（微生物学专业论文）青霉pt95菌株菌核中积累油脂的研究.pdf

摘要 摘要 从山西汾阳混交林土壤中分离到一株能在菌核内积累类胡萝卜素的 青霉p t 9 5 菌株，通过形态观察和r a p d 分析已经将p t 9 5 菌株鉴定到 青霉属汤姆青霉系( p e n i c i l l i u mt h o m i is e r i e s ) ，并对该菌株产类胡萝t - 素 情况进行了分析研究。本论文主要从以下几方面对p t 9 5 菌株在固态培 养条件下菌核中积累油脂进行了研究。 对p t 9 5 菌株在察氏、j o h a m s 、p d a 培养基上的生长周期、菌核 生物量、油脂含量与油脂产率进行了比较，结果表明：葡萄糖作为 碳源有利于p t 9 5 菌株产生大量菌核、获得高产率油脂；( 篁) j o h a m s 培养 基能缩短p t 9 5 菌株生长周期且能较大幅度提高油脂产率；光照培养 有利p t 9 5 菌株进行油脂的积累。 培养基中不同的碳氮比对p t 9 5 菌株菌核分化和积累油脂的影响表 现在：碳氮比为3 0 ：1 时，p t 9 5 菌株菌核生物量达到最高；碳氮比为 7 0 ：1 时，油脂含量和油脂产率为最高；碳氮比在1 0 ：1 至7 0 ：1 范围 内，随着碳氮比的增加，油脂含量也相应地增加。 分析了不同氮源对p t 9 5 菌株在j o h a m s 培养基上的菌核分化、菌 核生物量、油脂产率的影响，结果表明：蛋白胨、硝酸钠、硝酸铵作 为氮源有利于p t 9 5 菌株菌核分化、积累油脂；尿素、氯化铵、硫酸 铵不支持青霉p t 9 5 生长。 分析了磷酸氢二钾、硫酸亚铁对p t 9 5 菌株菌核生物量、油脂含量 与油脂产率的影响，发现磷酸氢二钾浓度在0 5 9 l 至1 0 9 l 范围内， p t 9 5 菌株菌核生物量、油脂产率随着磷酸氢二钾浓度的增加而增加； 硫酸亚铁浓度越高，对p t 9 5 菌株菌核分化与油脂积累的抑制作用越 强。 通过正交实验对p t 9 5 菌株的培养条件进行了优化，最佳培养基的 配方为：葡萄糖1 5 7 5 9 ；n h 4 n 0 31 0 9 ；k z h p 0 40 5 9 ；m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 9 ；k c l0 1 4 9 ：f e s 0 40 0 0 2 9 ；z n c l 20 0 0 2 9 ；m n c l 2o 0 0 2 9 ：硫胺 素o 0 0 0 1 9 ；琼脂2 0 9 ；加蒸馏水至1 0 0 0m l ；培养时间1 4 天。对正交 实验结果进行方差分析，表明：碳氮比和培养时问是影响p t 9 5 菌株积 青霉p t 9 5 菌株菌核中积累油脂的研究 累油脂的显著因子，磷酸氢二钾浓度对p t 9 5 菌株积累油脂的影响不显 著。 用优化培养基培养p t 9 5 菌株，发现p t 9 5 菌株菌核生物量、油脂 产率在菌核成熟期达到了最高值，分别为5 3 9 m g 平板、1 7 8 1 3 m g 平 板，油脂含量在第八天达到了4 1 2 的最高值，并对p t 9 5 菌株所积累 油脂成份进行了初步分析，其油脂的组成为月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、 花生酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生烯酸、二十碳二烯 酸。 关键词：青霉；菌核；油脂积累 摘要 a b s t r a c t as t r a i no fp e n i c i l l i u ms p p t 9 5w a si s o l a t e df r o ms o i ls a m p l ec o l l e c t e d c l o s et of e n y a n g ，s h a n x ip r o v i n c e t h es t r a i nc a l lf o r ma b u n d a n to r a n g e ， s a n d s h a p e d s c l e r o t i ai nw h i c hc a r o t e n o i da r ea c c u m u l a t e d b y m o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n dr a p dt y p i n g ，p t 9 5s t r a i nh a db e e n i d e n t i f i e dt opt h o m i is e r i e s t h ea n a l y s i sh a db e e nd o n eo na c c u m u l a t i o no f c a r o t e n o i di ns c l e r o t i a t h ea i mo ft h i sp a p e rw a ss t u d y i n gt h ee f f e c t so f v a r i o u sf a c t o r so nl i p i da c c u m u l a t i o ni ns c l e r o t i ao fp t 9 5s t r a i no na g a r m e d i a b yc o m p a r i n gg r o w t hp e r i o d ，s c l e r o t i a lb i o m a s s ，c o n t e n to fl i p i da n dl i p i d y i e l do f p t 9 5s t r a i ni nc z a p e ka g a t ( c a ) ，p o t a t od e x t r o s ea g a r ( p d a ) a n d j o h a m sn u t r i e n ta g a rm e d i a ，i tw a sf o u n dt h a tl i g h tg r o w t hc o n d i t i o nw a s f a v o r a b l et of o r m a t i o no fs c l e r o t i aa n dl i p i db i o s y n t h e s i so ft h i s f u n g u s j o h a m sn u t r i e n ta g a rm e d i u mc o u l ds h o r t e nt h eg r o w t hp e r i o da n de n h a n c e l i p i dy i e l do f p t 9 5s t r a i n t h eh i g h e s tl i p i dy i e l dw a so b t a i n e dw h e ng l u c o s e w a su s e da sc a r b o ns o u r c e s t u d i e so nt h ei n f l u e n c eo fc no ns c l e r o t i a lb i o m a s sa n dl i p i dp r o d u c t i o n o fp t 9 5d e m o n s t r a t e dt h a tl i p i dc o n t e n ta n dl i p i dy i e l dr e m a i n e dt h eh i g h e s t a tac n r a t i oo f7 0 ：1a n ds c l e r o t i a lb i o m a s sr e m a i n e dt h eh i g h e s ta tac n r a t i oo f3 0 ：1 a tc n r a t i o sh i g h e rt h a n10 ：1l i p i dc o n t e n ta n dl i p i dy i e l d o f p t 9 5s t r a i ni n c r e a s e dg r a d u a l l yu n t i lc n - r a t i oo f7 0 ：1 b yc o m p a r i n gg r o w t hp e r i o d ，s e l e r o t i a lb i o m a s sa n dl i p i dc o n t e n ta n dl i p i d y i e l do fp t 9 5s t r a i no nm e d i ac o n t a i n i n gd i f f e r e n tn i t r o g e ns o u r c e s ，i tw a s f o u n dt h a tp e p t o n e ，n a n 0 3a n dn h 4 n 0 3w e r ef a v o r a b l et ot h ef o r m a t i o no f s c l e r o t i aa n dl i p i d b i o s y n t h e s i s o ft h i s f u n g u s a m o n gs e v e r a ln i t r o g e n s o u r c e st e s t e d ，u r e a ，n h 4 c 1a n d ( n h 4 ) 2 8 0 4d i dn o ts u p p o r tp t 9 5s t r a i n g r o w t hu n d e rt h et e s t e dc o n c e n t r a t i o n s t h ee f f e c t so fk 2 i - i p 0 4a n df e s 0 4o ns c l e r o t i a lb i o m a s s ，l i p i dc o n t e n ta n d l i p i dy i e l dw e r es t u d i e d t h et o t a ls c l e r o t i a lb i o m a s sa n dl i p i dy i e l di n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o no fk 2 h p 0 4 ( o 5 9 l 1 o g l ) i nt h em e d i a t 1t 青霉p t 9 5 菌株团板中积岽油腊酮研艽 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ h o w e v e r ，f e s 0 4 c o u l di n h i b i ts c l e r o t i a l d i f f e r e n t i a t i o n a n d l i p i d a c c u m u l a t i o n t h eh i g h e rt h ec o n c e n t r a t i o no ff e s 0 4w a s ，t h es t r o n g e rt h e i n h i b i t i o nw a s t h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u mm e d i u mw a so b t a i n e da n d c o n t a i n e d p e r l i t e r ：g l u c o s e1 5 7 5 9 ，n i - 1 4 n 0 31 0 9 ，k 2 h p 0 4o 5 9 ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，k c lo 1 4 9 ，f e s 0 40 , 0 0 2 9 ，z n c l 20 0 0 2 9 ，m n c l 20 0 0 2 9 ， t h i a m i n0 0 0 01g ，a g a r2 0 9 u n d e rt h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n s ，t h el i p i d v i e l d sr e a c h e di t sm a x i m u mv a l u e so f1 7 3 5 9 r a ga tt h e1 4 t hd a y t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h ei n f l u e n c eo f t h ec a r b o nt on i t r o g e nr a t i oa n dc u l t u r eu m ew a s o b v i o u sa n dt h a to fk 2 h p 0 4 w a sn o to b v i o u s t h ei n f l u e n c eo fc u l t u r et i m eo ns c l e r o t i a lb i o m a s s ，l i p i dc o n t e n ta n dl i p i d v i e l do fp t 9 5s t r a i ni no p t i m u mm e d i u mw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss u g g e s t e d t h a t l i p i d a c c u m u l a t i o nw a sc l o s e l ya s s o c i a t e d w i t ht h es c l e r o t i a l d i f f 色r e m i a t i o no fp t 9 5 t h ed a t as h o w e dt h a ts c l e r o t i a lb i o m a s sa n dl i p i d v i e l dw a si n c r e a s i n gu n t i lm a t u r ep e r i o d so fs c l e r o t i a p t 9 5c o u l da c c u m u l a t e h i g h e s tl i p i di ns c l e r o t i a ( 41 2 ) w h e ng r o w ni no p t i m u mm e d i u ma tt h e e i g h t hd a y t h eh i g h e s tl i p i dy i e l d a n dh i g h e s ts c l e r o t i a lb i o m a s sw e r e o b t a i n e du n d e ro p t i m u mm e d i u ma tt h em a t u r ep e r i o d so fs c l e r o t i a ，r e a c h e d r e s p e c t i v e l y1 7 8 1 3m g a n d5 3 9m gp e rp l a t e ap r e l i m i n a r ya n a l y s i so nt h e f a t t ya c i dc o m p o s i t i o nw a sp e r f o r m e d t h el i p i di n s c l e r o t i ao fp t 9 5w e r e c o m p o s e do fd o d e c a n o i ca c i d ，p a l m i t i ca c i d ，s t e a r i ca c i d ，e j c o s a n o i c a c i d ， d a l m i t o l e i ca c i d ，o l e i ca c i d ，l i n o l e i ca c i d ，l i n o l e n i ca c i d ，e i c o s e n o i ca c i da n d e i c o s a d l i e n o i ca c i d k e yw o r d s ：p e n i c i l l i u ms p ；s c l e r o t i a ；l i p i da c c u m u l a t i o n 第一章文献综述 第一章文献综述 油脂与人类日常生活的关系与日俱增，它不但是维持生命的重要物质，也是工 业生产的重要原料。当前，用于生产油脂的原料主要来源于石油和动植物等，而石 油储藏量却在逐年减少，动植物的养殖业和种植业饱和，加上人口的增长使得不断 增加的油脂需求量与自然资源严重短缺的矛盾日益尖锐，特别是随着日趋严重的全 球性能源短缺与环境恶化，使得人们不得不从环境保护与资源开发的角度出发，积 极开发替代化石燃料的可再生新能源。因此多渠道开发其他油脂资源就成为必然， 相应地开辟微生物油脂这一新的油脂资源的，千发和研究，不仅丰富了传统的油脂工 业技术，而且也将是工业化生产油脂的一个重要途径【l 。】。 l 微生物油脂的研究进展 国内外研究状况 微生物油脂( m i c r o b i a lo i l s ) 又称单细胞油脂( s i n g l ec e l lo i l ，s c o ) ，是由酵 母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普 通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂p j 。利用微生物产生油脂，与传统的油 脂生产工艺相比除具有油脂含量高外，还有许多优点。微生物细胞增殖快，生产周 期短；微生物生长所需的原料丰富，价格便宜，且能利用农副产品及食品工业、造 纸工业中产生的废弃物，起到保护环境作用；所需劳动力少同时不受季节、气候变 化的限制；能连续大规模生产，并且能够降低成本：还能利用细胞融合、细胞诱变 等手段，使微生物生产出比动、植物油脂更符合人体需要的高营养油脂或某些特 定脂肪酸组成的油脂。 微生物产生油脂研究已有半个多世纪的历史。第二次世界大战期间，由于连年 战火，油脂奇缺，德国科学家们就开始了微生物生产油脂的研究工作，并发现了高 产油脂的斯达油脂酵母( l i p a n y c e ss t a r k e y i ) 、粘红酵母( r h o d o t o r u l ag l u t i n i s ) 、 曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 以及毛霉属( m u c o r ) 等微生物。2 0 世纪8 0 年代初，日本成 功地建立了发酵法工业化生产长链二元酸的新技术，结束了以蓖麻油裂解合成十三 碳二元酸的历史。1 9 8 6 年，日本和英国等国家率先推出含微生物y 一亚麻酸 ( g l a ) 油脂的保健食品、功能性饮料和高级化妆品等产品，微生物油脂实用化已 迈出了第一步 4 】。1 9 8 8 年我国上海工业微生物研究所h j 手艮道了g l a 的发酵生产，其 g l a 占油脂总量的8 o 。1 9 9 3 年张峻【6 等人筛选到一株被孢霉( m o r t i e r e l l a 青霉p t 9 5 菌株菌核中积累油脂的研究 i s a b e l l i n a ) 的突变株m 6 ，其菌体得率为2 5 ，油脂含量为3 2 8 ，g l a 含量为 8 8 4 。同年，据南开大学生物系报道 ，他们用深黄被孢霉a s3 3 4 1 0 为出发菌 株，经紫外诱变得变异菌株，在1 0 l 罐中发酵产生g l a 时，菌体得率为2 9 3 ， 油脂含量达4 4 7 ，其中g l a 含量达9 4 4 。1 9 9 8 年杨革等人f 6 目以拉曼被孢霉 ( m o r t i e r e l l ar a m a n n i a n a ) s m 5 4 1 为原始菌株，经过紫外线复合氯化锂诱变处理， 得到突变株s m 5 4 1 - 9 ，其油脂含量由5 8 9 l 提升到1 5 7 9 l ，花生四烯酸 ( a r a c h i d o n i ca c i d ，从) 含量由3 2 1 m g l 增加到6 2 3 m g l 。传代实验表明， s m 5 4 1 9 具有良好的遗传稳定性。不过这方面与国外先进水平仍有一定差距。2 0 0 3 年施安辉、周波通过对粘红酵母g r l ；。生产油脂最佳小型工艺发酵条件的探讨发 现，最终油脂产量可达菌体干重的6 7 | 2 ，油脂成份分析结果为：3 3 - 3 1 的棕榈 酸；3 8 0 的油酸；o 2 0 的v 一亚油酸；2 6 0 的二十碳五烯酸 ( e i c o s a p e n t a e n o a t ea c i d ，e p a ) 和3 6 0 的二十二碳六烯酸( d o c o s a h e x a e n o a t e a c i d ，d h a ) 峭j 。清华大学吴庆余、缪晓玲通过异养转化细胞工程技术获得了脂类含 量高达细胞干重5 5 的异养藻细胞 9 1 。 进入2 0 世纪9 0 年代，特种油脂的发展越来越受人们的重视。罗玉萍 1 0 1 分离到 一株高产棕榈油酸的酵母，总腊中棕榈油酸含量高达5 0 1 4 。m a t s u n a g a 等筛选到 两株c y a n o b a c t e t i a 总脂中棕榈油酸的含量分别达5 4 4 年1 15 4 5 。这些工作为利用 微生物发酵生产棕榈油酸提供了广阔的前景：s t e wd a n s k 和r a d e v a n 分别筛选到产 生a a 的真菌，他们总脂中a a 的含量高达4 2 5 5 川；1 9 9 6 年y a z a w a 等从 p a c i f i c m a r k a r e l 的肠内容物中分离到一株叫s c r c 一2 3 7 8 的海生细菌，能产生e p a ， 其含量达2 4 - - 4 0 ，被认为是e p a 的一种新资源。1 9 9 6 年n a k a h a r a 等从海水中分 离到一株s c h i z o c h y t r i u ms p s r 2 1 ，其d h a 产量达到每天2 9 l 。1 9 9 6 年s i n g h 等在 优化培养基上对t h r a u s t o c h yt r i u ma t c c 2 8 2 1 0 进行培养，5 天后d h a 产量达到 1 0 6 1 m g l 。研究者还发现某些海藻和硅藻也能生产出较高产量的e p a 。据文献报 道，产特种油脂微生物主要有三类，即真菌、藻类和细菌等。最新文献报道在氮源 缺陷型培养基中，深黄被孢霉表现出了显著的生长活性( 其生物量达3 5 9 l ) 和 高糖摄入量，即使培养基的初始浓度很高也如此。待氮源耗尽后，真菌菌体中将会 大量积累脂肪，从而得到一个油脂产量为1 8 1 9 l 的可观的培养结果，总菌体干重 和油脂得率都得到大幅度的增加( 每消耗lg 葡萄糖分别增加o 3 4 9 和0 1 7 9 ) 。所 得到的微生物油脂中，其g l a 的质量分数为：3 5 1 0 ，即相当于每克干菌体可 以得到1 6 1 9 m gg l a ，每升培养基液可得到g l a 的最大质量浓度为o 8 0 1 9 。 第一章文献综述 与此同时，利用微生物生产油脂也逐步走出实验室，出现产业化、规模化生产 趋势。1 9 8 6 年以来，英、日等国已相继投入工业化生产，英国j o h n 和s t u r g e 公司 发酵法生产g l a 的年产量为1 0 0 t 以上。我国这方面起步较晚，如武汉烯王生物工 程有限公司曾于2 0 0 0 年引进中国科学院等离子体物理研究所的花生四烯酸高产发 酵技术，在5 0 t 罐生产时，总脂的a a 含量在5 0 以上，干菌体得率超过3 ，总 油脂超过3 0 。 1 2 微生物产生油脂机理 细菌、酵母、霉菌、藻类中都有产油菌株，但以酵母菌和霉菌类真核微生物居 多。在酵母、霉菌等真核微生物中，某些产油种属能积累占其生物总量7 0 以上的 油脂，其中以甘油三酯( t r i a c y l g l y c e r o l ，t a g ) 为主，约占8 0 以上，磷脂约占 1 0 以上。t a g 的主要功能普遍认为是作为碳源和能源的储备化合物，因它具有比 碳水化合物和蛋白质高的热值，一经氧化将产生很高的能量。另外还具有维持膜结 构完整和正常功能的作用。t a g 在能量储存和能量平衡上占有重要的地位，与游离 脂肪酸相比，其具有低生物毒性，因而为不同种类的脂肪酸提供了合适的贮存形 式。 1 r 2 1 微生物油脂的生物合成 微生物产生油脂过程，本质上与动植物产生油脂过程相似，生物合成t a g 是 动、植物和微生物界广泛存在的多酶催化过程，属初级代谢的一部分“。目前研究 表明1 3 ，t a g 的合成代谢中关键的两个中间产物是磷脂酸( p a ) 和甘油二酯 ( d a g ) 。酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 细胞中p a 的合成与其他真核细 胞中合成类似，存在两条途径，即甘油一3 一磷酸( g 一3 p ) 途径和磷酸二羟丙酮 ( d h a p ) 途径。甘油一3 磷酸( g 一3 一p ) 途径通过其酰基转移酶( g a t ) 在s h 1 位 酰化，形成溶血磷脂酸( l p a ) 。同样地，d h a p 在其相应的酰基转移酶 ( d h a p a t ) 催化下在s h 1 位酰化，生成的1 - a c y l - d h a p 被其还原酶( a d r ) 还原 也生成l p a 。最近在分子水平研究t a g 的生物合成时还发现，g a t l p 和g a t 2 p 均能 以g 3 p 和d h a p 为底物，而表现为双重底物特性的啪1 位酰基转移酶i l 。l p a 在相应脂肪酰转移酶( a g a t ) 作用下在s v 2 位酰化，形成p a 。另外p a 也可以磷 脂为前提在磷脂酶d 作用下生成。 磷脂酸在磷脂酸磷酸酶( p a p ) 作用下去磷酸化形成d a g ，这是d a g 形成的 主要途径。另外，d a g 也可由磷脂酶c 催化水解磷脂得到。研究表明，d a g 转化 青霉p t 9 5 菌株菌核中积累油脂的研究 为t a g 时的酰基转移反应并不是由单一的脂肪酰基转移酶完成的 ”】。酿酒酵母 d a g 酰化生成t a g 主要有两个酶d g a l p 和l r o l p 参与催化，前者是标准的甘油二 酯酰基转移酶( d a g a t ) ，同t a g 合成途径中另外两个酰基转移酶一样以脂肪酰 c o a 为酰基供体；后者则以卵磷脂为酰基供体，表现为磷脂：甘油- - n 酰基转移酶 ( p d a t ) 的活性，将供体分子中s n 一2 位酰基转至t a g 的s n 3 位卅。最近的研究 发现还有两个具有脂肪酰c o a ：胆甾醇酰基转移酶( a c a t ) 活性的蛋白质a r e l p 和a r e 2 p ，可能也用脂肪酰c o a 为酰基供体，参与d a g 酰化反应m j 。另外，放射 性同位素标记实验发现酿酒酵母的微粒体成份能以d a g 和游离脂肪酸为底物合成 t a g 【l ”。但到目前为止尚未见分离或详细生物化学表征这种利用游离脂肪酸为酰基 供体的酰基转移酶的报道。 关于产油酵母t a g 合成多酶体系的研究工作直到最近才开始卅。实验表明粘 红酵母( r g l u t i n i s ) t a g 合成多酶体系存在于细胞溶胶中，主要通过蛋白质问相互 作用复合在一起。实验中分离出的多酶体系包含酰基载体蛋白( a c p ) 、酰基一a c p 合成酶、a g a t 、p a p 、和d a g a t 。该多酶体系不仅能利用l p a 和脂肪酰c o a 合 成t a g ，而且还可接受游离脂肪酸，合成t a g 及相关中间体。后来，还发现一个铁超 氧化物歧化酶( f e s o d ) 也和t a g 合成多酶体系复合在一起，其作用可能是防止 底物( 如不饱和脂肪酸) 和多酶体系中的蛋白质受到活性氧化物的损害【2 0 】。e m s 基 因突变法使粘红酵母细胞溶胶t a g 合成多酶体系失活，导致细胞生长和t a g 生物 合成速率下降口“。 可见，对产油微生物t a g 合成途径的研究还刚起步，微生物t a g 的生物合成 途径中仍然存在着许多富有挑战性的研究课题，对这些课题的深入研究非常有利于 将来在生产实践中应用产油微生物资源。 1 2 2 微生物油脂合成代谢调控 虽然阐明从脂肪酰c o a 合成t a g 的途径在油脂合成中非常重要，但该途径并不 是产油微生物所特有的。事实上，产油微生物对油脂积累的重要调控元件是有关脂 肪酸合成的一些因素。 目前，人们对产油酵母和产油霉菌利用葡萄糖为碳源积累t a g 的代谢途径已 有比较深入的认识，当产油微生物培养基中可同化氮源耗尽并且可同化碳源丰富的 情况下，其t a g 积累过程被激活。这个过程牵涉到微生物代谢和与代谢相关的一 系列生理生化过程的变化。首先，当氮源枯竭时，产油微生物的酰苷一磷酸 ( a m p ) 脱氨酶活性增加，a m p 脱氨酶将a m p 大量转化为肌苷一磷酸( i m p ) $ n 4 第一章文献综述 氨，相当于微生物对缺氮的一种应激反应【2 2 1 。通常产油酵母线粒体中异柠檬酸脱氢 酶( i c d h ) 都是a m p 依赖性脱氢酶，细胞内a m p 浓度的降低将减弱甚至完全停 止该酶的活性【2 ”。因此，异柠檬酸不再被代谢为2 酮戊二酸，三羧酸( t c a ) 陷入低 迷状态，代谢路径发生改变。线粒体中积累的柠檬酸通过线粒体内膜上的苹果酸柠 檬酸转移酶转运进入细胞溶胶中口“，在a t p ：柠檬酸裂解酶( a c l ) 的作用下裂解 生成乙酰c o a 和草酰乙酸。这样，微生物在氮源枯竭、蛋白质合成停滞的情况下仍 可将葡萄糖有效地代谢为乙酰c o a ，并在脂肪酸合成酶( f a s ) 的作用下完成脂肪酰 c o a 的合成。然而，在有些产油真菌中i c d h 的体外活性并不完全依赖于 a m p 【2 5 j 。当环境氮源耗竭后a m p 的浓度降低，仍然会减量调节i c d h 的活力，激 活这些真菌的油脂积累代谢。在产油接合菌中，只有当无细胞抽提物中检测不出 i c d h 活性时，油脂的积累过程才会启动【2 “。如果能发展一种选择性抑制产油微生 物i c d h 的工具，也许可以在更宽松的培养条件下使微生物在菌体内大量富积油 腊。然而到目前为止，产油微生物在响应限氮条件时a m p 脱氢酶的上游信号传导 机制还很不明确。另一个很基础的问题是，产油微生物为什么没有选择体内其它更 易得到的含氮有机分子，而是选择了a m p 作为氮的补充来源? 产油微生物油脂合成代谢调控中有两个关键酶，即a c l 和苹果酸酶( m e ) 。 柠檬酸裂解酶在细胞溶胶中催化柠檬酸裂解反应，提供油脂合成所需的乙酰c o a 。 a c l 的活性与产油微生物的油脂积累的能力具有很强的相关性，还没有发现微生物 能积累t a g 超过其生物量的2 0 却没有a c l 活性的例子。然而有一小部分的酵母 菌具有a c l 活性，但油脂的积累仍然不会超过生物量的1 0 。因此，a c l 是油脂 积累的个先决条件，但并不是有这种酶的微生物都是产油微生物 2 ”。在不同酵母 和真菌中也没有发现油脂积累的程度和a c l 的活性具有明确的定量关系。 a c l 催化反应的另一产物草酰乙酸首先由苹果酸脱氢酶( m d h ) 还原成苹果 酸，再在m e 作用下氧化脱羧得到丙酮酸，并释放n a d p h 。其中丙酮酸可透过线 粒体膜进入线粒体，参与新一轮循环，而n a d p h 作为脂肪酸合成酶进行链延伸必 不可少的辅助因子留在细胞溶胶中。线粒体中的丙酮酸既可以通过丙酮酸脱氢酶 ( p d h ) 产生乙酰c o a ，又可在丙酮酸羧化酶( p y c ) 的作用下产生草酰乙酸。这 两个产物在柠檬酸合成酶( c s ) 催化下合成柠檬酸，即a c l 的底物，完成产油微 生物t a g 合成调控最重要的代谢循环。值得注意的是，线粒体中乙酰c o a 无法直 接穿透线粒体内膜而进入细胞溶胶中参与脂肪酸合成。 青霉p t 9 5 菌株苗核中稠累油脂的研究 脂肪酸合成不仅需要连续供给乙酰c o a 用于碳链延伸，还需要提供足够的 n a d p h 。每一个乙酰c o a 单元在新生脂肪酸碳链上延伸时需消耗两当量的n a d p h 用于还原反应。研究表明，产油微生物油脂积累的多少与m e 的代谢调控有关，如 果m e 受到抑制，则油脂积累下降。这是因为虽然微生物代谢途径中由许多生成 n a d p h 的过程，但f a s 几乎只能利用由m e 产生的n a d p h 2 8 】。因此，有人认为 产油微生物中f a s 和m e 等可能有机地复合在一起形成成脂代谢体( l i p o g e n i c m e t a b o l o n ) 2 9 1 。因此，如果能鉴定和分离产油微生物的m e 基因，就可以利用基因 工程手段甚至化学生物学手段选择性调控苹果酸酶的活性，提高微生物产油能力 1 2 。 当然，当外界条件改变时产油微生物体内的t a g 也可能被降解。有的产油霉 菌只要培养基中碳源耗竭后就会大量分解储存的t a g ；而有的则还需要培养环境中 有较丰富的铁离子、镁离子或酵母提取物时才会启动降解储存t a g 的机制。 虽然目前对产油微生物t a g 生物合成和代谢调控机制的研究已取得了重要进 展，但尚未见成功地通过基因调控手段增加细胞内油脂贮存含量的例子 i ”。所以， 微生物产油脂领域具有广阔的研究和发展空间。随着石化资源日益枯竭和世界各国 能源形式日趋严峻，通过微生物转化和利用基因碳水化合物的可再生资源已成为社 会经济可持续发展的迫切要求。应充分利用现代分子微生物学、化学生物学和生物 化工技术的最新成果，加快对产油微生物菌种筛选、改良、代谢调控和发酵工程的 研究，降低获取微生物油脂的成本，使微生物产油的研究领域取得更快的发展。 1 3 微生物油脂的组成及生理功能 微生物发酵过程所产生的油脂，在组成成分上类似植物油，主要有中性油脂、游 离脂肪酸、类脂物及不皂化物，其中类胡萝b 素、亚油酸、y 一亚麻酸、二十碳五烯 酸、二十二碳六烯酸等多不饱和脂肪酸具有特殊的生理功能。 1 3 1 类胡萝l 、素 约有1 0 酐j 类胡萝b 素是维生素a n 前体 3 0 - 。3 1 ，人体缺乏维生素a 易得夜盲 症。类胡萝h 素的高活性的富含电子的长多烯碳链，使它具有抗过氧化自由基的作 用。许多研究【弘蚓表明，在机体衰老、患病及炎症过程中，体内自由基增加，而类 胡萝b 素能抑制自由基的产生，可以延缓衰老和预防癌症。类胡萝b 素是一种营养 性抗氧化剂。抗氧化剂是指能防止食品成分因氧化而导致变质的一类添加剂。抗氧 第一章文献综述 化剂在保护人体不受自由基所致的氧化损伤中具有十分重要的作用。另外，它还具 有着色功能，还是一种生理抗氧化剂，能增强动物的繁殖能力等等。 由于类胡萝h 素具有上面的诸多功能，因此，类胡萝h 素是理想的天然食品色 素，又是具有保健功效的食品添加剂。由于类胡萝h 素是一种脂溶性色素，其在食 品中的应用受到限制，在类胡萝h 素中添加一定量的乳化剂，可得到在水相和油相 均能很好溶解的粉制剂，还可以提高色素的稳定性【3 7 1 。 1 3 2 亚油酸 亚油酸能促进幼儿生长发育，防止和减轻老年人的动脉粥样硬化口8 1 。 1 3 3y 一亚麻酸( g l a ) g l a 是人体的一种必需脂肪酸，在一般的天然油料植物中并不存在。这种物质 与人体健康很有关系，是人体合成前列腺素( p g ) 等具有强烈生理活性的自身调节 物质的前体，如前列腺素e 具有阻止血液中胆固醇积累，防止血小板凝集，保护急 性心肌缺血，抑制动脉硬化斑块形成等多种重要的生理功能。而g l a 的缺乏会抑 制p g 的合成，从而引起血压升高、动脉硬化、血栓形成、糖尿病、风湿病、肥胖 症和皮肤老化等疾病。此外，g l a 还能改善过敏性皮炎、多发性皮肤硬化症、酒精 中毒等功能。1 9 9 0 年h a y a s h i 等利用a h 一1 0 9 a 鼠肝癌细胞发现g l a 的抗癌活性以 及在体外g l a 对血清白蛋白的抗癌作用 4 1 。由此可见，g l a 具有极其重要的生物 活性及营养与医疗方面的应用价值，引起各国学者的关注。以前国际上销售g l a 主 要是从月见草的种子油中提取口”，但是月见草的来源受天气、产地等的影响，不能 满足市场的需求。而微生物发酵法生产却不受原料限制，精炼成本也较低。在这方 面的研究日本已走在前面。1 9 8 5 年o s a m as u z u k i 等对深黄被孢霉( m o r t i e r e l l a i s a b e l l i n a ) 等进行了葡萄糖浓度为6 0 4 0 0 r g l 的高浓度碳源发酵培养，结果油脂含量 为3 5 7 0 ，g l a 含量为3 1 1 。1 9 8 7 年蓑岛良一等用雅致小克银汉霉 ( c u n n i n g h a m e l l ae l e g a n sl e n d n ) 发酵生产g l a ，其含量可达18 左右。自19 8 6 年以来，英国、日本已将发酵的g l a 产品投放市场，产品主要用于医药、保健食 品、功能性饮料和高级化妆品。这方面研究在国内少有报道，且y 一亚麻酸含量为 8 左右，与国外相比差距较大 4 0 1 。 1 3 4 二十碳五烯酸( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) e p a 和d h a 能极有效地降低血脂、胆固醇，提高高密度脂蛋白，抑制血小板 凝集，溶解血栓，同时，d h a 是大脑髓质的重要组成部分，因此能明显改善血栓性 痴呆，高血脂糖尿病的症状，对免疫系统疾病具有缓解作用，并可提高青少年智 青霉p t 9 5 菌株菌核中积累油脂的研究 商，增强中老年人的记忆力，提高孕妇、胎儿及新生婴儿的身体素质，促进胎儿和 新生婴儿的大脑发育。但人体自身不能合成e p a 和d h a ，只能从食物中摄取，大 自然中除深海鱼脑中含量较丰富外，其他食物中含量都很低。若能根据微生物的脂 肪酸代谢合成途径，致使微生物产生大量e p a 和d h a ，那么其前途将无可限量。 1 3 5 新型实用油脂一结构脂( s l ) 结构脂是人工合成的新一类油脂，主要是指将短碳链脂肪酸、中碳链脂肪酸中 的一种或两种均有，与长链脂肪酸一起与甘油结合，所形成的新型脂质。它是既有 短中链饱和脂肪酸，又有长链不饱和脂肪酸的新一代食用油脂一结构酯( s l ) 。s l 具有改善免疫功能、防止网状内皮系统受损、降低癌症发病率、防止形成血栓、降 低胆固醇、改善平衡等生理功能1 4 卜4 2 1 。 1 4 产油脂的微生物 能够生产油脂的微生物有酵母、霉菌、细菌和藻类等，其中真核的酵母、霉菌 和藻类能合成与植物油组成相似的甘油三酯，而原核的细菌则合成特殊的脂类。目 前研究较多的是酵母、藻类和霉菌。现在用于生产多不饱和脂肪酸的微生物主要为 藻类、细菌和真菌，由于细菌产量低所以目前主要集中在藻类和真菌。常见的产油 酵母有：浅白色隐球酵母( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 、弯隐球酵母( c r y p t o c o c c u s a l b i d u s ) 、斯达氏油脂酵母( l i p a n y c e ss t a r k e y i ) 、茁芽丝孢酵母( t r i c h o , s p i r o n p u l l u l a n s ) 、产油油脂酵母( l i p o m ys t i p o f e r ) 、胶粘红酵母( r h o d o t o r u l ag i u l i n i s ) 、类 酵母红冬饱( r h o d o s p o r i d i u mt o r u l o i d e s ) 等。常见的产油霉菌有：土霉菌s o e r g u l l u s t e r r e u s ) 、紫瘫麦角菌( c l a v i c e p s p u r p u r e a ) 、高梁褶抱黑粉菌( t o l y p o s p o r i u m ) 、高i j j 被孢霉( m o r t i e r e l l aa l p i n a ) 、深黄被孢霉( m o r t i e r e l l a 捃a b e l l i n a ) 等。常见的产油海藻 有：硅藻( d i a t o m ) 和螺旋藻( s p i r u l i n a ) 。 1 5 多不饱和脂肪酸的研究进展 多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ，p u f a s ) 系指含有两个或更多个双 键的长链脂肪酸，因其独特的生物活性，已经进入生物制药和营养保健品领域。在 过去的2 0 年中，人们越来越多地意识至f j p u f a s 的缺乏与某些疾病有关，除了其潜在 的制药应用以外，p u f a s 在食物源中的存在和公众对健康食品的重视，而使这些化 合物引起消费者的广泛关注。特别是含有单个或更多个非共轭顺式双键的c i8 _ 2 2 p u f a s ，因潜在的治疗学和营养学等方面的作用而引起研究者的极大兴趣【50 1 。 第一章文献综述 p u f a s 存在于动物和植物中，但在微生物特别在一些藻类、真菌和细菌中含量 丰富，且多以贮存油和膜