（无线电物理专业论文）有机药物分子包合体系及基因药物传递体系的核磁共振研究.pdf

摘要 本文利用液体和固体核磁共振技术，结合m o n t ec a r l o 计算模拟以及凝胶渗 透色谱( g p c ) 等分析方法，对环糊精药物分子包合物体系、高分子基因载体 及其与d n a 的复合物体系中不同组分间的相互作用和相容性、高分子的降解动 力学以及降解机理等进行了系统的研究，主要取得以下结果： 1 利用溶液2 d r o e s y 谱、1 3 c 固体高分辨谱及自扩散系数测量等核磁共 振技术，研究了环糊精( c d ) 和0 l 萘乙酸等药物分子包合物的相互作用。结果 表明，包合物的形成不仅和主客体分子的疏水性强弱有关，同时还和体系中主体 的空腔大小，客体的基团大小有关。通过r o e s y 实验结果可以确定包合物形成 与否，进而通过测量不同比例下客体分子自扩散系数的变化，计算出包合物结合 与解离的平衡常数，以此为基础对药物包裹体系在实现缓释方面的应用方式进行 了探讨。 2 首次通过对自扩散系数测量方法的修饰，结合实时氢谱测量对可降解基 因载体- 交联聚乙烯亚胺衍生物的动态降解过程进行了系统的研究。发现基因 载体聚合物在不同p h 值条件下降解的速度有明显差别，具有高度的p h 依赖性； 通过液体二维核磁谱结果还得出降解前后的分子结构信息并确定降解位点。利用 一维加权扩散实验观察降解过程中聚合物表观分子量的变化，发现在碱性情况下 聚合物降解过程显示出了两个阶段，结合实时1 h 谱结果，推测这是由于在碱性 情况下分子间发生了明显积聚；而在中性和酸性两种情况下积聚不显著，最后结 合m o n t ec a r l o 模拟结果发现只有中性情况下符合随机降解模型，而酸性条件则 需要其他的降解模型解释。 3 利用脉冲梯度场( p f g ) 等磁共振技术结合反拉普拉斯变换方法和m o n t e c a r l o 模拟对另一基因载体聚谷氨酸动态降解过程进行了系统研究。不但完成了 对聚合物在酸性条件下降解前后的结构变化的观测，而且通过p f g 技术发现聚 谷氨酸降解过程中，其任一时间点的自扩散实验中信号强度变化均呈非指数衰 减，需通过一个延伸型的指数函数进行拟合，通过对拟合得到的函数进行反拉普 拉斯变换后可以得到体系中的扩散系数分布图，进一步可以推导出在任意降解时 间点上的聚合物分子量分布。结果发现，在降解过程中随着聚合物平均分子量的 t t t 降低，体系中的分子量分布不断变宽，这一结果与g p c 实验结果完全吻合，而 且从p f g 实验中得到的平均分子量变化趋势和随机断裂方式下的m o n t ec a r l o 模 拟实验结果十分吻合，据此可以认为聚合物的降解是一个随机断裂的过程。该部 分的实验结果表明，结合自扩散系数测量和反拉普拉斯变换有望成为一种测量高 分子分子量分布具有普适性的新方法。 4 首次将固体核磁共振应用到聚合物d n a 复合物体系，观察复合物体系中 不同n p 比对其相互作用和相结构的影响，研究表明n p 比的变化对聚乙烯亚 胺d n a 基因递送体系分子水平上相互作用有着很大的影响；另外，还发现不同 分子量的聚乙烯亚胺聚合物载体在n p 比为3 的情况下对复合物中d n a 的微观 尺度没有明显影响；通过氢的自旋扩散实验，首次测得在p e i d n a 复合物体系 中d n a 相尺寸的大小，并发现在体系中n p 比达到3 以上的复合物中d n a 和 p e i 达到了分子水平上的相容。 从发展新的核磁共振方法，拓展核磁技术应用范围的角度来看，本文首次 提出了采用一维脉冲梯度场技术快速测量降解过程中聚合物的分子量变化的新 方法；并首次将m o n t ec a r l o 模拟与p f g 实验结果进行了关联分析，从而不仅可 以实时观测体系分子量的变化，而且可以对体系的降解机理进行深入分析；首次 将延伸型指数函数引入对自扩散曲线的拟合，并通过反拉普拉斯变换，建立了一 种实时测量聚合物体系分子量分布的新方法；首次将固体核磁共振的研究方法， 引入聚合物d n a 复合物体系的研究。实验结果表明，这些方法具有实时、非破 坏性，易于实现、能够提供新的结构信息等优点，具有实际的应用价值。 关键词：自扩散；包合物；核磁共振；降解；基因传递；m o n t ec a r l o ；自旋扩散； p e i d n a ；脉冲梯度场；反拉普拉斯变换 a b s t r a c t t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nc y c l o d e x t r i na n do r g a n i cd r u gm o l e c u l e s ，d e g r a d a t i o n p a t h w a yo fp o l y m e r si n c l u d i n g ac r o s s - l i n k e d p o l y e t h y l e n e i m i n e ( c - p e i ) a n d 丫- p o l y g l u t a m i ca c i d “一p g a ) s u i t a b l e a s g e n ec a r r i e r sa n dt h ei n t e r a c t i o na n d m o r p h o l o g yo fp o l y e t h y l e n i m i n e d n ac o m p l e x e sw e r es t u d i e db yp f gn m r m e a s u r e m e n tc o m b i n e dw i t hm o n t ec a r l os i m u l a t i o n , 1 h _ l hr o e s ya n ds o l i d - s t a t e h i g h - r e s o l u t i o n1 3 cn m rs p e c t r o s c o p y t h em a i nr e s u l t si n c l u d e ： 1 t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nc y c l o d e x t r i na n ds e v e r a ld r u gm o l e c u l e sw e r e s t u d i e db yn m rd i f f u s i o nm e a s u r e m e n t t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n t so ft h el i g a n d si n s o l u t i o n ，w h i c hr e f l e c t st h ea f f i n i t yo fa s s o c i a t i o nb e t w e e nc y c o d e x t r i na n dt h e m ， w e r ef o u n dt od e c r e a s ea st h ec o n c e n t r a t i o no fc y c l o d e x t r i ni n c r e a s e d t o g e t h e rw i t h 2 d _ r o e s ye x p e r i m e n t s ，i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a ti n f o r m i n gi n c l u s i o nc o m p l e x ，t h e h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o ni sp r e d o m i n a n ta m o n gv a r i o u sp o s s i b l ei n t e r a c t i o n sb e t w e e n c y c l o d e x t r i na n dt h el i g a n d s b a s e do nt h ea b o v ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，t h ep o t e n t i a lo f a p p l i c a t i o no fc d d r u gm o l e c u l es y s t e mi nd r u gr e l e a s ew a sd i s c u s s e d 2 t h ed e g r a d a t i o np a t h w a yo fac r o s s l i n k e dp o l y e t h y l e n e i m i n e ( c - p e i ) s u i t a b l ea sag e n ec a r r i e rw a ss t u d i e da td i f f e r e n tp hv a l u e sb yr e a lt i m e1 hn m ra n d d i f f u s i o n - w e i g h t e d 1 hn m rs p e c t r o s c o p y t h ec p e iw a s s y n t h e s i z e db y c r o s s l i n k i n g p e i s e g m e n t s w i t h 2 ，4 - p e n t a n e d i o ld i a c r y l a t e ( p d d a ) t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tu n d e rb a s i c ，n e u t r a la n da c i d i cc o n d i t i o n s ，t h e d e g r a d a t i o no fc p e io c c u r st h r o u g hh y d r o l y s i so ft h ee s t e rm o i e t i e so ft h ep d d a l i n k e r s t h ed e g r a d a t i o nh a l f - l i f eo ft h ep o l y m e ri s2 2 ，4 8a n dm o r et h a n7 2 0ha tp h 1o 2 ，7 4a n d4 6 ，r e s p e c t i v e l y , s h o w i n gt h a tt h ea p p a r e n tm o l e c u l a rw e i g h to fc - p e i i nt h ed e g r a d a t i o np r o c e s sw a sm o n i t o r e d f u r t h e r m o r e ，am o n t ec a r l os i m u l a t i o n w a sa p p l i e dt os i m u l a t et h er e l a t i o nb e t w e e nt h ea v e r a g em o l e c u l a rw e i g h ta n dt h e n u m b e ro fc h a i ne n d sd u r i n gt h ed e g r a d a t i o np r o c e s so fam o d e ls y s t e mo fc p e i b y c o m p a r i n gt h en m r r e s u l t sw i t ht h o s eo b t a i n e df r o ms i m u l a t i o n , t h em e c h a n i s mo f d e g r a d a t i o nu n d e rp hc o n d i t i o n sa n dm o n t ec a r l os i m u l a t i o ni sau s e f u ls t r a t e g yf o r v c h a r a c t e r i z i n gt h ed e g r a d a t i o np r o c e s so fd e g r a d a b l ep o l y m e r s 3 t h ed e g r a d a t i o np a t h w a yo f7 - p o l y g l u t a m i ca c i d ( 丫一p g a ) s u i t a b l ea sa p o l y m e r i cc a r r i e rw a ss t u d i e da ta c i d i cc o n d i t i o nb yr e a lt i m e1 hn m r a n dp f g n m rt e c h n i q u e s b yu s i n gam o d i f i e dv e r s i o no fd i f f u s i o n - w e i g h t e d1 hn m r e x p e r i m e n t , t h ev a r i a t i o no ft h ew e i g h t a v e r a g e dm o l e c u l a rw e i g h t ( m o f7 - p g a d u r i n gt h ed e g r a d a t i o np r o c e s sw a sm o n i t o r e d m e a n w h i l e ，t h ep f gn m rr e s p o n s e c u r v eo f7 - p g ar e v e a l san o n - e x p o n e n t i a lb e h a v i o rw h i c hi se x c e l l e n t l yf i r e db yf l s t r e t c he x p o n e n t i a lf u n c t i o n b yp e r f o r m i n ga ni n v e r s el a p l a c et r a n s f o r m a t i o no ft h e s t r e t c he x p o n e n t i a lf u n c t i o nad i s t r i b u t i o nc u r v eo ft h ed i f 弛i v i t yi so b t a i n e dw h i c hi s e n a b l e st h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o nt ob ee x t r a c t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e w i d t ho ft h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o ni n c r e a s i n ga st h ea v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t d e c r e a s e sd u r i n gt h ed e g r a d a t i o np r o c e s s t h ed e c r e a s ei na v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t w i t hd e g r a d a t i o nt i m e ，a sd e t e r m i n e db yp f gn m r , a g r e e sw i t ht h ec o r r e s p o n d i n g r e s u l t so b t a i n e db ym o n t ec a r l os i m u l a t i o n s ，s u g g e s t i n gt h a tt h ed e g r a d a t i o ni sa r a n d o mp r o c e s s t h ea b o v em e t h o dc a nb eu s e d2 l sag e n e r a lm e t h o do fd e t e r m i n i n g m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no fp o l y m e r s 4 s o l i d s t a t e1 hw i d e 1 i n en m ra n d3 1 pm a g i ca n g l es p i n n i n g ( m a s ) n m r w e r ea p p l i e dt oas e r i e so fp e i d n ac o m p l e xs a m p l e sw i t hd i f f e r e n tp e im o l e c u l a r w e i g h t sa n dn i t r o g e n p h o s p h a t e ( n p ) m o l a rr a t i o s ，i no r d e rt od i s c l o s et h ei n f l u e n c e o fv a r i o u ss t r u c t u r a lf a c t o r so nt h ei n t e r a c t i o n sa n dm o r p h o l o g y t h er e s u l t so f 1 h n m r s p e c t r as h o w e dt h a tt h el i n e w i d t ho ft h ep e is i g n e dw a sg r e a t l yb r o a d e n e dw i t h i n c r e a s i n gt h en pr a t i o m e a n w h i l e ，i nt h e3 l pm a se x p e r i m e n t ，t h es i g n a lw a sf o u n d t os h i f tu p f i e l dw i t ht h ei n c r e a s eo ft h en pr a t i o b o t h1 ha n d3 1 pn m r e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e dt h a tt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt w oc o n s t i t u e n t sa n ds u b s e q u e n t l yt h e m o r p h o l o g y o ft h e c o m p l e x e sv a r y w i t ht h en p r a t i o b yc a r r y i n g o u t1 h s p i n - d i f f u s i o ne x p e r i m e n t s ，t h ed o m a i ns i z e so fd n ai nt h ec o m p l e x e sw e r e d e t e r m i n e d t h ed o m a i ns i z eo fd n ai sf o u n dt od e c r e a s eg r e a t l yw h e nt h en pr a t i o c h a n g e sf r o m0 5t o3a n dc h a n g e so n l ys l i g h t l yw i t hf u r t h e ri n c r e a s eo f t h e n pr a t i o a r e rm a k i n gat h o r o u g ha n a l y s i sa n dd i s c u s s i o no nd r u gc o n t r o lr e l e a s ea n d g e n ed e l i v e r ys y s t e m sw i t hg e n e r a ln m rt e c h n i q u e s ，w ep r e s e n t sam e t h o do f1d v i p f gn m r t e c h n i q u et or e a l i z eq u i c ko b s e r v a t i o no nt h em wc h a n g eo fp o l y m e r d u r i n g i t s d e g r a d a t i o np r o c e s s m o r e o v e r , a c c o r d i n gt o t h ei n v e r s e l a p l a c e t r a n s f o r m a t i o nt h e o r ya n db a s e do naf u n c t i o no fd i f f u s i v i t yd i s t r i b u t i o no fp o l y m e ri n s o l u t i o n , 2 dp f gn m rt e c h n i q u ei sd e v e l o p e dt om e a s u r et h em wd i s t r i b u t i o no f p o l y m e r c o m b i n e dw i t hm o n t e c a r l os i m u l a t i o n , t h ed e g r a d a t i o nm e c h a n i s mc a l lb e f i g u r e do u t t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t si n d i c a t et h a tt h ep f gn m r m e t h o d sc a n b e t t e ri n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o n s ，m o r p h o l o g ya n dd y n a m i c si n f o r m a t i o no fs y s t e m s i n c l u d i n gd r u gc o n t r o lr e l e a s ea n dg e n ed e l i v e r ys y s t e m si no u rw o r ka n di s a c c o r d i n g l ym o r ec o n v e n i e n t ，n o n d e s t r u c t i v ea n da p p l i c a b l ec o m p a r e dw i t ho t h e r m e t h o d s ，i e g p c k e y w o r d s ：s e l f - d i f f u s i o nc o m p l e xn m rd e g r a d a t i o n g e n ed e l i v e r ym o n t e c a r l o s p i nd i f f u s i o n p e u d n ap f gi n v e r s el a p l a c et r a n s f o r m a t i o n v i i 主要符号和缩略语 a q ：采样 b p p s t e ：双向梯度场激发回波技术 c d - 环糊精 、 c o s y ：相关谱 c p m a s d d ：交叉极化厂魔角旋转高功率去偶 d ：自扩散速率 d n a ：脱氧核糖核酸 f i d ：自由感应衰减 g ：客体分子 g p c ：凝胶渗透色谱 h s q c ：异核单量子相干谱 积分值 岛：结合解离平衡常数 胍分子量 n m r i 核磁共振 m ：氮磷摩尔比 p e i ：聚乙烯亚胺 p f g ：脉冲梯度场 r f ：射频 r t ：室温 r o e s y ：旋转坐标系下空间相关谱 乃：自旋晶格弛豫时间 a - n a a ：a 萘乙酸 q ：溶液黏度 1 d ：一维 2 d ：二维 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 矗1 ll 作者签名：墼盐日期：之丝显笸 f ) = 一芦( f g ( t ) a t 一f g ( t ) ( 1 t ) = 0 ( 1 2 ) ；6 而在实际的体系中往往在两个梯度脉冲间隔内，分子会发生布朗运动，核自 旋的位置会发生变化，造成磁化矢量不能完全被重聚，进而使得实验采到的信号 发生衰减，经过推导得出信号强度变化与分子扩散系数的相互关系： 2 r l n i ( 2 r ) i ( 0 ) = 一y 2f f ( t ) d f ( t ) d t( 1 3 ) 5 其中i ( 2 z ) 和i ( 0 ) 分别是2 z 幂i 0 时刻的信号强度，丫是被观测核的磁旋比，其中 tt f ( t ) = f g ( t ) d t 一f g ( t ) d t - ( 1 4 ) ；6 结合公式1 3 和1 4 可以推出s t e j s k a l t a n n e r 方程： h 韶力i ( o ) _ 彳平q 尹3 + q 舀甏妒2 一d 6 ) + d ：( a 一别3 ) 一驯忑( 1 5 ) 其中g 和6 分别为梯度场的强度和宽度，g o 是指背景梯度，是指两个梯度脉 冲起始间隔，d 是分子的自扩散系数，2 t 是指自旋回波时间，t 2 是被测分子的 横向驰豫时间。 在主磁场足够的均匀情况下，即g ：f 3 可以看出h 3 、h 5 位于内侧【9 ，1 0 1 ，图中显示，各个客体分子中芳环上的 氢与a 环糊精环内的氢有交叉峰，说明客体分子通过芳环嵌入a 环糊精空腔内 与甜环糊精形成了包合物 1 2 1 。 1 6 第二章环糊精与有机药物小分子的包合研究华东师范大学博士论文 6 6 f i g u r e2 2p a r t i a lr o e s ys p e c t r ao fg u e s t s c i - c di nd 2 0a t5 0 0m h z w i t h s p i l ll o c kt i m eo f5 0 0i n s 第二章环糊精与有机药物小分子的包合研究华东师范大学博士论文 2 3 2 包合体系的自扩散系数的测定结果 t a b l e2 1d a t ao f t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n t so f t h eg u e s tm o l e c u l e so fd i f f e r e n tm o l a rr a t i o b e t w e e nt h eg u e s tm o l e c u l ea n dc t - c di nd 2 0s o l u t i o n sa t3 0 0k 4 ：o 4 ：1 4 ：2 4 ：3 4 ：4 4 ：5 4 ：6 8 4 6 8 8 3 5 9 8 2 2 9 8 0 9 1 7 9 8 3 7 8 4 3 7 7 6 5 9 8 9 2 9 5 9 2 9 2 7 1 9 1 0 0 8 9 1 4 8 7 7 3 8 7 2 1 8 6 0 2 8 4 4 8 8 2 9 5 8 0 9 5 7 9 2 7 7 0 5 7 5 0 4 t a b l e2 1 中数据显示，随着0 【c d 比例的增加，各个样品中客体自扩散系数 逐渐下降，进一步证实客体有机分子与a c d 形成了包合物，同时测得d c o m p = d 0 - c y c l 。d c ) 【t 血= 3 0 1 1 1 0 一o m 2 s 。 以实验测定的自扩散系数d 为纵坐标，a c d 与客体分子的初始浓度比，为 横坐标作图( 图2 3 ) ，可以观察到客体分子自扩散系数随着0 【环糊精浓度的升高 而降低。根据公式( 2 2 ) 计算得到水杨酸根、苯酚和苯甲酸根与a 环糊精形成 包合物的平衡常数( t a b l e2 2 ) 及其包合比，经过拟合得出a 环糊精与上述客体 的包合比为1 ：1 ，与前人工作结果相符【1 3 】。以苯甲酸根为例，我们推测出包合 物的结构模型( f i g u r e2 4 ) 。从平衡常数可以看出随着客体空间位阻的变大，它 们与a 环糊精形成包合物的平衡常数呈减小的趋势( 墨。a l i 翻址c 局b e n z o a t e ，墨 。a l i 聊砒c p h 删) ，与苯酚或者苯甲酸根相比，水杨酸根中多引进了一个基团，使 得分子在与环糊精作用时的空间位阻加大，从而阻碍分子与环糊精之间的包合作 用；根据疏水理论，a 。c d 的疏水空腔对亲水性强的水杨酸根不易包合，疏水性 导致k as a l i c y l a t e 墨o l a e n o l 的因素之一。上述结果表明客体空间结构和疏水能力两种 因素对于主客体的稳定结合具有影响。 1 8 第二章环糊精与有机药物小分子的包合研究华东师范大学博士论文 笔 茎 f i g u r e2 3p l o to f t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n t so f t h eg u e s tm o l e c u l e sa saf u n c t i o no f t h e m o l a rr a t i ob e t w e e nt h eg u e s tm o l e c u l ea n da - c di nd 2 0s o l u t i o n sa t3 0 0k + 舯一呀o o f i g u r e2 4m o d e lo f t h ec o m p l e xf o r m e db e t w e e na - c da n da r o m a t i cg u e s t t a b l e2 2t h ea s s o c i a t i o nc o n s t a n t so fc o m p l e x e sb a s e do nd i f f e r e n tg u e s t s 1 9 第二章环糊精与有机药物小分子的包合研究华东师范大学博士论文 2 40 【环糊精芳香类客体包合物研究小结： 1 ) 通过偶自扩散系数的测定和1 h 一1 hr o e s y 谱完成了在水溶液中水杨酸根、 苯酚及苯甲酸根和a - c d 形成包合物的结构的鉴定和平衡常数的测定。 2 ) 通过r o e s y 谱中的1 h 1 h 空间相关峰得出包合物的形成是芳香性有机物的 芳环进入了环糊精的空腔内。 3 ) 随着客体空间位阻的增大形成包合物的平衡常数在减小。 2 5 环糊精和0 【萘乙酸包合物研究背景 2 5 1a 。萘乙酸概况 仅萘乙酸( a - n a a ) 是一种光谱性植 物生长调节剂，能使多种蔬菜增产，并能 够起到防止落花落果和诱导开花的作用 【8 】。同时作为一种有机弱酸，a - n a a 还具 有促进胆汁分泌、抗炎及保肝作用。其利 胆作用强，持续时间长且效果明显。环糊 精是一类由葡萄糖基构成的内部中空的桶 o l i c o h s c h e m e2 31 1 1 es t r u c t u r a lf o r m u l ao f a - n a a 状化合物，其中最常见的是a ，p ，7 - 环糊精三种，它们分别含有6 ，7 和8 个 葡萄糖单元，环糊精的空腔具有强烈的疏水性 1 4 】，当客体分子尺寸和理化性质 与空腔相匹配时，环糊精可依靠分子间的作用力包合一些客体分子的部分或者是 全部基团，形成包合物。由于环糊精本身无毒，相对廉价易得，作为药品的缓释 和保护性囊材非常适宜 1 5 1 9 】。潘祖亭等用环糊精作为主体分子包裹a - n a a 实 现其缓释，并通过荧光光谱方法测量包合物形成与解离的平衡常数局，以便考 察两者相互作用的强弱 8 。 2 5 2 研究思路 本部分工作拟通过液体和固体核磁共振方法，对0 l 一，p 环糊精与a - n a a 的 主客体相互作用进行研究，讨论环糊精空腔大小对包合物形成的影响，同时通过 第二章环糊精与有机药物小分子的包合研究华东师范大学博士论文 自扩散系数测量的方法测定水溶液中形成包合物的平衡常数局，并预计在此基 础上包合物的实际应用。 2 6 环糊精和0 【萘乙酸包合物的实验部分 2 6 1 实验材料和样品准备 a ，b 环糊精购于f l u k a 公司，a - n a a 购于s i g m a - a l d r i c h 公司，均为分析 纯。环糊精旭萘乙酸按照一定摩尔比在室温下溶于重水配制而成，所有溶液样 品中，客体分子的浓度均为5m m o l l 。 环糊精凡萘乙酸包合物固体样品的制备方法：将a 或p 环糊精和a 萘乙酸 的水溶液( 摩尔比1 ：4 ) 置于通风厨中，使溶剂在室温及排风条件下蒸发，所 得的固体样品在真空干燥箱中进一步抽干待用。 2 6 2 核磁共振实验 溶液核磁共振实验采用b r o k e ra v a r i c e5 0 0 谱仪，其1 h 的共振频率为5 0 0 1 3 m h z 梯度场处于z 方向上，最大输出梯度场强度为0 5 3 5t m ，实验采用双向梯 度脉冲的强度为2 分1 6 次步进到9 5 ，扩散时间为1 6 0m s ，温控系统为b - v t 3 0 0 0 ，实验温度控制在3 0 0k ，误差为0 1k ，实验中1 h9 0 。脉冲的宽度为1 0 2 p s o 二维1 h 1 hr o e s y 实验f 2 维采样点数为1 0 2 4 ，累加次数为1 6 次，f 1 维采 样点数为2 5 6 个点，混合时间为5 0 0m s ，其中水峰压制的二维实验f l 维采样点 数为5 1 2 个点，实验温度都为3 0 0k ，实验采用环糊精与甜萘乙酸摩尔比为3 ：2 的样品。 固体n m r 实验所用仪器为b r o k e rd s x - 3 0 0 ，1 h 和1 3 c 共振频率分别为 3 0 0 1 3 和7 5 4 7m h z ，其中1 3 c 化学位移以甘氨酸羰基信号( 相对于为81 7 6 0 3 ) 为标准设定，固体1 3 c 高分辨n m r 谱测量通过交叉极化、魔角旋转和高功率质 子去耦( c p m a s d d ) 技术实现。实验中，m a s 转速均为5k h z ，弛豫时间为 2 1 第二章环糊精与有机药物小分子的包合研究华东师范大学博士论文 3s ，交叉极化的时间为1m s 。 2 6 3 理论计算推导 1 9 6 5 年s t e j s k a l 等 5 】提出的用核磁共振脉冲梯度场技术测定溶液中分子自 扩散系数的方法具有非破坏性和简便快捷等特点，是研究混合体系中分子相互作 用的重要工具 1 2 】。从实验中得到堆积谱( 图2 5 ) 计算所得到的自扩散系数， 4 2 04 1 84 1 6如1 4 艿 f i g 2 5t h es t a c k e ds p e c t r ai nt h ed i f f u s i o ne x p e r i m e n t s 计算局所依据的原理和方法如下：若环糊精c d 和客体分子g 在溶液中存在包 合平衡，则 即g + c d 石= g a 兰瓯：c d( 2 3 ) 蜀为包合反应的平衡常数，其表达式为 耻拚器 ( 2 4 ) n m r 自扩散系数测量法所观测到的自扩散系数与客体分子交换速率有关， 如果客体分子的游离态和结合态在扩散时间尺度内快速交换，则n m r 测到的自 扩散系数是客体分子两种状态下自扩散系数的加权平均，即 第二章环糊精与有机药物小分子的包合研究华东师范大学博士论文 d 酗= f o r e 。+ ( 1 一厂) 砬唧 ( 2 5 ) 式中，d o b 。是观测到的客体分子的自扩散系数，d 触是自由状态下客体分子 的自扩散系数，p 是客体完全处于包合状态下的自扩散系数，它无法直接通 过实验测到，但由于客体分子的质量远小于c d 的分子量，所以我们近似地用 c d 的自扩散系数代替。厂是混合物中游离的客体分子浓度与总浓度的比值。 厂= 鼎 结合方程( 2 4 ) ，得出 ( 2 6 ) 耻而 眨7 ， g o 是客体分子的总浓度，是环糊精的总浓度与客体分子的总浓度比值联立方 程( 2 5 ) 和( 2 7 ) ，得到 k 。= 丽i 瓦d o b s 万- - d s 丽=【高g 盎d 】n ( 2 8 ) 8 i l r ( d c 0 唧一d 缸) 一( d 幽一d 丘c c ) o ( d c 。唧一 o b 。) 。 、7 可以通过现中曲线拟合求出蜀值【6 。 2 7 环糊精和a 萘乙酸包合物研究结果与讨论 2 7 11 h 1 hr o e s y 谱 图2 6 是仪一n a a 和p c d 混合溶液的2 d r o e s y 谱图，二维1 h 1 hr o e s y 谱可以指认出空间距离很近( o 5 姗以内) 的质子 2 0 ，图2 6 中67 和7 6 、7 9 8 0 的信号对应于c t - n a a 的萘基上的质子，64 1 5 对应于a - n a a 上亚甲基质子；6 3 5 3 6 为位于p c d 环外质子，63 7 3 9 对应于p c d 环内质子。由图2 6 可发 现，在67 4 7 6 、7 9 8 0 和63 7 3 9 处的信号间有交叉峰产生，而在67 4 7 6 ， 67 9 8 o 和63 5 - - - 3 6 之间则为发现有交叉峰，这表明a - n a a 中的萘基嵌入1 3 c d 环内；同时从图2 6 中还可发现，在64 1 5 和63 7 3 9 处也存在交叉峰，这表 第二章环糊精与有机药物小分子的包合研究华东师范大学博士论文 明a - n a a 的亚甲基也嵌入了p c d 环内。 8 2 8 0 7 8 7 6 7 4 7 27 0 辛 f i g2 6p a r t i a lr o e s ys p e c t r ao fa - n a a 9 一c di nd 2 0 w i t has p i nl o c kt i m eo f5 0 0m s 上述结果表明，在水溶液中a - n a a 的疏水部分进入了1 3 - c d 的腔内，形成 了包合物。对于c x - n a a 和a c d 的混合溶液，在与前者相同的实验条件下， 2 d r o e s y 谱上并未明显观察到上述交叉峰，当采用水峰压制技术后将重水残余 的质子信号压制之后才能看到67 4 7 6 ，67 9 8 o 和63 7 3 9 的交叉峰，在64 1 5 和63 7 3 9 处则未观察到交叉峰( 图2 7 ) 。由此可知，a c d 与b c d 均能与a - n a a 形成包合物，但1 3 - c d 更容易与0 【n a a 结合，且形成的包合物更加稳定。从a - c d 和1 3 - c d 空腔半径0 2 8 5 和0 3 7 7n l n ，a - n a a 上仅萘环半径约有0 2 4 21 1 1 1 1 ，同时 又存在亚甲基和羧基的空间位阻效应影响，同样可以得出以上结论。 第二章环糊精与有机药物小分子的包合研究华东师范大学博士论文 8 2 8 0 7 8 7 6 7 4 7 2 7 0 彦 f i g2 7p a r t i a lr o e s ys p e c t r ao fa - n a a a c d i nd 2 0w i t has p i nl o c kt i m eo f5 0 0r t l $ ( w i t hs o l v e n ts u p p r e s s i o n ) 2 7 21 j cc p m a s 谱 图2 8 为d c d ，a c d 以及它们与a - n a a 包合物固体样品的1 3 cc p m a s 谱， 当p c d 空腔内部没有包含客体分子时，c d 有多种可能的构象存在，使谱图2 8 ( a ) 中与配糖键相连的1 ，4 号碳原子信号的裂分非常复杂。但是，在p c d 与a - n a a 包合物的谱图中 图2 8 ( c ) ，这些多重裂分消失，这是c d 与客体分子形成包 合物的直接实验证据 2 1 】。因为在包合物中，客体分子的支撑使得c d 的构象变得 对称，葡糖单元上的相应碳原子都在相同的化学环境中。同样在图2 8 p ) 中，伐c d 在混合a - n a