（微生物学专业论文）白色链霉菌发酵生产ε聚赖氨酸的工艺研究.pdf

摘要 酵，说明 补料分批发酵是一种适合s . a l b u l u s 发醉生产e - p l的培养方式。 此 外， p h反 馈控制变速流加培 养方式要略 优于葡萄搪 反 馈控制间 歇补 料培养， 两 种 补 料培 养最 后的s - p l 产量, s - p l 得 率分别为7 .3 6 g / l 和6 .5 3 叭, 0 .0 7 2 g . e - p l / g . s u b 和0 . 0 6 8 g . e - p l / g .s u b 。 而且发 酵过程中 ，由 于变速 流加葡萄糖 对培养基中的 基质浓度影响较小， 不会造成发酵环境的 剧烈变化， 能为菌体 生长和 s - p l合成代谢提供持续稳定的环境，而间歇补料时由于一次性加入 的营养物质浓度和体积较大， 对发酵环境的影响较大， 不利于细胞内各种代 谢的正常进行。 对 e - p l提取工艺进行初步研究发现，发酵液预处理过程中，过滤可能 会导致e - p l的损失; 选择大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂d 1 5 2 对。 - p l 进行粗提取， 洗脱剂为0 . 1 n h c l 溶液， 洗脱速度为2 .5 m u m in 时， s - p l的 浓缩倍率为2 .2 9 倍，回收率为7 8 .8 3 %;选择活性炭进行脱色，既能达到脱 色的目的，又能使s - p l因吸附作用而导致的损失降低。 关键词: 。 一 聚赖氨酸;白 色链霉菌; 发酵; 补料; p h控制 abst ract i n o r d e r t o e n h a n c e e p o l y - l - l y s i n e ( s - p l ) p r o d u c t i o n 妙s t r e p t o m y c e s a l b u l u s f e r m e n t a t i o n , t h e f e r m e n t a t io n c o n d i t i o n s a n d e x t r a c t i o n t e c h n o l o g y o f s - p l fr o m c u lt u r e b r o t h w e r e i n v e r s t i g a t e d a s f o ll o w i n g : o e x p l o r e d t h e c o n d i t i o n s o f s - p l f e r m e n t a t i o n i n s h a k e fl a s k ; ) o p t i m i z a t io n o f b a t c h f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s o f f_ - p l p r o d u c t io n i n 5 0 l a u t o c o n tr o l f e r m e n t o r , )c o m p a r e o f d i ff e r e n t f e d - b a t c h m e t h o d s ; t h e p r i m a r i l y s t u d y o f t h e s e p a t a t i o n a n d e x tr a c t i o n o f e - p l fr o m c u l t u r e b r o t h . t h e e ff e c t s o f t e m p e r a t u r e , p h a n d c u l t u r e m e d i u m a m o u n t o n e - p l p r o d u c t i o n i n s h a k e fl a s k w e r e s t u d i e d , i t w a s a f o u n d a t i o n w o r k f o r o p t i m i z a t i o n o f b a t c h f e r m e n t a t i o n i n 5 0 l f e r m e n t o r . t h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e s u i t a b l e t e m p e r a t u r e f o r t h e p r o d u c t i o n o f e - p l w i t h p h c o n tr o l w a s e n h a n c e d t o 1 . 5 9 g / l f r o m 0 .8 9 g / l w i t h o u t p h c o n t r o l ; t h e c u l t u r e me d i u m v o l u me o f 1 0 0 ml i n 5 0 0 ml d r a k e f l a c k wa s f a v o r a b l e f o r t h e g r o w th o f c e l l s a n d s y n t h e s i s o f s - p l . t h e r e s e a r c h e s s h o w e d t h a t t e m p e r a t u r e , p h a n d s ti r r e r s p e e d p l a y e d i m p o r t a n t r o l e s o n t h e b a t c h f e r m e n t a t i o n o f s - p l i n 5 0 l s u t o c o n tr o l f e r m e n t a t i o n j a r . t h e o p t i m a l t e m p e r a t u r e f o r s . a l b u l u s g r o w th a n d s - p l s y n t h e s i s w a s 3 0， t h e s a m e a s i n s h a k e fl a s k , t h e l o w y i e l d o f e - p l w a s a c c o m p a n i e d b y t h e l o w r a t e o f c e l l s g r o w t h a t 3 2; t h e r e s i d u a l g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n w a s s ti l l 2 0 . 1 g / l a t p h 3 . 0 , l o w p h w o u l d b e n e fi t n e i t h e r c e l l s g r o w th n o r s - p l s y n t h e s i s , t h e h i g h a c c u m u l a t i o n ( 3 .0 5 g / l ) o f e - p l w a s a c h i e v e d a t p h 4 . 0 , a n d t h e h i g h勿 c e l l w e i g h t ( 1 2 . 8 8 g / l ) w a s o b t a i n e d a t p h 5 .0 , h o w e v e r , w h e n p h s h i f ts t o 5 . 0 o r h i g h e r , t h e a c c u m u l a t e d c - p l w a s d e p o l y m e r i z e d ; h i g h s t i r r e r s p e e d a c c o m p a n y i n g h i g h d i s s o l v e d o x y g e n w o u l d i m p r o v e t h e g r o w th o f c e l l s a n d s y n t h e s i s o f s - p l , a n d t h e d i s s o l v e d o x y g e n w a s s u ff i c i e n t t o m e e t t h e r e q u i r e m e n t o f c e ll s g r o w t h a t 2 0 0 r p m , h o w e v e r o v e r h i g h s t i r r e r s p e e d s u c h a s 4 0 0 r p m w o u l d d a m a g e t h e m y c e li u m s o a s t o d e c r e a s e s - p l un d e r t h e c o n d i t i o n : 3 0， i n i t i a l p h 6 . 8 , a e r a t i o n 1 2 0 0 l / h , s t i r r e r s p e e d 2 0 0 r p m a t p r o p h a s e o f c u lt u r e , a t a n a p h a s e , s t ir r e r s p e e d 3 0 0 r p m , p h c o n t r o l l e d a t 4 .0 , a ft e r 8 4 . 5 h c u l t u r e , t h e 如 e l d a n d p r o d u c t i v i ty o f a - p l w a s 3 .2 1 叭 a n d 0 .0 6 5 g . e - p l / g . s u b r e s p e c t i v e l y , t h e y i e l d o f e - p l w a s i n c r e a s e d b y 3 1 0 % fr o m 0 .7 8 g / l . t w o d i ff e r e n t k i n d s o f f e d - b a t c h c u l t u r e w e r e i n v e s t i g a t e d , 由 e r e s u l t s s h o w e d t h a t f e d - b a t c h c u l t u r e w a s fi tt e r f o r e - p l p r o d u c t i o n w i t h s .a l b u l u s t h a n b a t c h c u l t u r e . i n a d d i t i o n , p h c o n t r o l a n d v a r i a b l e s p e e d f e d - b a t c h c u lt u r e w a s s u p e r i o r t o g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n c o n t r o l a n d s p a n f e d - b a t c h c u l t u r e , b o t h t h e 外 e l d a n d p r o d u c t i v i t y o f e - p l w i t h f o r m e r t a c t i c w e r e h i g h e r t h a n t h e l a tt e r , t h e y w e r e 7 .3 6 g / l a n d 6 .5 3 g / l , 0 . 0 7 2 g . e - p l / g . s u b a n d 0 .0 6 8 g . e - p l / g . s u b , r e s p e c t i v e l y . t h e r e a s o n w a s l i k e l y a t t r i b u t e d t o t h a t t h e l a tt e r f e d - b a t c h c u l t u r e w a y w o u l d b r in g a t r e m e n d o u s c h a n g e o f c u l t u r e s y s t e m d u e t o t h e a d d i t i o n o f g r e a t v o lu m e n u t r i m e n t w i t h h i g h c o n c e n t r a t i o n , a n d l e a d t o t h e d i s o r d e r o f m e t a b o l i s m , b u t t h e f o r m e r w a y c o u l d k e e p a c o n t i n u a l a n d s t a b i l e c o n d i t i o n f o r c e l l s g r o w t h a n d e - p l s y n t h e s i s . t h e n , t h e s e p a r a t i o n a n d e x t r a c t i o n o f s - p l fr o m b r o t h w a s p i l o t s t u d i e d . i n t h e p r o c e s s o f b r o t h p r e t r e a t m e n t , fi l t r a t i o n w a s l i k e l y t o l e a d s - p l l o s i n g ; t h e w e a k a c i d c a t i o n - e x c h a n g e r e s i n d 1 5 2 w a s c h o o s e d t o s e p a r a t e s - p l fr o m p r e t r e a t e d b r o t h , t h e e l u e n t w a s 0 . 1 n h y d r o c h l o r i c a c i d , v e l o c i ty o f fl o w w a s 2 .5 m um i n , t h e c o n c e n t r a t i o n o f a - p l w a s c o n d e n s e d衍 2 2 9 % , c o e ff i c i e n t o f r e c o v e ry r e a c h e d 7 8 . 8 3 %; d e c o l o r i z e d w i t h a c t i v a t e d c h a r c o a l c o u l d d e c r e a s e t h e l o s s o f e - p l . k e y wo r d s : e - p o l y - l - l y s i n e , 兰 1全 -有关 lr r g _ti 9 h i , 使 用 学 位论 文 的 规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和 借阅 。 本 人授 权 直星么全可以 将 学 位论 文的 全 部 或部 分 内 容 编 入 有 关数 据 库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 名 。手 写 。: 嘴 阂 v 导师 签 一 手 写 ): 叮 v v 签 字 f1 j% : 呼 月 “ 日 签 字 日 期 : 沪了 年 月卯日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通讯地址: 电话: 邮编: 前言 1 .前 言 1 . 1 课题的研究目的和意义 食品的腐败变质一直是人们关心的一个问题，近年来， 全世界农副产品、 水产品、果蔬等食品腐烂变质而引起的经济损失十分巨 大， 如何防止食品腐败 变质越来越引起人们的重视。 长期以 来，由 于受到经济环境和开发水平的制约， 几乎所有的食品都采用化学合成防腐剂来延长食品的保质期.随着人们生活水 平的 提高和健康意识的加强，对食品品质提出了 更高的要求， 这其中除了食品 的营养、感官和外观包装外，食品的食用安全性更为人们所关注。然而有研究 表明，化学防腐剂如果在规定剂量内使用，是不会对人体产生毒副作用，但如 果超剂量使用会产生累积毒性， 而且有的化学防腐剂还有致癌作用，如苯甲酸 盐可能 会引 起食物中 毒现象、 亚 硝酸和亚硝酸盐 可能 会生 成致癌的 亚硝酸钱il l . 而天然防腐剂不但具有抗菌性强、 安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范 围广等合成防腐剂无法比拟的优点，有的还具有一定的营养价值。因此，近年 来天然防腐剂的研究和开发利用成为了食品工业的一个热点。目前，国外一些 发达国家批准使用微生物食品防腐剂有乳酸链球菌素( n i s i n ) 、纳他霉素 ( n a t a r n y c i n ) 和。 一 聚 赖 氨 酸 ( s - p o l y - l - ly s in e ) )1 9 8 9 年日 本 窒 素 公 司 首 先 用生 物技 术方法工业生产聚赖氨酸，并允许在日 本使用， 后来韩国也允许作为食品添加 剂使用。 在美国 和欧洲， 主要是使用山 梨酸作为防腐剂，最近， f d a已正式批 准。 一 多 聚 赖氨酸作为 天然食品 添 加剂 13 1: 一 聚赖氨酸( 简称s - p l ) 是8 0 年代由 日 本首先发现的一种新型食品抑菌剂，它具有广谱抑菌性，能够抑制革兰氏阳 性菌、 革兰氏 阴 性 菌、 真 菌 和 一 些耐 热 性芽抱杆 菌 等14 -5 1 . s - p l 添 加于食品中 仅 需微量就能奏效，且不会影响 食品口 味感，由于耐高温、安全高效、抑菌谱广， 可以 应用于多 种果蔬、 食品、 饮料和 保健性药物的 保鲜剂i 7 ,8 1 自 上世纪8 0 年代日 本学者发现。 - p l的抑菌功能以来， 科研工作者采用了各 种方法来提高s - p l 的产率，目 前，只有日 本实现了 工业化生 产，国内还停留在 实验室研究阶段，主要原因是还没找到合适的大型发酵的生产条件。所以，为 了 适 应食品 行业对天然防腐剂的 需要， 对。 - p l的 生 产扩大的 研究具有十 分重要 的意义。 前言 1 . 2 文献综述 1 . 2 . 1 天然防腐剂的主要种类 1 . 2 . 1 . 1 植物源天然防腐剂 1 ) 茶多酚 大量实验表明，茶多酚对人体有很好的生理效应， 它能清除人体内多余的 自由 基，改进血管的渗透性能，增强血管壁弹性，降低血压，防止血糖升高， 促进维生 素的 吸收与同 化例 . 还有抗癌防 龋、 抗机体脂 质氧化和抗辐射等作用。 茶多 酚还具有很 好的防 腐保鲜作用1 0 , 1 11 ， 对枯草杆菌、 金黄色葡萄 球菌、 大肠杆 菌、 番茄溃疮、龋齿链球菌以及毛霉菌、青霉菌、赤霉菌、炭疽病菌、啤酒酵 母菌等均有抑制作用。 2 ) 香精油 香精油生长在热带的芳香植物的根、树皮、种子或果实的提取物，一直是 人们较感兴趣的天然防腐剂之一，近些年来有关香精油作为食品防腐剂的报道 很多.丁香油中主要成分为丁香酚，还含有靴质等。 吴传茂等11 2 1研究发现:丁 香油对金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌、 酵母、黑曲霉等有广谱抑菌作用，且在 1 0 0 以内对热稳定，突出特点是抑制真菌作用强。山苍子油是从山苍子的鲜果、 树皮以 及叶中 提取的， 含柠檬酸、甲 基庚 烯酮以 及其他物 质. 余伯良 等回研究 发现，山 苍子油对多数霉菌的抗菌效力与山梨酸钾相近，但强于苯钾酸钠。 3 ) 大蒜素 大蒜所含有的大蒜辣素对痢疾杆菌等一些致病性肠道细菌和常见食品腐败 真菌都有较强的抑制和杀灭作用。这使得它成为一种天然的防腐剂，深圳教育 学院的 马慕英11 4 1 用大蒜水溶液对几十种污染食品的 常 见霉菌、 酵母菌等真菌进 行试验，结果发现它对这些真菌均有抑制作用，且防腐能力与化学防腐剂苯甲 酸钠和山 梨酸钾的效果相近。大蒜蒜瓣的抗菌性能十分微弱，蒜苗与蒜的茎叶 具有相当的抗菌作用。其抗菌性能在高温下下降很多，因此应用大蒜提取物防 腐 保 鲜 应 力 求 在较 低 温度 ( 8 5 下 ) 进行。 大 蒜的 最 适 作 用声 为4 .0 左右， 因 而 适宜用于酸性食品的防腐保鲜中。 4 ) 葱醒中草药 蕙醒类中草药，其存在形式主要是葡萄糖或非葡萄糖贰，同时也含有一定 量的游离态葱醒，如大黄、虎杖、决明子、何首乌和茜草等，具有两个相互共 前言 扼的a . p 不 饱 和 簇 基 结 构. 熊 卫东 等11 5 1对 葱 醒 类中 草 药 进 行了 抑菌 试 验。 结 果 表明， 其综合的抑菌活性应介于苯甲 酸钠和肉桂醛之间。因此具有作为天然防 腐剂的可行性。 1 . 2 . 1 . 2 动物源天然防腐剂 1 ) 鱼精蛋白11 6 ,1 7 1 鱼精蛋白是在鱼类精子细胞中发现的一种细小而简单的含高精氨酸的强碱 性蛋白 质，它对枯草杆菌、巨 大芽抱杆菌、地衣型芽抱杆菌、凝固芽泡杆菌、 胚芽乳杆菌、干酪乳杆菌、 粪链球菌等均有较强抑制作用， 但对革兰氏阴性细 菌抑制效果不明显。 研究发现， 鱼精蛋白 可与细胞膜中 某些涉及营养运输或生 物合成系统的蛋白 质作用，使这些蛋白质的功能受损，进而抑制细胞的新陈代 谢而使细胞死亡。 鱼精蛋白 在中性和碱性介质中的 抗菌效果更为显著。广泛应 用于面包、 蛋糕、菜肴制品( 调理菜) 、水产品、豆沙馅、 调味料等的防腐中。 2 ) 蜂胶11 8 1 蜂胶是蜜蜂赖以生存、繁衍和发展的物质基础。各国科学家经过研究证实， 蜂胶是免疫因子的激活剂，它含有的黄酮类化合物和多种活性成分，能显著提 高人体的免疫力，对搪尿病、癌症、高血脂、白 血病等多种顽症有较好预防和 治疗效果。同时，蜂胶对病毒、病菌、霉菌有较强的抑制、杀灭作用，对正常 细胞没有毒副作用。因此在食品中添加蜂胶不仅是一种天然的高级营养品，而 且可以作为天然的食品添加剂。近年来研究还发现，蜂胶经过特殊工艺加工处 理后可制成天然口香搪。其中的有效成分具有洁齿、护牙作用，可防止龋齿的 形成，同时还可以逐渐消除牙垢。 3 ) 壳聚塘 ( c h i t o s a n ) 壳 聚搪又叫甲 壳 素11 91 ， 是由 蟹虾、昆 虫等甲 壳 质。 脱乙 酞后的多糖类物质， 对大肠杆菌、普通变形杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用 而不影响食品风味. 广泛应用于腌渍食品、生面条、米饭、豆沙馅、调味液、 草墓等保鲜中。 近几年来，国内 外有关刊物发表了不少关于壳聚搪以 及壳聚搪 衍生物的 制备及应用等研究 报道12 0 1 。 随 着科 研工者 对甲 壳素的 研究深入， 其应 用也必然越来越广泛。 1 . 2 . 1 . 3 微生物源防腐剂 1 ) 溶菌酶12 1 1 溶菌酶是一种无毒蛋白质，能选择性地分解微生物的细胞壁，在细胞内对 前言 吞噬后的病原菌起破坏作用从而抑制微生物的繁殖。 特别对革兰氏阳性细菌有 较强的溶菌作用，可作为清酒、千酪、香肠、奶油、生面条、 水产品和冰淇淋 等食品的防腐保鲜剂. 2 ) 乳酸链球菌素洲s i n ) 乳酸链球菌素是由 多种氨基酸组成的多 肤类化合 物12 2 1 ， 可作为 营养物质被 人体吸收利用。1 9 8 9 年，联合国粮食及农业组织/ 世界 卫生组织( f a l / w h o ) 食 品 添加 剂 联 合专 家 委员 会 确 认 乳酸 链球 菌素 可 作为 食品 防 腐 剂12 3 1 . 1 9 9 2 年3 月 我国卫生部批准实施的文件指出愁“ 可以科学地认为乳酸链球菌作为食品保藏剂 是安全的” 。它能有效抑制引起食品腐败的许多革兰氏阳性细菌， 如肉毒梭菌， 金黄色葡萄球菌，溶血链球菌，利斯特氏菌，嗜热脂肪芽抱杆菌的生长和繁殖， 尤其对产生抱子的革兰氏阳性细菌有特效。乳酸链球菌素的抗菌作用是通过干 扰细胞膜的正常功能，造成细胞膜的渗透，养分流失和膜电位下降，从而导致 致病菌和腐败菌细胞的 死亡12 4 1 。 它是一 种无毒的 天然防 腐剂， 对食品的 色、 香、 味、口感等无不良影响.现己广泛应用于乳制品、罐头制品、鱼类制品和酒精 饮料中12 3 1 3 ) 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 纳他霉素( n a t a n y c in ) 1 2 5 , 261 ，是由纳他链霉菌受控发酵制得一 种白色至乳白色的 无臭无味的结晶粉末，通常以 烯醇式结构存在。它的作用机理是与真菌的麦角 凿醇以及其他幽醇基团结合，阻遏麦角幽醇的生物合成，从而使细胞膜畸变， 最终导致渗漏，引起细胞死亡。在焙烤食品时用纳他霉素对面团进行表面处理， 有明显的延长保质期作用。在香肠、饮料和果酱等食品的生产中添加一定量的 纳他霉素，既可以防止发霉，又不会干扰其他营养成分。 4 ) e - m c 赖 氨 酸( e - p o ly - l - l y s in e ) 12 7 .2 8 1 e - p l的研究在国 外特别是在日 本己比 较成熟，我国 刚刚起步。 它是一种天 然的生物代谢产品。具有很好的杀菌能力和热稳定性， 是具有优良防腐性能和 巨大商业潜力的生物防 腐剂。 在日 本， f- - p l己 被批准作为防 腐剂添加于食品中， 广泛用于方便米饭、湿熟面条、熟菜、海产品、酱类、 酱油、鱼片和饼干的保 鲜防腐中。 1 . 2 . 2 1 . 2 . 2 . 1 一 聚赖氨酸的研究进展 e - p l的结构 前言 聚赖氨酸的化学合成是在1 9 4 7 年首先完成的。化学法合成的聚赖氨酸为a 型， 其赖氨酸残基之间的酞胺键是由 a - 氨基和a - 基缩合而成。 1 9 7 7 年日 本学者 从放线菌培养过滤液中提取出一种含有2 5 3 0 个赖氨酸残基的同型单体聚合 物. 这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基通过a - 梭基和 一 氨基形成的酞胺键连接而 成。 故 称为 9 - 聚 赖氨 酸 位p l) 12 9 ,m e h - n h -c h 2- c h 2- c h t- c h t c h -c o c o h n h 3 图1 . 1 e - 聚赖氨酸 f ig . 1 . 1 c - p o l y - l - l y s in e h - n h -c h 巧 0 3c -o h nh rc hrc h rc h 2-c h7 图1 .2 企 聚赖氨酸 f i g . 1 . 2 a - p o l y - ll y s i n e 1 . 2 . 2 . 2 e - p l 的性质 s - p l 带正电荷，可以和阴离子物质发生结合，没有固定的熔点， 2 5 0 以上 开始软化分解;成品为淡黄色粉末、吸湿性强，略有苦味，溶于水，微溶于乙 醇，但不溶于乙 酸乙醋、乙醚等有机溶剂;能够承受一般食品加工过程中的热 处理， 热稳定性高，1 2 0 加热 1 0 m i n 仍具有抑菌活性， 可随原料一同进行灭菌 处理，防止二次污染，但遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐类、铜离子等可因 结合而使活性降低，与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂肪甘油酩等合 用有增效作用。 e - p l 是含有2 5 3 0 个赖氨酸残基的阳离子聚合多肤， 当聚合度低 于十肚时， 会丧失抑菌活性。 具有高抑菌活性的 。 - p l 的分子量在3 6 0 0 -4 3 0 0 之 间。 红 外 光谱分析表明:在1 6 8 0 - 1 6 4 0 c m 和1 5 8 0 - 1 5 2 0 c n i 之间 有强吸收峰。 pi m e - p l 抑菌谱广， 抑菌效 果如表1 . 1 所示13 3 1 。 在酸性和微酸 性环境中 对革兰氏 阳性菌、 革兰氏阴性菌、 酵母菌、 霉菌均有一定的抑菌效果， e - p l 对其他天然防 腐剂不易抑制的革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果非常好，而且其对 耐热性芽抱杆菌和一些病毒也有抑制作用。s - p l 对细菌的最低抑菌浓度都在1 0 0 e l g / ml以 下， 但对酵母菌、 霉菌的 抑菌浓度要求较高， 为1 2 82 5 6 g g / m l 。 单独 使用多聚赖氨酸对枯草芽抱杆菌、黑曲霉抑制不明显，采用多聚赖氨酸与醋酸 复合作用对枯草芽抱杆菌等耐热性较强的芽抱菌抑制增强， 因 此e - p l 与醋酸双重 作 用比 单 独使用时抑菌范围 更加广泛i34 a 前言 表1 . 1 e - 聚赖氨酸抑菌效果( h t r a 喊2 0 0 0 ) i 1 t a b l e 1 . 1 t h e in h ib it o ry e ff e c t s o f s - p l o n m ic r o b i a l g ro w t h ( h ir a k i, 2 0 0 0 ) 四 g r o u p_s p e c ie s _ _ _ _ ._ _im i c ( p g l m l z,m e d iu m f u n g i a s p e r g i l l u s n ig e r i f 0 4 4 1 6 2 5 0 1 ye a s t s 晌c i e n s i f 0 0 5 7 7 o d o t o 尹 . 如 l a c t a s e i f o1 4 2 3 p. me mb r a n a rh勿r u l a 2216675333643494，544 g r a m - p o s it i v e b a c t e r i a g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a s p o r o b o l o m y c e s r o s e u s i f 01 0 3 7 s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e z y g o s a c c h a r o m y c e s r o u x i i 1 17 0 1 1 3 0 g e o b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s i f 0 1 2 5 5 0 b a c i l l u s c o a g u l a n s i f 0 1 2 5 8 3 b . s u b t i l i s j am 1 0 6 9 c l o s t r i d i u m a c e t o b u ty t i c u m i f o1 3 9 4 8 l e u c o n o s t o c me s e n t e r o i d e s i f 03 8 3 2 l a c t o b a c i l l u s b r e v i s i f 03 9 6 0 l .p l a n t a r w n i f o 1 2 5 1 9 mi c r o c o c c u s l u t e u s i f o1 2 7 0 8 s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s i f 0 1 3 2 7 6 s t r e p t o c o c c u s l a c t ic i f o 1 2 5 4 6 r a o u l t e l l a p l a n t i c o l a i f 0 3 3 1 7 c a m p y l o b a c t e r j e j u n i e s c h e r i c h i a c o l i i f o1 3 5 0 0 p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a i f 0 3 9 2 3 3 4 一 一 一 二 一 一 一 一 一 一 一 s a lm o n e l l a ty h y m u r i u m 一 一 一 行一一 1 6 - 4 注: m e i u m : 1 p o t a t o d e x t ro s e b r o t h ( p h 5 .6 ) , 2 m a lt b r o t h ( p h 5 . 0 ) , 3 g l u c o s e m a l t b r o t h ( p h 6 . 0 ) , 4 n u t r i e n t b r o t h ( p h 7 . 0 ) , 5 d e o x y c h o l a t e b r o t h ( p h 7 . 4 ) , 6 b r a in h e a rt i n f u s i o n b r o t h ( p h 7 . 0 ) , 7 t ry p t o - s o y a b r o t h ( p h 7 . 3 ) , 8 t h i o g l y c o l l a t e m e d i u m w i t h o u t i n d i c a t o r ( p h 7 . l ) , 9 b m c e l l a b r o t h . mi c : mi n i m u m i n h i b i t o ry c o n c e n t r a t i o n . . 2 . 2 . 3 s - p l的抑菌机理 传统研究认为， 食品 防 腐剂的 作用机理主要表现在如 下3 个方面: ( 1 ) 作用于 细胞 壁和细胞膜系统; ( 2 ) 作 用于 遗传物质或遗传微粒结 构; ( 3 ) 作用于 酶或 功能 蛋白。 s h i m a s , s a k a i h 等136 1研究发现， 防 腐剂主 要抑制 微生 物的呼 吸作 用， 导致 能量物质a t p 和还原物质n a d h 亏缺， 所有合成代谢受阻， 活性的动态膜结构不 能维持， 代谢方向趋于水解， 最后产生细胞自 溶。 实验表明， e - p l 踞留生物膜后， 破坏依赖于膜结构完整的能量代谢和细胞及细胞器赖以生存的对物质的选择 性，导致胞内 溶酶体膜破裂而诱导微生物产生自 溶作用，最终导致细胞死亡。 1 9 8 3 年， v a a r a m 等3 7 / 发 现聚阳离子能 破坏 g细菌的 外膜， 并进一 步杀 死这 前言 些细菌. 1 9 9 2 年v a a r a m 13 s 1进一步发现， 聚赖氨酸是 通过吸附 到g . 细菌的 外膜上， 释放出大量的脂多糖，破坏细菌外膜，而起到抑菌作用的。 1 9 8 4 年， s h i m a s 等13 6 1对s - p l 的进一步研究发 现当 其浓度为1 - 8 m g / l时， 即对g + . g . 细菌有抑制作用， 且抑菌能力强， f- - p l 必须含有1 0 个以上赖氨酸残 基才具有抑菌活性， 对氨基的 化学修饰会降低其抑菌能力。e - p l通过与细胞膜 作用影响微生物细胞的呼吸，与胞内的核糖体结合影响生物大分子的合成。 1 . 2 . 2 . 4 s - p l的发酵生产 1 ) s - p l的生产菌 目 前工 业上 一般采用白 色链霉菌( s t r e p t o m y c e s a l b u l u s ) 作 为发酵生 产菌株， 白色链霉菌在形态特征方面，菌抱子丝简单分枝、密螺旋，颜色为灰色或灰棕 色， 组成抱子丝的抱子数量有数十个， 抱子是1 .21 . 5 g m 的 椭圆形， 具有多刺的 表 面 结 构。 生 长 温 度1 5 4 0 ( 最 适 3 0 -c ) p 1 ,3 9 1 e 除 了 s a l b u l u s 外 ， s z o k a n g 等 14 0 !发 现 一 种 丝 状的 麦 角 真 菌 ( c la v ic e p s p u r p u r e a ) 能 够积累一 种类似聚赖氨酸、 含有大量赖 氨酸的 化 合物 麦角胺 ( c l a v i c e p a m i n e s ) ， 不 过其产物的 化学结构与 s . a l b u l u s 不同; 2 0 0 2 年， m a s a n o b u n 等14 1 1找到 一种简便有 效的 筛选* p l 产生菌的 方法， 通过在培养基中 加入一种酸 性染 衡 o l y r - 4 7 8 ， 由 于正负电 荷的 相互吸引 作用，可以 在 - p l 产生菌菌落周围 产 生明显的颜色变化， 而且变色圈的大小从一定程度上可以反映出。 - p l 产生能力的 强弱， 因此， 可以 进行大规模筛选。 ma s a n o b u n 等采用这种方法调查了 3 0 0 多种 土壤中 各种 - p l 产生菌， 通过1 6 s r n a 序列分析， 发现大多数 - p l 产生菌集中在 链霉 菌科 ( s t r e p t o m y e e t a c e a e ) 的 几 个不同的 属和麦角真菌 ( e r g o t f u n g i ) 这两类微生 物上，且不同菌株的产物其赖氨酸单体数也有所不同。如表1 .2 所示: 前 性 红 目 匀 _.-， 表1 .2 e - p l 的生 产菌( m a s a n o b u n e t 碱 2 0 0 2 ) 14 1 1 t a b le 1 .2 a - p l - p r o d u c i n g b a c t e r ia ( m a s a n o b u n e t a l, 2 0 0 2 ) 14 1 1 种名 s t r e p t o m y c e s a l b 诚川 a v u s 分子盘 ( 赖氨酸单体数) s a l b u l u s ( mn - 4 ) s . ro s e v e r t i c i l l a t u s ( mn - 1 0 ) s . ly c i d u s ( y 1 5 5 0 7 ) s a m o s u s ( x 6 2 8 8 4 ) s . l a c e n d u l a e ( mn - 5 ) s c y a n e u s ( a j 3 9 9 4 6 0 ) s tr e p t o v e r t i e il l i u m m o s h u e n s e ( m n - 6 ) k i t a s a t o s p o r a k if u r t e n s e ( mn - 1 ) 助i c h l o e s p . ( mn - 9 ) s t r e p t o m y c e s a l b u l u s 3 4 6 约2 0 0 0 ，晶体分子量约8 0 0 约 1 9 0 0 约 1 1 0 0 -2 2 0 0 ( 8 -1 7 ) 约3 1 0 0 -3 8 0 0 ( 2 4 -2 9 ) 约 3 3 0 0 -4 5 0 0 ( 2 5 -3 6 ) 2 ) 白色链霉菌发酵生产s - p l 目 前， 工业上通过好氧发酵来生产 - p l的菌种大多为s t r e p t o m y c e s a l b u l u s 3 4 6 的 突变株。 该 菌株 是1 9 7 7 年14 2 1 由日 本 学者s h i m a s 和s a k a i h从土 壤中 分离 纯化得到，1 9 8 1 年13 1 1 ，他们研究了 野生型s . a l b u l u s 3 4 6 的发酵生产条件，发现 在缺乏补充碳源的发酵培养基中，尽管菌体生长良 好， 但是没有s - p l的积累， 在补充碳源中甘油和葡萄糖是最好的， 单独使用有机氮源不适合于 - p l的生产， 硫酸 钱和酵母膏的 混合使用更有利于e - p l 的形成。 在发酵过程中， p h的下降是 e - p l 积累 的 关键条件。 当 发酵 起始p h为6 . 0 , 细 胞生长 达到稳定期时， 培养 基中 开始有s - p l的积累， 最高s - p l为0 . 5 lr/ l左右。 另外， 在培养基中即使 加入 l - l y s in e 也 不 会 增 加。 - p l 的 产 量 。 1 9 8 3 年， s h i m a 等 人 14 3 采 取 两 步 培 养的 方 法 来提高s - p l 的 产量， 首先将s a l b u l u s 在含有2 0 g / l 甘油 和5 9 / l 酵母膏的 培养 基中3 0 培养1 d ， 然后过滤， 将收 集到的 菌丝接 入含有2 0 g / l 葡萄搪、 2 0 叭 柠檬 酸 和1 0 叭 硫酸 按的 培 养基中 ， 培 养8 - 9 天 后得 到。 - p l 产量 为4 - 5 叭。 为 了 进 一 步 提 高e - p l 的 产 量， h ir a k i 等 14 0 1( 1 9 9 8 ) 通 过 诱 变 对 菌 种 进 行改 造. s - p l的 合成可能途经赖氨酸代谢支路， 最后经聚合酶作用生成。 在赖氨酸代谢 通路中 ， 存在终产物赖氨酸的 反馈抑制，因 此选用赖氨 酸的 结构 类似物 s - ( 2 - 氨 乙 基- l 一 半肤氨酸( a e c ) 作为抗性 筛选标记可以 消除 赖氨酸的反 馈抑制，抗性物 质甘氨酸可以 代替 d 一 丙氨酸掺人细胞壁，破坏肤聚糖短肤间的交联，影响细胞 壁的 通 透性。 诱变选育了a c e + g 了突变株， 发现 变异株