（农药学专业论文）碘化酪蛋白甲状腺活性物质的LCMS鉴别与测定.pdf

中国农业大学硕士学位论文 中文摘要 摘要 本论文采用液质联用( l c - m s ) 技术，研究开发了碘化酪蛋白甲状腺活性物质的定量和确证 方法，该方法也可用于鉴别和间接测定碘化酪蛋白。首先，用氢氧化钡溶液对碘化酪蛋白进行水 解，用l c m s 对水解产物中的各种碘化氨基酸进行分离和确证。实验发现碘化酪蛋白水解产物中 的碘化氨基酸主要包括：一碘酪氨酸，二碘酪氨酸，二碘甲腺原氨酸，三碘甲腺原氨酸，反式三 碘甲腺原氪酸和四碘甲腺原氨酸( 又称甲状腺素，l ) 。根据所得质谱图，发现各种碘化氨基酸在 电喷雾电离源中特征离子的形成规律是捕获一个质子、溶剂加合、脱羧、脱氨和脱氨脱碘。并可 通过m z 6 0 6 与m z 6 5 2 的丰度比来区分三碘甲腺原氨酸的两种异构体。进而确定四碘甲腺原氨酸 作为碘化酪蛋白甲状腺活性标识化台物。然后，在定性鉴别研究的基础上，对碘化酪蛋白的水解 方法和水解条件进行了优化。实验发现，氢氧化钡是最佳水解剂。当氢氧化钡浓度为1 8 ( m m ) ， 温度在1 1 0 条件下，水解8 1 5 h ，四碘甲腺原氨酸得率最高。最后建立了以四碘甲腺原氨酸 为标识化合物的碘化酪蛋白甲状腺活性物质l c m s 定量方法，并对方法性能进行了考察。实验发 现，用该方法测得的碘化酪蛋白中“标识化合物”的含量为1 0 - t - 0 0 5 。以碘化酪蛋白计算的 方法线性范围为1 l o o m g 。测定限为l m g ，相对标准偏差小于1 0 ，回收率为9 0 1 1 0 ，并用 四种商品碘化酪蛋白对方法的可靠性进行了验证。 关键词：l c m s ，碘化酪蛋白，碘化氨基酸标识化合物，甲状腺索 中国农业大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t i nt h i st h e s i san e wm e t h o df o ri d e n t i f i c a t i o n sa n dd e t e r m i n a t i o nt h e i n d i c a t i n gc o m p o u n do f t h y r o a c t i v em a t e r i a l sf r o mi o d i n a t e dc a s e i nb yl c - m sw a sd e v e l o p e d f i r s t l y , u s i n gl c - m s ，t h e i o d o - a m i n oa c i d sf r o mi o d i n a t e dc a s e i na f t e rh y d r o l y s i s b yb a r i u mh y d r o x i d ew e r es e p a r a t e da n d i d e n t i f i e d t h ei o d o - a m i n oa c i d sf o u n di nt h eh y d r o l y s a t eo fi o d i n a t e dc a s e i nw e r e3 - i o d o - t y r o s i n e ( m i t ) ，3 , 5 d i i o d o - t y r o s i n e ( d i t ) ，3 , 5 - d i i o d o t h y r o n i n e ( t 2 ) ，3 , 3 5 一t r i i o d o - t h y r o n i n ef r 3 ) ，3 , 3 ， 5 - t r i i o d o - t h y r o n i n e ( r t 3 ) a n d3 , 3 ，5 , 5 - t e t r a i o d o - t h y r o n i n ef r 4 ) f r o mt h em a s ss p e c t r u m so fe a c h i o d o a m i n oa c i d ，t h ef o r m a t i v er u l e so fc h a r a c t e r i s t i ci o n so f e a c hi o d o a m i n oa c i d si ns o u r c eo fe s i + w a sd e d u c e d ，t h a ti s ，a d d i n gp r o t o n , a d d i n gs o l v e n t , d e c a r b o x y l a t i o n ，d e a m i n a t i o na n dd e a m i n a t i o nw i t h d e i o d i n a t i o ns i m u l t a n e o u s l y , a n db yc o m p a r i n gt h ea b u n d a n c eo fm z 6 0 6a n dm z 6 5 2 ，t h et w oi s o m e r s o ft r i i o d o - t h y r o n i n ec a nb ed i s c r i m i n a t e d t h e n ，3 , 3 ，5 , 5 - t e t r a i o d o - t h y r o n i n ew a ss e l e c t e da st h e i n d i c a t i n gc o m p o u n do ft h et h y r o a c t i v em a t e r i a l sf r o mi o d i n a t e dc a s e i n s e c o n d l y , t h em e t h o da n d c o n d i t i o no fh y d r o l y s i so fi o d i n a t e dc a s e i nw e r eo p t i m i z e d i tw a sf o u n dt h a tt h eb a r i u mh y d r o x i d ei s t h eb e s th y d r o l y s i sr e g e n tf o ri o d i n a t e dc a s e i n ，a n dw h i l et h ec o n c e n t r a t i o no f b a r i u mh y d m x i d ei s1 8 p e rc e n t ( m m ) ，a n dh y d r o l y s i s t i m ei s8t o1 5h o u r sa tl i o q ，t h eh i g h e s ty i e l do fi n d i c a t i n g c o m p o u n d so ft h y r o a c t i v em a t e r i a l sf r o mi o d i n a t e dc a s e i nw a so b t a i n e d a tl a s t , o na b o v eb a s i s ，t h e q u a n t i t a t i v em e t h o do f i n d i c a t i n gc o m p o u n d s ”w a sf o u n d e d u s i n g t h i sm e t h o d ，t h ea n a l y t i c a lr e s u l to f t h y r o x i n ef r o mi o d i n a t e dc a s e i ni s 1 0 0 0 5 al i n e a rr a n g eo f1 1 0 0m g r e c o v e r yf r o m9 0t o 11 0p e rc e n t ，r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nb e l l o w i n g1 0 a n dd e t e c t i o nl i m i to fl m g w e r ef o u n db y c a l c u l a t i n gw i t hi o d i n a t e dc a s e i n f o u rp r o d u c t so fi o d i n a t e dc a s e i nw e r ed e t e r m i n e db yt h i sm e t h o d w h i c h p r o v e t h em e t h o di sr e l i a b i l i t y i l k e yw o r d s ：l c m s ，l o d i n a t e dc a s e i n ，l o d e - a m i n oa c i d s ，i n d i c a t i n gc o m p o u n d ，t h y r o x i n e 中国农业大学硕士学位论文独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：年月 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 时间：年月 日 时间：年月日 中国农业大学硕士学位论文 主要符号表 缩写英文名称 l c m s e s i s i r p a d t l c g c 缩写词表( a b b r e v i a t i o n s ) l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - - m a s ss p e c t r o m e t r y e l e c t r os p r a yi o n i z a t i o n s e l e c ti o n r e c o d i n g p h o t o d i o d e a r r a y d e t e c t o r t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y g a s c h r o m a t o g r a p h y 中文名称 液相色谱一质谱联用 电喷雾电离 选择离子方式采集数据 二极管阵列检测器 薄层色谱法 气相色谱法 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 液相色谱法 c e i d m a s v r i a e l i s a f d a e m e a m i t d n t ， c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 毛细管电泳 i s o t o p ed i l u t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y 同位紊稀释质谱法 a n o d i c s t r i p p i n gv o l t a m m e t r y 阳极溶出伏安法 r a d i o i m m u n o a s s a y 放射免疫测定 e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附测定，酶联免疫 f o o da n d d r u g a d m i n i s t r a t i o n美国“食品药品管理局” t h ee u r o p e a na g e n c yf o rt h ee v a l u a t i o no f 欧洲药产品评价局 m e d i c a lp r o d u c t s 3 - i o d o - t y r o s i n e 一碘酪氨酸 3 , 5 一d i i o d o - t y r o s i n e 3 ，5 - d i i o d o - t h y r o n i n e 二碘酪氮酸 二碘甲腺原氨酸 v i i 中国农业大学硕士学位论文 主要符号衰 3 , 3 5 - t r i i o d o - t h y r o n i n e 三碘甲腺原氨酸 r t 33 , 3 5 - t r i i o d o t h y r o n i n e 三碘甲腺原氨酸 3 ，3 ，5 ，5 t e t r a i o d o - t h y r o n i n e ( t h y r o x i n e ) 四碘甲腺原氨酸( 甲状腺素) 第一章绪论 l 研究的目的和意义 碘化酪蛋白( t h y r o a c t i v ei o d i n a t e dc a s e i n ，i o d o p r o t e i n 或t h y r o p r o t e i n ) 是一种具 有类似甲状腺活性的蛋白，动物摄入后能起到补充甲状腺素的作用。r e i n e k e 和t u r n e r ( 1 9 4 2 ) 首先报道这种具有甲状腺活性的碘化酪蛋白合成方法，随后被广泛应用于医药和动物生产中。作 为医用碘化酪蛋白由于具有甲状腺毒性，美国f d a 已于1 9 8 4 年撤销其所有制荆的生产和销售 ( 联邦撤销登记号：2 9 f r l 4 6 7 6 ) 。但作为饲料添加剂却一直在长期使用，我国学者邹晓庭等( 1 9 9 8 ) 王德刚等( 1 9 9 8 ) ，杨晓建等( 2 0 0 1 ) ，马玉龙等( 2 0 0 1 ) 和孙延明( 2 0 0 2 ) 的研究都表明碘化酪 蛋白作为饲料添加剂具有促进动物生长、提高增重和饲料报酬、改善胴体质量、提高猪和奶牛的 泌乳量、降低仔猪死亡率、提高家禽产蛋率和改进羽毛质量等多方面的积极作用。另外对于水产 动物，如鳟鱼等也有很好的促生长效果。 然而，在长期的使用过程中人们也注意到，添加使用碘化酪蛋白对动物生产有很多弊病。 如碘化酪蛋白除了促进糖、脂肪和蛋白质的代谢外，还影响动物体内很多酶的浓度和活性，以及 其他激素的分泌和降解速率，易绘动物健康带来一些不好预测的负面影响。此外，碘化酪蛋白还 影响胎儿和幼儿骨骼的发育和生长，增加氧耗和激活许多组织中腺昔三磷酸酶增加产热量，因 此使动物更易产生热应激等。 目前作为饲料添加剂用碘化酪蛋白，不同的国家采取了不同的做法。美国、加拿大以及东 南亚一些国家包括台湾均仍在使用：美国主要允许用于奶牛和鸭；加拿大用于哺乳母猪；东南亚 则来加太多限制，在家禽、猪和水产中仍均能使用。我国农业部、卫生部、国家药品监督管理局 于2 0 0 2 发令禁止在饲料和动物饮水中使用( 农业部、卫生部、国家药品监督管理局公告1 7 6 号) ， 但生产厂家的出口贸易仍在进行。目前国内尚无可靠的碘化酪蛋白鉴别与测定方法。 因此，不管是从国家禁用的角度还是从对外出口产品的质量控制角度，碘化酪蛋白甲状腺活 性物质的鉴别和测定都有着十分重要的意义。 2 国内外研究现状 2 1 碘化酪蛋白的合成及性状 自r e i n e k e 和t u r n e r ( 1 9 4 2 ) 合成具有甲状腺活性的碘化酪蛋白之后，出现了很多关于碘化 酪蛋白的专利。我国学者张静波和姚惠萍等( 1 9 9 4 ) 也申请了碘化酪蛋白的专利合成方法。碘化 酪蛋白的合成是以酪蛋白和碘为原料在碱性环境和过氧化氢存在的条件下，通过控制一定的温 度使碘与酪蛋白中的酪氨酸残基的芳环发生亲电取代反应而生成。 工业合成的碘化酪蛋白是一种橘黄色至棕黄色。无味或微有焦糖香味的固体粉沫。不溶于水， 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 但可溶于碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠等碱性溶液，但随着p h 值的降低( p h 4 左右时) 会从溶 液中沉淀析出。 2 2 碘化酪蛋白中活性物质及其作用机理 有关碘化酪蛋白的活性物质r e i n e k e 和t u r n e r ( 1 9 4 2 。1 9 4 3 ，1 9 4 5 ，1 9 5 4 ) 做了大量的研究。 首先从碘化酪蛋白中分离出d l 一甲状腺素l 和l 一甲状腺素t t ，进而使用大鼠和蝌蚪作为实验动物 研究发现碘化酪蛋白活性与其甲状腺素含量正相关，并进一步证明l 一甲状腺素是碘化酪蛋白的主 要活性物质。而后m i s c h l e r 和r e i n e k e ( 1 9 7 0 ) 使用二维薄层色谱法( t w od i m e n s i o n a lt l c ) 又从碘化酪蛋白中分离出具有高甲状腺活性的甲状腺索l ，进一步证明甲状腺素是碘化酪蛋白的 活性物质。 一般认为碘化酪蛋白主要是通过甲状腺素发挥其药理生理作用，但甲状腺素并不以游离的方 式或氨基酸残基的方式存在，而是以某种前体的方式交联于酪蛋白分子当中，如图1 ，是g e o r g e 。 和r i c h a r d ( 1 9 7 0 ) 在其专利中介绍一种前体结构。碘化酪蛋白进入动物或人的消化道，经水解 释放甲状腺素被吸收后发挥其生理作用。甲状腺分泌的甲状腺素有两种，即3 , 3 ，5 一三碘甲腺原 氮酸( t 3 ) 和3 ，3 ，5 ，5 ，四碘甲腺原氨酸( n ) ，其中t a 的活性大约是t 的5 倍。但含量较低，通 常所说的甲状腺激素是指t 。3 一一碘酪氨酸( m i t ) 和3 ，5 - - - - - 碘酪氨酸( d i t ) 是甲状腺激素 体内合成的前体物质。甲状腺激素的主要生理作用有以下三个方面；一是促进脂肪、糖和蛋白质 代谢；二是增强毛细血管通透性，使肾的排泄功能增强；三是促进幼畜的生长发育。 圈1 碘化酪蛋白中一种推测的甲状腺素前体 f i g 1 a p o s t u l a t e dp r e c u r s o r o f t h y r o x i n e i n i o d i n a t e d c a s e i n 2 3 碘化酪蛋白的水解方法 碘化氨基酸是碘化酪蛋白的特征水解产物，不稳定，在水解过程中容易脱碘而部分或完全损 失。文献报道的碘化酪蛋白的水解方法，碱法使用氢氧化钡酸法使用硫酸一正丁醇。r e i n e k e 和t u r n e r ( 1 9 4 3 1 9 4 5 ) 的研究表明氢氧化钡和正丁醇( 用硫酸水解时) 对甲状腺素有保护作用， 且r e i n e k e ( 1 9 5 4 ) 的同位素稀释技术证明在使用4 0 的氢氧化钡水解碘化酪蛋白的过程中甲状腺 不与溶液中的碘发生碘交换反应。c h a n g ( 1 9 7 0 ) 发现使用6 m o l l 的盐酸水解碘化酪蛋白时加 入5 的巯基乙酸也能起到保护甲状腺紊的作用。而c a m e 等( 1 9 8 6 ) 的研究显示6 m o l l 的盐酸 2 l l l l 可使一碘酪氨酸( m i t ) 和二碘酪氨酸( d i t ) 完全脱碘，加入苯酚等保护剂效果也不明显：但使 用高浓度的氢氧化钠对m i t 和d i t 没有明显的脱碘作用。 2 4 文献中报道的碘化酪蛋白中甲状腺素含量及其测定方法 在具有甲状腺活性的碘化酪蛋白人工合成之后碘化酪蛋白中甲状腺素含量测定曾引起人们 广泛的兴趣。通过测定碘的间接测定甲状腺素。生物测定，薄层色谱( t l c ) 和气相色谱法( g c ) 等曾依次用来测定碘化酪蛋白中甲状腺素含量。 r e i n e k e 和t u r n e r ( 1 9 4 5 ) 分别使用测碘的方法和用大鼠与蝌蚪作为实验动物生物测定的办 法测定了碘化酪蛋白甲状腺素的含量。 p e t e r s o n 等( 1 9 6 5 ) 报道了使用t l c 鉴别含有碘化酪蛋白的饲料添加剂中的甲状腺素， m i s c h l e r 和r e i n e k e ( 1 9 7 0 ) 使用纤维薄层板，甲酸一水( 3 + 5 ) 和正丁醇一氨水( 2 m o l l ) 一 氯仿( 3 7 + 7 + 6 ) 为展开剂，测定了碘化酪蛋白的甲状腺素t 。和t 的含量。 c h a n g ( 1 9 7 4 ) 使用b s t f a 作衍生剂。g c 法测定了碘化酪蛋白的n 含量。 各种测定方法的测定结果见表i 可以看出不同的测定方法，结果差异很大，其中产品变异 的原因也有测定方法误差影响。目前国际公认的碘化酪蛋白中结合态甲状腺素含量为1 ( 如 e m e a 报告的数据) 。 表1 文献中不同方法测得的碘化酪蛋白甲状腺紊含量 f i g 1 a n l y r i c a lr e s u l t s o f t h y r o x i n e i n i o d i n a t c dc a s e i nb y d i f 话旭n t m e t h o d f r o m l i m r a t u m s 文献来源使用方法t 测得量 r e s o u r c e 8g e t h o do fa s s a yf o u n d r a n e i k ee pe ta l ( 1 9 4 5 、 b i o s a y 2 8 5 0 r e n e i k eere ta lf 1 9 4 5 )c m +3 4 r e n e i k ee ec ta t ( 1 9 5 4 1 i s o t o p ed i l u t i o nt e c h n i q u e 1 0 4 m i s c h l e rtw e ta l ( 1 9 7 0 ) t c l 0 7 9 ；o6 1 ( t 3 ) c h a n gs y ( 1 9 7 3 ) b “o h h g c h c l - g c 03 0 0 2 8 c ，m ：通过攫淀磺间接测定甲状腺索的经典方法t h e c l a s s i c a l a n a l y s i s m e t h o d o f t h y r o x i n e b y d e t e r m i n i n g i o d i o o 2 5 甲状腺素的检测方法概述 如上文所述，早期使用的通过测定碘的间接方法和生物测定法测定见状腺素如今已经很少见 到，但薄层色谱法和气相色谱法测定甲状腺索等碘化氨基酸却沿用至今。且随着现代仪器分析技 术的发展而得到了较大发展。f a i r c l o t h ( 1 9 6 5 ) 等报道了使用t l c 分离碘化氨基酸的方法对一 碘酪氨酸( m i t ) ，二碘酪氨酸( d i t ) ，二碘甲腺原氮酸( t ：) 。三碘甲腺原氨酸( t 3 ) 和甲状腺素 t 。进行了分离。a b o u l e n e i n 和s e r i g n e s e ( 1 9 9 4 ) 使用配提交换手性t l c 分离了l t 4 和d - t 4 a 自k l e b e 等( 1 9 6 6 ) 介绍了b s a ( n ，n 双三甲硅烷基乙酰氨) 和s t a l l i n g 等( 1 9 6 8 ) 介绍了b s t f a 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 ( n ，n 双三甲硅烷基三氟乙酰氨) 作为氨基酸的衍生剂之后，衍生气相色谱法在碘化氨基酸等分 离测定上得到了普遍应用。如n i h e l 等( 1 9 7 1 ) 使用气相色谱法测定了人血清中的t ，和t d 。 2 0 世纪中叶之后，伴随着仪器分析技术的迅速发展和生理学、医学和有关甲状腺蛋白的研究 逐步深入，以及临床诊断的需要，高效液相色谱( h p l c ，如d o o ml 等( 1 9 9 1 ) 对甲状腺的毒 物生理的研究) ，毛细管电泳( c e ，如s e h m a l z i n gd 等( 1 9 9 7 ) 对血清甲状腺素的测定) ，同位 素稀释质谱( i d m ，如m 6 1 1 e r 等( 1 9 8 3 ) 的甲状腺素测定方法的研究) 以及阳极溶出伏安法( a s v ， 如h e r n a n d e z 等( 1 9 9 4 ) 对尿中甲状腺素的测定) 等在分析甲状腺素等碘化氨基酸，及其取代物 等两性化合物上都得到了广泛的应用。 放射免疫法( r i a ) 和酶联免疫( e l i s a ) 是临床上测定甲状腺激素的较常用的方法( g b t 1 5 4 7 7 ，1 9 9 5 ) ，具有较高的灵敏度，但其主要适用于测定体液，如血清等样品。 使用l c - m s 分离鉴定碘化酪蛋白中的碘化氨基酸还未见报道。 2 6 甲状腺素的净化与富集方法 2 6 i 溶剂萃取 b l a u ( 1 9 3 5 ) 研究了甲状腺素的萃取方法，发现正丁醇是萃取甲状腺素的非常有效的试剂 并且在酸性条件下更有利于甲状腺素的萃取。当用等体积的正丁醇萃取用硫酸酸化的甲状腺蛋白 水解液时，甲状腺素在丁醇和水解液中的比率可达9 9 4 ：0 6 。r e i n e k e 等( 1 9 4 5 ) 从碘化酪蛋白 水解液中分离活性物甲状腺素时，也是使用的正丁醇作液液萃取。h a y 等( 1 9 8 1 ) 和b i a n e h ir ( 1 9 8 4 ) 分别用乙酸乙酯和乙酸乙酯+ 正丁醇( 争 1 ) 萃取血液中的t 4 ，回收率分别为8 5 9 5 和9 7 6 9 8 0 。 2 6 2 柱层析和固相萃取 b r a a s c h 等( 1 9 5 4 ) 使用硅藻土层析柱对甲状腺组织中的t 4 ，t 3 进行了净化，达到了满意效 果，回收率分别为9 5 和9 8 。g a l t o n 和p i t t - r i v e r s ( 1 9 5 9 ) 报道了使用d o w e x - 1 阴离子交换 树脂富集净化生物类样品，通过控制洗脱液的不同p h 值，可将各种碘化物定量洗脱a 固相萃取 是色谱技术在样品制备上的延伸，文献中报道的使用周相萃取方法净化富集甲状腺素使用的小柱 有c 1 8 ( l o v e l l 等( 1 9 9 0 ) ) ，d i o l ( s a r n a n i d o u 等( 2 0 0 0 ) ) 和硅胶( h a y 等( 1 9 8 1 ) ) 等填料。 2 7 开发碘化酪蛋白活性成分的l c - m s 鉴别与测定方法的可行性 鉴于甲状腺索的测定方法虽有多种，但大多缺少相应的确证方法，或确证方法繁琐，不适用于 碘化酪蛋白活一陛物质的鉴别与测定，特别是添加微量碘化酪蛋白的饲料样本。 2 0 世纪9 0 年代，液质联用技术( l c - m s ) 成熟起来( 电喷雾电离技术获2 0 0 2 年诺贝尔化学 奖) 并得到了广泛的应用，l c - m s 具有灵敏度高，选择性强，分离、定量和确证一次完成等特点。 选择离子方式具有抗干扰能力强，不需要待测物与其它干扰物完全分离就可准确定量，且灵敏度 4 中国农业大学硕士学位论文 第章绪论 较一般紫外检测器高2 3 个数量级。这些特点非常有利于碘化酪蛋白的活性物测定与鉴别。 如前文所述，碘化酪蛋白的特征水解产物是活性成分甲状腺素等碘化氨基酸，有利于e s i + 源质谱的检测。饲料中碘化酪蛋白的使用量一般在5 0 2 0 0 m g k g ，相当于甲状腺素含量0 5 2 ug k g ，经过适当的净化富集方法，活性成分甲状腺素等仍然可用l c - m s 确证和定量，从而推知 碘化酪蛋白的添加量。所以开发l c i i s 的碘化酪蛋白活性成分的鉴别测定方法是十分可行的。 3 研究内容和方法 1 研究内容 本论文试图从国家禁用的高度，用l c m s 的方法找出可为国际公认的、严密科学的鉴别碘化 酪蛋白甲状腺活性物质的方法，并逐一考察比较碘化酪蛋白的水解和其他处理条件，做到准确定 量，为进一步建立饲料中碘化酪蛋白的定性确证和定量测定打下基础。研究内容如下： a 使用l c - m s 技术，对碘化酪蛋白水解产物中各种碘化氮基酸进行鉴别，确定其甲状腺活性 标识化合物，建立定性鉴别方法。 b 以标识化合物为目标，优化各种实验条件建立l c - m s 定量方法。 c 方法性能检验。 2 技术路线见图2 使用标准品优化色谱质谱参数 山 l c m s 分离坚定碘化酪蛋白中各种碘化氨基酸 山 碘化酪蛋白甲状腺活性标识化台物的选择 、l ， 碘化酪蛋白水解条件的比较研究和优化 山 结合实际样品进一步优化各种参数 山 方法建立 w 方法性能考察 山 实际样品测定 图2 技术路线框图 f i g 2 r o u t eo f t e c h n o l o g y 中国农业大学硕士学位论文第二章碘化酪蛋白甲状腺弧形物质的l c m s 定性鉴别 第二章碘化酪蛋白甲状腺活性物质的l c - m s 定性鉴别 摘要本实验使用l c - m s 方法完成了对碘化酪蛋白水解产物中甲状腺活性物质t 。、r t s 和t 4 以及 其它碘化氢基酸的色谱分离和质谱鉴别。实验发现使用w a t e r ss y m m e t r ys h i e l d t mr p l 8 柱，乙腈 ( b ，含0 1 甲酸) 和水( a ，含0 1 甲酸) 为流动相，0 8m l m i n ，线性洗脱( b 从1 0 到 5 0 ) 4 0 r a i n ，电喷雾电离源( e s i + ) 锥孔电压为4 0 v 时，各碘化氮基酸即能得到完全分离， 又能得到丰度较高准分子离子峰和碎片离子峰了。通过所得质谱图发现各碘化氨基酸在e s i + 源 中的分子离子及碎片离子的形成规律是加质子，加溶剂，脱羧，脱氨和脱氨脱碘。探讨了影响电 喷雾质谱灵敏度和稳定性的因素。确定了以t 3 、r t a 和t 的色谱峰保留时间和出现相应准分子离 子峰及主要碎片离子峰及其比率作为碘化酪蛋白甲状腺活性物质的定性标准。 关键词：碘化酪蛋白，甲状腺活性物质，l c - m s ，鉴别，甲状腺素 1 前言 有关碘化酪蛋白水解产物中甲状腺活性物质的分离与鉴别，m i s c h l e r 和r e i n e k e ( 1 9 7 0 ) 使用萃取分离和t l c 的方法鉴别了其中的t 3 和t 4 ，但手续繁琐，且尚有不明物质不能确定。使 用l c m s 一次完成各碘化氨基酸的分离与确证方法简单，结果可靠。 2 试剂与仪器 2 1 试剂 2 1 1 超净水( 用n a n o p u r e u l t r o p u r e w a t e rs y s t e m 制各) ；z , l l 青( 色谱纯，购自f i s h e r 公司) ； 氢氧化钡 b a ( o h ) 2 8 h 2 0 、硫酸、甲酸和甲酵；分析纯，购自北京化学试剂公司；碘化酪蛋白( 购 自浙江黄岩荣耀化工厂) ；一碘酪氨酸( m i t ) 、二碘酪氨酸( d i t ) 、二碘甲腺原氨酸( t 2 ) 、三 碘甲腺原氨酸( t 3 ，r l r 3 ) 和四碘甲腺原氨酸( 甲状腺素t 4 ) ，h p l c 级，购自s i g m a 公司。 2 1 2 氢氧化钠溶液( 1 0m o y l ) ：称取2 0 0g 氢氧化钠于一2 0 0m l 的烧杯中，加蒸馏水溶解， 冷却至室温，用蒸馏水定容至5 0 0 m l 容量瓶中。 2 1 3 硫酸溶液( c ( 1 1 2 s 0 4 ) = i 0t o o l l ) ：移取2 7 8 0m l 浓硫酸溶于2 0 0 m l 水中定容至5 0 0 m l 容量瓶中。 6 中国农业大学硕士学位论文第二章碘化酪蛋白甲状腺弧形物质的l c m s 定性鉴别 2 1 4 甲状腺素标准储备液( 5 0 0 ug m l ) ：称取甲状腺素5 0 o o m g ，用0 1 m o l f l 的氢氧化钠溶 液1 0 m l 溶解，用水定容至1 0 0 m l 容量瓶中，4 c 冰箱中储存。 2 1 5 甲状腺素标准工作液：分别移取0 5 0 ，1 0 0 ，1 5 0 ，2 0 0 ，2 5 0 m l 的标准储备液( 2 1 4 ) 至1 0 0 m l 容量瓶中，用水定容至刻度。 2 1 6 碳酸氢钠水溶液溶液( 0 7 ) ；称取3 5 9 碳酸氢钠于2 0 0m l 的烧杯中，加约1 5 0m l 蒸 馏水溶解，定容于5 0 0 m l 容量瓶中。 2 1 _ 7 碘化酪蛋白溶液( 1 0 m g m l ) ：称取l o 0 0 9 碘化酪蛋白于一2 5 0 m l 三角瓶中，加入1 5 0 m l 碳酸氢钠溶液( 2 1 6 ) ，于7 0 ( 2 水浴加热溶解，并以碳酸氢钠溶液( 2 1 6 ) 定容至1 0 0 0m l ，充 分摇匀。 2 1 8 碘化酪蛋白溶液( 1 0m g m l ) ：准确移碘化酪蛋白溶液( 2 1 7 ) 1 0 0 0m l 于1 0 0m l 容量 瓶中，用碳酸氢钠溶液稀释到刻度。 2 1 i9 p h 7 0 的乙酸缓冲溶液：溶解0 4 1 9 无水乙酸钠，加入5 m l 甲醇，定容于1 0 0 m l 容量瓶 中，使用用精密p h 计，用0 i 的乙酸溶液调p h7 0 2 i i 02 甲酸甲醇溶液：用移液管吸取1 0 0m l 甲酸，置于盛有约3 0 m l 甲醇的5 0m l 容量瓶 中，并加甲醇至刻度。 2 2 仪器 2 2 1 分析天平：感量0 0 0 0 1 9 。 2 2 2 超声波清洗机：8 8 9 2 型，c o l e ；p a r t n e r 公司，美国。 2 2 3 烘箱：温度可控制到1 1 0 1 c a 2 2 4p h 计：准确至0 0 1 。 2 2 8 离j b o q , ：b i o f u g e 2 2 r , i - i e r a e u s 公司，德国 2 2 6 液相色谱质谱联用仪( w a t e r s2 6 9 0 z q ，w a t e r s3 4m a p l es t r e e tm i l f o r d m a 0 1 7 5 7 ) 可在 柱后串入二极管阵列监测器( w a t e r 9 9 6p h o t o d i o d ea r r a yd e t e c t o r ) 。 7 主里查些苎堂堡主堂位论文 第二章碘化酪蛋白甲状腺弧形物质的l c m s 定性鉴别 2 2 7 高速组织匀浆机：p o w e r g e n7 0 0 d ，f i s h e r 公司，美国 2 2 8 固相萃取小柱( o a s i sm a x3 c c ，w a t e r sc o r p o r a t i o n ，m i l f o r d ，m a s su s a ) 。 3 实验方法 3 1 样品水解与处理 准确移取1 0 o o m l 碘化酪蛋白溶液( 2 1 7 ) ，置于2 o x1 5 的聚四氟镙口水解管中，加入 5 0 0 9 八水合氢氧化钡。超声波脱气l o m i n ，吹氮l m i n ，拧紧盖子。于1 1 0 烘箱中水解1 2 h 。取 出，趁热用约5 0 r a l 蒸馏水，将水解液转移至1 0 0 m l 烧杯中，加入2 0 m l 的正丁醇和1 o m l 氢氧 化钠溶液( 2 1 2 ) ，在磁力热搅拌下，缓慢滴加l m o l l 的硫酸1 6 0 m l 。用p h 计调p h l 2 1 3 ， 转移至l o o m l 容量瓶中，并定容。充分摇匀，取约2m l 于1 0 0 0 0 9 离心1 5 m i n ，上清液上机测 定。 3 2 色谱质谱条件和数据处理 3 2 1 色谱条件 色谱柱( w a t e r ss y m m e t r ys h i e l d t mr p l 8 色谱柱( 5um ，3 9 m m i s o m m ) ： 流动相a ( 0 1 的甲酸水溶液) ，流动相b ( 乙睛) ，梯度洗脱b 从1 0 ( 保持5 m i n ) 到4 0 线 性洗脱3 5 m i n ，流速为0 8 m l m i n ，柱后分流，0 2 m l m i n 进质谱。进样体积2 0u1 。 3 2 2 质谱条件；电喷雾正离子( e s i + ) 模式i 锥孔压为4 0 v ；脱溶剂温度3 8 0 c ；脱溶剂氮气 流速4 0 0 l h ，四级杆质量分析器扫描范围1 5 0 9 0 0 a m u 。数据处理使用w a t e r sm a s s l y n x m 3 5 软 件。 4 结果和讨论 4 1 色谱与质谱条件的选择、优化 考虑碘化酪蛋白的水解物和我们感兴趣的甲状腺活性物质基本是氪基酸或含较大疏水集团 的氨基酸衍生物，宜采用反相液相色谱和电喷雾离子化作为实验的基本原则。我们先用w a t e r s s y m m e t r y 柱和乙腈b ( o 1 的甲酸) 和水a ( o 1 的甲酸) 为流动相，以二极管阵列检测器在2 1 0 4 0 0 n m 扫描，比较、优化不同流速与梯度淋洗方式各色谱峰的分离效果。然后用直接进样的方式， 在质谱分析器直接注入l 、r r 和t 。标样，采用扫描范围1 5 0 9 0 0 a m u ，毛细管电压3 k v ，脱溶剂 气4 0 0 l h ，脱溶剂气温度3 8 0 ，以不同的锥孔电压进行多通道正负离子同时检测发现采用 正离子( e s i + ) 方式，锥孔压为4 0 v 时效果最好，有较高的灵敏度，又能得到丰度较高准分子离 8 中国农业大学硕士学位论文 第二章碘化酪蛋白甲状腺弧形物质的l c m s 定性鉴别 子峰和碎片离子峰a 最后将色谱和质谱部分直接相连，综合考虑分析时间和检测效果，对上述确 定的条件与参数略作调整，确定了3 2 中的色谱质谱条件，并取得了很好效果。图3 给出了s i r 方式检测均采用准分子离子( m + 1 ) + 作为检测离子得出的色谱图。图4 图9 给出了各色谱峰对应 的化合物的质谱图。 4 2 各碘化氨基酸的质谱解析 由图4 图9 可知，在本实验条件下，碘化氨基酸的氨基捕获一个质子形成( m + 1 ) + 分 子离子，碎片离子的形成规律为脱羧，脱氨，脱碘和脱氨脱碘同时发生。另外大分子量的碘化氨 基酸还形成溶剂加合峰。其中t 3 ，r t 3 的质谱图的离子完全相同，但可从m z 6 0 6 与m z 6 5 2 的丰度 比加以确认。在t 3 质谱图中，m z 6 0 6 与m z 6 5 2 的丰度比接近于l ，如图7 ，而r t 3 的质谱图中 m z 6 0 6 与m z 6 5 2 的丰度比远小于l 。说明l 较r t 3 容易脱掉羧基，这在本实验中得到多次证实， 如图8 。各碘化氨基酸的特征离子列于表2 。 衰2 各碘化氨基酸的特征离子峰归属 t a b l e2p r e s e n t a t i o no f e h a r a c t e r i s t i ci o n so f e a c hi o d o - a m i n oa c i d 特征离子( m z ) c h r a c t e r i s t i ei o n ( m z ) 警d 誉o - a m i n 酸。船麓a d dw a n k d r u 脱i n 氨a t i o n d e c a r b 膦o x y l 砌。罴 ( m 12 + f m 4 丛o r a l 6 ) ( m - 4 5 f ( m - 1 4 3 f m r r3 0 82 9 12 6 21 6 4 d i t4 3 44 1 73 8 82 9 0 。 1 25 2 6 5 0 94 8 03 8 2 t 16 5 26 9 36 3 5 6 0 65 0 8 r t t6 5 26 9 36 3 56 0 65 0 8 t 4 7 7 88 1 97 6 17 3 26 3 4 4 3 影响各碘化氨基酸电喷雾质谱灵敏度的因素 a 影响碘化氨基酸的e s i 质谱灵敏度的因素首先取决于各碘化氨基酸自身的性质。碘化氨 基酸的氨基容易捕获一个质子形成( m + 1 ) + 离子，羧基容易失去一个质子而形成( m i ) 离子， 因此酸性环境有利于得到带正电荷的准分子离子，碱性环境有利于形成带负电荷的准分子离 子。兼顾反相色谱在酸性环境下有利于各碘化氨基酸的分离，所以使用e s i + 方式采集数据能得 到满意的效果。 b 电解质浓度。在电喷雾形成带电小液滴后，电解质离子与待测物离子竞争到达小液滴的表 面，从而影响了待测物离子的汽化，使样品的信号减弱。在本试验中流动相加入0 1 的甲酸， 即可以降低流动相的p h 值，有利于各碘化氨基酸的分离，又有利于e s i + i 拘检测a 但当甲酸的 9 中国农业大学硕士学位论文第二章碘化酪蛋白甲状腺弧形物质的l c m s 定性鉴别 浓度增加到0 2 时，各碘化氨基酸的信号都有不同程度的降低。此时电解质的离子竞争作用 是主要作用。 1 0 0 乎 i 芒 晋 蛊