（微生物学专业论文）溶源性发酵乳杆菌及其温和噬菌体的研究.pdf

山东大学博士学位论文 溶源性发酵乳杆菌及其温和噬菌体的研究 摘要 酸奶是国内主要的发酵乳制品，由于具有多种保健功能而深受消费者的青 昧。目前，酸奶的生产菌株除了常见的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌外，还有双 岐杆菌和嗜酸乳杆菌。为了进一步改善酸奶的保健功能，生产各种特色酸奶，很 有必要对其它益生乳杆菌的生理特性进行详细研究。像乳酪发酵过程一样，酸奶 生产也同样受到噬菌体的威胁。随着国内酸奶生产规模和种类的增加，噬菌体的 危害也逐渐显现出来，甚至导致酸奶发酵的失败。但目前国内外对于酸奶生产菌 株噬菌体的研究报道较少，国内尚处空白。鉴于上述情况，本论文重点对酸奶来 源的乳杆菌及其噬菌体进行研究，以期为降低酸奶发酵过程中噬菌体的污染奠定 理论基础。 本实验从国内2 0 种不同晶牌酸奶中分离到2 0 株杆菌，经形态观察、革兰氏 染色、过氧化氢酶反应等特性分析初步证明是乳杆菌。利用丝裂霉素c ( m m c ) 诱导法，对上述2 0 株乳杆菌进行溶源性检测，结果发现其中7 株是溶源性菌株。 诱导的噬菌体经过电镜观察发现，形态均呈典型的蝌蚪状，有六边形的头、长而 非收缩性的尾，在噬菌体分类中属于有尾噬菌体目( u r o v i r a l e s ) 、s i p h o v i r e d a e 科( 指具有长而非收缩性尾) 。经限制性内切酶分析，7 个噬菌体的基因组d n a 具有相同的限制性内切酶图谱，推断它们为同一种噬菌体，命名为c y b 5 ，宿主 菌为乳杆菌y b 5 。 逶过s d s p a g e 对噬菌体巾y b 5 外壳蛋白进行分析，得知其外壳蛋白的主 要成分是一个分子量为3 1 9k d a 的蛋白，同时对其包装机制的研究发现，该噬 菌体的d n a 包装机制为p a e 型。进一步对溶源性菌株y b 5 及其相应的治愈菌株 y b 5 - a 生长特性比较，治愈菌株细胞多呈分散状排列，单个细胞稍长，菌落稍 大；而溶源性菌株的细胞多聚为簇状，单个细胞略短，菌落也稍小一点，可能是 前噬菌体的存在增加了溶源性菌株的代谢负担。 对溶源性菌株y b 5 进行1 6 sr d n a 基因测序鉴定。利用p c r 扩增该菌株的 山东大学博士学位论文 1 6 sr d n a 的基因，并进行序列测定，所得结果与数据库进行相似性比对，结果 发现该菌株与发酵乳杆菌有9 9 的同源性，确定该菌株为发酵乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t u m ) 。其1 6 sr d n a 序列已递交g e n b a n k ，注册号为 d q 2 0 8 9 3 1 。 对工6 f e r m e n t u my b 5 的生理特征进行了研究。结果表明，该菌株表现出较 强的耐渗透压能力。与4 的n a c l 浓度能够抑制保加利亚乳杆菌生长相比，抑 制y b 5 生长的n a c l 浓度是6 。y b 5 有很强的耐酸性。在p i a2 5 时，菌株仍能 正常生长。y b 5 还能产生抑菌活性物质，其发酵液对金黄色葡萄球菌和部分乳 球菌有明显的抑制作用，并且该抑菌物质在口h2 3 时抑菌活性最大，经6 0 8 0 热处理后，其抑菌活性增强。 采用鸟枪法和限制性酶切片段克隆法，对温和噬菌体0 y b 5 的基因组序列 进行了测定。共测定了5 1 1 0 1b p 的序列。经s e q u e n c h e r 软件序列拼接发现形成 两个较大的重叠群c o n t i g1 和c o n t i g 2 ， 占到噬菌体m y b 5 全基因组的9 4 - 9 9 ， 其大小分别为6 5 7 7b p 和2 5 4 0 0b p ，约 覆盖率达到1 6 倍 对获得的基因组序列进行了生物信息学分析。首先利用o r ff i n d e r 软件、 g e n e m a r k 软件和f g d 咂s b 三种软件，对重叠群中的基因编码区进行预测，结 合n c b ib l a s t x 相似性搜索结果，可确定噬菌体c y b 5 基因组的两个重叠群 c o n f i g1 和c o n t i g2 分别编码了1 0 和3 7 个o r f s ( o p e nr e a d i n gf r a m ，o r f ) t 其 中，c o n t i g1 中的o r f l 0 是不完整的。所有o r f s 中，有4 3 个o r f s 向一个方 向转录，只有4 个o r f s 向反方向转录。利用相似性搜索及其在基因组中的位置 对预测的o r f s 进行基因产物功能预测，可对2 3 个o r f s 基因产物注释可能的 功能，这2 3 个o r f s 分布在c y b 5 基因组7 个相应的模块中，即包装模块、头 部模块、颈部模块、尾部模块、裂解模块、溶源模块和复制模块 对巾y b 5 基因组的整体特征分析发现，由y b 5 基因组中存在基因重叠和间隔 区域，在已推定的4 7 个基因中存在7 个基因重叠区( 共有1 1 个基因的c d s ， 即编码区之间发生了重叠) ，3 2 个基因问区。基因间区小于5 0b p 的有2 5 个，只 有7 个较大的基因间区，最大的基因间区有3 9 7b p 。这都表明c y b 5 基因组编 山衷大学博士学位论文 码区密度较大，非编码区所占比例较少，这与已报道的乳酸菌噬菌体基因组特征 一致。通过f i n d t e r m 软件分析发现在7 个较大的基因间区中共有3 个转录终止 子，一个是紧接裂解素基因之后，另外两个分别是在整合酶基因的上下游，由此 推测在裂解素之前的形态发生模块相关基因可能位于一个操纵子中转录，符合噬 菌体蛋白转录规律。 利用自优化预测软件s o p m a 对由y b 5 编码的前头部成熟蛋白酶( p r o h e a d h e a dm a t u r a t i o np r o e t a s e ) 、主要头部蛋白( m a j o rh e a dp r o t e i n ) 、穿孔素( h o l i n ) 、裂 解素( 1 y s i n ) 和整合酶( i n t e g r a s e ) ，共5 个蛋白质的二级结构进行预测，得到了它们 各自的二级结构；利用蛋白结构同源模建软件s w i s s m o d e l 莽 上述五个蛋白进 行三级结构预测，获得了比较精确的整合酶的3 d 结构模型。 经过多序列比对及进化树软件包m e g a 分析，构建了巾y b 5 编码的5 个噬菌 体蛋白的进化树。其中，前头部成熟蛋白酶和主要头部蛋白是位于一个重叠群中， 两基因都属于噬菌体形态发生模块，属于晚期表达基因。从迸化树可看出，与二 者亲缘关系最近的是罗伊氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sr e u t e r i ) 的噬菌体蛋白，说明 形态发生模块相对保守。其余三个蛋白，即穿孔素、裂解素和整合酶，位于一个 重叠群中。裂解模块中的两个蛋白( 穿孔素和裂解素) 表现出类似的进化关系， 其亲缘关系最近的蛋白来自于明串珠菌( l e u c o n o s t o c ) 噬菌体；而与整合酶的亲 缘关系最近的也是罗伊氏乳杆菌的噬菌体蛋白。以上结果表明，与吐) y b 5 噬菌体 蛋白亲缘关系最近的都是异型发酵乳酸菌的噬菌体蛋白，说明噬菌体的进化关系 反映了寄主菌的进化关系；同时，不同模块的进化又有所不同，说明噬菌体进化 可能存在h g t ( 即水平基因转移) 。因此噬菌体基因组是纵性遗传和水平基因转 移共同进化的结果。 利用h m m t o p 软件预测出穿孔素h o l i n 和裂解素l y s i n 的跨膜结构域，h o l i n 蛋白的n - 端在膜夕 ，c _ 端在膜内，跨膜区域在第9 - 2 6 a a 处；l y s i n 蛋白的n - 端 在膜内，c 一端在膜外，跨膜区域是第1 1 3 0 a a 。用信号肽在线分析软件预测出l y s i n 蛋白有信号肽，位置是卜2 9 a a ，在第2 9 和第3 0 个氨基酸处切割。 鉴于裂解素的多种应用以及噬菌体中y b 5 编码的裂解素携带有信号肽序列 m 山东大学博士学位论文 这一独特特征，本论文尝试将其克隆到表达载体上进行原核生物的表达研究。通 过限制性内切酶和p c r 分析证实已经成功构建了0 y b 5 裂解素基因的原核表达 载体，为其在原核中的表达打下基础。 综上所述，本文对国内市售酸奶中分离的发酵乳杆菌的生理特征进行了大量 研究，同时对其温和噬菌体中y b 5 的生物学性质及其基因组序列给予了详细的分 析。 关键词；酸奶，发酵乳杆菌，溶源性，温和噬菌体，基因组测序，生物信息学， 结构预测，进化分析 山东大学博士学位论文 s t u d i e so nl y s o g e n i cl a c t o b a c i l l u s f e r m e n t u ma n di t s t e m p e r a t eb a c t e r i o p h a g e s a b s t r a c t a st h em a j o rf e r m e n t e dd a i r yp r o d u c t si nc h t , y o g u r t sc a l lp r o m o t eh u m a n h e a l t ha n db ef a v o r i t ef o rm o s tc o n s i 】l n e 璐t h es t a r t e rc u l t u r eo f at r a d i t i o n a ly o g u r t n o r m a l l yi n c l u d e sac o m b i n a t i o no fl a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s p b u t g a r i c u sa n d s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u a a tt h ep r e s e n t , t h et r a d i t i o n a ll a c t o b a c i l t u ad e l b r u e c k i i s u b s p b u g a r c u sc u l t u r ei nm a n yy o g u r tp r o d u c t sh a sb e e nr e p l a c e db y o r c o m b i n a t e dw i 也b i f i d o b a c t e r i u ma n dl b a c i d p h i l u a t oi m p r o v eay o g u r t sh e a l t h v a l u ea n dm a n u f a c t u r ev a r i o u sc h a r a c t e r i s t i cy o g u r t sf r o mo t h e rm a t e r i a l ss u c ha s a m y l a c e o u sm a t e r i a la n dc 0 1a n ds oo n , i ti sn e c e s s a r y t o i n v e s t i g a t et h e p h y s i o l o g i c a lf e a t u r e so fo t h e rl a e t o b a c i l l i l i k et h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fc h e e s e ， o n eo ft h eg r e a t e s th a z a r d so ft h em a n u f a c t u r ep r o c e s so fy o g u r t si sb a c t e r i o p h a g e i n f e c t i o n , w h i c hi sc a p a b l eo fs l o w i n go re w - e ns t o p p i n gp r o d u c t i o n i nr e c e n ty e a r s ， p h a g ei n f e c t i o no fc u l t u r e su s e di ny o g u ap r o d u c t i o nh a sb e c o m em o r ef r e q u e n t b e c a u s eo fi n c r e a s e dp l a n ts c a l ea n dh e a v i e rp r o d u c t i o ns c h e d u l e si nc h i n a t oo u r k n o w l e d g e ，l i t t l ei sk n o w na b o u tt h el a c t i ca c i db a c t e r i ab a c t e r i o p h a g ef r o mc h i n e s c f e r m e n t e dd a i r yp r o d u c t s t h eo b j e c t i v eo f t h i ss t u d yw a st oi s o l a t ea n dc h a r a c t e r i z e t h es w a i n so fl a c t o b a c i l l u sa n dt h e i rb a c t e r i o p h a g e ss o 嬲t oe f f e c t i v ep r e v e n tt h e i n f e c t i o no f b a c t e r i o p h a g e 2 0i s o l a t e si s o l a t e df r o m2 0v a r i o u sb r a n d so fy o g u r tw c r ef u r t h e rc o n f i r m e dt o b el a c t o b a c i l l ib yi t sr o dc e l lm o r p h o l o g y , g r a m - p o s i t i v es t a i n s , a n dc a t a l a s e - n e g a t i v e r e a c t i o n s e v e ns t r a i n sa m o n gt h e2 0l a c t o b a c i l l iw e r ef o u n dt ob el y s o g e n i cs t r a i n sb y m i t o m y c i n ( m m qi n d u c t i o n a n dt h ei n d u c e db a c t e r i o p h a g e sf r o mt h el y s o g e n i c s t r a i n sh a v eh e x a g o n a lh e a d s ，l o n gn o n - c o n t r a c t i l et a i l ，b e l o n g i n gt ot h ec a u d o v i r a l e s o r d e ra n ds i p h o v i r i d a ef a m i l y ( m o r p h o t y p eb 1 ) 1 1 1 c yw e r ef r r t h c r m o r ec o n f i r m e dt o b et h es a m eb a c t e r i o p h a g eb yi d e n t i c a lr e s t r i c t i o np a t t e r n sa n dw e r en a m e d 中y b 5 i t sl y s o g e n i cs t r a i nw a sn a m e dy b 5 s d s - - p a g ep r o f i l es h o w e dt h a tt h ep h a g eh a d o n em a j o rs t r u c t u r ep r o t e i na b o u t3 1 9k d a c o m p a r i n gt h eg e n o m i cr e s t r i c t i o n v 山东大学博士学位论文 p r o f i l e sb e f o r ea n da f t e rh e a t i n g , t h ed n ap a c k a g i n gm e c h a n i s mc o u l db ei n f e r r e dt o b ep a c - t y p e i nt h ep r o p h a g e c u r e de x p e r i m e n t s ，t h el y s o g e n i es t r a i na n dt h ep r o p h a g e - c u r e d s t r a i ns h o w e dd i f f e r e n tg r o w t hb e h a v i o r t h ep r o p h a g e - c u r e ds t r a i ny b 5 一as h o w e d l a r g e rc o l o n i e st h a nt h a to ft h el y s o g e n i cs t r a i n t h ec e l lm o r p h o l o g yo fy b 5 aw a s l o n g e ra n da r r a n g e di nc h a i n s ，w h i l et h el y s o g e n i cs t r a i ny b 5p r e f e r r e dt od i s t r i b u t e i nc l u s t e r s t h er e a s o ni n f e r r e dm a y b et h ei n t e g r a t i o no fp r o p h a g ed n ai n t o c h r o m o s o m ei n c r e a s e dt h el o a do fh o s ts 仃a i l 投b u tt h eg r o w t ha n da c i d - p r o d u c i n g c u r v eo f t h et w os t r a i n sh a dn o te v i d e n t l yd i f f e r e n c e t oi d e n t i f yt h el y s o g e n i cs t r a i ny b 5 ，t h ef u l l - l e n g t h1 6 sr d n ag e n ew a s a m p l i f i e da n ds e q u e n c e d t h er e s u l t s ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e rd q 2 0 8 9 3 1 ) w e r e a l i g n e da g a i n s tt h e1 6 sr d n as e q u e n c e so ft h er i b o s o m a ld a t a b a s ep r o j e e lt h e c l o s e s tk n o w nr e l a t i v ei nt h es u b m i t t e ds e q u e l l c e , w i t h9 9 5 i d e n t i t y , w a sf o u n dt o b et h el b f e r m e n t u ms u b s p 。s t r a i n t h e s er e s u l t sc o n f i r m e dt h a tl a c t o b a c i l l u sy b 5i s am e m b e ro f t h e s p e c i e sl b f e r m e n t u m i nt h ep h y s i o l o g i c a le x p e r i m e n t , l b f e r m e n t u my b 5r e v e a l e ds t r o n g e ro s m o t i c p r e s s u r et o l e r a n c e t h el o w e s tr e p r e s s i o nc o n c e n t r a t i o no fn a c lf o rl b 歹酚辨翻，姗 y b 5i s6 w h i l et h ec o r r e s p o n d i n gc o n c e n t r a t i o nf o r l d e l b r u e c k i ib u l g a r i c u si s4 a tt h es a m et i m e , l b f e r m e n t u my b 5h a ds t r o n g e ra c i dt o l e r a n c ea l s o i tc a l l sg r o w t h n o r m a l l y , w h e nt h ep hv a l u eo f t h ee n v i r o n m e n ti s2 5 w h a t sm o r e , t h es t r a i nc a n s s y n t h e s i sa n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e t h es u p e m a t a n to ft h ec u l t u r er e v e a l e de v i d e n t l y a n t i m i c r o b i a la c t i v i t yf o rs t a p h y l o c o c c u sa l o e l 撂a n dl a c t o c o c c u a # p 。t h eo p t i m a lp h v a l u eo ft h ea n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c ei s2 - 3 h e a t e dt o6 0 - 8 0 cc a nn o td e p r e s si t s a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y , e n h a n c i n gt h ea n t i m i e r o b i a la c t i v i t yo nt h ec o n t r a r y s h o t g u nc l o n i n g ，r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ef r a g m e n t sc l o n i n ga n dp r i m e rw a l k i n g s e q u e n c i n gs t r a t e g i e sw e r eu s e dt od e t e r m i n et h eg e n o m i cs e q u e n c e so ft h e 6 f e 嗍m mt e m p e r a t eb a c t e r i o p h a g eo y b 5 a l t o g e t h e r , 5 1 ，1 0 1b ph a v eb e e n s e q u e n c e d , w h i c hw e r e9 4 - 9 9 o ft h eg e n o m e t h e s ef 工a g m e n t sc o u l db ea s s e m b l e d i n t oc o n t i g1a n dc o n t i g2 ，t h e yw e r e6 5 7 7b pa n d2 5 4 0 0b p ，r e s p e c t i v e l y t h e c o v e r a g eo f t h ef r a g m e n t ss e q u e n c e dw a s1 6t i m e s v i 生查奎兰堡主兰垡堡兰 t h eo b t a i n e ds e q u e n c e sw e r ea n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c s p r e d i c t e db yo r f f i n d e r , g e n e m a r ka n df g e n e s b ，e o n t i g1a n dc o n t i g2e n c o d e d t e na n dl b = i l t y - s e v e n e r r s ，r e s p e c t i v e l y d 刀口i nc o n t i glw a si n c o m p l e t e f o r t y - t w oo r f sm n o n gt h e f o r t y - s e v e ne r r sw e r ee n c o d e do no n es t r a n d ，a n do n l yf o u re r r sw e r el o c a t e do nt h e c o m p l e t e l ys t r a n d b a s e do nc o m p a r a t i v ea n a l y s i sw i t ho t h e rp u t a t i v ep r o t e i n so ft h e l a c t o b a c i l l u aa n dl n c t o c o c c u ab a c t e r i o p h a g ea n dt h e i rl o c a t i o ni nt h eg e n o m e ， f u n c t i o n sw e r ea s s i g n e dt ot w e n t y - t h r e ed py b 5 p u t a t i v eo r f s t h e s e d py b 5 p r o t e i n s w e r ed i s t r i b u t e di nd n a p a c k a g i n gm o d n l e , h e a dm o d u l e , h e a d t a i lj o i n i n gm o d u l e , t a i lm o d u l e ，l y s i sm o d u l e ，l y s o g e n ym o d u l ea n dr e p l i c a t i o nm o d u l e g e n e si nt h eg e n o m ew a sc o m p a c t a n dt h e r ew e r es e v e ng e n e so v e r l a pr e g i o n s i n v o l v e de l e v e ng e n e s , a n dt h i l c t y - t w oi n t e r g e n i er e 舀o n s t w e n t y - f i v eo f t h et h i r t y - o n e i n t e r g e n i cr e g i o n sw e r es m a l l e rt h a n5 0b p ，w h i l eo n l ys e v g ni n t e r g e n i cr e g i o n sw e r e l a r g e r t h eb i g g e s ti n t e r g e n i cr e g i o nw a s 3 9 7b p a l lo ft h i si n d i c a t e dt h ed = 1 ：s i t yo f g e n ee n c o d i n gr e g i o n so f 中y b 5w a sc o m p a c ta n da c c o r dw i t ht h ef e a t u r e so f p r o k a r y o t eg e n o m e t h e r ew e r et h r e et r a n s c r i p t i o nt e r m i n a t o rw e r ef o u n di nt h et w o c o n f i g sb yr e l a t i v es o r w a r e o n el o c a t e dd o w n s t r e a mo ft y s ( e n c o d i n gf o rl y s i n ) ，a n d t h eo t h e r sf l a n k e di n t ( e n c o d i n gf o ri n t e g r a s e ) ，r e s p e c t i v e l y w i t ht h es e c o n ds t r u c t u r ep r e d i c t i o ns o r w a r es o p m a ( s e l f - o p t i m i z e dp r e d i c t i o n m e t h o ，s e c o n ds t r u c t a m s o f f i v e p h a g e p r o t e i n s ( p r o h e 坦d m a t u r a t i o n p r o t e a s e ，m a j o r h e a dp r o t e i n , h o l i n , l y s i na n di n t e g r a s e ) e n c o d e db y4 , y b 5w e r ep r e d i c t e d t h e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e so ft h ef i v ep r o t e i n sw e r es t i 埘i 缸b u to n l yt h a to fi n t e g r a s e w e r eo b r a i n e d b ym u l t i p l es e q 啪c c sa l i g n m e n ta n de v o l u t i o ns o r w a r ep a c k a g ea n a l y s i s ，f i v e p h y l o g e n c t i ct r e e so f t h ef i v ep r o t e i n sm e n t i o n e da b o v ew e r ec o n s t r u c t e d a m o n gt h e f i v ep r o t e i n s ，p r o h e a dm a t u r a t i o np r o t e a s ea n dm a j o rh e a dp r o t e i nw e r ei nc e n t i g1 ； t h eo t h e rp r o t e i n sw e r ei nc o n t i g2 f r o mt h ee v o l u t i o na n a l y s i s ，t h ec l o s e s tr e l a t i v e s o ft h et w op r o t e i n si nc o n t i g1a n di n t e g r a s ei nc o n t i g2w e r eb a c t e r i o p h a g ep r o t e i n s f r o mh e t e r o f e r m e n t a t i v el a c t o b a c i l l u sr e u t e h t h ec l o s e s tr e l a t i v e so f h o l i na n dl y s i n , t h et w op r o t e i n sw e r ei n c l u d e di nl y s i sc a s s e t t en o r m a l l y , w e r eb a c t e r i o p h a g ep r o t e i n s v f t 山东大学博士学位论文 f r o ma n o t h e rh e t e r o f e r m e n t a t i v el a c t i ca c i db a c t e r i a 一l e u c o n o s t o c i naw o r d t h e c l o s e s tp r o t e i n so ft h ef i v ep r o t e i n se n c o d e db y 垂y b 5w e l eb a c t e r i o p h a g ep r o t e i n s 丘o mh e t e r o f e r m e n t a t i v el a c t i ca c i db a c t e r i a , w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ee v o l u t i o no f b a c t e r i o p h a g er e f l e c t e dt h ee v o l u t i o no ft h e i rh o s te v o l u t i o nd i f f e r e n c eb e t w e e n m o d u l e si n d i c a t e dt h ep r e s e n tg e n o m ew e r et h er e s u l to fv e r t i c a le v o l u t i o na n d h o r i z o n t a lg e n et r a n s f e r ( h o t ) t h et r a n s m e m b r a n e r e g l o l l so f h o l i na n dl y s i nw e r ep r e d i c t e db yh m m t o pa n d t m h m ms 0 1 a r e t h e 缸 a n s m c m b r 8 n er e g i o no f h o l i nw a s9 - 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p a g e p e g m p i t e h o l l y s i n t 符号说明及缩写词 英文全称 m i t o m y c i nc a m i n oa c i d a m p l l e i l l i nr e s i s t a n c eg e n e b a s e p a i r ( s ) c a l f i m e s t i n a la 1 ：k a l i n ep h o s p h a m s e c o h e s i v ee n d d e o x y r i b o n u c l e i o s i d e 仃i p h o p h a t e e l h i d i u mh o m i d e e t h y l e n ed i a m i n 删c a c i d p e r c e n t a g eo f c r 屺c o n t e n t h o r i z o n t a lg e n et r a n s f e r k n o b a s c k i l o d a l t o n l u r i a - b e r t a n im e d i u m d e m r o g o s a - s l m r p e o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c m ) p h o r e s i s s o d i u md o & c y l “i f a t e s d s - p o l y a c r l a m i d eg de l e c l x o p h o r e s i s p o l y e t h y l e n eg l y c o l p h o s p h o t u n g s f i ca c i d i s o e l 洲cp o i n t 强s e d t ab u f f e r g e n ee n c o d i n gh o l i n g e n ee n c o d i n gl y s i n g o n ee n c o d i n gi n t e g r a s e 中文名称 丝裂霉素c 氨基酸 氨苄青霉素 碱基对 牛小肠碱性磷酸酶 粘性末端 脱氧三磷酸核糖核苷 溴化乙锭 7 , - - 胺四乙胺 e 屺百分含量 水平基因转移 干碱基 千道尔顿 l b 培养基 m r s 培养基 开放阅读框 聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基磺酸钠 s d s 景丙烯酰胺凝胶电泳 聚乙二醇 磷钨酸 等电点 t e 缓冲液 穿孔素基因 裂解素基因 整合酶基因 附件一 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下