（微生物学专业论文）海洋枯草芽胞杆菌dm03抗病原真菌物质的研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 煞 如需保密，解密时间 妒7 年6 月弓。e t 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同x - 作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生张、司竹干 帆研年。7 月汐矿日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，, - j - 以采用影印，缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：司优，干 导师签名：久艺 签名慨铆7 年。7 月口7 7 日 签名吼w 少年 月吕日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 海洋枯草芽胞杆菌d m 0 3 抗病原真菌物质的研究 目录 摘要i a 1 3 s t r a c t i i 第一章文献综述l 1 1 植物病害及生物防治概况l 1 1 1 植物病害概述l 1 1 2 植物病害生物防治概况l 1 2 农用抗生素研究概况2 1 2 1 农用抗生素的研究现状3 1 3 海洋微生物源农用抗生素的研究概况4 1 3 1 海洋微生物是农用抗生素的重要来源4 1 3 2 海洋微生物产生的抑菌活性物质4 1 4 枯草芽胞杆菌在植物病害生物防治中的应用概况5 1 4 1 枯草芽胞杆菌抗植物病原真菌的研究进展5 1 4 2 枯草芽胞杆菌抗植物病原真菌的机制8 1 4 3 枯草芽胞杆菌产生的抑菌物质9 1 5 研究目的及意义1 2 第二章材料与方法1 4 2 1 实验材料。1 4 2 1 1 菌株1 4 2 1 2 实验仪器1 5 2 1 3 培养基15 2 2 实验方法1 6 2 2 1 深海细菌的活化1 6 2 2 2 产活性物质菌种筛选1 6 2 2 3 菌株d m 0 3 的形态学鉴定1 7 2 2 4 菌株d m 0 3 的生理生化鉴定1 7 2 2 5 菌株d m 0 3 的1 6 sr d n a 序列分析。1 7 2 2 6 菌株d m 0 3 抑菌谱测定1 9 华中农业人学硕l ：论文 2 2 7 海洋细菌d m 0 3 所产活性物质的稳定性研究2 0 2 2 8 菌株d m 0 3 抑菌物质的分离2 0 第三章结果与分析。2 4 3 1 活性菌株的筛选2 4 3 2 细菌d m 0 3 的形态学特征2 5 3 3 细菌d m 0 3 的生理生化结果2 6 3 316 sr d n a 序列分析2 7 3 3 11 6 sr d n a 基因扩增产物2 7 3 3 21 6 sr d n a 基冈测序结果2 7 3 3 3 菌株d m 0 3 的系统发育树2 8 3 4 菌株d m 0 3 发酵液上清的抑菌谱2 9 3 5 菌株d m 0 3 所产的抑菌物质稳定性3l 3 6 活性物质的分离3 2 3 6 1 有机溶剂萃取3 2 3 6 2 硫酸铵沉淀3 2 3 6 3 分子量大小的初步确定3 3 3 6 4n a t i v e - p a g e 3 3 3 7m a l t i t o f m s 指纹图谱3 4 第四章结论。3 6 第五章讨论3 7 参考文献3 9 致谢4 4 海洋枯争芽胞杆菌d m 0 3 抗病原真菌物质的研究 摘要 本研究从2 0 0 株深海细菌中筛选出1 4 株对植物病原真菌具有稳定拮抗作用的深 海细菌，从中筛选出抑菌活性较强的菌株d m 0 3 ，对其分类学地位进行鉴定，确定 其拮抗谱，并对该菌所产生的抑菌活性物质进行了初步的分离、纯化以及鉴定。结 果如下： 1 以水稻纹枯病、棉花枯萎病和油菜菌核病三类植物病原真菌为指示菌株，对 国家海洋局第三海洋研究所提供的2 0 0 株深海细菌进行了初步筛选，获得1 4 株具有 明显的广谱抑制植物病原真菌的深海细菌，经过复筛获得一株抑菌活性较强，所产 抑菌物质的理化性质较为稳定的枯草芽胞杆菌d m 0 3 ，发现其发酵液对实验室现有 的植物病原真菌都有良好的抑菌效果，在p d b 培养基中培养4 8h 后得到无菌上清 滤液也表现出良好的抑真菌生长活性。 2 菌株d m 0 3 的发酵液与病原真菌对峙实验表明，d m 0 3 对植物病原真菌的抑 制机理表现为营养竞争抑制与抑菌活性产物抑制相结合。 3 对菌株d m 0 3 所产的抑菌活性物质的理化性质进行研究表明，其抑菌活性物 质对温度不敏感，在1 0 0 0 c 处理1 0m i n 依然能观察到抑菌活性，在p h3 l l 和紫外 照射处理后其抑菌活性依然存在，说明该物质具有良好的稳定性。该活性物质经硫 酸铵盐析沉淀，沉淀复溶于t r i s h c i 缓冲液后，使用1 0 0k d a 超滤管进行超滤，该 物质被截留，说明其分子量大于1 0 0k d a 。截留液经n a t i v e p a g e 分离可得到两条 具有抑真菌活性的蛋白条带，切出蛋白条带，经胶内胰蛋白酶酶解后，进行基质辅 助激光解离飞行时间质谱分析，发现其中一种蛋白与现已见报道的枯草芽胞杆菌产 生的蛋白质谱图均不相同，表明d m 0 3 所产的抑菌活性物质可能含有一种新的蛋白 类抑菌物质。 4 实验结果表明，菌株d m 0 3 在适宜其生长的海水培养基中不产活性物质，只 有在p d b 培养基中才能收集到活性物质产物，这表明其活性物质的产生可能与其生 长环境的变化有关。其具体原因还在进一步的研究中。 关键词：海洋枯草芽胞杆菌；植物病原真菌；抑菌活性；抗菌蛋白；分离 华中农业人学硕1 ：论文 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , f o u r t e e ns t r a i n so fb a c t e r i aw h i c hh a v em o r ee f f e c t i v ea n ds t a b l e a n t i f u n g a la c t i v i t i e sa g a i n s tp l a n tp a t h o g e n i cf u n g iw e r es c r e e n e df r o mt w oh a n d r e d s s t r a i n so fm a r i n eb a c t e r i a a m o u n gt h e m ，d m 0 3s t r a i ns h o w e dh i g h e ri n h i b i t o r ya c t i v i t y a n dw a ss e l e c t e dt ob es t u d i e df u r t h e r t h ef o l l o w i n gw o r kw a sf o c u s e do nt h e c h a r a c t e r i s t i c so fi t st a x o n o m y , t h ed e t e r m i n a t i o no fi t sa n t i g o n i s t i cs p e c t r a ，t h ei s o l a t i o n ， p u r if i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h ea n t i f u n g a ls u b s t a n c e ss e c r e t e db yd m 0 3s t r a i n t h er e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 r h i z o c t o n i as o l a n i ，f u s a r i u mo x y s p o r i u mf s p v a s i n f e c t u ma n ds c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u mw e r es e l e c t e da si n d i c a t o rs t r a i n s ，t w oh u n d r e d ss t r a i n so fm a r i n eb a c t e r i a f r o mt h et h i r di n s t i t u t eo fo c e a n o g r a p h ys t a t eo c e a n i ca d m i n i s t r a t i o nw e r et e s t e do n t h e i ra n t i f u n g a la c t i v i t i e s ，a n df o u r t e e ns t r a i n sw e r es c r e e n e db e c a u s eo ft h e i ro b v i o u sa n d s t a b l ei n h i b i t o r ya c t i o no np l a n tp a t h o g e n i cf u n g i a n dt h e n ，d m 0 3s t r a i nw h i c ho w n e d h i g h e ra n dm o r es t a b l ea n t i f u n g a la c t i v i t ya m o n gt h e mw a ss e l e c t e dt ob ei n v e s t i g a t e d f u r t h e r p r e p a r a t o r ye x p e r i m e n ts u g g e s t e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho fd m 0 3 s t r a i nh a d e x c e l l e n ti n h i b i t o r ye f f e c to nt h ei n d i c a t o rs t a i n s ，w h i l et h es u p e m a t a n to fi t sf e r m e n t a t i o n b r o t hs h o w e dl i t t l ei n h i b i t o r y e f f e c t f o r t u n a t e l y ，t h e c e l l - f r e e s u p e r n a t a n to f t h e f e r m e n t a t i o nb r o t ho fd m 0 3s t r a i nc u l t u r e di np d am e d i u mr e v e a l e dh i g ha c t i v i t yo f i n h i b i t i n gt h eg r o w t ho f t h ef u n g i 2 t h ei n h i b i t i o nm e c h a n i s mo fd m 0 3s t r a i nt o w a r dp l a n tp a t h o g e n i cf u n g iw a s l i k e l yn u t r i e n t sc o m p e t i t i o nc o m b i n e dw i t ht h ep r o d u c t i o no fa n t i f u n g a ls u b s t a n c e s ， w h i c hw a sp r o v e db yt h ep l a t ei n h i b i t i o ne x p e r i m e n tb e t w e e nt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho f d m 0 3s t r a i na n dp l a n tp a t h o g e n i cf u n g i 3 t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ea n t i f u n g a ls u b s t a n c e ss e c r e t e db yd m 0 3s t r a i nw e r e i n v e s t i g a t e d ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea n t i f u n g a ls u b s t a n c e sw e r er e s i s t a n tt oh e a t ，u v l i g h t ，a c i da n da l k a l i a f t e rb e i n gh e a t e da t10 0 0 cf o r10m i no ri r r a d i a t e db yu vl i g h tf o r 3 0m i n ，t h es u b s t a n c e sc o u l ds t i l li n h i b i tt h eg r o w t ho ft h ei n d i c a t o rs t r a i n ，a n dw h e np h v a l u ew a sv a r i e df r o m3t o 11 ，t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h es u b s t a n c ev a r i e d i n s i g n i f i c a n t l y t h es u b s t a n c e sw e r ep r e c i p i t a t e du s i n gs a t u r a t e da m m o n i u ms u l f a t e 海洋枯草芽胞杆菌d m 0 3 抗病原真菌物质的研究 s o l u t i o n ，r e d i s s o l v e di n ir i s h c lb u f f e r , a n dt h e nf i l t e r e du s i n ga10 0k d au l t r a f i l t r a t i o n c u b e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea c t i v ec o m p o n e n t so ft h es u b s t a n c ew a st r a p p e db yt h e u l t r a f i t r a t i o nc u b e a f t e rt h a t ，t h ea c t i v ec o m p o n e n t sw a sd e t e r m i n e du s i n gn a t i v e - p a g e ， t w op r o t e i ns t r a p sw e r ec a p t u r e di nt h ep a g eg e l t h e nt h et w os t r a p sw e r ec u to u tf r o m t h eg e lp l a t e h y a r o l y z e db yt r y p s i na n dt r e a t e d 舔t h ep r e p a r a t i o nf o rm a l d i - t o f m s a n a l y s i s p r o t e i nm a s sf i n g e r p r i n t i n ga n a l y s i so ft h em ss p e c t r as u g g e s t e dt h a to n eo ft h e a c t i v ec o m p o n e n t sh a dn om a t c h e di nt h en c b i n rp r o t e i nd a t a b a s e ，w h i c hi n d i c a t e dt h a t d m 0 3s t r a i nw a sl i k e l yt op r o d u c ean o v e la n t i f u n g a l p r o t e i nw h i c hh a dn e v e rb e e n r e p o r t e db yo t h e r s 4 d m 0 3s t r a i nc o u l dn o tp r o d u c ea n t i f u n g a ls u b s t a n c e si nt h em bm e d i u mw h i c h w a sm o r es u i t a b l ef o ri t sg r o w t h ，w h i l et h ea c t i v es u b s t a n c ec o u l db es e c r e t e dw h e n d m 0 3s t r a i ng r e wi np d ao rp d bm e d i a , t h i ss u g g e s t e dt h a tt h ep r o d u c t i o no ft h ea c t i v e s u b s t a n c em a yd e p e n do nt h eg r o w t hc o n d i t i o n so fd m 0 3s t r a i n k e y w o r d s ：m a r i n eb a c i l l u ss u b t i l i s ；p l a n tp a t h o g e n i cf u n g i ；a n t i f u n g a la c t i v i t y ； a n t i f u n g a lp r o t e i n ；i s o l a t i o n 海洋枯草芽胞杆菌d m 0 3 抗病原真菌物质的研究 第一章文献综述 据联合国估计，2 0 0 9 年世界人口总数约为6 8 亿，且仍在不断增加，预计到2 0 5 0 年将达到9 0 亿。面对如此巨大的人口压力，人类对粮食的需求也一翻再翻，愈加迫 切。而植物病害，尤其是由真菌引发的植物病害，却在不断地导致粮食减产。据联 合国粮食及农业组织( f a o ) 统计，谷物生产因病害损失1 0 ，棉花生产因病害损 失1 2 ，全世界作物因病害造成的经济损失高达1 , 2 0 0 亿美元( 欧阳迪莎等，2 0 0 3 ) 。 因而，对植物病害的有效防治被认为是减少粮食损失、提高粮食产鼍，以解决粮食 短缺问题的主要途径之一。 1 1 植物病害及生物防治概况 1 1 1 植物病害概述 植物病害历来被认为是最难防治的病害之一。根据病原的种类可将植物病害分 为两大类：( 1 ) 非侵染性病害：由非生物引起，如营养成分的缺乏，水分的缺失或 过量，低温冻害和高温灼病，肥料、农药的不合理施用，或废水、废气造成的药害、 毒害等。( 2 ) 侵染性病害：由生物引起，有传染性。侵染性生物主要包括真菌、细 菌、病毒、线虫及寄生性种子植物等( 葛红莲等，2 0 0 4 ) 。其中以真菌为主，又分为 非专性寄生与专性寄生两类。非专性寄生是外生的根侵染真菌，如腐霉菌( p y t h i u m s p p ) 引起苗腐和猝倒病，丝核菌引起苗立枯病。专性寄生是植物微管束病原真菌， 如尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 、黄萎轮枝孢( v e r t i c i l l i u ma l b o a t u m ) 等引起 的枯萎( 李丽霞等，2 0 0 7 ) 。 1 1 2 植物病害生物防治概况 在植物病害的防治方面，一直以来，化学农药因其防效高、作用速度快、杀菌 谱广及成本低廉等优点，而被广泛用于防治植物病害，对提高农产品质量及产量、 增加农民收入起到了举足轻重的作用。目前，化学防治仍然是最有效和最主要的植 物病害防治方法之一。但化学农药的缺点也同渐凸显，如毒性高、结构稳定、难以 降解；在农作物中易残留，并渗透到土壤、河流或地下水中，造成环境污染；人畜 食用后在体内积累，影响人体健康( 鲁小城，2 0 0 6 ) 。此外，长期使用某些化学农药 使作物病原菌产生抗药性，致使发生农药使用愈多，而病虫害却愈加严重的现象。 随着人们环保意识的增强，化学农药的负作用逐渐受到人们的重视，因而对新 华中农业大学硕i j 论文 型化学农药的研发及应用也提出了苛刻的要求。而一种新化学农药的开发不仅耗资 巨大，还需要一个漫长的研究和试验过程。鉴于化学农药的种种弊端，人们将目光 转向了生物防治的研究和开发。 我国植物病理学家陈延熙提出了较符合自然情况的生防概念，即植物病害的生 物防治是指在农业生态系统中通过调节寄主植物的微生物环境，使其利于寄主而不 利于病原或者使其对寄主与病原物的相互作用发生有利于寄主而不利于病原物的影 响，从而实现植物病害的防治。这一概念说明，人们对于病害生物防治的认识己从 单纯依靠拈抗微生物控制病原生物或病害，发展到借助于多种因素来创建一个利于 植物而不利于病原生物生长的环境，以达到防治病害的目的( 王万能等，2 0 0 4 ) 。 我国植物生防的研究工作始于2 0 世纪5 0 年代初期，从6 0 年代开始，由拮抗性 放线菌发展为利用一些快速生长和繁殖的细菌、真菌及病毒等：从腐生的土壤微生 物到植物体微生态系中微生物的利用；病害种类从种传和土传病害到地上部分的气 传和虫传病害。而后这方面的研究迅速展开，并成为植物病害防治工作中的研究热 点( 郑福庆等，1 9 9 8 ) 。 具有生防作用的微生物中，无论是对自然发生的生防现象，还是人们用于生物 防治的过程中，细菌表现得尤为明显。其主要优势在于：( 1 ) 细菌的种类繁多、数 量庞大、繁殖速度快；( 2 ) 许多细菌存在于植物根际和地表，对植物根际的生态影 响较小：( 3 ) 大多数细菌可培养，在实际应用中易于操作和控制；( 4 ) 某些细菌 不仅能防治病害，还可以促使作物增产。因此，用细菌防治植物病害，尤其是真菌 引起的作物病害，越来越受到人们的关注。目前比较有潜力或已经使用的生防细菌 有芽胞杆菌( b a c i l l u ss p p ) 、假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p p ) 、土壤放射杆菌 ( a g r o b a c t e r i u mr a d i o b a c 纪r ) 和巴氏杆菌( p a s t e u r e l l a ) 等( 杨秀荣等，2 0 0 8 ) 。 随着从陆地环境筛选新的高效、低毒或无毒的生防微生物的难度越来越大，人 们将目光丌始转向海洋及其他极端环境。据统计，占地球表面积逾7 0 的海洋环境 中，约有1 0 0 万2 亿种微生物，目前能被分离培养和鉴定的微生物种类仅占5 ， 其中已被分离鉴定的还不足1 ( 林水成等，2 0 0 3 ) 。因而可以说，海洋微生物将是 获得新型农用抗菌素的重要资源( r 1 黎等，2 0 0 3 ) 。 1 2 农用抗生素研究概况 农用抗生素是指细菌、真菌和放线菌等微生物的次生代谢产物，这些物质在低 海洋枯草芽胞杆菌d m 0 3 抗病原真菌物质的研究 浓度下能选择地影响或抑制农作物病原菌、害虫及杂草的生长和发育等，如放线酮、 灭瘟素、阿维菌素等。目前农用抗生素的主要来源是土壤微生物，如井冈霉素、阿 维菌素和春雷霉素等的产生菌( 周启等，1 9 9 5 ) 。 与化学农药相比，农用抗生素具有以下优点：( 1 ) 活性高、防治效果好，对使 用环境无污染或污染很少；( 2 ) 可被其它生物或自然因素所降解，不易在环境中积 累；( 3 ) 生产原料多为农副产品，来源广，可再生，生产成本低；( 4 )各个品种 生产工艺相似、设备相同，一条生产线可生产多个品种，且生产过程中废弃物可再 利用，对生产环境造成的污染很低( 杨金饱和闫同顺，2 0 0 7 ) 。 1 2 1 农用抗生素的研究现状 随着医用抗生素的发展，在2 0 世纪5 0 年代，有些植物病理工作者，利用医用 链霉素和土霉素防治某些果树及蔬菜病害，取得了一定效果，从而引起了广泛的注 意。而后，农用抗生素逐渐发展成为抗生素研究的一个新方向。 2 0 世纪5 0 年代后期，汞制剂的限制使用促使日本进行农用抗生素的研究。s c t s u o 等( 1 9 5 8 ) 成功研制出杀稻瘟菌素( b l a s t i c i d i n s ) ，并于1 9 6 1 年大面积应用于稻瘟 病的防治，基本上取代了有机汞制剂在防治稻瘟病上的应用。杀稻瘟菌素的工业化 生产及应用，开创了农抗研究的新时期。此后不久即出现了如多氧霉素( p o l y o x i n ) 、 春日霉素( k a s u g a m y c i n ) 、有效霉素( v a l i d a m y c i n ) 等高效低毒无公害的新农抗， 并把农抗的开发扩展到从微生物中筛选和分离具有杀虫、除草和抗病毒等功效的活 性物质的研究，筛选出了像杀螨剂杀螨素( t e t r a n a c t i n ) 和除草剂双丙胺磷 ( b i a l a p h o s ) 等新型生物农药( 杨金艳等，2 0 0 7 ) 。现在对农用抗生素的研究方兴未 艾，世界各国都已将农抗的研究列入了国家重点规划，受到特别重视。 国内对农用抗生素的研究始于2 0 世纪5 0 年代初期。1 9 5 3 年，植物病理学家尹 莘耘从陕西泾阳老酋蓿根的土壤中分离到了对棉花黄萎病有一定防效的菌株“5 4 0 6 ” ( s t r e p t o m y c e s j i n g y a n g e n s i sn s p ) ，揭开了我国农用抗生素研究的序幕。随后该抗 生菌肥料在全国部分省、区进行了大田试验，增产效果达到1 0 3 0 ( 李智，2 0 0 3 ) 。 6 0 8 0 年代，灭瘟素、放线菌酮( a c t i d i o n e ) 、井岗霉素( v a l i d a m y c i n ) 、庆大霉素、 多抗霉素、杀蚜霉素、公主岭霉素、农抗1 2 0 、浏阳霉素和韶关霉素等抗生素相继 研制成功，并广泛应用于农作物病害的防治，取得了显著成果。9 0 年代，中生菌素、 武夷霉素等新农抗不断涌现( 杨金艳等，2 0 0 7 ) 。我国在作物病害的生物防治方面虽 华中农业大学硕l j 论文 取得了可喜成果，但基本上还停留在“以仿为主”的阶段，真正拥有自主知识产权的 农用抗生素寥寥无几。 近年来，我国在新农用抗生素的研究领域展现出了诱人的前景，仅1 9 9 1 年全国 农用抗生素学术会议报道的新农用抗生素就有5 种。这标志着我国在农用抗生素的 研究开发方面，正由“以仿为主”阶段向“创制”阶段迈进( 杨金艳等，2 0 0 7 ) 。 1 3 海洋微生物源农用抗生素的研究概况 随着人们对海洋资源的重视，从海洋资源中筛选抗植物病原真菌的微- 物也r 渐引起植物病理学家和微生物学家的重视，并逐渐成为生物防治的热点。 1 3 1 海洋微生物是农用抗生素的重要来源 海洋环境十分独特，包括了高压、寡营养、低温、无光照以及海底局部的高温、 高盐的所谓生命极限环境。海底是一个特殊的世界，这罩有极高的静压力( 每增加 l o m 深度，约增加1 个大气压) ，多数地方较冷( 1 3 0 c ) ，某些热涌泉区域则较热 ( 2 0 0 - - 4 0 0 0 c ) ，还存在高p h 和高浓度重金属离子区域( 韦成礼等，1 9 9 8 ) 。因而， 海洋微生物资源的研究开发和应用越来越受到世界各国特别是沿海国家的重视。 这些所谓生命的极限环境及其食物供应决定了生存于此的微生物在遗传背景和 代谢途径方面必然存在差异( y a y a n o s ，1 9 9 5 ) ，其必能产生有别于陆地微生物代谢产 物的新型生物活性物质。同时还由于海洋微生物种类丰富，为了争夺有限的营养资 源和进行自我防御，不可避免地引起微生物物种之间的竞争，从而产生抑制竞争对 手的次生代谢物质( 郝树站等，2 0 0 5 ) 。海洋环境的独特性为海洋微生物能够产生新 的活性物质提供了必要的条件和潜在的可能性，因而海洋微生物是农用或医用药物 开发的潜在资源。 1 3 2 海洋微生物产生的抑菌活性物质 海洋微生物主要包括海洋细菌、海洋真菌和海洋放线菌，其中种类约为陆生微 生物的2 0 倍以上( 焦炳华等，2 0 0 6 ) 。对海洋微生物抗菌活性的研究起步于1 9 世纪 末，并在2 0 世纪4 0 5 0 年代迅速展丌。r o s e n f e l d 和z o b e l l ( 1 9 4 7 ) 研究了5 8 株海 洋细菌，发现其中9 株菌对一些非海洋来源细菌或人类病原菌具有很明显的抑制或 杀灭作用，拮抗活性最高的是芽胞杆菌属( b a c i l l u s ) 和微球菌属( m i c r o c o c c u s ) 。 g r e i n 和m e y e r s ( 1 9 5 8 ) 对从海水分离到的1 6 6 株放线菌进行了研究，发现有7 0 株 对革兰氏阳性菌和阴性菌有不同程度的拈抗作用；k r a s i l n i k o v a ( 1 9 6 2 ) 报道了从全 4 海洋枯争芽胞杆菌d m 0 3 抗病原真菌物质的研究 球各海域深度为o 3 ，5 0 0m 的水中分离的3 2 6 种细菌，其中1 2 4 种对金黄葡萄球菌、 分支杆菌等病原细菌有拮抗作用。此后随着各国对海洋生物资源开发力度的加强及 研究水平的提高，对海洋微生物活性物质的开发研究进展迅速，仅1 9 8 8 1 9 9 2 年期 间就报道了近4 0 0 个新化合物( 田黎等，2 0 0 3 ) 。 在所有海洋微生物中，对海洋细菌产生的生物活性物质的研究占主要地位。海 洋细菌由于长期生活在海洋中，比陆栖细菌更偏爱含电解质多的环境。海洋特殊的 地理环境和资源环境孕育了许多有特性的海洋细菌，在它们的代谢产物中潜藏着许 多新颖、特殊的活性物质( 郝树站等，2 0 0 5 ) 。目前发现可以产抗生素的海洋细菌包 括芽胞杆菌属( b a c i l l u s ) 、交替单胞菌属( 爿l t e r o m o n a s ) 、假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、 黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、微球菌属( m i c r o c o c c u s ) 、着色菌属( c h r o m a t i u m ) 、 钦氏菌属( c h a i n i a ) 及许多未定菌，某些抗生素从未在陆生菌中发现过( 詹萍，2 0 0 7 ) 。 1 4 枯草芽胞杆菌在植物病害生物防治中的应用概况 枯草芽胞杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 是一种嗜温好氧性革兰氏阳性细菌，广泛分布 于各类生境中，所产芽胞大小为0 伽9 1 0 1 5l a m ，呈椭圆形或柱状，位于菌体 中央或稍偏。由于具有良好的遗传操作性，枯草芽胞杆菌已作为相关科学研究中的 模式菌株，成为革兰氏阳性菌株的典型代表，并完成了全基因组序列测定( k u n s te t a 1 ，1 9 9 7 ) 。枯草芽胞杆菌芽胞内生形式使其具有抗逆性强、能够耐受各种不良环境 的特点，如能够在较酸的环境中( p h2 3 ) 生存，在温度高达8 0 0 c 的地方仍能生长 繁殖，等等( 陈力，2 0 0 7 ) 。相关研究表明，这类细菌不仅繁殖速度快、对营养的需 求很低，而且易定殖于植物表面，基于这些特点，枯草芽胞杆菌已经成为目前生物 农药中研究最广泛的微生物之一( 何礼远，1 9 8 5 ) 。它们在控制植物病害发生、促进 植株生长和提高作物产量等方面表现出了巨大的应用价值，引起了植物保护工作者 的极大关注( 杨佐忠，2 0 0 1 ) 。 1 4 1 枯草芽胞杆菌抗植物病原真菌的研究进展 国外将枯草芽胞杆菌用于植物病害防治的历史可以追述至上世纪5 0 年代， j o h n s o n 等( 1 9 4 5 ) 最早报道了枯草芽胞杆菌的杀菌活性，从此开始了拮抗微生物的 研究工作。而a n w a r ( 1 9 4 9 ) 利用枯草芽胞杆菌( 召s u b t i l i s ) 防治由麦根腐长蠕孢 菌( h e l m i n t h o s p o r i u ms a t i v u m ) 引起的大麦苗期枯萎病，则标志着枯草芽胞杆菌用 于防治植物病原真菌的真i f 开始。此后用b s u b t i l i s 防治植物病害的研究成为国内外 5 华中农业人学硕f ：论文 的研究热点。c h a n g 和k o m m e d a h l ( 1 9 6 8 ) 用植物病原真菌拮抗菌液浸泡玉米种子， 不仅防止了幼苗枯萎病的发生，促进了幼苗生长和产量提高，而且有效地控制了玉 米在仓储期的腐烂现象，延长了其仓储时间。p a p a v i z a 和l u m s d e n ( 1 9 8 0 ) 发现枯 草芽胞杆菌可以防治水稻等农作物的多种土传真菌病害。h w a n g 和c h a n k r a v a r t y ( 1 9 9 2 ) 利用枯草芽胞杆菌( b s u b t i l i s )( e h r e n b e r g ) c o h n 菌株成功地防治了由 立枯丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n ik u e h n ) 引起的豌豆根腐病。 田问试验证明，芽胞杆菌生防制剂无论在稳定性、与化学农药的相容性方面， 还是在对不同植物真菌病害防效的一致性方面，都远远优于非芽胞杆菌类或真菌类 生防制剂( m o n i c ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。2 0 世纪9 0 年代以来，国外已有多种枯草芽胞杆菌 制剂投放市场。美国迄今至少有5 株b s u b t i l i s 进行了市场开发和商品化生产，分别 是g b 0 3 、m b l 6 0 0 、q s t 7 1 3 、q s t 2 8 0 8 和枯草芽胞杆菌解淀粉变种( b s u b t i l i sv a t a m y l o l i q u e f a c i e n sf z b 2 4 ) 。其中，美国a g r a q u e s t 公司用q s t7 1 3 菌株和q s t2 8 0 8 菌株分别开发出了活菌杀菌剂s e r e n a d e t m 和s o n a t a a s t m ，目前己得到广泛使用，叶 面喷洒可防治蔬菜、樱桃、葡萄葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等细 菌及真菌病害( 李晶等，2 0 0 8 ) 。g b 0 3 ( 商品名为k o d i a k t m ) 和m b i6 0 0 ( 商品名 为s u b t i l e x t m ) 分别由美国g u s t a f s o n 公司和m i c r o b i ol t d 公司丌发，通过根部施用 或拌种可有效防治镰刀菌( f u s a r i u ms p ) 、曲霉( a s p e r g i l l u ss p ) 、链格孢属( a l t e r n a r i a s p ) 和丝核菌属( r h i z o c t o n i as p ) 引起的豆类、麦类、棉花和花生等作物的根部病 害( 关小红，2 0 0 8 ) 。解淀粉枯草芽胞杆菌变种( b s u b t i l i sv a r a m y l o l i q u e f a c i e n s f z b 2 4 ) 被t a e n s a 公司商品化生产，商品名t a e g r o t m ，施用于温室或室内栽培树苗、 灌木和装饰植物根部，可防治由镰刀菌和丝核菌引起的根腐病和枯萎病( 黄丽丹和陈 玉惠，2 0 0 6 ) 。俄罗斯全俄植保所开发的枯草芽胞杆菌可湿性粉剂a l i r i n e b ，可用于 防治多种作物真菌，如镰刀菌( f u s a r i u m ) ，水稻纹枯病( r h i z o c t o n i a ) ，炭疽病 ， ( c o l l e t o t r i c h u m ) ，菌核病( s e l e r o t i n i a ) 等病害，田间防效高达6 0 , - , 9 5 ，增产达 2 5 3 5 ；另一枯草芽胞杆菌产品g a m a i 由活菌和代谢物组成，主要防治由 c l a v i b a c t e rm i c h i g a n e n s es u b s p m i c h i g a n e n s e ，e r w i n i ac a r a t o v o r as u b s p c a r a t o v o m 和p s e u d o m o n a sc o r r u g a t a 引起的番茄细菌病害( 李品等，2 0 0 8 ) 。韩国b i o 公司将 枯草芽胞杆菌与链霉菌抗生素、植物抗真菌多糖混合制成生物杀菌剂m i l d e w c i d e ， 叶面喷施可防治蔬菜和葡萄霜霉病、白粉病，也可防治花卉、水果和水稻真菌病害 ( 李品等，2 0 0 8 ) 。 6 海洋枯草芽胞杆菌d m 0 3 抗病原真菌物质的研究 国内将枯草芽胞杆菌用于植物病害防治起步较晚，但自上世纪8 0 年代以后，我 国对该方面的研究得到了广泛开展，并取得了一系列成果。目前国内利用枯草芽胞 杆菌进行防治的植物病害分布广泛、种类繁多，主要包括蔬菜病害( 菜豆、茄子等 的苗期病害( 顾真荣等，2 0 0 2 ) ，菠菜枯萎病( 孔建等，1 9 9 9 ) ，辣椒炭疽病( 何红 等，2 0 0 3 ) ；作用病害( 大豆根腐病、小麦根腐病( 隋文志等，1 9 9 9 ) ，小麦纹枯病 ( 张学君等，1 9 9 4 ) ，水稻纹枯病( 陈志谊等，1 9 9 7 ) ，稻瘟病( 彭化贤等，2 0 0 2 ) ， 豆类锈病( 王雅平等，1 9 9 2 ) ，小麦白粉病( 朱天辉等，2 0 0 0 ) ，小麦赤霉病( 王雅 平等，1 9 9 2 ；王雅平等，1 9 9 3 ) ；树木果实病害金花梨灰霉病( 朱天辉等，2 0 0 0 ) ， 桃、油桃和甜樱桃褐腐病( 范青等，2 0 0 0 a ) ，采后柑桔果实青、绿霉病( 范青等， 2 0 0 0 b ；范青等，2 0 0 2 ) ；等等。 国内已经成功投入商品化生产的枯草芽胞杆菌制剂主要有百抗、麦丰宁、纹曲 宁、依天得和根腐消等。百抗( 1 0 亿儋枯草芽胞杆菌可湿性粉剂) 由云南农业大学、 中国农业大学和云南省星耀生物制品厂共同研发的新型微生物农药杀菌剂，已获得 农业部登记注册，并在多