（有机化学专业论文）基于核酸适体识别和生物酶信号放大检测可卡因的研究.pdf

j 基于核 核酸适体( d n aa p t 疫原性、配体广泛等优点 识别和检测。而信号放大 重要，其中基于尘物酶信号放火的荧光定量p c r 技术和滚环复制( r c a ) 技术常 用的体外扩增方法。在本论文的研究中，将核酸适体识别与生物酶信号放大的荧 光分析法相结合，提出了一类新颖的、灵敏的呵卡因的检测方法。其主要内容如 下： l 基于核酸适体和荧光定量p c r 技术检测可卡囚新方法的研究 本章中，基于核酸适体识别与荧光定量p c r 生物酶信号放大技术实现了可卡 因的实时定量检测。为了实现低背景和高信噪比，本章利用磁珠分离技术实现了 p c r 模板链的彻底分离及富集，在很大程度上提高了检测方法的灵敏性。而荧光 定量p c r 技术对模板链进行了2 “倍的扩增，更进一步地提高了检测方法的灵敏 性。结合以上两种技术，该检测方法可检n ! f - i9f m o l 级的可卡因，并显示出良好 的特异性。在最佳检测条件下，可卡因浓度在1 0 0 0m o l l 1 0 击m o l l 之间时， p c r 循环闭值c t 值与可卡因的浓度之间存在线性关系，检测限为3 1 0 叫1m o l l 。 2 基于核酸适体和滚环复制技术检测可卡因新方法的研究 本章中，基于核酸适体识别及滚坏复制生物酶信号放大技术，构建出一种高 灵敏检测可卡因的荧光分析方法。当有目标物质可卡因存在时，可卡因与核酸适 体a 链上的序列特异性结合，将核酸适体互补链b 链从a 链上替换下来，再以替换 下来的b 链为引物环化探针c 链，从而通过滚环复制技术实现可卡因的定量检测， 检测限为2 0p m o l 。d n a 链也可以固定在芯片表面进行滚环复制扩增，但是芯片 上的滚环复制产物很难实现定量检测，因此在均相中利用此技术进行信号放大对 实现分析物的高灵敏定量检测变得尤为重要。另外，本实验方法还利用纳米会颗 粒比表面积大，能够结合成百上千条d n a 链的性质，提高检测方法的灵敏度。总 之，本实验方法具有很高的灵敏度和良好的特异性，为复杂生物环境下物质的检 测提供新的思路和模式。 关键词：核酸适体；荧光定量p c r ；滚环复制；可卡因；荧光 一一 s t u d yo nt h ec o c a i n ed e t e c t i o n b a s e do na p t a m e r r e c o g n i t i o na n d b i o l o g i ce n z y m es i g n a l a m p l i f i c a t i o n a b s t r a c t a p t a m e rh a sc a u g h tm o r ea n dm o r ea t t e n t i o ni nt h et a r g e t m o l e c u l e ( s m a l l m o l e c u l eo r p r o t e i n ) i d e n t i f i c a t i o na n dt e s t i n gb e c a u s eo ft h eh i g h a f f i n i t ya n d s p e c i f i c i t y , l o wm o l e c u l a rw e i g h t ，n o n i m m u n o g e n i c i t yc h a r a c t e r i s t i c s a n dt h es i g n a l a m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g yi sp a r t i c u l a r l yi m p o r t a n tt od e t e c tt h em o l e c u l e st h a tc a nn o t b et e s t e db yd i r e c ta m p l i f i c a t i o ni nal o wc o n c e n t r a t i o n i nv i t r o ，t h e n u c l e i ca c i d a m p l i f i c a t i o ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tm e a n so fb i o t e c h n o l o g yr e s e a r c h t h e b i o l o g i ce n z y m e 。b a s e ds i g n a l a m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g i e ss u c ha sf l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v ep c r ( f q p c r ) a n dr o l l i n gc i r c l ea m p l i f i c a t i o n ( r c a ) a r et h em o s t c o m m o n l yu s e ds i g n a la m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g y i nt h i ss t u d y , t h en o v e la n ds e n s i t i v e d e t e c t i o nm e t h o dh a db e e nd e s i g n e dc o m b i n i n ga p t a m e rr e c o g n i t i o nw i t ht h e b i o l o g i c e n z y m e - b a s e ds i g n a la m p l i f i c a t i o n t h em a j o rc o n t e n t so ft h et h e s i sw e r ea sf o i l o w s ： 1a na p t a m e r - b a s e da n df q p c ra m p l i f i c a t i o nm e t h o df o rt h ed e t e c t i o no f c o c a i n e i nt h i sc h a p t e r , an o v e lm e t h o db a s e do na p t a m e ri d e n t i f i c a t i o na n df l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v ep c rs i g n a l a m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g yf o rd e t e c t i o no fc o c a i n ew a s p r e s e n t e d i no r d e rt oa c h i e v el o wb a c k g r o u n da n dh i g hs i g n a l n o i s er a t i o ，w eu s e d m a g n e t i cb e a ds e p a r a t i o nt e c h n o l o g yt oa c h i e v eac o m p l e t es e p a r a t i o na n de n r i c h m e n t o fp c r t e m p l a t ec h a i n t h es e n s i t i v i t yh a db e e ng r e a t l yi m p r o v e d t h et e m p l a t ec h a i n w a sa m p l i f i e db y2 “t i m e sb yt h ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep c r t e c h n 0 1 0 9 y ，f u r t h e r l m p r o v m gt h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t y a sar e s u l to ft h e s et w oc o m b i n e de f f e c t s 9f h l 0 1 l e v e lo fc o c a i n ec o u l db ed e t e c t e du s i n gt h i sm e t h o d ，a n ds h o w e dg o o ds p e c i f i c i t v i n t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，c te x h i b i t e dal i n e a rd e p e n d e n c eo nc o c a i n ec o n c e n t r a t i o n i n aw i d er a n g ef r o m10 ut o10 m o l lw i t ha d e t e c t i o nl i m i to f3 10 1 1 m o i l 2a na p t a m e r - b a s e da n dr c a a m p l i f i c a t i o nm e t h o df o rt h ed e t e c t i o no fc o c a i n e i nt h ep r e s e n ts t u d y ，t h em e t h o df o rh i g h l ys e n s i t i v ed e t e c t i o no fc o c a i n ew a s d e v e l o p e db a s e do na p t a m e ri d e n t i f i c a t i o n a n dr c as i g n a la m p l i f i c a t i o n w h e n c o c a i n ew a si np r e s e n t ，a p t a m e rw a ss p e c i a l l yc o m b i n e dw i t hc o c a i n es ot h a tt h e s u p p l e m e n t a r ybc h a i nw a sr e p l a c e df r o ma p t a m e r t h ebc h a i nw a sd i r e c t l yu s e dt o c y c l i z ep r o b ec ，a n dr e a l i z e dt h eq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no fc o c a i n et h r o u g ht h er c a t e c h n o l o g y i nt h i ss t u d y ，t h ed e t e c t i o nl i m i to f2 0p m o lw a sa c h i e v e d w h e nt h ed n a c h a i nc o u l da ls ob ea d a p t e dt os u r f a c e so ft h ec h i p s ，t h eq u a n t i t a t i v er c aw a sp r o v e d d i f f i c u l t ，f u r t h e re m p h a s i z i n gt h ei m p o r t a n c eo fr e a l t i m ea m p l i f i c a t i o nm e t h o d sf o r s e n s i t i v eq u a n t i z a t i o ni n h o m o g e n e o u sp h a s es o l u t i o n i na d d i t i o n ，as i n g l ea u n a n o p a r t i c l ec o u l db el o a d e dw i t hh u n d r e d so fd n a ，w h i c hh a dg r e a t l yi m p r o v e dt h e s e n s i t i v i t y i nc o n c l u s i o n ，t h i sm e t h o de x h i b i t e de x c e l l e n ts e n s i t i v i t y ，s e l e c t i v i t y ，g o o d s p e c i f i c i t y ，a n dp r o v i d e dan e wi d e aa n dp a t t e r nf o rt h em o l e c u l a rd e t e c t i o nu n d e r c o m p l e xb i o l o g i c a le n v i r o n m e n t k e yw o r d s ：a p t a m e r ；f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v ep c r ；r o l l i n g c i r c l e a m p l i f i c a t i o n ；c o c a i n e ；f l u o r e s c e n c e i v 目录 第二章前言1 1 核酸适体研究进展2 1 1 核酸适体的定义2 1 2 核酸适体的来源及体外筛选2 1 3 核酸适体的特点3 1 3 1 靶物质的广泛性3 1 3 2 高亲和性和高特异性一4 1 3 3 分子量小一”4 1 3 4 稳定性好，可重复性4 1 3 5 体外筛选、化学合成4 1 4 核酸适体的信号转换方式及应用4 1 4 1 基于电化学方法的信号转换原理5 1 4 2 基于荧光法的信号转换原理6 1 4 2 1 一般荧光法信号转换”6 1 4 2 2 工具酶荧光法信号转换7 2 信号放大技术研究进展l o 2 1 荧光定量p c r 信号放大技术1 1 2 1 1 荧光定量p c r 技术”1 1 2 1 2 荧光定量p c r 技术的特点1 1 2 1 3 荧光定量p c r 技术的检测方法1 2 2 1 3 1s y b rg r e e ni 检澳0 1 2 2 1 3 2t a q m a n 探针检测13 2 1 4 荧光定量p c r 技术的应用“1 3 2 2 滚环复制信号放大技术_ 1 4 2 2 1 滚坏复制技术的原理：1 4 2 2 2 滚环复制技术的特点”1 4 2 2 3 滚环复制的检测方法一1 5 2 2 4 滚环复制技术的应用1 6 2 2 4 1 在单核苷酸多念性( s n p s ) 检测分析中的应用”1 6 2 2 4 2 在细胞原位检测分析中的应用17 2 2 4 3 在蛋白质芯片中的应用18 2 2 4 4 在纳米材料中的应用l8 3 本课题的意义及研究内容2 0 第二章基于核酸适体和荧光定量p c r 检测呵卡凶新方法的研究 1 前言2 1 2 实验部分一2 2 2 1 试剂2 2 2 2 仪器2 3 2 3b 链的设计“2 3 2 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备一2 3 2 4 1 基本原理2 3 2 4 2 凝胶浓度选择原则2 4 2 4 31 5 聚丙烯酰胺凝胶的制备2 4 2 4 3 1 安装电泳装置2 4 2 4 3 2 灌制凝胶2 4 2 4 3 3 上样与电泳2 5 2 4 3 4 检测p c r 产物”2 5 2 5 实验方法”2 6 2 5 1 金电极处理2 6 2 5 2 核酸适体的固定和杂交2 6 2 5 3 荧光定量p c r 技术检测可卡因2 6 3 结果与讨论2 7 3 1 实验原理2 8 3 2 检测方法的表征_ 2 9 3 2 1 裸金电极与a 链的结合“2 9 3 2 2 巯基封闭金电极结合位点3 0 3 2 3a 链与b 链的杂交31 3 2 4 可卡因作用3 2 3 3 不同浓度b 链标准曲线的绘制3 3 3 3 1b 链的紫外标准曲线3 3 2 3 3 2b 链的荧光定量p c r 标准曲线3 4 3 4 可卡因的线性相关性及灵敏度的研究3 6 3 5 检测方法特异性的研究3 8 4 小结：3 9 第三章基于核酸适体和滚环复制技术检测可卡凶新方法的研究 一、l l 1 日i j 舌4 0 2 实验部分4 l 2 1 试剂4 l 2 2 仪器4 2 2 3d n a 链的设计4 2 2 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备4 3 2 5 实验方法4 3 2 5 1a u 纳米粒子的制备4 3 2 5 2a u 纳米粒子在磁珠上的修饰4 3 2 5 3d n a 的固定和杂交4 5 2 5 4 可卡因作用“4 5 2 5 5 信号放大及荧光检测4 5 3 结果与讨论4 5 3 1 实验原理4 5 3 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳4 7 3 3 实验条件优化4 8 3 3 1 滚环复制作用时间优化”4 8 3 3 2 分子信标杂交时间优化”4 8 3 3 3 滚环复制反应条件的优化”4 9 3 4 检测方法线性相关性及灵敏度的研究5 0 3 5 检测方法可重复性的研究”5 2 4 小结5 3 结论一5 4 参考文献5 5 3 致谢6 3 攻读学位期间发表的学术论文6 4 独创性声明_ 一6 5 青岛科技人学研究牛学位论文 第一章前言 随着人类基冈组计划( h g p ) 的顺利完成，人类已进入了后基因组时代，生 命科学从确定核酸( d n a 或r n a ) 序列层面深入到蛋白质组学研究和功能基因 组研究上来。如何构建快速、有特异性、集约化的高灵敏小分子和蛋白质检测 技术是当今蛋白质组学研究所面临的紧迫任务【2 3 】。而基于抗体抗原结合识别蛋 白质的传统技术受到了以下两方面的限制：( 1 ) 不是所有的蛋白质都能得到与 之相对j 衄的高效、专一结合的抗体；( 2 ) 生物体细胞内小分子和蛋白质等的含 量往往极低，需要更灵敏的检测方法。因此，迄今为止，还难以构建完全以抗体 为识别已件的高灵敏蛋白质检测技术【4 ，5 】。与抗体为识别元件相比，核酸适体 ( d n aa p t a m e r ) 由于具有配体广泛、高亲和性及高特异性、分子量小、无免疫 原性等优点，被越来越多的应用于目标分子( 小分子或蛋白质) 的识别和检测1 6 7 1 。 核酸适体是一类能与蛋白质等靶物质特异性结合的寡聚核苷酸片段，而且对 目标分子具有高度亲和性和专一性的识别能力【8 9 】。核酸适体常通过组合化学合 成，具有化学稳定性好、易保存等优点。而由生物有机体产生的抗体活性保存期 有限、对外界温度敏感及固定时活性易受损。因此，基于核酸适体识别的检测技 术发展迅速，已有针对不同疾病的蛋白质传感器和相应的诊断技术得到了研究 【l o 】。目前，国外常用荧光检测法【1 1 、比色法【1 2 】、电化学 1 3 , 1 4 1 和晶体石英微天平方 法i l5 】等方法基于核酸适体对蛋白质进行检测，相关的蛋白质识别技术也正在迅速 地发展。信号放大技术对不能进行直接扩增的低浓度待测分子的检测尤为重要。 核酸分子体外扩增是生物技术研究的重要手段，其中基于生物酶信号放大的荧光 定量p c r 技术和滚环复制( r c a ) 技术更是最常用的体外扩增方法。荧光定量 p c r 技术是通过对p c r 反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现 对起始模板定量及定性的分析方法( i6 1 ，不仅实现了定量检测d n a 模板，而且具 有特异性和可靠性强、灵敏度高、实时性和准确性、无污染性、实现多重反应等 特点【1 7 ，i 引。目前已广泛应用于医学和分子生物学等领域。r c a 技术是一种在恒温 下对环状单链d n a 序列进行扩增的方式【1 w ，由于其不仅能直接扩增特定的d n a 、 r n a ，还能实现靶序列的信号放大，而且扩增是在等温下实现的，反应条件温和， 其灵敏度呵达到1 个拷贝的核酸分子，因此近年来滚环扩增技术得到了广泛的应 用，已被成功地运用于病毒基因的检测、单核苷酸多念性( s n p s ) 等一系列研究 基丁核酸适体识别和生物酶信号放人枪测可 冈的研究 中，利用滚环复制进行识别信号的扩增和放大的研究也越来越多【2 0 1 。经以一f ：两种 技术放大后的信号均被转换成荧光信号，通过荧光分析方法得剑榆测。 在本论文的研究中，将核酸适体识别与生物嗨信号放大的荧光分析f m l l 结 合，提出了一类新的、灵敏的目标分子( 小分予或蛋门质) 的枪测方法。理论上， 该类方法的灵敏度可检测到1 个拷贝的核酸分子，在实现d n a 和r n a 的绝对定 量分析、基因突变及其多念性的高灵敏度检测厅面，这种枪测技术将会发挥重要 作用。 1 核酸适体研究进展 1 1 核酸适体的定义 自1 9 9 0 年美国的t u e r k 和e l l i n g t o n t 2 1 】分别从寡核营酸分子的文库罩筛选m r n a 型寡核苷酸适体以来，基于核酸适体的识别与检测方法在分析化学、犟凶 调控、蛋白质组研究、疾病治疗与新药研发等方面具有广阔的应用j 订景【22 | 。核酸 适体( a p t a m e r ) 也称为适体、适配体和适配子等，是通过指数富集配体系统进化 ( s e l e x ) 技术从人工构建的随机单链寡核：舒酸文库罩筛选 b 末，能与相应配体 高效、专一结合的一类单链寡核苷酸序列，一般是由2 5 8 0 个碱基组成，可以是 d n a 也可以是r n a t 2 3 , 2 4 。 1 2 核酸适体的来源及体外筛选 核酸适体的筛选过程起始于组合化学合成的随机寡核：旨酸库。与其它类型的 文库相比，随机寡核苷酸库具有库容量大、多样性高两大显著优点。理论上如果 寡核苷酸中的随机序列由n 个碱基组成，库容量则为4 “。若再考虑人为塑造的修 饰文库，就更增加了随机序列的多样性。一般首轮筛选的库容达到l o 1 0 b 即可 满足实际需要。 s e l e x 技术是2 0 世纪9 0 年代初建立的一项新的体外筛选技术，其总的思 路是从随机的、库容为1 0 1 5 左右的寡核苷酸库中筛选到与靶物质高度结合的序 列，然后通过数轮的筛选、分离和指数富集，最终得到需要的d n a 或r n a ，即 核酸适配体( a p t a m e r ) 。美国科罗拉多大学( u n i v e r s i t yo f c o l o r a d o ) 的t u e r k 2 5 】 等首先运用s e l e x 技术筛选到噬菌体t 4d n a 聚合酶的r n a 序列后，此项技术 就成为各国学者的研究热点，为生物、化学和医学领域的研究提供了高效的检测 手段。 s e l e x 技术的工作流程通常包括以下几个环节【2 6 1 ，如图1 1 所示。 2 薰 图1 1s e l e x 技术线路图 f i g 卜1t h es c h e m eo fs e l e xt e c h n i q u e 首先，人工建立一个含有1 0 ”1 0 ”个单链随机寡核苷酸( d n a 或r n a ) 序 列的文库，其中随机寡核苷酸序列一般在1 5 6 0 个碱基之间；随机序列的两端为 固定序列，这些序列是随后p c r 循环时结合引物所必需的。其次，d n a 或r n a 随机库在特定缓冲体系下与靶物质温育，然后通过特定方法纯化出与靶物质结合 的寡核苷酸适体。再次，所分离的寡核苷酸适体先经常规p c r 再通过不对称p c r 扩增出次级s s d n a 库，进入下一轮筛选。最后，重复筛选、分离、扩增的循环 步骤。随着每一轮筛选条件的不断提高，与靶分子高度特异结合的s s d n a 或r n a 分子呈指数级增长，经过大约8 1 5 轮筛选富集后，亲和力达到饱和，最终得到所 需要的a p t a m e 一2 7 j 。 1 3 核酸适体的特点 1 3 1 靶物质的广泛性 核酸适体代表着一类功能与抗体类似的新型分子。由于核酸适体不仅具有类 似抗体对目标分子高亲和力和高特异性、分子量小、结构简单和易合成等优点， 而且具有反应速度快、可反复使用和长期保存等优点【2 8 3 0 1 ，所以在十几年来得以 迅速的发展，筛选出的核酸适体所识别的靶物质，从无机离子【3 1 , 3 2 】、氨基酸【3 3 , 3 4 】、 有机染料3 5 1 ，到多肽【3 6 , 3 7 】、蛋白质【3 8 枷】、抗生素4 1 , 4 2 】，甚至整个细胞【4 3 4 5 1 ，涉及 范围十分广泛。理论上来讲，通过s e l e x 技术可以筛选得到任何相应靶物质的 核酸适体。 基丁_ 核酸适体识别和生物酶信号放人检测可k 闪的研究 1 3 2 高亲和性和高特异性 核酸适体与其靶物质之间存在高度特异的亲和力，这种亲和力的解离常数多 在1 0 - 2m o l l 1 0 - 9m o l l 4 6 , 4 7 1 之l 日j ，高于其它类型的配体，何些甚至强于其天然 配体。角质细胞! l 长因子与其核酸适体结合的解离常数竞达3 0 0f m o l l ( 0 3 1 0 一眩m o l l ) ，是迄今t f - 亲和力最高的适配体对f = | 7 1 。 核酸适体与配体之问有较大的接触嘶移 ( 3 0 4 0l l m 2 ) 4 8 】，能够感知配体方面 极其细微的变化，能够分辨出不同配体上一个牲团的燕别，甚至能够识别同蛋 白质分子的不同构象、不同功能状念【27 1 ，如茶碱与其r n a 核酸适体的亲和力相 当于其类似物如咖啡因( 与茶碱只槲差一个碱基) 的1 0 ，0 0 0 倍1 4 9 1 。另外，核酸 适体还可以将氨基酸、腺：侍等生物小分予的突变体、异构体区分丌来5 0 堙1 。因此 核酸适体具有高特异识别的能力。 1 3 3 分子量小 核酸适体是一段由2 5 - 8 0 个碱基组成的谁链寡核苷酸片段，分子置。一般为 8 1 5k d a ，分子量小，与目标分子结合空l 日j 位阻小。 1 3 4 稳定性好，可重复性 相对于酶和抗体抗原，核酸适体不仪具有良好的稳定性，而且可在不同温度、 盐浓度、变性剂等条件下反复变性和复性，进行重复利用。 1 3 5 体外筛选、化学合成 核酸适体的制备不依赖于动物或细胞，而是通过s e l e x 技术体外筛选出来 的，可通过改变筛选条件及筛选后修饰，使筛选出的核酸适体适应不同反应体系 的需要。筛选出的适体可以通过化学合成生产，纯度高、组成确定，几乎消除了 适体制备的批问误差，较单抗制备更快速、更廉价。 1 4 核酸适体的信号转换方式及应用 由于核酸适体具有高亲和性和高特异性、配体广泛、分子量小和易合成、易 储存、易化学修饰等优点，基于核苷酸适体的识别与检测方法在分析化学、基因 调控、蛋白质组研究、疾病治疗与新药研发等方面具有广阔的应用前景【2 2 1 。但是 核酸适体本质上只是一段寡核苷酸片段，当将其用于检测各种靶物质时，它与靶 物质特异性的识别本身并不能产生可检测的信号。因此，为了实现信号检测，需 4 青岛科技人学研究生学何论文 要将核酸适体的谚 别作用转换为可检测到的物理或化学的信号。按照信号转换原 理的不同可将核酸适体的信号转换方式分为电化学方法和荧光检测法两种。 1 4 1 基于电化学方法的信号转换原理 s t o j a n o v i c 等【5 3 1 ( 如图1 2 所示) 将可卡凶的核酸适体一端刚定诅：会电极 ：， 另一端修饰甲基蓝作为电信号检测分子。当有靶物质l i 丁卜凶存舀：时，核酸适体与 靶物质结合，空恻上形成的折叠结构使得甲基蓝靠近会电极表面，产生感应r n 流， 以此电信号的变化实现对可卡因的检测，检测限为1 0v m o l l 。幽内的张成孝研 究小组【蚓将钉复合物修饰剑核酸适体上，对可卡因进j ，了检测，此方法灵敏度较 高，检测限达到了ln m o l l 。 图1 2 利用电化学信号检测可卡因原理图 f i g 1 - 2t h es c h e m a t i co ft h ee l e c t r o n i ca p t a m e r - b a s e d ( e a b ) c o c a i n es e n s o r r a d i 等f 5 5 】用混合自组装法将巯基修饰的核酸适体固定于余电极表面，构建了 一种检测凝血酶的可再生阻抗型传感器( a p t a s e n s o r ) ，凝血酶的动念响应浓度范 围是5 0 3 5 0n m o l l ，检测限为2 0n m o l l 。 l e 等”6 】借助中性p n a ，利用核酸适体靶物质复合体在内切酶溶液中的稳定 性，以二茂铁衍生噻吩聚合物为电化学活性探针，以凝血酶为目标物，构建出了 一种新型非标记的可再生阻抗型传感器，获得的检测限低达1 0n m o l l 。 c l a r k 等【5 7 】( 如图1 - 3 a 所示) 将凝血酶核酸适体的一端固定在金膜表面，在 另一端加入一段术端修饰亚甲基蓝并与适体互补的的核苷酸片段，发展了一种基 于核酸适体的检测凝血酶的电化学方法( e l e c t r o c h e m i c a la p t a m e r b a s e d ，e a b ) 。 在没有凝m l 酶的存在的情况下，两段核苷酸片段互补结合，形成的空间结构远离 会膜表面；而当凝血酶与其核酸适体结合后，互补的核酸片段被挤下来，其修饰 亚甲基蓝的木端与余膜表面接触产生感应电流，以此电信号的变化实现对凝血酶 5 基r 核酸适体二。l l 刀t 1 0 币i i l j l 物酶信号放人枪测叮k l k l 的研究 的检测。z u o 等1 5 8 】和l u 等1 5 9 1 在此丛础上进一步改善得到如图1 3 b 和1 3 c 所示 的方案。 图1 3 利用电化学信号检测目标物原理图 图中e t 代表感应电流 f i g 1 3t h es c h e m a t i co ft h ee l e c t r o n i ca p t a m e r b a s e ds e n s o r s e t ：e l e c t r o nt r a n s f e r 总之，虽然核酸适体在电化学生物检测中的研究及应用历史较短，但是以上 研究工作充分证实了核酸适体在基础研究中的优势及疾病诊断应用中的潜力。 1 4 2 基于荧光法的信号转换原理 由于核酸适体易于进行荧光标记或与荧光物质结合，且荧光检测法易与其它 的信号放大技术相结合，方案设计比较灵活，所以核酸适体在荧光检测中的应用 较多。 1 4 2 1 一般荧光法信号转换 鉴于e b ( 溴化乙啶) 能嵌入杂交双链的碱基对中增强荧光信号，l i 掣6 0 j 以 e b 为荧光指示剂，以匹配序列与靶物质对核酸适体的竞争结合作用为原理，提 出了一种非标记适体的荧光分子丌关，用于检测凝血酶。 b o c k 等【6 i 】( 如图1 4 a 所示) 设计了一种用于凝血酶检测的荧光分子丌关，原 理为：设计的凝血酶核酸适体可以将分别标记有荧光物质与猝灭物质的信标链头 6 青岛科技人学伊究生学位论文 碰头进行连接。当有同标凝m 酶存在时，由于核酸适体与凝i f u 酶的结合能力强于 与标记猝灭物质的信标链结合能力，所以标记猝火物质的信标链被替换下米，使 得荧光物质产生荧光，因而实现凝血酶的检测。为了进一步提高检测的灵敏性， t s i a n g 等【6 2 1 ( 如图1 4 b 所示) 将荧光物质标记任核酸适体57 木端，狞火物质标记 到其互补链的3 米端，降低t d n a 链杂交时的阻力，提岛检测的灵敏性。 5 c c 2 g c 曼苎曼篓篓! ! ! f c c ? c ：璺曼廷墼冀! 曼璺翟蓖 5 f c a c t g i g t t g g t g t g g t t g g g g c g g f g c g 黼呼筘铀c 淀嚣丽f f 一 譬：e 7 。 c a 曩苁趸丐一 5 f 口 ll 围一一 固、| c5鸭-=cctgccacc-c彭tccg t乳一fcaccctgccacc-ctccgct-c嚣 g _，t t 5 t f g ，f k 6 僦撇铽弩 ，苫。，：? + 驴9 t 二：辨7 名t 砷_ ； g f 粼、t ，、，r 6 毯酉函函 图l _ 4 核酸适体信标检测凝血酶的原理图 f i g 1 - 4t h es c h e m eo ft h r o m b i nd e t e c t i o nb ym o l e c u l a rb e a c o na p t a m e r 1 4 2 2 工具酶荧光法信号转换 利用核酸适体的核酸分子性质，结合分子克隆中p c r 技术及常用的工具酶 ( 如连接酶、外切酶、聚合酶) ，避免对核酸适体探针进行直接的化学修饰，近 年来发展了在均相中检测靶物质的方法。 j i n g 等【6 3 】( 如图1 5 所示) 巧妙地设计了基于核酸适体与靶物质结合引起的 链替换扩增体系。首先设计一条可形成颈环结构的单链d n a ，此单链d n a 由两 部分碱基序列组成：一部分是可卡因的核酸适体序列( 黑体标出) ，另一部分为 灰色碱基序列，其中灰色碱基的37 术端序列与可卡凶核酸适体序列有9 个碱基互 补。当目标可卡因存在时，可卡因与其核酸适体结合使得灰色碱基的3 末端序列 被替换下来。此时加入第二条单链d n a ，使其与核酸适体的序列瓦补，将可卡 因包在链中间。最后加入一条与灰色碱基的3 木端序列 工补的引物，在k f 聚合 酶的作用下从3 到5 端延伸，将可卡因及第二条单链d n a 替换下来，使它们进 入下一个循环中。在聚合酶作用的同时加入荧光染料s y b rg r e e ni ，检测嵌入 双链中染料的荧光信号，从而实现对可卡囚的定量分析。 7 气 基丁_ 核酸适体彭 别羊i i ! l i 物酶信号放人检测可i ：- i 天1 的研究 一衄h 仲 壮眦- 删粼s oe 面澎s g f 胁曼c 艘蛳； ， 图1 5 基于核酸适体与链替换扩增反应的可卡因传感器原理图 f i g 1 5s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no fc o c a i n es e n s i n gs t r a t e g y b a s e do ns t r a n dd i s p l a c e m e n ta m p l i f i c a t i o n f r e d r i k s s o n 等【删( 如图l 一6 所示) 结合定量p c r 技术发展了一种高灵敏检测 血小板源生长因子( p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r ，p d g f ) 的分析方法。具体过 程为：针对p d g f 的二聚体有嚼个核酸适体的结合位点，在其适体的两端延伸设 计了4 0 个碱基，并只加入一段与两个适体尾部约有1 0 个碱基的互补的模板d n a 链。当p d g f 二聚体存在时，两段核酸适体探针同时与其结合，因此在空间上会 彼此靠近，大大提高了探针尾部与模板d n a 链的杂交机率。与模板杂交后的两 段探针在连接酶的作用下进行链接，与模板链形成稳定的双链d n a 链。连接产 物用实时荧光定量p c r 进行检测，可达到4 0 1 0 。2 1m o l l 的检测下限。 图1 - 6 基于核酸适体与聚合酶链反应的高灵敏的p d g f b b 检测原理图 f i g 1 - 6s c h e m eo fp d g f - b b d e t e c t i o nb ya p t a m e r - b a s e da n dp c r 8 锯 # 镍 觐 奶 洲 瓷 礁 护 鲁 ，一 青岛科技人学研究生学位论文 s h l y a h o v s k y 等1 6 5 j ( 如图1 7 所示) 巧妙设计了一种核酸适体孑靶物质结合 自动放大信号的体系。首先构建一个 ：t 段寡聚核苷酸组成的复合体：可卡闳核 酸适体片段、酶切位点的寡核苷酸片段及信号检测片段互补序列。当有靶物质可 卡因存存的情况f ，靶物质与核酸适体结合，面：聚合酶的作用下使得核酸适体链 可以沿着酶切片段延伸出一条信号检测”段：= i ! ! i j 内切嘛作用下，信号检测片段从 复合体一卜脱落，结合靶物质的核酸适体又，t 1 以进 j ：延伸，然后1 1 f 酶切；脱落下来 的信号检测片段与分子信标结合产尘荧光