅是维生素a 的前体和食品加 工业的天然色素，而且能防治癌症、肿瘤、，t l , 血管疾病、老年性痴呆和白内障等与 年龄有关的退化性疾病，是非常重要的保健品。在饱和的盐水中，盐藻细胞内甘油 积累可达其干重的8 0 以上【5 】。甘油是优质的化妆品原料，同时也是化工和医药工 业中广泛应用的有机化合物。盐藻还富含蛋白质，是人类的理想食品和经济动物的 优质饵料。 1 1 杜氏盐藻分子遗传学的研究 杜氏盐藻能够在含有5 0m m o l l - 15m o l l “n a c i 的环境中生存 6 】，具有广泛的 适盐度，说明盐藻存在着相关耐盐基因和高效的渗透调节机制，是研究植物渗透调 节机制的理想模型。因此，国内外研究者广泛地开展了基因克隆和遗传研究。 b e n a m o t z 及b e l m a n s 等研究表明，盐藻体内进行渗透调节的物质是甘油，3 磷酸甘油脱氢酶( g p d ) 是甘油代谢过程中的关键酶，能控制细胞内甘油的产生和 积累m 。周冀明等采用l e m b l 3 和九昏1 0 载体构建杜氏盐藻基因组文库和e d n a 文库，并从基因组文库和c d n a 文库中分别获得了3 个和3 6 个g d p 基因的阳性克 隆【8 。s a d a k a 等研究表明盐藻对高盐的适应与细胞内某些蛋白表达量有关，并 于1 9 9 1 年鉴定了与盐适应相关的一种1 5 0 k d 蛋白；m o r l y 等于1 9 9 4 发现并鉴定与 盐适应相关的另一种6 0 k d 蛋白 i i 】。f i s h e r 等通过e d n a 序列分析表明1 5 0 k d 蛋白 是一种转铁蛋白【1 2 】，6 0 k d 蛋白是一种碳酸酐酶，位于细胞膜上，与离子的运输有 关【1 3 】。杨志勇等构建基因组文库，并从文库中亦克隆出碳酸酐酶基因，肌动蛋白基 因和硝酸还原酶基因【l ”。张晓宁等克隆了盐胁迫条件下杜氏盐藻特异表达基因片段 1 5 1 。这些工作为进步研究耐盐机制奠定了基础。此外，也有其它的一些基因被克 隆。l o n g 等从构建的c d n a 文库中克隆出主要叶绿素结合蛋白基因【1 “。k o 等克隆 了位于基体的钙牵蛋白基因7 】。谈诤等克隆了杜氏盐藻肌动蛋白基因及5 端上游 片段 1 8 j 。 原生质体是生理研究和遗传育种的良好材料。杜氏盐藻细胞膜外仅有一层糖蛋 白外被，容易制备原生质体。制备藻类原生质体的方法有机械法和酶法。c h a r d a r d 利用蛋白酶b 制备了d b i o c u l a t a 的原生质体1 2 j 。刘广发等采用链霉蛋白酶制备了 d p e i r c e i 的原生质体，并利用p e g 将原生质体与带选择性标记c a t 基因的大肠杆 菌进行融合，获得了融合体，结果证明提高了氯霉素抗性，但未能从融合子中提取 到质粒，而且融合予对c m 的抗性随着传代也逐渐降低1 1 9 , 2 0 】。何咏雷利用蛋白酶k 制得杜氏盐藻( d s a l i n a ) 的原生质体，并采用p e g 化学法将其与带c a t 基因的大 肠杆菌d h 5 c t 进行融合，获得的融合子具有较高的c m 抗性，但并未从平板上检测 到这个结果，通过液体培养的后代抗c m 能力大大降低( 尚未发表) 。l e e 等利用 p e g 法迸行杜氏藻和紫球藻的细胞融合和遗传重组工作，结果得到一些形态像紫球 藻而又耐盐的重组体【2 “。然而，这些研究工作虽取得了很大的进步，但终究未能解 决原生质体的平板再生和融合予的稳定遗传等问题。 1 2 杜氏盐藻基因工程的研究 近年来，藻类分子遗传学的发展，不仅为光合、固氮、渗透调节等基本生命现 象和生理的机理过程研究提供了有利手段，也为藻类的基因工程奠定了基础。二十 世纪八十年代初，海洋蓝藻首先取得遗传转化的成功，开创海洋基因工程的新世纪。 此后逐渐形成了两个并行发展的领域：海洋蓝藻基因工程和海洋真核藻类基因工 程。海洋真核藻类基因工程首先从莱茵衣藻( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d i i ) 遗传转化 开始。其后，莱茵衣藻广泛应用于分子遗传学和基因工程的研究，目前己成为唯一 的染色体、叶绿体、线粒体三套基因组均能遗传转化的模式生物【2 ”。载体的构建是 藻类基因工程的一个关键所在，是影响外源基因表达稳定性和表达效果的重要因 素。至今国内外已对2 0 余种红藻进行过研究，在其中的1 4 种中发现有质粒。秦松 等在一些经济藻类如钝顶螺旋藻、真江蓠中也了发现质粒口m5 1 。目前，研究者利用 已经发现的或改造的质粒构建了各种穿梭载体。h a l l 等采用玻璃珠研磨法将含 n p t - i i 和n o s 启动子的p g a 4 8 2 转化莱茵衣藻硝酸还原酶突变株，用硝酸盐培养 基筛选到的转化子中有5 2 对卡那霉素表现出抗性【2 “。j a r v i s 等进行了萤火虫荧光 素酶基因在绿藻椭圆小球藻( c h l o r e l l ae l l i p o s i d e a ) 中的瞬间表达实验，结果检测 到荧光酶素的合成，2 4 h 时活性最高，4 d 后逐渐丧失【2 ”。由于穿梭载体构建的成功， 藻类的基因转化得以深入和发展。 杜氏盐藻缺乏细胞壁，易于制备原生质体，对外源基因表达产物耐受能力强， 是作为基因工程中表达宿主的难得材料。杜氏盐藻生长快、易培养等优点使其非常 4 有望成为一种高效廉价的新型生物反应器。但是，杜氏盐藻的遗传转化研究进展较 慢。目前适合转化筛选的抗性标记较少以及植板率较低是制约盐藻转基因研究工 作发展的重要原因。 李庆顺等通过测定杜氏藻的d n a 酶活性发现杜氏盐藻的d n a 酶活性较低，适 合于作为外源d n a 转化受体的较好候选者【2 8 1 。何咏雷等采用基因枪将带有3 5 s 启 动子的含c a t 基因的p b l 2 2 1 质粒转化杜氏盐藻细胞，但获得的结果并不理想( 待发 表) 。耿德贵等实验筛选杜氏盐藻基因工程选择标记，结果表明氯霉素适合作为杜 氏盐藻基因工程的筛选抗生素，6 0 “g m l 。是致死浓度【2 9 】；并采用电击法将g u s 基因 转化杜氏盐藻，获得瞬间表达，其中以u b i l q 启动子的转化效率最高【3 0 】。2 0 0 5 年， c o n g p i n g t a n 等建立了杜氏盐藻p d s l 0 0 0 h e 微粒轰击转化系统，也是以g u s 作为 报告基因引1 。 g u s 基因是目前在杜氏盐藻基因工程及植物基因工程中应用最广泛的报告基 因。g u s 用于荧光分析的作用原理是依赖于酶作用于合适的底物后，释放出易于从 底物中分辨出来的产物。常用的荧光分析底物是m u g 、x g l u c 、r e g ，其中尤以 x g l u c 最为常用。g u s 作用于底物x - g l u c 时，首先切割葡糖醛酸部分，产生无色 的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。g u s 作为 报告基因具有酶活稳定、不需要辅助因子以及灵敏度高等优点，但同时也存在重大 的缺点，例如g u s 检测需要昂贵的底物；检测时必须杀死细胞，不能应用于活体 、检测；在植物类材料中发现有g u s 的内源活性等p “，反应颜色的深浅有时不能说 明g u s 活性的高低或有无。这些缺陷将不可避免地限制g u s 在基因工程中的发展 前景。绿色荧光蛋白作为一种新型报告基因，克服了上述缺陷而成为一种目前最为 优良的标记基因。、 1 3g f p 在基因工程中的应用 绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 是s h i m o m u r a 等于1 9 6 2 年在研 究水母( a e q u o r e av i c t o r i a ) 生物荧光现象时首先报道的口，是酸性、球状蛋白。水 母g f p 是分子量为2 7 3 0 k d 含2 3 8 个氨基酸的蛋白质，结构非常稳定口4 】；其生 色基团由蛋白分子多肽链第6 5 6 7 位氨基酸s e r - t y r - g l y 链内环化加氧形成对羟苯 甲基咪脞环酮，和周围其它三个氨基酸形成六肽生色团口邓“，当受到3 9 5 n m 近紫 外光或4 7 0 n m 蓝色光激发后，在c a 2 + 激活下能发出5 1 0 n m 的绿色荧光。 1 9 9 2 年，p m s h e r 等【37 】首次克隆得到水母( av i c t o r i a ) g p 基因。他们根据 g p 的氨基酸序列合成了相应的寡核苷酸片段，以此作为探针从水母的c d n a 文库 中筛选到3 种肋阳性克隆，g 加基因由3 个外显子组成，分别编码6 9 、9 8 和7 1 个氨基酸。后来的研究中用到的许多窘加突变体都是在其基础上通过改变若干碱基 而得到的。为了证实g 勿是否能在异源细胞中表达，c h a l f i e 等做出了大量引人注 目的工作口8 1 。他们用p c r 方法扩增得到g f p l oe d n a ，并把这一片段克隆到原核 表达载体上，然后转化大肠杆菌，经i p t g 诱导后，在紫外光源下转化细菌能发出 绿色荧光。他们又把编码i b - t u b u l i n 的m e c 2 7 基因与g f p 基因重组并转化线虫，可观 测到4 种接触受体神经元的细胞中有明显的荧光。以上结果表明罟珍能在原核及真 核细胞中有效表达，无需外加辅助因子和任何特殊处理，a l p 基因可作为新的报告 基因或分子探针应用于目前的有关研究中。 人们曾一度认为g f p 对植物细胞有毒，h a s e l o f f 和a m o s 报道1 39 1 ，转a l p 基因 拟南芥的愈伤组织不能分化成再生植株，推测绿色荧光的光子干扰会产生自由基， 对细胞核造成氧化损伤。但许多研究人员并没有观测到g f p 对植物细胞明显的毒 性，认为g f p 对植物细胞有毒的证据不足。动物和植物的适应性不同，植物的形 态、生理特征使其能适应光线，而动物细胞可能会受到灼伤。所以，对植物来说， g f p 没有毒性。j o r d a n 认为单子叶植物和双子叶植物对g f p 的耐性不同【4 0 1 ，h a r p e r 等在田间试验中也证明g f p 没有毒性i 4 1 1 。 e f p 基因作为报告基因具有许多优点。( 1 ) 检测方便，只需荧光显微镜或激发 光源；( 2 ) 材料无需前处理，可以活体观察；( 3 ) 不需任何反应底物及其它辅助因 子；( 4 ) 由于植物本身不含有g f p ，不会出现假阳性结果。另外，g r p 作为分子探 针可以代替用于细胞学研究的荧光染料从而避免由于染料扩散造成的定位不准： g f p 如果作为免疫反应的二抗标记会使抗原的检测变得简单易行；g f p 与细胞器特 异多肽融合使得亚细胞定位研究工作向前跨越了一大步f 4 2 】。张明等【4 3 l 探讨了荧光蛋 白作为报告蛋白用于蛋白质转运系统研究的可行性，结果表明水母绿色荧光蛋白在 t a t 信号肽和t a t 转运酶的共同作用下，以折叠形式转运至周质空间；通过荧光定量 分析表明信号肽保守序列中的双精氨酸是保证绿色荧光蛋白转运及转运效率所必 需的。 h u 等用野生型g f p 转化玉米及拟南芥菜原生质体，只在前者检钡9 到绿色荧光。 无论用什么启动子，g f p 也不能在烟草和拟南芥菜中表达h j 。c h i u 等重复h u 等的 试验也得到同样结果，但他们用突变型g 彦( $ 6 5 t ) 基因转化烟草叶肉细胞和拟南 芥菜得到成功【4 甜。基因枪转化云杉花粉、大豆悬浮细胞和水稻胚性愈伤组织，g f p 都得到不同程度的瞬间表达 4 删羽。此后，g 彦在植物中实现了稳定表达。v a i n 等用 基因枪方法转化水稻未成熟胚，通过愈伤组织再生得到转基因植株。在根部及暗中 培养的黄化幼苗中都有明显的绿色荧光，但在绿色叶片中荧光并不明显【4 9 】。他们认 为转化使用的目的基因启动子c a m v 3 5 s 适用于双子叶植物，而在单子叶植物中表 达较弱。由于叶绿素在蓝紫光激发下产生红色自发荧光，如果g 函表达量太低，前 者红色荧光也可能掩盖后者绿色荧光。p a n g 等用植物内含子插入a l p 基因之中以增 强其表达并连接于强启动子之后，通过组织培养均得到转基因再生植株，并且绿色 叶片的荧光清晰可见t s o 。 6 杜氏盐藻通常被作为植物类材料进行研究。2 0 0 3 年，李杰等构建了带有报告基 因e g f p 的表达载体p a r t 7 g f p 和p u c g f p ，利用基因枪法转化杜氏盐藻，发现l 眦1 的金粉颗粒能够将外源基因导入盐藻细胞h ”。这是目前所能查阅到的唯一篇将 g p 作为报告基因应用于盐藻基因工程载体的文献报道。 本实验拟从构建盐藻高效表达载体入手，采用更为廉价的电转化方法将报告基 因g f p 转入盐藻细胞，摸索合适的转化条件，探讨外源基因在赫藻中的表达效果， 期望为建立新型杜氏盐藻反应器奠定良好的理论基础。 1引言 盐藻是一种具有独特经济价值的真核微藻，也是基因工程中作为表达宿主的难 得材料，非常有望成为种高效的、廉价的新型生物反应器。但是，杜氏盐藻的遗 传转化研究进展较慢。当前，寻找合适的载体、有效的转化条件以及便捷的筛选方 法，从而建立和完善杜氏盐藻遗传转化系统，成为盐藻转基因研究工作者关注的焦 点。 1 1 研究价值和意义 目前，缺乏合适的转化筛选标记是阻碍盐藻基因工程发展的重要原因。g f p 作 为报告基因具有突出的优点，可用于活细胞检测。因此，本实验采用一种适用于盐 藻的强启动子与报告基因g 加相结合构建了2 种新型表达载体，并利用较为廉价的 电击法将2 种质粒载体转化盐藻细胞，探讨外源基因在盐藻细胞中的表达情况。杜 氏盐藻细胞作为一种单细胞低等真核生物，其细胞膜结构特殊，对于渗透压十分敏 感。传统的电击缓冲液渗透压较低，难以维持盐藻细胞的正常生活力。根掘现有的 文献报道的转化条件，难以重复转化效果。因此，将电击转化方法应用于盐藻基因 工程需要进一步摸索和改善转化条件。本实验从改良电击缓冲液入手，尝试添加甘 油作为稳渗剂，期望为完善杜氏盐藻电击转化方法提供有效的信息，提高转化效率， 改善转化效果。 1 2 国内外研究现状 国内外相当多的研究组在盐藻的生理学 5 2 5 5 1 耐盐机制晰9 1 和方面开展了卓 有成效的研究工作。盐藻的遗传方面的研究主要是筛选一些突变体f 6 蛳”，开展原生 质体融合1 9 - 2 1 l 和进行基因克隆 6 1 8 】。+ 盐藻在基因工程及蛋白表达方面具有广阔的应用前景，但有关遗传转化的研究 一直较少，我国科研工作者为建立盐藻稳定的遗传转化及表达体系做出了大量的努 力。目前，应用盐藻基因工程的筛选标记主要是g u s 基因1 3 0 3 l j 。g u s 基因在检测过 程中已表现出明显的缺陷，如在受体内存在内源活性，需要昂贵的底物，不能用于 活细胞检测等。g 彦作为一种新型报告基因，克n tg u s 基因的上述缺陷。但是， 迄今仅有一篇文献报道了将报告基因e g f p 应用于杜氏盐藻基因工程，转化采用了 较为昂贵的基因枪法。电击转化法是基因工程中一种常用的转化方法，将电转法 应用于杜氏盐藻基因工程方面的报道也较为罕见。根据现有的文献报道的转化条件 1 3 0 1 ，难以重复转化效果。因此，杜氏盐藻电击转化条件有待于进一步摸索和完善。 利用电击转化法将报告基因觑，导入杜氏盐藻细胞方面的研究目前尚未见报道。 1 3 本研究拟解决的问题 针对目前杜氏盐藻遗传转化研究工作中出现的主要问题，本实验将以建立和完 善杜氏盐藻的遗传转化及表达体系为目标开展研究工作；通过将报告基因g f p 与适 用于盐藻的强启动子相连，构建盐藻的新型表达载体，期望为杜氏盐藻转化筛选提 供一种良好的筛选标记。实验采用电击法将构建的质粒载体转化盐藻细胞，对于转 化藻龄、电击缓冲液和电场强度分别进行了讨论，摸索最佳转化条件。实验探讨了 甘油对于盐藻电击转化及细胞生长的影响，尝试为盐藻电击转化过程提供种可靠 的稳渗剂。实验通过荧光检测报告基因g 章的表达，探讨外源基因在杜氏盐藻细胞 内的表达情况，期望为建立新型杜氏盐藻生物反应器奠定良好的遗传学基础。 9 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 藻种、菌株及质粒 杜氏盐藻d u a n l i e l l as a l i n a 藻种为中国科学院青岛海洋所秦松博士馈赠，经本 实验室纯化并保存。大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l id h 5 a 为本实验室保存，大肠杆菌 e s c h e r i c h i ac o l i m c 4 1 0 0 a 为法国国家科学研究中心细菌化学研究所吴龙飞博士馈 赠。质粒p u c q g u s 由中国遗传所耿德贵和陈颖博士馈赠；p 8 7 6 0 ( 含g 和基因) 为法国国家科学研究中心细菌化学研究所吴龙飞博士馈赠。 2 1 2 引物合成 根据质粒p 8 7 6 0 中g r p 基因的序列设计引物，并在上下游分别加入s m ai 和s a c i 酶切位点。引物合成由上海生工生物工程公司完成，引物序列见表1 。 表1 引物序列 t a b l e1 t h es e u c n c e so f p r i m e r s 名称序列 p 1 p 2 p 3 蝴c e cg g ga c ca t g g a c a n ta a ce a t e t a a c g g a ga t e g c a t g cc t gc a g t t a t t t e t a g c ac c c 黯g a t g a n a g g a g a n g a ac t t t t a 2 1 3 杜氏盐藻培养基j o h n s o n 配方 大量元素( g l 。1 ) ：m g c l 2 7 h 2 01 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 ，k n o s o 5 ，k c lo 2 ， n a h c 0 30 1 5 l ，k h 2 p 0 40 0 4 3 ，c a c l 2 0 0 3 5 ，n a c l3 0 0 。 微量元素( m g l “) ：h 3 8 0 46 1 0 ，( n h 4 ) 6 m o ? 0 2 4 4 h 2 03 8 0 ，z n c l 2 ( z n s 0 4 7 h 2 0 ) 4 1 ，c u s 0 4 5 h 2 06 0 ，c o c l 2 6 h 2 05 1 ，m n c | 2 。4 h 2 0 4 1 。 一铁盐溶液( m g l “) ：n a 2 e d t a 。2 h 2 02 0 9 ，f e c l 3 6 h 2 0 2 4 4 。 lm t r i s h c l 溶液( p h8 o ) ：配制1 l 培养基加入1 0 m l 。 d h7 5 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。固体培养基加入1 5 琼脂粉，灭菌条件相同。 2 1 4 细菌l b 培养基配方( 1 l ) 胰蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c i5 9 ，p h7 0 ，1 2 1 灭菌2 0 r a i n 。 2 1 5 主要分子生物学试剂 表2 主要分子生物学试荆及生产广家 t a b l e2 c h i e f r e a g e n t su s e di nm o l e c u l a rb i o l o g ya n dt h e i rp r o d u c e r s 试；f | i生产厂家 限制性内切酶 r n a s e l d n a 连接酶 d n am a r k e r p c rp e r f e c t s h o t r “t a q 聚台酶 胶回收试剂盒 t a l c a r a 公司 s a b c 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 v - g e n e 公司 1 0 2 1 7 化学试剂 l 一阿拉伯糖购自合肥创因生物科技公司，甘油( 分析纯) 购自上海生i 生物工 程公司。其它化学试剂均购自合肥大药房，主要为国产分析纯。 2 1 8 常用仪器 ( 1 ) t g l 1 8 r 台式高速冷冻