（微生物学专业论文）四氢呋喃的微生物降解研究.pdf

浙江大学博士学位论文 摘要 摘要 具有广泛用途的四氢呋喃在国民经济各个领域的使用日益扩大，随之进入环境的量日益 增多，其溶剂特性和致癌性对于环境生态的损害风险也在日益增加。本论文围绕四氢呋喃 ( t e t r a h y d r o f u r a n ，t h f ) 的微生物降解这一主题，对t h f 高效降解菌筛选、培养条件优化、 降解基因克隆和利用t h f 降解菌反应器处理含四氢呋喃废水等多个方面内容开展了研究， 结果分述如下： ( 1 ) 四氢呋喃降解菌的筛选鉴定 通过采集多处环境样品并经一年驯化富集，从混合样品中筛选到1 株t h f 降解红球菌 y y l ( r h o d o c o c c u ss p y y l ) 初步研究表明，该菌株对t h f 耐受性达到了2 0 0 m m ，远高 于报道菌株；t h f 浓度为2 0 m m 的液体培养基中，1 0 2 h 内可降解t h f 达1 0 0 ，因此具有 进一步研究利用价值。同时分离获得了2 株与其伴生的芽孢杆菌b a c i l l u sc e r e u s 和b a c i l l u s a q u i m a r i s 。 ( 2 ) 四氢呋喃降解条件优化 文献报道t h f 降解条件基本采用了其它菌株培养方法，因此通过优化，t h f 降解速率 可进一步提高。采用p l a c k e t t b u r m a n 和响应曲面实验设计方法，筛选出了对r h o d o c o c c u s s p y y l 生长和t h f 降解具有显著促进作用的三种微量元素，优化了1 h f 降解无机盐培养 基中主要组分的浓度。最终获得了最佳t h f 降解培养基组成为：n h 4 c i1 8 0 9 l ， k 2 h p 0 4 3 h 2 0 o 81 9 l ，酵母膏0 0 6 9 l , m g s 0 4 7 h 2 00 4 0 9 l ，z n s 0 4 7 h 2 0 o 0 0 6 9 l ， f e s 0 4 。7 h 2 0o 0 2 4 9 l ，初始p h8 2 6 。经优化后r h o d o c o c c u ss p w l 的生长速率和t h f 降 解速率较第一个报道的t h f 降解红球菌高5 倍左右，提高到了0 0 8 9 2 h 1a n d1 3 7 6 0m gt h f h - 1 g 干重，而且优化后培养基在组成上也更加简单，因此更具实际应用于t h f 废水处理的 可行性。 ( 3 ) t h f 降解单加氧酶基因簇克隆 红球菌是第一个报道能够降解t h f 的微生物菌株，目前还没有相关降解基因的报道。 本文根据报道的p s e u d o n o c a r d i as p k 1 中t h f 降解单加氧酶基因序列，采用 c o n s e n s u s - d e g e n e r a t eh y b r i do l i g o n u c l e o f i d ep r i m e r ( c o d e h o p ) p c r 和染色体步移法一一 热不对称交互式p c r 完成了a 亚基的完整序列扩增。又根据扩增序列和p s e u d o n o c a r d i as p 浙江大学博士学位论文 摘要 k 1 中t h f 降解单加氧酶基因簇序列设计了一致性引物，扩增了长为1 02 5 5 b p 的单加氧酶 基因簇。开放阅读框分析和b l a s t 比对发现r h o d o c o c c u ss p y y l 的t h f 降解多组分单加氧 酶基因簇中基因表达方向和排列顺序均与p s e u d o n o c a r d i as p k 1 一致，而且各亚基的相似性 均在9 4 以上，表明该基因簇在不同菌株之间相对保守；但在单加氧酶与醛脱氢酶基因之 间被插入了一个转座酶基因。对各亚基氨基酸序列的分析表明，a 亚基可能是一个跨膜蛋白， 推测这是难以离体检测到该单加氧酶活性的重要原因。进一步对该单加氧酶各个亚基氨基酸 序列和对应菌株1 6 sr d n a 序列进行聚类分析，r h o d o c o c c c u ss p y y l 和p s e u d o n o c a r d i as p k 1 中t h f 降解多组分单加氧酶进化距离趋近于0 ，而两者在分类地位上却相对较远，因此 进一步提供了该单加氧酶是可能通过水平转移引起的证据。 ( 4 ) 分离t h f 降解菌株反应器应用研究 急性毒性实验表明，废水中t h f 浓度大于 1 6 0 m m 时，活性污泥中过氧化氢酶、脲酶、 脱氢酶、磷酸酶、蛋白酶活性均受到抑制，d g g e 研究结果表明微生物多样性也明显降低， 导致污泥处理有机废水的效能降低，在一个周期内，有机碳不能被完全分解。平板计数观察 到，随着t h f 浓度增加，活性污泥中可培养细菌、真菌数量显著减少，而t h f 对放线菌影 响较小在长期接触情况下，1 0 m m t h f 即可抑制过氧化氢酶、脲酶、脱氢酶、磷酸酶、蛋 白酶活性，尤其是脱氢酶，几乎完全被抑制。d g g e 研究表明，受t h f 废水影响的活性污 泥生物多样性指数从1 4 2 4 降低到了o 8 2 3 所有毒理实验结果说明t h f 排放将对活性污泥 性能造成非常显著的不利影响，因此t h f 废水治理应该受到重视。 根据文献报道和筛菌结果，目前已知的t h f 降解菌株较少，而且很多活性污泥中并不 存在或者难以驯化获得降解t h f 的高活性污泥用于t h f 废水处理。而采用生物强化手段是 切实可行的办法本文以镇海炼化厂曝气池活性污泥为载体，构建了用于t h f 降解茵 r h o d o c o c c u ss p y y l 定植的s b r 反应器，研究r h o d o c o c c u ss p y y l 在反应器中定植条件结 果表明该t h f 降解菌在反应器内的定植需要共同存在b a c i l l u sc e r e u s 和b a c i l l u sa q u i m a r i s 以帮助或协同其创造良好的共生微生境，这为该降解菌的应用奠定了研究基础。 r h o d o c o c c u s s p y y l 成功定植的反应器，经优化后连续进水条件下可高效处理进水浓度 为2 0 m m 的t h f 废水，t h f 去除率达到1 0 0 。同时表明r h o d o c o c c u ss p y y l 在反应器内 的定植，可增加其对p h 变化抗性，在p h - j 上的指导、生活上的关怀、人格塑造上的影响，对于这些弟 子永远铭记于心，在此真诚的祝愿闵老师身体安康；同时弟子也会紧遵教诲，一步一脚印， 在以后的人生学习科研道路上努力探索追求。 我要深深地感谢我的父母，“慈母手中线，游子身上衣”，他们无怨无悔的付出和支持， 是我能够安心完成学业的强有力支柱。虽然他们未能在学业上对我有所指导，但自小他们的 言传身教，教会了我勤俭自律，教会了我谦逊奋进，这是任何东西都无法替代的。对于他们 的生育养育教诲之恩，倾我所有也难以回报。同时还得感谢我的家人，我奶奶、大姐、二姐、 大姐夫、二姐夫以及我可爱的外甥外甥女，感谢他们对我生活上的照顾和关心，对我人生选 择的指点，在我人生的坎坷中，是他们给了我温暖和勇气在此希望他们都健康快乐。 在实验室的这些年，还要感谢师兄师姐吕镇梅、阮爱东、姚晓华、吕振华、余海霞、邵 铁娟、张俊会、丁霞、刘同宝、章骥、刘静、黄峥、李钠、关健、刘击；同窗宣瑛和袁海平； 师弟师妹汪美贞、桑丽雅、李子木、应燕玲、孟智奇、赵诣、杨贵芹等等；还有闰博、谭振 宁、唐鹏、焦会朋、王晶晶、林铖等等，对我的指导、帮助和支持。这五年时间里与你们一 起共同渡过的美好而难忘的时光会是我最珍贵的回忆。在此要特别感谢吕镇梅师姐对我的信 任和支持，给我的锻炼机会，让我在这五年中学会了许多也成长了许多 感谢我的室友丁海涛，研究生阶段开始以来相互之间的鼓励与支持、探讨与交流、指点 与帮助，给我在科研和生活上的启发，终生受益。感谢我的其他室友在生活上的帮助和理解。 也感谢曾经带给我快乐给我过帮助的朋友方芳、黄杰锋、干玉景等等。 最后要感谢所有支持过帮助过我的老师、同学、朋友! 谢谢你们! 姚燕来二零零九年三月二十日于浙江大学紫金港校区 淅江大学博士学位论文附录清单 附录清单 附录l ：r h o d o c o c c u ss p y y l1 6 sr d n a 序列 附录2 ：r h o d o c o c c u ss p y y l 中t h f 降解多组分单加氧酶基因簇序列及开放阅读框和编 码氨基酸序列 附录3 ：克隆基因与核酸数据库中基因序列相似性比较 附录4 ：t h f 降解多组分单加氧酶各亚基与报道单加氧酶氨基酸序列相似性比较 v i 淅太学博士学位诗史第一章文献综进 第一章文献综述 第一节四氢呋哺及其降解研究进展 l 1 四氢呋喃理化性质 祥舒 1 2 四氢呋喃的应用 具有低毒、低沸点、流动性好等特点，是一种重要的有机合成屎抖和性能优良的溶荆， 是发展前景广阔的精细石油化工产品 四氢呋喃性质稳定，能洛解许多有机和无机化音物，被喑为万能溶剂t h f 对多种有 淅江大学博士学位论文第一章文献综述 机化合物的良好溶解作用，特别对聚氯乙烯和丁苯胶，使得其广泛应用于合成树脂和天然树 脂加工、聚氯乙烯管材加工、聚氯乙烯屋顶涂料、聚氯乙烯薄膜涂料、磁带涂层、p v c 表 面涂层、清洗p v c 反应器、脱除p v c 薄膜、玻璃纸涂层、塑料印刷油墨、热塑性聚氨酯涂 层等生产 b h a t te ta 1 ，1 9 8 8 ；v a i lr a v e n z w a a ye ta 1 ，2 0 0 3 ；w i t t m a n ne ta 1 ，2 0 0 8 。作为无机化 合物溶剂，t h f 应用于各种试剂、烷基碱金属化合物和芳基碱金属化合物、氢化铝和氢化 硼、甾族化合物和大分子有机聚合物等不能以水作为反应性溶剂的合成反 立 a r c h e r , 1 9 8 4 ； d o h e r t y , 2 0 0 0 ；u se n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g e n c y , 1 9 8 4 。它还用作电镀铝液，可任意控制 铝层厚度，且光亮度较好 四氢呋喃作为有机合成原料的一个重要应用是与1 , 4 丁二醇缩聚生成聚四氢呋喃醚 ( p o l y o x y t e t r a m e t h y l e n eg l y c o l ，p t m g ) ，进而缩聚生成聚四亚甲基醚二醇 ( p o l y o x y t e t r a m e t h y l e n ee t h e rg l y c o l ，p t m e g ) ，也称四氢呋喃均聚醚。世界上5 0 的p t m e g 用于生产氨纶弹性体纤维，4 0 用于合成聚氨酯弹性体，1 0 用于其它。氨纶纤维是近年来 快速发展的合成纤维，在国际上被称为第二皮肤，其弹性好，是聚对苯二甲酸丁二醇酯的3 倍，非常适合用于生产紧身衣裤、泳装、运动服、内衣裤的领口和袖口等。t h f 还可用于 生产环氧乙烷聚醚聚氨酯橡胶；也能在一定压力和温度下与一氧化碳反应生成己二酸，己二 酸合成己二胺，最终生成尼龙6 6 。此外，t h f 还可用于生产四氢噻吩、l ，4 二氯乙烷，2 ， 3 一二氯四氢呋喃、戊内酯、丫丁内酯和吡咯烷酮等化工产品 g r i t z n e re ta 1 ，1 9 8 8 ；m e a de ta 1 ， 1 9 9 5 ；t z i n ge ta 1 ，2 0 0 3 ；v a i lr a v e n z w a a ye ta 1 ，2 0 0 3 ；w o l f ee ta 1 ，2 0 0 7 。医药、农药、特殊橡 胶和溶剂等是我国t h f 主要应用方面，在医药工业中，可用于生产抗感染类药和激素类药， 用于合成咳必清、利复霉素、黄体酮、头孢噻肟钠、琥乙红霉素、头孢三嗪呐、倍他美松、 地塞米松、地塞米松磷酸钠和用作制药溶剂等。 1 3 国内外四氢呋喃的生产和消耗 作为一种重要的有机合成原料和万能溶剂，国外t h f 的开发与生产较早，2 0 0 1 年世界 t h f 产量已经达到3 0 0 万t 张希功，2 0 0 1 ，而至2 0 0 6 年底，全球阿f 生产能力已经达到了 将近6 5 0 万t ，消费量达4 8 0 万t ，而且目前正在以每年5 6 的速率增长 钱文斌，2 0 0 8 。 国内t h f 开发和生产相对较晚，生产能力较弱。1 9 9 8 年以前我国t h f 生产能力非常小， 总年产能力约5 0 0 o t ，远远不能满足国内需求。1 9 9 8 年以后，国内t h f 生产得到较快发展。 2 0 0 1 年国内t h f 产量约为5 0 0 0 0 t ，表观消费量约为1 0 万t ，所以仍需要依赖进1 2 2 0 0 5 2 淅大学博士学位论文 第一章支献综逮 年我国t h f 年产量达到大约在5 , 8 万t 左右，但是依i d 没有达到我国宴际年消费量77 万l 的水平2 0 0 6 年，我国进口量大约4 a ) 万t 左右，t h f 总消费量大约是1 0 6 万t 预测2 0 1 0 年，国内t h f 消费量将达到2 0 j 0 万t 目前国内t h f 生产能力显著提升，但其广泛的应用 前景以及快速的消赞增长趋势，可能舍促使今后t h f 进口量不断增加( 圉1 2 ，囤1 3 ) 田l 2 近年来日基呋喃曲进口量 f i 9 1 2 i m p o r t n t o f t e m s h y d r o f u m n i n ” l 一剖9 斟 l 。目l 斛 目1 3 近年束目 氢呋喃消费 f i 9 13 c 。f l m o f t m y d r o t m a n a t h i n m i y e a r s 1 4 四氢呋喃生理毒性以及生态毒理研究进展 虽然t h f 被认为是一种慨毒性有机化旨轫 和其他生物直接或问接接触到或暴露于t h f 中 泉，对其进行7 各璃生理毒理研究t 1 9 9 s l ， 但是由于t h f 的广泛使用，越来越多的人 因此美国国家毒理项目将t h f 列为考察对 t h f 毒理学研究结果表明，大鼠经口l d 5 0 为16 5 0m g k g ；注射l d 为25 0 0 m 毋g ： 吸入l c ，o 为2 10 0 0 m g u 3 h k a t a h i r ae ta l ，1 9 8 2 ，属于一种相对低毒有机溶剂但在高浓 度下，台引起共济失调和昏迷状志【c h l l a b r a da l ，1 9 9 0 ；h y g i c n i s t s ( a c g i h ) ，1 9 8 6 ；k a t a h i r a n a 1 1 9 8 2 大鼠、豚鼠竟及猫在5 0 r e g a l 浓度下弛，部分动物可侧倒，l o o m g l 下出现深 度麻醉，部分动物在暴露1 45 h 后死亡；2 0 0 m g ，l 下i h 印出现麻醉，如长时问作用，可 引起死亡在1 0 0 到5 0 0 0 m 叽之问能遣戒小鼠中枢神经系统抻制 k a l ：a h i r a ma l ，1 9 8 2 ；m a l l e y da l ，2 0 0 1 1 t h f 对气管上皮细胞具有抑制作用、对皮肤和轱膜有刺激作用【l k e o k ada l ， 1 9 8 4 动物一姨接触高剂量或反复接魁，可出现肝脂肪浸润厦细胞溶解经口染毒，可引 起胃出血和溃疡2 0 r - 潞濠直接潦于兔皮肤可引起中度皮肤刺教，5 0 水溶液可引起严重 腐蚀性损害2 0 水洛藏可引起严重角膜麦，速可能是由t h f 作为。万能溶剂”特性导致 细胞膜损伤引起 s i l i c ah 蛆，1 9 9 5 1 t i f f 接触空气时形成爆炸性过氧化袖，可增加t l f f o；i g i e 8 9 u f】；eo 浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 的刺激作用。致癌性研究则充分表明t h f 具有肝脏毒性和致肝癌活性，同时能使肾小管肿 瘤和癌症的患病率增加 1 9 9 8 ；c h h a b r ae ta 1 ，1 9 9 8 ；g a r n e re ta 1 ，2 0 0 2 t h f 易挥发，人类主要通过吸入和接触而受到其影响四氢呋喃的高蒸汽压和水溶性， 使a # i 1 暴露于t h f 中的可能性增大【( h s d b ) ，1 9 9 6 。低浓度时对皮肤和粘膜有刺激作用；高 浓度时有麻醉作用、肝脏毒性和致死作用。高浓度吸入后临床表现为可出现头晕、头痛、胸 闷、胸痛、咳嗽、乏力，口干、恶心、呕吐等症状，可伴有眼刺激症状。部分患者可发生肝 功能障碍。国外报道引起人麻醉的浓度为7 38 0 0 m g m 3 。急性中毒会导致昏迷、肌肉张力减 退和角膜反射消失，并导致昏迷和死亡【( h s d b ) ，1 9 9 6 1 。g o s s e l i n 等认为t h f 是一种非常毒 的物质，对人来说它的口服致死剂量为5 0 到5 0 0 m g k g g o s s e l i ne ta 1 ，1 9 7 6 。 目前关于t h f 的体内代谢报道相对较少。b u r k a 和b o y d 报道了t h f 母体化合物呋喃 在体内被代谢成亲电化合物，会与组织亲核物质在坏死部位发生反应 b u r k ae ta 1 ，1 9 8 5 。 t h f 毒性相对较小，但是t h f 是否会被代谢成为更加有害的物质目前还未有研究报道如 果位于氧原子边上的碳原子被羟基化，生成丫丁内酯，它会引起痉挛，同时也有研究发现丫 丁内酯会造成肾上腺髓质细胞瘤和髓质增生发生频率增加，具有一定致癌性 e l o v a a r ae ta 1 1 9 8 4 ；h e n r ye ta 1 ，2 0 0 7 最新体外研究发现t h f 会被代谢成亲电化合物与d n a 反应生成 d g u o t h f 而导致d n a 损伤和细胞病变，这可能是暴露于t h f 下造成生理毒性以及致癌性 的重要原因【h e r m i d ae ta 1 ，2 0 0 6 。 目前关于t h f 排放造成的环境毒理学研究还相对较少。体外研究证明，t h f 在1 0 t o1 0 0 m m 浓度下就会抑制多种酶活性，尤其是多种细胞色素p 4 5 0 依赖性多功能氧化酶活性，另外 由于溶剂特性还会增强其它化合物的毒性 m o o d y , 1 9 9 1 。t h f 废水排放会抑制活性污泥好 氧呼吸，导致p h 上升 吕振华e ta 1 ，2 0 0 6 。测定活性污泥中多种酶活性表明，浓度大于1 1 3 m 的t h f 可以完全抑制脱氢酶活性，对磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶活性也有强烈抑制作用 l v e ta 1 ，2 0 0 8 。脱氢酶是污泥活性的重要指标，脱氢酶活性抑制说明1 h f 对活性污泥性能具 有显著抑制作用【李今e ta 1 ，2 0 0 5 采用厌氧处理t h f 废水时，低浓度t h f 对厌氧消化产 生轻微抑制作用，当浓度达到2 0 0 m g l 时，则产生显著抑制【王怡e t a l ，2 0 0 3 。 1 5 四氢呋喃的微生物降解研究进展 近年来t h f 应用范围越来越广，用量也越来越大，随废水废气排放到环境中的量必然 越来越大，在使用区域的水体，地下水中都发现了t h f 的存在 i s a a c s o ne ta 1 ，2 0 0 6 ；m o l a r , 4 浙江大学博士学位论文第一章文献综述 2 0 0 1 由于高水溶特性、对依赖于细胞色素p 4 5 0 酶活抑制以及致癌性，t h f 排放将可能对 人类的身体健康造成影响 d r a p e re ta 1 ，1 9 9 7 ；m o o d y , 1 9 9 1 。因此对t h f 污染的治理受到了 越来越多的关注 1 5 1 四氢呋喃降解菌 虽然t h f 作为一种有机化合物，在接触热、高压以及氧化剂等情况下，容易发生剧烈 反应，但它作为饱和醚类，一般情况下，对碱、氧化剂、还原剂都很稳定，经m i d w e s tr e s e a r c h i n s t i t u t e ( k a n s a sc i t y ，m o ) 研究证明t h f 在室温下是一种稳定化合物，在2 年研究实验 中，没有发现t h f 发生降解；而且一直以来都被认为是一种难生物降解化合物 p a i n t e r e ta 1 ， 1 9 8 5 ；王怡e t a l ，2 0 0 3 ，因而难以筛选到能够降解t h f 的纯培养或者混合培养物 b a t t e r s b y e ta 1 ，1 9 8 9 。这一难题对t h f 废气废水的生物治理提出了挑战。 生物治理关键是筛选到能够降解相应有机化合物的培养物。第一个能以四氢呋喃为唯一 碳源生长的菌株直到1 9 9 1 年才由b e r h a r d t 和d i e k m a n n 分离到，为r h o d o c o c c u ss 仃a i l l2 1 9 【b e r n h a r d te ta 1 ，1 9 9 1 ，随后被鉴定为r h o d o c o c c u sr u b b e r b o c ke ta 1 ，1 9 9 6 。但是该菌株在 四氢呋喃浓度高于l o m m 时生长就会完全受到抑制。 随后从被二氧杂环己烷污染污泥中利用多种环醚和链醚作为唯一碳源分离到l 株属于 假诺卡氏菌属( p s e u d o n o c a r d i as p ) 放线菌株，命名为s t r a i n1 1 9 0 ( a t c c5 5 4 8 6 ) ，能在含 有t h f 培养基上快速生长，代时为1l h p a r a l e se ta 1 ，1 9 9 4 。 u l r i k ek o h l w e y e r 等从废水处理厂里分离到了1 株能够在有氧条件下以四氢呋喃为唯一 碳源和能源生长的菌株p s e u d o n o c a r d i as p s t r a i nk 1 【k o h l w e y e r e ta 1 ，2 0 0 0 ，随后被鉴定为一 个新种，命名为p s e u d o n o c a r d i at e t r a h y d r o f u r a n o x y d a n ss p n o v 【k a m p f e re ta 1 ，2 0 0 6 。 它在 2 0 m mt h f 、p h 7 0 、2 8 c 下的倍增时间为1 4 h ，能在7 2 h 内完全降解t h f 。该菌株对t h f 耐受浓度为6 0 m m k o h l w e y e re ta 1 ，2 0 0 0 到目前，报道能够利用t h f 为唯一碳源或者能够降解t h f 的微生物种类也相对较少， 只发现红球菌属r h o d o c o c c u ss p 和假诺卡氏菌属p s e u d o n o c a r d i as p 冲少数几个菌株以及真 菌c o r d y c e p ss i n e n s i s 能利用t h f 【b e r n h a r d te ta 1 ，1 9 9 1 ；d a y ee ta 1 ，2 0 0 3 ；k i me ta 1 ，2 0 0 8 ； k o h l w e y e re ta 1 ，2 0 0 0 ；n a k a m i y ae ta 1 ，2 0 0 5 ；p a r a l e se ta 1 ，1 9 9 4 。 5 沂大学博学位论文第一章x 献综速 1 5 2 四氧呋喃阵解逢径研究进履 四氢呋喃是一种单体化台物，结构相对简单b e m h 盯d t 和d i e k m a n n 最先用 r h o d o c o c c 懈s t r a i n2 1 9 研究7t h f 的降解途径p , h o d o c o c c 驸s t r a i n2 1 9 能够利用t h f ，但 是不能利用3 一羟基四氢呋喃( t e l r a h y d r o f u r a n - 3 - 0 1 ) ；能够利用丁内酪( b u l y r o l a e t o n e ) 且利 用速率与t h f 相同，通过氧邻位碳琢于羟基化，再连一步氧化生成环酮，环酮经b a y e r - v i l l i g e r 氧化反应生成而得到内酯，该过程常见于环碳化台袖降解过程，例如环己酮的降解 a b t i ld a l ，1 9 8 9 1 根据咀上结论，推测t h f 阵解途径如图1 4 所示。t h f 首先经氧原子部位碳厚 子的羟基化而生成2 - 羟基四氢呋喃，再经氧化而生成丁内酯，丁内醅也有可能是2 羟基四 氢呋哺自发进幸亍异构化而非辞催化形成的，丁内酯开环生成斗羟基丁酸，禾羟基丁酸进一步 被氧化成丁二酸即琥珀酸进入三羧酸循环而被微生袖利用但是囤1 , 4 所乖降解途径仍然是 一种饭谩，到目前为止，没有检测到任何中间产物，如2 羟基四氢呋喃。这可能与t h f 属 干难生物降解化合物，生物代谢速率较慢，代谢中闻物不易积累有关用同一菌种降解四氢 呋喃的结构粪似物2 , 5 二甲基四氢呋喃曲实验结果也支持所推捌的上述降解逢径【b o c kc ta l 。 1 9 9 6 t h j e m e r 等研究7p s e u d o n o c a r d i as ps t r a i t l k i 的t h f 降解途径，也未能拴利到相关 代谢中间物 1 1 f i e m e r da l ，2 0 0 3 琵喾羚 ，h 了k ：帅d 州帅腑 o “，、一 f w ，、c 熙 一。睇，、o 口 田l 日氢呋喃降解代谢速径【惭* n m ，2 0 0 3 】 f l4 m m b o l i 皿p a t h w a yo f t h f 蛐# 卟h h i 州e l ，2 0 0 3 1 5 3 四氢呋喃降解途径中唪的研究进展 根据四氢呋喃在徽生物中的代谢途径，降解第一步是醚键断裂，而醚键具有较高键能 浙江大学博士学位论文第一章文献综述 ( 3 6 0k jm o l - 1 ) t h i e m e re ta 1 ，2 0 0 3 ，因此是t h f 降解的关键步骤。催化该反应的酶为一单 加氧酶。单加氧酶是氧化酶中的一类大家族，在药物代谢、环境污染物降解中有着重要作用。 单加氧酶在催化氧活化和氧原子转移中有着巨大的差异目前研究比较深入的是依赖p 4 5 0 单加氧酶和甲烷单加氧酶【b a a d e re ta 1 ，2 0 0 8 ；v a t s y a y a ne ta 1 ，2 0 0 8 。另一类常见的单加氧酶 是黄素依赖型单加氧酶。 由于未能检测到t h f 降解代谢中间物，也未能测定t h f 降解单加氧酶的离体活性 【k o h l w e y e re ta 1 ，2 0 0 0 ，因此为该单加氧酶的分离造成了困难。但b a r b a r at h i e m e r 等人研 究发现n f 降解过程中，在p s e u d o n o c a r d i as p s t r a i nk 1 细胞提取物中可以特异性检测到 n a d h 细胞色素c 还原酶活性，通过对该还原酶的纯化，其分子量为4 0 k d a 。光谱研究发 现它含1 个铁硫簇和1 个黄素辅酶，黄素辅酶与该蛋白以共价键结合。氨基酸序列n 末端 与各种氧化酶的还原酶组分有极大相似性克隆该酶基因t h m d 发现，该基因编码1 个3 6 0 个氨基酸的蛋白，与多个含有双铁核多组分单加氧酶n a d p 受体还原酶有3 8 的相似性， 存在1 个n 末端叶绿体类型的二铁二硫铁氧化还原蛋白配位基序，1 个中心黄素异咯嗪环结 合基序和1 个碳末端n a d h 核糖结合基序 t h i e m e rc ta 1 ，2 0 0 1 多组分单加氧酶通常含有 n a d ( p ) h 受体还原酶、1 个小的调节蛋白和单加氧酶，由2 个或者3 个不同的亚基组成 根据序列比对以及n a d h 细胞色素c 还原酶在t h f 培养基中的特异性表达活性，猜测该还 原酶为一多组分单加氧酶的组分，并以该酶n 末端序列设计特异性引物筛选相应基因文库， 得到了编码该多组分单加氧酶全基因序列 p s e u d o n o c a r d i as p s 妇i l lk 1 中t h f 降解多组分单加氧酶由4 个亚基组成( 图1 5 ) ，分 别由t h m a 、t h m d 、t h m b 、t h m c 4 个基因编码，其中t h m a 编码t h f 降解多组分单加氧酶氧 化酶亚基，t h m b 编码氧化酶b 亚基，t h m c 编码一个连接蛋白，t h m d 编码最初分离的 n a d h 细胞色素c 还原酶，4 个亚基都位于质粒同一个基因簇上，且方向相同( 囹1 5 ) 所有的t h m 基因均以a t g 开始，在它前面有1 个核糖体结合位点。在t h m a 和t h m d 之间有 1 个功能未知的小阅读框，这一开放阅读框没有核糖体结合位点，并且与现已知蛋白序列不 具有相似性。t h m c 起始密码子和t h m b 终止密码子重叠，这种现象在编码功能非常相近蛋白 基因序列中也存在，例如分解代谢酶的不同亚基 n o r m a r ke ta 1 ，1 9 8 3 。1 h f 降解多组分单 加氧酶组成与来至r h o d o c o c c u s r h o d o c h r o u s 的烯烃单加氧酶相同，但是它们基因的排列顺 序不同【s a e k ie ta 1 ，1 9 9 4 根据对t h f 降解单加氧酶基因核酸序列分析，其碱基组成、g c 含量与p s e u d o n o c a r d i a s p k 1 基因组之间存在较大差异，因此作者认为该单加氧酶可能是通过横向转移由其它菌株 7 淅4 学博学位论文 第一章史献缘连 获得 t n i e m 盯e t a l ，2 0 0 3 l 。芏。盏。置。z 。置。一芏。z 。芏。芏。， “m mm - ，cmm “ 芒- 亡型盈卜二“兰刍d 尚_ ! 三卜 ， ， 田1 5 p s e u d o n o e a r d i a s 吲n k i 中口氢呋喃阵解簿基因结构l n 删a l ，2 0 0 3 1 f 培i5 0 瞄es t r o e t u o f t h f 女g r a d m g 翱斟m p s e a d o n o 曲n i as ps t r a i n k l 【n i 钿目da 1 2 0 0 3 】 对t h f 阵解单加氧辞氟基酸序列分析发现，t h f 降解多组分单加氧酶与来自 r h o d o c o c c u s 咖如曲，0 甜 3 2 7 6 烯烃单加氧酶的相似性较高 m i n m ha l ，1 9 9 5 1 此外这些多 肽与其它单加氯酶也具有较大相似性如来自p s e u d o m o n a ss pc f 6 0 0 的苯酚水解酶 n o r d l u n de ta 1 ，1 9 9 0 1 和来自m e t h y l o c o c c u sc a p s u l a t u s 的可滓性甲烷单加氧簿 s t a i n t h o r p ee t d ，1 9 9 0 1 特别的，t h m a 亚基与这些单加氧酶的加氧酶m 亚基具有较高相似性t h m a 中 存在4 十高度保守的备氟酸残基( g l u - 1 1 4 ，g l u - 1 4 4 ，g l u 2 0 9 ，g l u 2 3 ) 和2 个组氪酸 残基( h i v l 4 7 ，h i s - 2 a 6 ) x 一射线晶体衍射分析来自m c c a p m d a t u s 和胁舳m 埘 t r i c h o s p o r i u m o b 3 b 可溶性甲烷单如氧薛的加氧酶组分表明这些保守残基为活性部位双棱铁 中，奇( b i n 眦l e a r - i r o ne e a t e f ) 配位体 r o s e n z w e l ge t a l ，1 9 9 3 1 w e s t e r h e i d e na l ，2 0 0 0 ，因此 t h f 水解可能由 i l l m a 双棱铁中心部位催化在甲烷单加氧酶中还发现双棱铁中心位于1 个由临近残基侧链形成的疏水区 r o s e n z w e i ge ta 1 1 9 9 7 ，在t h m a 中有4 个这样的疏水 残基是保守的。而另外4 个被其他琉水氟基酸替代t h r o b 表达产物的相似性相对轻低，与 以上3 种单加氧酶的加氧酶争亚基只有2 6 2 8 相似性。而由t h m c 推导所得多肤与鼓据库 数据相比鹱发现仅仅与来自rr h o d o c h r o u s 烯烃单加氧酶的a m o b 蛋白存在相似性( 2 1 ) f s a e k ie ta l ，1 9 9 4 在t h f 降解多组分单加氧酶基因簇上下游中，存在2 个醛脱氢酶编码基因s a d 和a l d h o s a d 编码琥珀酸半醛脱氢酶 s a c c i n a t es e m i a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ) ，推测催化t h f 降解途 径中琥珀酸半醛脱氢生成琥珀酸的反应；a l d h 编码4 羟基丁醛脱氢酶，推女 催化禾羟基丁 醛脱氢生成牟羟基丁殴s a d 与束自p s “d o m o n a s p u t i d af 1 催化帖茗油氧化醛脱氢酶( c u m i c a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ) ( 4 8 i d e n f i 哼) i v a t o n ，1 9 9 7 】和来自胁d 删。脚f l u o r e s e n $ s t 苯乙 醛脱氢酶( 4 7 ) 相诎性较高b d 啪e d a l ，1 9 9 7 a i d h 与来自s m e p t m y c e sc o e l i c o l o r 的 一醛脱氢酶具有最大的相似性( 5 9 ) p s e u d o n o c a r d i as ps t r a i nk i 四氢呋喃降解单加氧酶基因簇中还发现，在t h m c 和a l d h 浙江大学博士学位论文第一章文献综述 中间存在2 个开放阅读框o c t v 和o r f z ，这2 个基因编码的相关蛋白功能还未知，根据序列 比对o r y v 编码蛋白与来自r h o d o c o c c u ss p s t r a i nn 1 8 6 2 1 的一种蛋白具有3 0 相似性 n a g y e ta 1 ，1 9 9 5 。由o r f z 编码蛋白与位于m e t h a n o t h e r m o b a c t e rt h e r m o a u t o t r o p h i c u m 和e c o l i 中 跨膜蛋白类似，二级结构分析发现该蛋白中存在6 个跨膜螺旋结构，因此o r f z 编码蛋白可 能是一内膜蛋白 虽然目前已经克隆了p s e u d o n o c a r d i as p s 仃a i l lk 1 中t h f 降解途径中关键酶以及2 个醛 脱氢酶，但是催化中间代谢物丁内酯开环生成4 羟基丁酸以及4 羟基丁酸脱氢生成4 - 羟基 丁醛的酶还未见报道。而在类似降解途径中，如环戊酮和环己酮代谢途径中，环内酯开环一 般由内酯水解酶催化 d o n o g h u e e ta 1 ，1 9 7 5 ；g r i f f i ne ta 1 ，1 9 7 2 ，而且内酯水解酶与催化环戊 酮和环己酮加氧的单加氧酶位于同一基因簇上 c h e n ge ta 1 ，2 0 0 0 ；1 w a k ie ta 1 ，2 0 0 2 ，因此催 化t h f 降解途径中丁内酯开环的可能为位于同一基因簇的一内酯水解酶。另外，目前文献 只报道p s e u d o n o c a r d i as p s t r a i n k l 中t h f 降解单加氧酶的相关序列，而未见最初分离的t h f 降解菌r h o d o c o c c u sr u b b e r 以及其它菌株中单加氧酶的相关报道，因此对于t h f 降解单加 氧酶多样性以及进化关系还有待进一步研究 第二节分子生物学技术在未知功能基因克隆中的应用 2 1 简并p c r 在未知功能基因克隆中的应用 微生物代谢特异化合物由特定功能基因编码的酶催化，了解编码功能基因，是进行该基 因克隆以及深入研究其催化机理和开发利用的前提，但这些功能基因往往是未知的对于未 知基因克隆，目前已发展了多种方法，较为成熟的主要可分成以下几种：1 ) 基因组测序 m c l e o de ta 1 ，2 0 0 6 ；p r u s te ta 1 ，2 0 0 5 ；s c h n e i k e re ta 1 ，2 0 0 7 通过基因组测序和序列生物信 息学分析，可以了解核酸序列组成，并发现新基因。但对大多数实验室和科研工作者来说这 是一项繁重和花费巨大的工作。因此其在应用上受到了限制。2 ) 基于m r n a 表达和基因组 差异的分子生物学方法。比如m r n a 差异显示、差异杂交、抑制消减杂交 l i a n ge ta 1 ，1 9 9 2 ； r e b r i k o v e ta 1 ，2 0 0 4 1 。这些方法需要提取m r n a 、进行反转录和杂交，需要花费较多时间， 而且由于m r n a 易降解和低表达量，操作中需要更加小心和注意。3 ) 同源未知基因的p c r 克隆。这是被广泛应用于同源未知基因克隆的手段。它从相关氨基酸或者核酸序列保守域设 计简并或者一致性引物用于扩增未知序列由于基于p c r 的策略无需额外d n a 或者r n a 9 浙江大学博士学位论文第一章文献综述 操作，对模板要求相对较低，而且核酸和蛋白数据库中序列信息的急速增加，使得相关引物 设计和实验操作变得较为方便，因此该方法在不同生物分类领域内得到了广泛应用。 一般简并引物在扩增亲缘关系较近物种间同源基因获得了较大成功，但是这一策略在分 离亲缘关系较远的序列，尤其进化和突变等原因使得保守残基较少情况下，往往不能成功。 但t i m o t h y 等发展了一种新简并引物设计策略，称之为c o n s e n s u s d e g e n e r a t eh y b r i d o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r ( c o d e h o p ) p c r ，则极大提高了简并引物扩增效率，可用于亲缘关系 较远的同源基因克隆 r o s e e ta 1 ，2 0 0 3 ；r o s ee ta 1 ，1 9 9 8 同所有简并引物设计一样，c o d e h o pp c r 引物设计也需要根据保守氨基酸残基。将 具有同源性蛋白序列进行多序列比对，具有高度保守的短区域被看作无空缺块，如图1 6 所 h e n i k o f f e ta 1 ，2 0 0 0 。c o d e h o pp c r 引物就是从这些保守序列块中设计出来被用于扩增 它们之间的这段区域0 a t t p ：b l o c k s f l a c r c o r g c o d e h o p h t m l ) 。c o d e h o pp c r 引物由两部分组 成：较短3 简并核心区域区和5 一致夹板区( 图1 6 ) 3 简并核心区域由1 1 1 2 个碱基组成， 根据经多序列比对后较短但具有3 - 4 个高度保守氨基酸残基的区块( b l o c k ，如“p c q g ”) 设计，每个引物3 区为一种可能的密码子集合，编码对应目标蛋白序列3 _ 4 个保守氨基酸残 基( 如包含所有可能的编码“p c q g ”的核酸序列) ( 图1 6 ) 相对于一般简并引物，较短 的3 简并序列减少了引物简并度，使得简并引物中有效引物浓度大大增加。每个引物都具 有一个相同的5 一致夹子区域( c o n s e n s u sc l a m pr e g i o n ) ，是根据密码子偏向性设计的一致性 序列，它最大程度地预测了3 简并区侧翼保守氨基酸编码序列( 如图1 6 中“y m v c g g p ” 氨基酸序列) 。5 夹板结构长度取决于所需退火温度，长度一般为2 0 3 0 个碱基。这样设计 既减少了引物简并度，又提高了引物退火温度，保障了p c r 产物特异性。此外，扩增从3 简并核心与目