（有机化学专业论文）保济丸水溶性多糖的研究.pdf

摘要 保济丸( b a oj i p i l l ) 用去离子水煮提，浓缩，再用s e v a g 法去蛋白，乙醇分 步沉淀得两种拳且多糖a 和b ；a 和b 经s e p h a d e xg 一1 5 0 柱层析进一步纯化，得 到三种精制多糖b j p a 、b j p b l 和b j p b 2 ( b j p 是保济丸多糖的简称) ；s e p h a d e x g 一2 0 0 柱层析测定多糖分子量及纯度，三种多糖洗脱曲线均为单一峰形，表明都 为均一多糖，分子量分别为5 2 1 0 4 ，9 2 1 0 3 ，3 5 1 0 3 。 b j p a 、b j p b l 、b j p b 2 三种多糖均为杂多糖，且都存在a 糖苷键。经酸水 解，高效液相色谱( h p l c ) 分析单糖组成：红外光谱法( i r ) 推测糖苷键构型； 高碘酸氧化，s m i t h 降解和h p l c 分析糖苷键的连接方式。b j p a 由l 一鼠李糖 ( 3 8 3 ) 、d 一木糖( 1 5 3 ) 、d 甘露糖( 1 8 2 ) 、d 葡萄糖( 1 2 ) 和d 一半乳 糖( 1 6 2 ) 五种单糖组成，糖苷键连接方式以1 2 连接为主，1 6 连接为次； b j p b l 的单糖组成为l 鼠李糖( 4 0 ) 、d 木糖( 6 7 ) 、l 阿拉伯糖( 7 7 ) 、 d 果糖( 9 o ) 和d 葡萄糖( 7 2 6 ) ，糖苷键连接方式为1 2 和1 6 ，且以1 6 连接方式为主；b j p b 2 的单糖组成为l 鼠李糖( 1 5 4 ) 、d 一木糖( 2 2 5 ) 、 d 葡萄糖( 4 8 1 ) 和半乳糖( 1 4 o ) ，糖苷键连接方式为1 2 和1 6 。 关键词：保济丸多糖；分离纯化；杂多糖；凝胶柱层析；组成与结构分析 a b s t r a c t t h ep o l y s a c c h a r i d e sb j p a ，b j p b l ，b j p b 2h a v eb e e ni s o l a t e da n dp u r i f i e df r o m c o a r s e - p o l y s a c c h a r i d e s ( aa n db ) b yu s i n gd i s t i l l e d - w a t e ra se l u a n ti ns e p h a d e xg 一1 5 0 c o l u n mc h r o m a t o g r a p h y c o a r s e p o l y s a c c h a r i d e s ( aa n db ) w e r eo b t a i n e df r o mb a o j ip i l l b yw a t e r - e x t r a c t i n g ，a l c o h o l p r e c i p i t a t i n g 。s i n g l ep e a ks h a p ew a ss h o w e di n s e p h a d e xg 一2 0 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y t h e i rm o l e c u l a rw e i g h tw e r er e s p e c t i v e l y e s t i m a t e d t ob e5 2 x 1 0 4 9 ，2 1 0 3 ，3 5 1 0 3 ， b j p a ，b j p b l ，b j p b 2a r ew a t e r s o l u b l ea n dh e t e r o g e n e o u sp o l y s a c c h a r i d e s t h e c o m p o s i t i o no fm o n o s a c c h a r i d eh a v eb e e ni d e n t i f i e db ya c i dh y d r o l y s i sa n dh p l c a n a l y s i s t h es t r u c t u r eh a v eb e e na n a l y z e db y 】r p e r i o d a t eo x i d m i o n h p l ca n d s m i t hd e g e n e r a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t et h a tb j p ac o n s i s t so f l r h a m n o s e ( 3 8 3 ) ， d 一( + ) - x y l o s e ( 1 5 3 ) ，d m a r m o s e ( 1 8 2 ) d - g l u c o s e ( 1 2 ) ，d g a l a c t o s e ( 1 6 2 ) ； b j p b - ii n c l u d e s l r h a n l n o s e ( 4 ，0 ) ，d 一( + ) - x y l o s e ( 6 7 ) ，d f r u c t o s e ( 19 0 ) ， d g l u c o s e ( 7 2 6 ) ；b j p b 2i n c l u d e sl r h a m n o s e ( 1 5 4 ) ，d 一( + ) x y l o s e ( 2 2 5 ) ， d g l u c o s e ( 4 8 1 ) a n dd g a l a c t o s e ( 1 4 。o ) t h ei rs p e c t r u mi n d i c a t e dt h a tb j p a b j p b l ，b j p b 2a r el i n k e db y o g l y c o s i d i cb o n d s w h i l et h eb a c k b o n eo fb j p ai s m a i n l yl i n k e db y1 2g l y c o s i d i cb o n d s ，w i t haf e w 】一6l i n k a g e 。b j p b la n db j p b 2 a r em a i n l yl i n k e db y1 6g l y c o s i d i cb o n d s ，w i t haf e w1 2 l i n k a g e a c c o r d i n gt ot h e r e s u l t so f p e r i o d a t eo x i d a t i o na n ds m i t h d e g r a d a t i o n k e yw o r d s ：b j pp o l y s a c c h a r i d e s ；s e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o n ；h e t e r o g e n e o u s p o l y s a c c h a r i d e s ；c o m p o s i t i o na n a l y s i s a n db a s i cs t r u c t u r e a n a l y s i s ；g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y 3 第一章绪论 第一节前言 多糖是一种天然大分子化合物，来源于动物、植物及微生物，在海藻、真菌 及高等植物中尤为丰富。它是由醛糖和( 或) 酮糖通过糖苷键连接成的聚合物， 作为一切有机体必不可少的成分，同维持生命体机能密切相关。 近二十多年来，由于分子生物学和细胞生物学的发展，发现多糖及缀合物参 与细胞的各种生命现象的调节，如免疫细胞间信息的传递和感受，这与细胞表面 的多糖体的介导有密切关系。科学家们从大量的药理和临床研究发现，从天然产 物中分离出来的多糖往往是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞而对正常细胞没 有毒副作用。多糖作为免疫治疗药物正越来越受到重视，己成为新药研究的热点 之一，而其中最重要的是从药用植物中提取的水溶性多糖。越来越多的研究证明， 多糖不但能治疗机体的免疫系统受到严重损伤的癌症，又能治疗多种免疫缺损疾 病，如慢性病毒性肝炎和某些耐药细菌或病毒引起的慢性疾病【1 1 ，而且多糖作为 药物对细胞毒性小：在治疗肿瘤时，它不象化疗药物直接杀死生长着的癌细胞， 而是作为一种生物免疫反应或加强抗体生成及激活剂补体等，以达到抑制和消灭 肿瘤细胞的效果，对正常细胞影响极小【2 】o 多糖对多种恶性肿瘤、心血管疾病和抗衰老都有一定疗效。近年来的研究表 明糖结合物在信息传递、分子识别过程中具有关键作用1 3 1 ，例如：激素与细胞表 面受体的相互作用；细胞的发展与分化等。再者，由于多糖的分离、纯化及结构 分析等生化手段有了长足进步，使国内外对糖类的研究有了空前迅速发展的趋 势。有人预计，如同2 0 世纪是蛋白质、核酸时代一样，2 1 世纪应当是糖类科学 的时代，这种想法已越来越成为国内外学者的共i u 。 4 第二节多糖的研究进展 1 多糖的研究概况 糖作为生命中三类最重要的大分子物质之一，早在一个世纪前就已被人们所 认识，德国著名化学家e f i s h e r 因为在糖化学领域的杰出成就而荣获1 9 0 2 年的 诺贝尔化学奖。在很长的时间内，糖仅是作为生物体内的能量物质( 如葡萄糖、 糖原、淀粉等) 和结构物质( 如纤维素、几丁质、果胶等) 被认识的，对糖的生 物学功能的认识却较晚，因此糖的研究相对比较沉寂，远远落后于对核酸和蛋白 质的认识。到了2 0 世纪5 0 年代，随着化学和生物学的发展和分离技术的提高， 人们才开始认识到糖的结构是非常复杂多样的，其生物学功能也决非仅仅是能量 和结构上的功能。6 0 年代前后1 5 ，多糖作为广谱免疫促进剂引起人们极大的兴趣， 逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能。7 0 年代以来，随着免疫 物质、生物膜和各种生物活性物质研究进展表明，发现糖类在体内具有各种关键 的生物功能。8 0 年代以后，人们得到了有关糖的结构和功能的越来越多的信息， 特别是近十几年来人们对糖的认识有了质的飞跃，认识到糖是除核酸和蛋白质之 外另一重要的生命物质恤】，涉及到特别是多细胞生命的全部时间和空间，如受精、 着床、分化、发育、免疫、感染、癌变、衰老等等7 圳。1 9 8 8 年，英国几位多年 从事糖类研究者首次提出“糖生物学”( g l y c o b i o l o g y ) 这一名称，1 9 9 3 年5 月 在美国召开的第一届糖工程会议上，会议主席哈特( gw h a n ) 宣称“糖生物学” 是生物学领域的最后一个重大前沿。2 0 0 1 年2 月2 3 日s c i e n c e 关于糖研究的专 栏出现化学糖生物学( c h e m i c a lg l y c o b i o l o g y ) 一词【1 ”，由于糖在生命过程中的 重要性，化学糖生物学由此成为一个重要的研究领域，是2 1 世纪一个倍受关注 的前沿学科，是对化学家的巨大挑战，对糖类的研究再次成为人们关注的焦点。 2 多糖的来源 多糖种类繁多，来源广泛。它们广泛存在于动物、植物、微生物( 细菌和真 菌) 和海藻中，它们又可分为胞外和胞内多糖。其中研究得比较多的是植物多糖 和微生物多糖。 2 1 动物多糖动物多糖来自动物结缔组织基质和细胞间质，可以说是脊椎 动物组织胞外空问的特征组分。从刺参中提取的酸性粘多糖对移植性实验肿瘤有 显著疗效，对m a 7 3 7 乳腺癌的疗效更加显著。同本学者从贝类中提得具有抗癌 活性成分的壳聚糖，抑制小鼠肉瘤s 1 8 0 生长，延长接种盐酸氧苯肿癌和共生肿 癌x 5 5 6 3 小鼠存活时间，对培养的癌细胞具有杀伤作用。另外，从动物脾肝中 得到的肝素，具有抗凝血的功能；硫酸软骨素则有保护机体组织弹性的作用，可 防治动脉硬化和骨质增生等1 。 2 2 植物多糖植物多糖来源于植物的根、茎、叶、皮、种子和花。从各种 中草药和其他植物中都可以提取分离出多糖。我国近年来对植物多糖，特别是具 有中国特色的中草药多糖的药物活性已有广泛报道，例如：报道降血糖的中草药 已达到1 0 0 余种，其中有显效的也有2 0 多种。其它如具有抗肿瘤、抗衰老、抗 病毒、抗放射、抗突变、抗遗传损伤、抗凝血、抗血栓等药物活性的报道很多， 但弄清结构说明构效关系尚少见。中草药作为药物开发及理论研究，我国已落后 于日本、韩国。 植物多糖研究得比较深入有稻草多糖、麦秸多糖、竹黄多糖 1 2 】、黄芪多糖”1 、 刺五茄多糖等。表- l 为部分植物多糖的来源、组成及主要生物活性。 2 3 微生物多糖微生物多糖包括细菌和真菌( 包括霉菌和酵母) 多糖，是 研究得比较详细的一类多糖。与动物和植物多糖相比，微生物多糖具有与它们相 似的性质，而且其产量和质量不受自然条件的影响。目前国内外从真菌( 主要是 担子菌纲和子囊菌纲) 中得到的真菌多糖己达数百种，有关真菌多糖的研究既深 又广，己开发利用的也有不少。在日本，香菇多糖( l e m i n a n ) f 1 4 1 和云芝蛋白多 糖( p s k ) 于7 0 年代末期进入临床，用于肿瘤等疾病的免疫治疗。扶树花【函的肠 f r o n d o s a 多糖、裂褶多耱( s p g ) 等己在欧美、日本临床上广泛应用，在我国云 芝多糖( c o r i o l a n ) 、槐耳- t r a m e t e s r o b i ni o p h i l a 多, 糖分别作为国家中药二类、一类 新药投入生产”1 。部分微生物多糖的结构、来源及主要生物活性见表2 。 表1 ：部分植物多糖的来源、组成及主要生物活性 表一2 ：部分微生物多糖的结构、来源及主要生理活性 2 4 海藻多耱全世界的藻类约有3 万多种，迄今为止被人们广泛利用的主 要是红藻、绿藻和褐藻三大类，约1 0 0 余种，对蓝藻的利用较少。海藻细胞间富 含粘质多糖、醛酸多糖和含硫多糖，胞内也有，如螺旋藻【”】。从海藻来源中提取 得到的多糖，大多含有硫酸根，其作为抗血栓药物已被大家公认，如褐藻多糖硫 酸酯对血栓的形成具有抑制作用【】1 ”，该作用可能与抑制血小板有关。虽然从海藻 来源多糖至今研究得不多，但已发现这些多糖除了具有免疫促进作用及抗肿瘤作 用，还具有抗病毒作用，如从红藻中分得一种多糖f 1 ”，对治疗感冒具有良好作用。 国外治疗艾滋瘸的权威预言，从海藻中可以获得有价值的抗艾滋病的多糖药物。 我国海藻资源丰富且类别很多，从中开发有价值的多糖前途很大，目前已有人从 海藻中开发出具有降胆固醇、降血脂的多糖保健品。 3 多糖的生物活性与应用 3 1 多糖的生物活性 多糖具有广泛的药理活性，除了具有抗病毒、抗凝血、抗炎、抗衰老、降血 脂、降血糖、抗过敏、抗菌等生物活性外，许多多糖还有免疫调节与抗肿瘤的生 物功能，而且一般对机体的毒性作用都较小，因此多糖的抗肿瘤作用受到广泛重 视，有的已在临床获得了有效应用见表一3 。多糖类药物的研究正从一一般药效学向 作用机理深入；由细胞水平向分子水平、基因水平深入；由单独用药向联合用药 ( 与细胞因子、放疗、化疗联合用药) 以及结构修饰和新剂型等方面深入【1 9 1 。 3 1 1 抗肿瘤：从细菌、真菌、酵母、地衣和高等植物、海洋植物中提取的多 糖均具有抗肿瘤活性。某些多糖还能对抗化学试剂( 如：三甲基胆蒽) 的致癌作用。 多糖作为抗癌剂最大的优点是毒副作用小，与化疗联合作用，还可以对抗化疗药 物的骨髓抑制等不良反应。多糖应用于肿瘤治疗将是一个新的迷人的领域2 0 1 。另 外，多糖是细胞成分，能强化正常细胞抵御致癌物侵袭，提高机体抗病能力。实 验证明，大多数多糖的抗肿瘤作用的机理不是通过直接杀死细胞或抑制细胞作 用，而是通过增强宿主的免疫系统来发挥作用。 3 1 2 抗病毒：多糖通过增强宿主免疫机制可以抵抗细菌、病毒、寄生虫的侵 袭，因而具有广泛免疫调节作用。如香菇多糖对泡状口炎病毒感染引起的小鼠脑 炎有显著疗效和预防作用，对阿伯耳氏病毒和十二型腺病毒感染也有效。硫酸酯 化多糖抗爱滋病病毒( h i v ) ，作用效果与s 0 4 一基的量成明显的比例关系口”。香 菇多糖、灵芝多糖等对抗慢性肝炎也有显著疗效。 3 1 3 抗凝血和降血脂：多糖具有抗凝血和降血脂作用，防治动脉粥样硬化疗 效确切，使动脉粥样硬化病程减慢，病变减弱，已形成的病变停止发展。多糖防 治动脉粥样硬化的作用归纳如下：( 1 ) 抗凝血：自1 9 1 6 年从肝脏提得肝素并用 作抗凝血剂以来，不仅肝素的应用有了进展，又发现了藻酸( a l g i n i ca c i d ) 、昆布多 糖、海带多糖等具有抗凝血作用。肝素是一种应用于l 临床的天然抗凝血剂，可通 过抑制凝蛋白酶原转变为凝血酶，固有抗凝血作用。( 2 ) 降血压：皮果衣为地衣 门植物，药理实验证实，其中的多糖体为降压的主要成分。海藻，如民间和中华 人民共和国药典中记载具有降血压功能，现已表明与其中的褐藻多糖有直接的对 应关系。( 3 ) 降血脂：肝索( h e p a f i n o i d ) 能促进脂蛋白脂肪酶的释放，使血液中大分 子的脂质分解成小分子，故对因血脂过多引起的血清混浊有澄清作用，也能明显 降低血胆同醇。茶叶多糖增强了卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性，故有利于胆同醇 的清除。 3 1 4 抗衰老：免疫系统与衰老有密切的关系，随年龄的增大，体内自由摹含 量增加，免疫功能遭到破坏，胸腺萎缩，t 细胞损耗，导致机体衰老，寿命缩短。 多糖能从整体上提高机体的免疫功能，淬灭自由基从一定程度延缓衰老，防治 老年病。 3 2 多糖的应用 3 2 1 作为药物用于治疗方面：近二 。年来，多糖作为药物的研究开发年有 了长足的发展。多糖作为药物对细胞毒性极小，对正常细胞影响很小阻2 ”。多糖 类的主要药理作用表现在促进免疫、抗肿瘤、抗突变、降血脂、降m 糖、抗病毒 等方面。药用多糖能治疗多种免疫缺损疾病，如慢性病毒性肝炎等；还能治疗风 湿病之类的自身免疫疾病【2 “，如香菇多糖、酿酒酵母培养液提取的p 葡聚糖等； 能抗肿瘤，治疗使机体免疫系统受伤的癌症，如蜜环菌多糖、亮菌多糖等；能抗 感染，如黄芪多糖、猕猴桃多糖等；能抗消化性溃疡，如红藻类多糖等；能降血 糖血脂，如海带多糖、甘蔗多糖等；具有突出的抗病毒活性，如号拉胶、红藻硫 酸多糖等；有的还能透导干扰素的产生；能促进核酸和蛋白质的生物合成，如灵 芝多糖、黄芪多糖等。部分国内外临床应用的多糖药物及其疗效见表一3 。 3 2 2 其它方面的应用2 5 - 2 7 】：多糖除了作为药物用于治疗方面，还作为凝固 剂、润滑剂、增稠剂、絮凝剂、悬浮剂、凝胶剂、添加剂等广泛应用于化工、食 品、石油、纺织印染、水处理和医药等工业。黄原胶( x a n t h a n ) 是细菌产生的胞外 多糖，具高度粘度及适当流动性，耐热、耐酸的水溶性多糖，大量应用于石油钻 探工业、食品工业和纺织工业。果胶( p e c t i n ) 是植物特有的细胞壁组分，它的来源 非常丰富，如水果皮、向日葵花盘及其他植物。果胶可作为果冻食品、巧克力等 的稳定剂，医药品及化妆品等工业的乳化剂，脱水剂。几丁质( 甲壳素) 是自然 界中储存量仅次于纤维素的第二大天然多糖，广泛存在于真菌、昆虫和甲壳类动 物之中，自然状态复杂，刚性很强，生物亲和性好，在大多数溶剂中难溶解，它 在纺织、印染、皮革、医药、生物工程等领域广泛应用，如利用几。质的衍生物 去乙酰壳多糖的电荷特性，代替活性炭处理自来水及废水，则成本低，效果好； 去乙酰壳多糖在人的皮肤、头发表面易形成一层薄膜，所以在化妆品上也有大量 应用。海藻多糖被应用于化工工业，作为凝固剂、稳定剂等；在食品工业中，目 的已有人从海藻中开发具有降胆固醇、降血脂的多糖保健品。因为海藻多糖是无 热能的，能强化纤维素阻止脂类吸收的效力，促进胆固醇排除，增加肠道蠕动， 所以又是一种优质保健食品添加剂。多糖不但可作为药物进行研究，还可作为保 健品进行开发。例如：日本的“茸源”就是添加有真菌多糖的保健食品。 表一3 ：部分国内外临床应用的多糖药物及其疗效 4 多糖构效关系的研究 多糖的构效关系2 8 1 是指多糖的一级结构和高级结构与其生物活性的关系。多 糖的结构分为四级，其中一级结构包括主链性质( 糖单元的组成、连接顺序及连 接方式) 和支链性质( 有无分支及分支类型、位置、长短) ；二级结构指多糖主链间 以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象；以二级结构为基础，由于糖单位间 的非共价键相互作用而导致有序且粗大的构象，即为多糖的三、四级结构。多糖 的一级结构又称为初级结构，二、三、四级结构则称为高级结构，两者均直接决 定多糖的生物学活性。 4 1 多糖的结构与活性 4 1 1 初级结构：就多糖的初级结构而言，多糖中单糖的组成、糖苷键的类 型以及一些官能团对其生物活性都有影响。至今己发现大多数具有抗肿瘤活性的 多糖都具有d ( 1 3 ) d 葡聚糖的主链结构，奇果菌属分离出的具抗肿瘤活性的 奇果菌多糖( g r i f o l a n ) ，基本结构是b 一1 ，3 结合的直链葡萄糖，3 分子中有1 分子 的b 1 , 6 侧链葡聚糖。但是，同样具有b 一( 1 - - 3 ) 一d 一葡聚糖主链结构的p a c h y m a n 和l a m i n a r a n 却几乎没有抑瘤活性，这表明主链结构并不是多糖抗肿瘤活性的最 基本原因。另据报道1 2 9 , 3 0 q 。( 1 3 ) 葡聚糖也具有较强的抗肿瘤活性。 4 1 2 高级结构：一般认为，空问构象比初级结构对多糖活性的影响更大， 多糖的特定空间构象是其产生生物学活性所必需的。有些多糖具有相同的一缴结 构，但活性大不相同，这主要是由高级结构的差别引起的。一般高级结构呈b 一 螺旋的多糖活性较高，而可拉伸带状或皱纹型带状的活性一般较低甚至没有。例 如：x 衍射分析表明，香菇多糖呈三股螺旋结构，裂褶多糖也能形成类似三股 螺旋的对称螺旋结构，在香菇多糖加入尿素或二甲亚砜，其活性就丧失，这二 者多糖在水溶液的比旋光度不同于在尿素或二甲亚砜中的旋光度，暗示在尿素或 二甲亚砜中，多糖立体构型改变了，从而引起活性的丧失，这充分证实立体构型 对多糖活性的显著性影响。但k r a u s 等人从多种植物中分离出一种b 一( 1 3 ) b ( 1 ，6 ) d 一葡聚糖结构的多糖，没有规则的空间构象，却也显示出较强的抗肿瘤活 性3 2 】，这似乎一定程度上否定了空间构象在多糖活性上的决定地位。尽管如此， 多数研究认为，生物学活性较强的多糖( 尤其是葡聚糖) ，一般都具有规则的空间 构象，向香菇多糖中添加尿素或二甲亚砜可导致失去其三股螺旋构象，其活性也 随之消失：向水不溶的裂褶多糖中添加尿素或氢氧化钠，则可诱导产生规则的空 间构象，从而表现出抗肿瘤活性m 1 ，这些都表明，规则的空间构象与多糖的生物 学活性密切相关。 目前，多糖的高级结构( 尤其是空间构象) 与活性的关系由于受到多糖空间结 构测试手段的限制，研究较少，也尚无定论，还有待进一步研究。 4 2 多糖的理化性质与活性 多糖的分子量【3 4 】、溶解度、旋光度、粘度嘲、药剂量【3 6 】等性状也影响其生 理功能。b r u n e t e a um 等从真菌植物疫霉的细胞壁中分离的具支链的葡聚糖的免 疫调节与分子量( m w ) 有关，具有较高聚合度的葡聚糖有最佳活性。硫酸化多糖 的抗病毒作用与分子量也有很大关系，分子量大于5 ，0 0 0 的多硫酸化多糖有抑制 合胞体形成的作用。实验表明，平均m w 最高的肝素分子片段在体外抑制h i v 活性最强【3 7 。硫酸葡聚糖的抗h 1 v - 1 活性随分子量的增加而增加，在m w = l o ，0 0 0 时最大，硫酸葡聚糖抗其它囊膜病毒能力也有近似的趋势。相对分子量为9 ，0 0 0 左右的右旋糖具有一定活性，其活性随着大于或小于此分子量而迅速降低3 8 1 ，由 此可见，不同的多糖产生生物学活性的最佳相对分子质量的范围不同。 另外，多糖的活性与溶解度有重要的关系。多糖溶于水足其发挥生物学活性 的首要条件，如从茯苓中提取的多糖组分中，不溶于水的组分刁i 具有生物学活性， 水溶性组分则具有突出的抗肿瘤活性，降低分子质量是提高多糖水溶性，从而增 加其活性的重要手段。如一种真菌多糖，不溶于水，在大鼠体内仅有微弱的抑瘤 活性，5 m g k g 剂量时抑瘤率为5 7 ，降低分子质量后，完全溶于水，l m g & g 剂 量可使抑瘤率达到1 0 0 【3 。向多糖中引入分支可在一定程度上削弱分子问氢键 的相互作用，从而增加其水溶性，如0 - ( 1 3 ) d 葡聚糖不溶于水，将其部分羧 甲基化后，水溶性提高，则它的抗肿瘤活性也明显提高【4 0 1 。有些含有疏水分支的 多糖不溶于水，经过氧化还原成羟基多糖后才溶于水，从而产生生物活性阻“。由 此可见，降低分子质量、引入支链或对支链进行适当修饰，均可提高多糖溶解度， 从而增强其活性。 多糖的黏度也会影响其实际使用，如裂褶多糖是很有应用前景的抗肿瘤药 物，但起初因为黏度太大，无法临床使用，后通过部分降解，使分子量降低，黏 度也减小，但由于其基本重复结构不变，还保持抗肿瘤活性，已供临床使用m 1 。 多糖分子中的游离羟基对活性也很重要，y a m a d a 发现将车前子多耱过氧化后， 其活性下降甚至消失，但当氧化物还原成多羟基后又显示出活性。 总之多糖的结构和理化性质都与其活性紧密相关，然而两因素并不是孤立地 影响多糖的活性，结构决定理化性质，从而影响活性，因此，在多糖构效关系的 研究中，除了单独考察各级结构和理化性质分别对多糖活性的影响外，还应研究 由于结构与理化性质之问、# n n 构2 _ n 以及各种理化性质之间的相互制约对多 糖活性产生的综合效应。 到目前为止，除了对肝素碎片寡糖的构效关系研究得较详细外，其他多糖( 及 寡糖1 的构效关系研究至今尚不多，且相当不完善，是一个有待加强的研究领域。 4 3 多糖的分子修饰 为提高多糖的活性，多糖分子修饰( 结构改造) 研究已有很大进展。将多糖 或寡糖进行衍生化，如降解、硫酸化、烷基化等，有可能大大提高多糖的生物活 性。其他修饰方法，如磷酸酯化、羧甲基化、羧乙基化等在多糖分子修饰中也有 运用。如在真菌多糖结构的化学修饰中，常用的改造方法有降解、羧甲基化、硫 酸酯化、乙酰化等。不同的改造方法对其生物活性的影响各不相同，例如：地衣 类多糖石脐素是b ( 1 6 ) d 一葡聚糖，因部分乙酰化而具有溶解性，表现出抗肿 瘤活性，当脱乙酰化或全乙酰化后其溶解性降低，就失去了抗肿瘤活性。香菇多 糖经硫酸化后生成香菇多糖硫酸( 1 e m i n a n s u l f a t e ) ，可抑制人m t - 4 细胞由于感染 h t l ，v 1 ( h i v 的早期名称) 产生的细胞病变【4 5 1 。目前发现的抗h 1 v 活性最强 的香菇多糖硫酸酯的结构是分子内含有每葡萄糖单位1 7 个硫酸根。近年来德 国人发明的硫酸酯化木聚糖成为治疗爱滋病等的药物( 1 9 8 9 ) ，己申请专利，并临 床试用，因而国内外产生了用硫酸酯化修饰多糖的热门研究。 多糖结构修饰是多糖药物学研究的一个重要分支，经过近几年来的发展，它 在赋予或增强天然多糖的活性、降低某些药物的毒副作用等方面已取得一定进 展。此外，多糖结构修饰也是研究多糖构效关系，从而探寻多糖活性中心的重要 手段。继续开展多糖结构修饰方法的探讨和对已有的结构修饰方法机理的进一步 深入研究，并尝试多种方法联合进行多糖结构定向修饰，将会推动糖药物学和糖 生物学的发展。 综上所述，多糖的研究不仅是对它的化学结构进行研究，而且更重要的是对 它的构效关系进行研究。多糖的构效关系研究，首先要弄清多糖的溶液性质和链 构象，而国内对多糖链构象和构效关系的报道很少，尤其溶液中链构象的研究几 乎是空白。因此，目前重要的课题是研究它们的构效关系，从分子水平阐明其作 用与机理，然后用化学修饰4 6 1 来改善它们的生物活性。 5 多糖的分离纯化与性质研究 5 1 多糖的分离提纯 5 1 1 多糖的提取：多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀 碱或稀盐溶液提取，尽量避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂，稀酸 提取时，时间宜短、温度不宜超过5 0 。c 。由于水提时间长且效率低，酸碱提易 破坏多糖的立体结构及活性，现在有的采用酶法提取多糖，即采用复合酶热水 m 浸提相结合的方法，复合酶多采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶， 此法具有条件温和、杂质易除和得率较高等优点。同一原料，分别用水、酸、碱、 盐或酶法提取所得多糖往往是不相同的4 。此外，廖代伟等应用季胺盐沉淀法、 醇析法和钙盐沉淀法提取了香菇多糖；于淑娟等率先用超声波协同酶法提取了灵 芝多糖，有效地缩短了提取周期，提高了产品质量。 5 1 2 除杂和脱蛋白质：多糖提取之后，其中还含有许多杂质和蛋白质要除 去，一般首先利用多糖难溶于有机溶剂的特性，用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤， 除去一部分醇溶性杂质，然后用s e v a g 法【4 9 、三氟三氯乙烷法( 微生物多糖) 或 三氯醋酸法( 植物多糖) 【50 j 脱游离蛋白质；去除结合蛋白质用蛋白酶；小分子杂 质的除去可以用透析法。除去蛋白质后，可以透析一次。至此，得到的溶液基本 上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物。 5 2 多糖的分级 分级( 将多糖混合物分离为单一的多糖) 方法很多，主要有以下一些方法： ( 1 ) 分步沉淀法：根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解 度的性质，逐次按比例由小到大加入这些醇或酮( 常用的是甲醇、乙醇和丙酮) 分步沉淀。这种方法适宜于分离各种溶解度相差较大的多糖。 ( 2 ) 纤维素阴离子交换剂柱层析：常用的交换剂为d e a e 一纤维素和 e c t e o l a 纤维素。此法适合于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。在p h = 6 时， 酸性多糖能吸附于交换剂上，中性多糖不吸附。然后用p h 相同离子强度不同的 缓冲溶液将酸性强弱不同的酸性多糖分别洗脱出来。但如果柱为碱性，则中性多 糖也能被吸附。另外，中性多糖还能与硼砂形成络合物，所以有时将柱处理成硼 砂型后，用不同浓度的硼砂溶液洗脱，也能将不同中性多糖分离出来。n 蔼i - t - 交 1 4 换剂柱层析是目前各国最常用的方法。另外通过层析，许多杂质还牢牢吸附于柱 上端，从而达到了多糖的纯化。多糖在交换剂上的吸附力与多糖结构有关。吸附 力一般随多糖分子中酸性基团的增加而增加。对于线状分子，分子量大的较分子 量小的多糖易吸附，直链多糖较分支多糖易吸附。通常1 9 多糖需1 0 0 9 d e a e - 纤 维素。洗脱方式可以是阶梯式或梯度式。 ( 3 ) 金属络合物法：根据不同多糖与各种铜、钡、钙和铅离子形成络合物 而沉淀的性质，常用的络合剂有费林溶液垆“、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。得 到的络合物沉淀经水充分洗涤后，用5 的无机酸乙醇液或硫化氢分解。 ( 4 ) 纤维素柱层析：将多糖混合物全部沉淀于惰性多孔的纤维素柱上面， 然后用不同浓度乙醇水溶液洗脱，则不同多糖就按次洗脱出来。纤维素柱先用乙 醇平衡，加多糖混合物于柱顶，则多糖就全部沉淀析出于柱上端，然后按浓度由 高到低的乙醇水溶液洗脱，洗脱过程中，各种多糖在柱上进行无数次的溶解和沉 淀过程，最终将各种多糖分离开来。这种方法实质上与分部沉淀法相反，可称“分 步溶解法”。其理论塔板数较高，所以流出液的纯度高。a a t o n o p o u l o s 等5 2 1 用这 种方法分离了各种酸性多糖。有人【5 卅分离酸性粘多糖采用了载体为硅藻土与磷酸 钙的柱层析。它的装柱与通常装柱法不同：将3 2 9 硅藻土与5 0 0 m lo 2 m 氯化钙 溶液相混，然后在搅拌下逐步加入6 4 0 m lo 2 m 磷酸氢二钾溶液，得到均匀的散 布于硅藻土颗粒中的磷酸钙沉淀，然后将此悬浮液装柱。上样后用o 0 2 m o l 不 同离子强度的磷酸缓冲溶液( p h = 6 5 ) 展层。这种柱的流速很慢，一般需要2 3 天，所以热天最好在低温下进行，以防止样品的发霉变质。 ( 5 ) 季胺盐沉淀法：根据长链季胺盐能与酸性多糖成盐形成水不溶性多糖 化合物的特性，以分离酸性及中性多糖。常用的季胺盐是十六烷基铵的溴化物 ( c t a b ) 及其碱( c t a o h ) 和十六烷基毗啶( c p c ) 。实验时必须严格控制多 糖混合物的p h 小于9 及无硼砂存在，否则中性多糖也会沉淀出来。通常c t a b 或c p c 水溶液的浓度为1 1 0 ( w v ) ，在搅拌下滴加于o 1 1 ( w v ) 的多糖 溶液中，这时酸性多糖即能从中性多糖中沉淀出来5 4 1 。一般地说，酸性强或分子 量大的酸性多糖首先沉淀出来，所以控制季胺盐的浓度，也能分离各种不同的酸 性多糖。根据形成的沉淀能溶于不同的盐溶液、酸性溶液和有机溶剂中的性质， 使多糖游离出来。 ( 6 ) 盐析法：根据不同多糖在不同盐浓度中具有不同溶解度的性质，加入 不同盐析剂使之逐步析出。常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，以硫酸 铵最佳。这种方法实质上是分步沉淀法的一种。 ( 7 ) 凝胶柱层析：它是根据多糖分子的大小和形状不同达到分离的目的。 常用的凝胶有葡聚糖凝胶( s e p h a d e x ) 及琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) 。展层剂为各 种浓度的盐溶液及缓冲液。但他们的离子强度最好不低于0 0 2 。凝胶柱层析也是 多糖分离中常用的一种方法。我们认为凝胶柱层析其柱之装填好坏对分离效果及 分离所需时间有很大影响。一般要1 次装柱，平衡时流速慢且稳定。关丁二凝胶层 析我国已有专著口“，凝胶柱层析不适宜粘多糖的分离。另外凝胶柱层析电可取代 透析除去多糖中小分子。 ( 8 ) 制备性区域电泳：不同的多糖在电场的作用下按其分子大小、形状及 其所带负电荷的不同而达到分离，载体通常是玻璃粉。这种方法分离效果较好， 但只适用于实验室小规模应用。 ( 9 ) 制备性高压液相色谱( h p l c ) ：h p l c 是在经典柱层析原理的基础上， 采用分布窄、粒径细的颗粒作载体，将流动相以高压注入柱内，样品组分迅速而 又不断地在流动相和固定相之间进行反复多次平衡分配，彼此分离，并向下迁移， 迁移速率依赖各组分与固定相之间的相对亲和力。 ( 1 0 ) 超过滤：不同的超过滤膜排阻不同分子量和形状的多糖通过，因而达 到分离。应用m i l l i p o r e 公司生产的p e l l i c o n 超过滤系统将柴胡多糖分为分子量不 同的四级分( i 、i i 、i 、i v ) 。 5 3 多糖纯度的鉴定 多糖的纯度不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即使是多糖纯品其微 观也是不均一的。多糖的纯度只代表相似链长的平均分布。我们通常所说的多糖 纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。一般要求两种方法或两个系统以上进 行检测，应该满足糖基摩尔比恒定，且旋光度、黏度、溶解度等理化性质稳定， 密度梯度超离心为单一峰，高压电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、纤维素乙酸酯薄膜 电泳或琼脂糖凝胶电泳等为单一区带，凝胶层析呈现单一峰等其中两项指标以上 才能判定为纯品。常用的纯度鉴定方法有4 种：超离心、高压电泳、凝胶层析和 高效液相色谱，现在应用较多的是h p l c 法，也有人将旋光测定作为一种纯度测 定标准。 ( 1 ) 超离心：我们知道微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度，大小 和形状有关。将多糖样品溶于o 1 m o l 氯化钠或水，或o 1 m t r i s 盐酸缓冲液中， 其浓度为1 5 ，进行密度梯度超离心。待转速达到恒定后( 通常是6 0 0 0 0 r p m ) ， 间隔照明。如果得到的结果是单一峰，则证明该多糖是均一的组分。( 2 ) 高压电 泳：位阻因素决定了不同多糖与硼砂形成不同的复合物。所以在电场作用下多糖 的相对迁移率常因复合物的不同而不同 5 6 1 。( 3 ) 凝胶柱层析：常用的凝胶为 s e p h a d e x 、s e p h a r o s e 和s e p h a c r y l ，洗脱剂通常用0 2 2 m o l l 的n a c l 或水。如 果只有单一峰，且峰形对称，则说明多糖为均一组分。( 4 ) 旋光测定：在多糖 溶液中加入乙醇，使其浓度为1 0 左右，离心得上清夜，上清液再d i l x z _ , 醇，使 其浓度为2 0 2 5 ，离心得第二次沉淀。如果两次沉淀的比旋光度相同，则浣明 该多糖为均一组分。 5 4 多糖分子量测定1 5 8 枷i 多糖的分子量测定至今仍是一个复杂的问题，因为多糖的分子量只代表一定 分子量范围的平均分布，多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。即使是 同一多糖，往往用不同的方法会测得不同的分子量。例如商品化的标准多糖 d x 一1 0 ( p h a r m c i a 出品) ，其量均分子量( m w ) 与数均分子量( m n ) 分别为9 4 1 0 3 和5 5 1 0 3 ，通常文献中的多糖分子量均为量均分子量。 多糖分子量测定是多糖化学研究重要的一环，多糖的生物活性、理化性质均 和分子量有关。多糖的性质往往与分子量大小有关。例如，多糖溶液的粘度不 但随浓度的增大而升高，而且与分子量大小有关。一般来说，分子量增大，粘 度增高。在生物学研究中，发现某些多糖由于分子量大小方面的差异，所产生 的某些效应也有一定差异。在多糖的应用中，以多糖作为试剂用于某实验时， 往往需要对分子量大小方面作选择。 不论在多糖性质的研究，或是在它的用途 等方面，都涉及分子量方面的问题，需测定分子量，因而测定分子量成为研究和 制备多糖的一项经常性工作。用于多糖分子量的测定的方法有渗透压法，蒸汽压 渗透计法，端基法，粘度法，光散射法，凝胶色谱法，超过滤法，沉淀法，凝胶 电泳法，高效液相色谱( h p l c ) 法，超离心分析法和分子筛色谱法等。 目前，由于唰压合成凝胶的出现，使得高效液相色谱法广泛应用于多糖的纯 度和分子量测定上。它具有快速、高分辨率和重现性好等优点。根据糖的种类可 以采用不同的分离方法，如反相色谱、高效离子交换色谱、凝胶渗透色谱、多胺 修饰的硅胶色谱、毛细管色谱等。这些方法现已得到广泛应用，如控制医用葡聚 糖的质量、直链与支链淀粉的测定以及异麦芽低聚糖的组分分离等。实验室中最 简便可用的是凝胶过滤法。根据在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定 关系的特性，先用己知分子量的d e x t r a n 系列标准葡聚糖多糖制作标准曲线，然 后由样品的沈脱体积从标准曲线中对照得出分子量。用凝胶过滤法测分子量，每 次缓冲液及流速均需相同，否则会产生较大的误差。用不同型号的凝胶材料其测 定分子量的范围不同，如s e p h a d e xg 一2 0 0 适用分子量( m w ) 范围在1 ，o o o 2 0 0 ，0 0 0 的样品。 6 多糖结构的分析 6 1 多糖结构 蛋白质、核酸和糖是生命体中最重要的三类大分子量物质，但对糖的结构与 功能的认识远远落后于对蛋白质和核酸的认识，主要原因有两方面：糖的构型 较蛋白质和核酸复杂，蛋白质和核酸是分别通过酰胺键和磷酸二酯键相连的线性 分子；而糖通过糖苷键相连，糖苷键有a 、p 两种立体异构形式，并且由于每个 单糖有数个羟基而往往形成支链结构。因此，糖的分离、结构分析和化学合成都 较困难。糖在生物体内的合成也远比蛋白质和核酸复杂。糖的结构分类沿用了 蛋白质和核酸的分类方法，其结构可分为一级、二级、三级和四级结构。 目前的生物化学和分子生物学的发展对糖类的结构测定提出了新的要求，例 如基因工程的目的产物有不少是糖蛋白，而多数糖蛋白的性质及功能跟糖链的存 在及结构有关。多糖的结构测定是比较困难的，但解剖多糖的低级和空问结构， 对于明确多糖的生物学功能具有重要的意义。完整的多糖结构分析包括对多糖的 一一级结构和高级结构的分析。目前能有效分析多糖的一级结构的方法有化学方 法、物理方法和生物方法。现在在多糖一级结构的分析中大多采用化学方法与物 理方法相结合，可基本阐明某一多糖的一级结构的大致特征。而目前用于多糖高 级结构分析的方法主要是物理方法，诸如x 一射线纤维衍射、核磁共振、电子衍 射等。 6 2 多糖一级结构的测定： 6 2 1 化学方法测定陋“】 化学方法是是多糖结构分析中使用最古老且最经典的方法。这主要可以确定 多糖的组成及糖链的连接方式，而且提供火量的其他结构信息。它包括水解法、 甲基化分析、s m i t h 降解、高碘酸氧化、三氧化铬氧化法等。 水解法：水解法可分为完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。完 全酸水解：分析多糖链组成成分的主要手段。将多糖以强酸( 硫酸、盐酸) 等试剂 作用，在一定温度下( 8 0 1 0 0 。c ) 进行完全酸水解( 4 1 0 h ) 。水解的难易程度与组成 多糖的单糖性质、单糖环的形状和糖苷键的构型有关。一般呋喃型糖苷键较吡哺 型易水解，n 型较b 型易水解，含有糖醛酸或氨基糖的多不易水解。部分酸水 解：利用多糖链中部分糖苷键如呋喃型糖苷键、位于链末端的糖苷键和支链上的 糖苷键易水解脱落，而构成糖链的主链重复结构的部分和糖醛酸等对酸水解则相 对稳定的特点，对多糖常采用部分酸水解法处理。多糖经部分酸水解后，经醇析、 离心，将上清液和沉淀分别进行分析。多糖部分酸水解之后的醇析产物往往是多 糖的主链重复性结构片段、糖醛酸链片段，从这些小片段可以推测多糖链的一些 结构特点。乙酰解：将多糖与乙酐、冰醋酸、浓硫酸等混合反应，可得到乙酰 化单糖及乙酰化寡糖，反应产物可用t l c 、g c 等鉴定。甲醇解：利用 h c i c h 3 0 h 溶液把多