（微生物学专业论文）微生物发酵法生产23丁二醇.pdf

摘要 摘要 以本实验室保藏的一株克雷伯氏杆菌( k l e b s i e l l as p ) 为出发菌株，经过紫外线、亚 硝基胍以及复合诱变和抗性平板的筛选方法，得到了一株遗传特征稳定的高产2 ，3 丁二 醇的突变菌株k l e b s i e l l as p u n 7 9 ，进而对该菌株产2 ，3 丁二醇摇瓶培养基和发酵条件进 行了优化。主要内容和结果如下： 1 对原始菌株进行多次u v 诱变、n t g 诱变、u v 和n t g 复合诱变后，利用产酸圈 大小和产物耐受程度对突变菌株进行筛选，最终获得了一株编号为k l e b s i e l l as p u n 7 9 遗传性能稳定的突变菌株，在未经过优化的条件下，该突变菌株产2 ，3 丁二醇量达到 2 4 2 0g l ，比原始菌株提高了2 8 倍，该菌株经过生理生化试验和传代试验结果表明该菌 株遗传性质稳定。 2 以高产2 ，3 丁二醇的诱变菌株u n 7 9 为出发菌株，系统研究了发酵培养基中碳源、 氮源、无机盐组成以及金属离子对菌体生长和2 ，3 丁二醇合成的影响。在发酵培养基单 因素影响试验的研究基础上，选择影响菌体生长和2 ，3 丁二醇合成的四个关键因素，设 计正交实验确定了四个重要因素的最佳水平，从而确定了发酵培养基的最佳配方( g l ) ： 葡萄糖8 0 ；酵母粉2 0 ；k h 2 p 0 46 0 ；k e h p 0 41 5 0 ：( n h 4 ) 2 s 0 43 0 ；柠檬酸钠4 0 ； m g s 0 4 7 h 2 0 0 1 ； c a c l 20 0 5 ；f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 5 ；z n s 0 4 7 h 2 00 0 0 5 ；m n s 0 4 7 h 2 0 0 0 0 5 ；e d t a0 0 5 。 。 3 考察了发酵培养基中添加有机酸、氨基酸、维生素、醇类对发酵产2 ，3 丁二醇的 影响。结果发现在培养基中添加乙酸、柠檬酸、丙酮酸作用是比较明显的；氨基酸中低 浓度的甘氨酸、丙氨酸的效果比较好；维生素中硫胺素和烟酸比较好；醇类添加效果不 佳。 4 发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对初始p h 、温度、接种量、装液 量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定了最佳的发酵条件如下：初始p h 值为5 5 6 5 ，培 养温度为3 5 ，装液量为2 5 0 m l = 角瓶中装1 0 0 m l 的发酵培养基，接种量为5 ( 即在1 0 0 m l 的液体培养基中接入5 m l 浓度为l x l 0 8 个r n l 的菌悬液) ，发酵方式采用分段发酵：即摇床 转速为1 2 0r m 培养2 5h 后转入静置培养至i j 4 8h 。 5 对摇瓶中流加补料进行了初步研究。研究发现，流加葡萄糖、氨水可以提高2 ，3 丁二醇的产量。 关键词：克雷伯氏杆菌； 2 ，3 丁二醇；诱变；分段发酵 a b s t r a c t a b s t r a c t am u t a t i o ns t r a i nk 昆b s i e l l as p u n 7 9w a so b t a i n e dw i t hs t a b l eg e n e t i cc h a r a c t e r ，a f t e r b e i n gt r e a t e dw i t hu v 、n t ga n dt h ef a s ts c r e e n i n gm e t h o db a s e do na c i dp r o d u c t i o na n d 2 3 - b u t a n e d i o lt o l e r a n c e t h e nt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e d t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ef o l l o w s ： 1 n l ec o m b i n e dm u t a t i o no fu va n dn t go n 胁撕把砌s pw a sc o n d u c t e d ，a n dt h ef a s t s c r e e n i n gm e t h o db a s e do na c i dp r o d u c t i o na n d2 3 b u t a n e d i o lt o l e r a n c ew e r ee s t a b l i s h e d a f t e rt h a t , t h e2 , 3 - b u t a n e d i o lp r o d u c t i o na b i l i t yw a si n c r e a s e dt o2 4 2 0g l ，w h i c hw a s3 8 t i m e st h a nt h a to ft h ew i l dt y p e m o r e o v e r 。h e r i t a g es t a b i l i t yw a sc o n f i r m e d a f t e rs e v e r a l g e n e r a t i o n so fs u b c l o n a t i o na n dp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s t s 2 e f f e c to fc a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e ，m i n e r a ls a l ta n dm e t a li o no nt h ec e l lg r o w t h a n d2 , 3 b u t a n e d i o lp r o d u c t i o no f 肋夙施肋s p 切n 7 9w e r es t u d i e d t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w s ( g l ) ： g l u c o s e8 0 ；y e a s te x t r a c t2 0 ；k h 2 p 0 46 ； k 2 h p 0 41 5 ；( n h 4 ) 2 8 0 43 ；c i t r a t es o d i u m4 0 ；m g s 0 4 7 h 2 00 1 ；c a c l 20 0 5 ；f e s 0 4 7 h 2 0 0 0 0 5 ；z n s 0 4 7 h 2 00 0 0 5 ；m n s 0 4 7 h 2 00 0 0 5 ； e d t ao 0 5 3 e 腩c to f v a r i o u ss u b s t a n c eo n2 , 3 b u t a n e d i o lp r o d u c t i o nh a db e e ni n v e s t i g a t e da sw e l l i m p r o v e m e n t sw e r eo b s e r v e dw h e na c e t i ca c i d 、c i r i t i ca c i d 、p y r u v i ca c i dw e r ea d d e d i n t ot h e m e d i u m o fa l la c i d st e s t e d g l y c i n e 、a l a n i n eo fl o wc o n c e n t r a t i o nc o u l de n h a n c et h e 2 ，3 - b u t a n e d i o lp r o d u c t i o ns l i g h t l y b e s i d e s ，v i t a m i nb l ，n i c o t i n i ca c i dc o u l di n c r e a s et h e q u a n t i t yo f2 , 3 b u t a n e d i o li nf e r m e n t a t i o nb r o t h l o w e rp r o d u c t i o no f2 3 - b u t a n e d i o lw a s f o u n df o l l o w i n gt h ea d d i t i o no fa l c o h o l s 4 f e r m e n t a t i o nc o n d i t o n so fk l e b s i e l l ns p u n 7 9w e r ed e t e r m i n e d ，o nt h eb a s eo ft h e r e s u l t i n gf e r m e n t a t i o nm e d i u mi nt h es h a k e f l a s k t h eo b t a i n e db e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n w a sd e s c r i b e da s ：o r i g i n a lp h 5 5 6 5 ，t e m p e r a t u r e 3 5 ，a m o u n to fi n o c u l a t i o n5 ，a m o u n to f l o a dlo o m l ( i n2 5 0 m l ，f l a s k ) ，r o t a t i o ns p e e d12 0 r p mf o r2 5 h ，t h e ns t a n d i n gf e r m e n t a t i o nf o r 4 8 h i na d d i t i o n t h ef e d b a t c h e dc u l t i v a t i o n sw i t hg l u c o s e ，a l k a l i n es u b s t a n c ew e r es t u d i e d i t w a sf o u n dt h a tt h eq u a n t i t yo f2 3 b u t a n e d i o lc o u l db ei m p r o v e db yc o n t i n u o u sa d d i t i o n so f g l u c o s ea n da m m o n i ai n t ot h ef e r m e n t a t i o nb r o t h k e y w o r d s ： k l e b s i e l l as p ；2 , 3 - b u t a n e d i o l ；m u t a t i o n ；b a t c hf e r m e n t a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含誉人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 趑笠塾 日期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 趣巴知 第一章绪论 第一章绪论 1 12 。3 一丁二醇概况 1 1 12 ，3 - t 二- 醇理化性质 2 ，3 丁二醇( 2 ，3 b u t a n e d i o l ，b d ) ，又称2 ，3 双羟基丁烷、2 ，3 丁烯乙二醇、二亚甲 基二醇，是一种手性复合物。它的分子式是c 棚l 0 0 2 ，结构式是：c h 3 c h ( o h ) c h ( o h ) c h 3 ， 相对分子量是9 0 1 2 k d a ，熔点( m p ) 2 3 2 7 c ，沸点( b o p ) 1 7 0 1 8 2 c ，闪点( f o p ) 1 8 5 。f ( 8 5 c ) ， 相对密度( d 2 0 2 0 ) = 1 0 4 5 。2 ，3 - 丁二醇是无色结晶或液体，具吸水性，能与水和醇相混溶， 能溶于醇和醚i j j 。 1 1 22 ，3 一丁二醇的应用 2 ，3 丁二醇是一种极具有价值的液体燃料，燃烧值是2 7 1 9 8j g - 1 ，相当于其它液体燃 料乙醇( 2 9 0 0 5j g 。1 ) 和甲醇( 2 2 0 8 1j g 。1 ) 【2 】；2 ，3 丁二醇也是一种非常有潜力的化工原 料；2 ，3 丁二醇脱水产物甲乙酮可作树脂、油漆等的溶剂；再进一步脱水可形成1 ，3 丁 二烯，可用于合成橡胶、聚酯和聚亚胺酯；酯化形式的2 ，3 丁二醇是合成聚亚胺的前体， 可应用药物、化妆品、洗液等；通过催化脱氢得到的二乙酰化形式的2 ，3 丁二醇可以用 作高价值香料的食品添加剂；2 ，3 丁二醇自身可以作为单体用来合成高分子化合物；左 旋形式的2 ，3 丁二醇由于具有较低的凝固点可用作抗冻剂p 1 ；2 ，3 丁二醇与甲乙酮脱氢形 成辛烷异构体，可生产高级航空用油；2 ，3 丁二醇酯化生成聚氨酯泡沫的前体；2 , 3 丁二 醇与乙酸反应生成2 ，3 丁二醇二乙酸酯，此酯类可加到奶油中改善风味；2 ，3 丁二醇在 我国还被添加到白酒中，以改善白酒的风味【4 _ 5 】。此外，还可制备油墨、熏蒸剂、增湿 剂、软化剂、增塑剂。 1 1 32 。3 一丁二醇的生产现状 生产2 ，3 丁二醇的主要方法有化学法和发酵法( 生物法) ，由于2 ，3 丁二醇结构特殊， 化学法生产2 ，3 丁二醇主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下水 解得到，成本高、过程烦琐、不易操作，所以一直很难实现大规模的工业化生产【6 】。因 此2 。3 丁二醇的用途也没有得到充分的开发，这使得尽管国际上2 ，3 - 丁二醇的发酵工业 基本达到了酒精发酵的水平，但也一直没有实现工业化。 发酵法是利用微生物将可再生资源( 如淀粉、纤维素等) 通过微生物发酵的方法生 产2 ，3 丁二醇，至今已经有近百年的历史。随着化石资源( 如石油和煤炭) 日益枯竭以 及传统化学工业给环境带来的污染日益严重，将可再生资源转化为化工原料的研究与开 发越来越受到世界各国的广泛关注，以木质纤维素的水解液为原料，通过细菌将碳水化 合物转化为2 ，3 丁二醇将有望进一步降低生产成本1 7 1 ，近年来，随着石油价格的日益攀 升，用微生物发酵法生产2 ，3 丁二醇并对其衍生物进行开发研究逐渐引起了人们的关注。 发酵法生产2 ，3 丁二醇有许多的优点：首先在成本上具有优势，化学法生产成本比较高； 江南大学硕士学位论文 其次，发酵法具有对环境友好的特征，2 ，3 丁二醇作为有机合成中间体取代了许多的化 合物和其它石化产品的市场，前景广阔，社会、环境效益显著，非常有利于该产品的广 泛应用；第三，由于发酵法生产2 ，3 丁二醇是以可再生资源为原料的，因此本身摆脱了 对石化原料的依赖，具有很好的应用前景。目前2 ，3 丁二醇的出厂价约1 0 万元吨左右， 2 ，3 丁二醇的工业化生产主要是发酵法，有关该研究国外进行的较早，取得的成绩也比 较显著，国内研究还处于初级阶段例。 1 9 8 8 年，r a m a c h a n d r a 等利用k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e 以及细胞循环技术得到3 9 6g l 2 。3 t - - 酣9 j ；1 9 9 1 年，z e n g 等利用e n t e r o b a c t e ra e r o g e n e s 膜反应器和细胞循环技术得 到1 1 0g l2 ，3 - 丁二醇0 0 ；2 0 0 3 年，p e r e g o 等利用b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 发酵得到5 1 6g l 2 ，3 t - - s t l l l ；2 0 0 6 年，山东大学许平教授以克雷伯氏菌株利用补糖发酵得到8 4 0g l 2 ，3 丁二醇【1 2 】，虽然报道2 ，3 丁二醇产量比较大，存在问题是培养基复杂，或采用细胞 循环、微膜等技术，前者成本过高且后处理困难，后者则需要较复杂设备，都不利于实 际生产。 1 2 发酵生产2 ，3 一丁二醇的茵种 目前发酵生产2 ，3 丁二醇的微生物主要是细菌类，包括克雷伯氏菌属( k l e b s i e l l a ) 、 芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 、肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) 、假单胞菌( p s e u d o m o n a d ) 和沙雷氏菌属 ( s e r r a t i a ) 等【1 3 1 。多粘芽孢杆菌和肺炎克雷伯氏菌是最具有工业化潜力的f 1 4 1 ，多粘芽 孢杆菌具有产生淀粉酶和木糖酶的能力，可以利用的底物比较广泛，产生的2 ，3 丁二醇 约9 8 为n 型的，常用来制备手性2 ，3 丁二醇，但其副产物乙醇的量比较大【1 5 。1 q ；克雷 伯氏杆菌属具有宽广的底物范围以及对培养条件具有很好的适应能力，产生的2 ，3 丁二 醇的量是多粘芽孢杆菌的两倍，发酵也很彻底，副产物乙醇的量也很少，但产生的2 ，3 丁二醇约8 6 9 5 为内消旋型，5 1 4 为l 型【4 o 。 这些细菌在发酵生产目标产物2 ，3 丁二醇的同时还会产生3 羟基2 丁酮、乙醇、乙 酸、乳酸等副产物，其中3 羟基2 丁酮是2 ，3 丁二醇的前体物质，在3 羟基2 丁酮还 原酶的作用下可以转化成2 ，3 丁二醇。不同的菌种发酵生产2 ，3 丁二醇的光学纯度不同 【1 3 】，例如：多粘芽孢杆菌主要生成d 型2 ，3 丁二醇；亲水气单胞菌可生成d 型和m e s o 型2 ，3 丁二醇；黏质沙雷氏菌可生成l 型和m e s o 型2 ，3 丁二醇。微生物体内2 ，3 - 丁二醇 的生成具有两个重要的生理功能【4 1 7 】：调节体内p h 值和保持体内n a d + f n a d h 平衡。 1 32 ，3 一丁二醇代谢途径及其酶和基因的研究 1 3 12 ，3 一丁二醇代谢途径 2 ，3 丁二醇代谢途径如图1 1 所示【1 8 。1 9 1 。在氧化途径中的丙酮酸的代谢是重要的一 步，有两个作用于丙酮酸的多酶复合体系：即丙酮酸脱氢酶酶系和丙酮酸甲酸裂解酶 酶系。在有氧的情况下，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系下参与丙酮酸的有氧代谢，形成乙酰 c o a 后转入三羧酸循环被彻底氧化；在厌氧( 发酵) 情况下则不再合成丙酮酸脱氢酶系， 而是诱导合成丙酮酸甲酸裂解酶酶系，进行混合酸发酵。在肠杆菌属、克雷伯氏菌属 2 第一章绪论 等的一些中具有作用于丙酮酸的第三个酶系：a 乙酰乳酸合成酶系，形成2 ，3 t - 醇。 葡萄糖 l 甘油醛- 3 磷酸 乙酰磷酸乙醛 窿窿竹 丁二醇 图卜l 典型的2 ，3 一丁二醇代谢途径 f i g 1 1r e p r e s e n t a t i v em e t a b o l i cp a t h w a yo f 2 ，3 b u t a n e d i o l ( 1 ) e m p 途径各种酶( 2 ) 乳酸脱氢酶( 3 ) 苹果酸脱氢酶( 4 ) 丙酮酸甲酸裂解酶 ( 5 ) 甲酸裂解酶( 6 ) 醛脱氢酶 ( 7 ) 醇脱氢酶( 8 磷酸乙酰转移酶 ( 9 ) 乙酸激酶 ( 1 0 ) 乙酰乳酸合成酶( 1 1 ) 乙酰乳酸脱羧酶( 1 2 ) 2 ，3 丁二醇还原酶 从丙酮酸到2 ，3 - 丁二醇的形成有三个酶参与：乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸脱羧酶和 3 羟基2 - 丁酮还原酶( 2 ，3 丁二醇脱氢酶) 。也有报道称枯草芽孢杆菌( b s u b t i l u s ) 、蜡状 芽孢杆菌僻卯旭淞) 和尿素微球菌( m 配陀力有另一条2 ，3 丁二醇合成途径，称作2 ，3 丁二醇 循环( 2 ，3 b u t a n e d i o lc y c l e ) ，如图1 2 。 一 卜一 a 媳啊m w 两啊嗍抽，b t ，f 以含一 图1 22 ，3 一丁二醇循环 f i g 1 - 2t h e2 , 3 b u t a n e d i o lc y c l e 3 翟 慕淼 谚o 江南大学硕士学位论文 乙酰羟基丁酮合成酶( a a c s a s e ) 和乙酰羟基丁酮还原酶( a a c r a s e ) 是2 ，3 - 丁二醇循 环中的代表酶，前者被3 羟基2 丁酮诱导后，后者被葡萄糖诱导，具有乙酰羟基丁酮合 成酶的菌株都具有乙酰羟基丁酮还原酶，但具有乙酰羟基还原酶并不一定具有乙酰羟基 合成酶。因此，乙酰羟基合成酶的存在即意味着2 ，3 丁二醇循环的存在【2 0 1 ，具有典型2 ，3 - 丁二醇途径的菌株并不一定具有2 ，3 丁二醇循环，如肺炎克雷伯氏杆菌和多粘芽孢杆菌 都具有典型的2 ，3 丁二醇途径，但前者具有2 ，3 一丁二醇循环，后者则没有。 1 3 22 ，3 - 丁二醇合成关键酶以及基因的研究 乙酰乳酸合成酶只在偏酸性条件下( p h 6 ) 合成 2 1 - 2 3 1 ，因而又有酶p h 6 之称。p h 6 酶催化一个两步反应：首先是丙酮酸与焦磷酸硫胺素( t p p ) 生成羟乙酰t p p 酶复合体， 然后另一分子丙酮酸与其复合体缩合生成乙酰乳酸。肺炎克雷伯氏杆菌的乙酰乳酸合成 酶被纯化，其最适合的p h 值是5 8 ，磷酸和硫酸竞争性的抑制此酶，肺炎克雷伯氏杆菌 的乙酰乳酸脱羧酶的最适合的p h 值是6 2 6 4 ，在p h 5 8 时，活性有最高活性的7 5 。 k r i s t i n ab 等发现表达2 ，3 丁二醇途径关键酶的a 乙酰乳酸合成酶、a 乙酰乳酸脱羧 酶、3 羟基2 丁酮还原酶位于克雷伯氏杆菌( e 口p 加秽疗p j ) 的同一个操作子上【2 4 之5 1 ，且该 操作子在k l e b s i e l l at e r r i g e n a 中也被发现。克雷伯氏杆菌中编码2 ，3 丁二醇生成途径中 的三个酶的基因被分离出来，它们位于同一个操纵子b u d a b c 中，如图1 3 ： 氯化钙 磷酸氢二钾，即在实验确定的因素中，葡萄糖的影响最大，因为细胞 生长对碳源要求较高，葡萄糖是速效碳源有利于菌体的生长，但也不能过多，因为糖分 过多，菌体代谢活动旺盛，容易引起菌种衰老，进而影响产物2 ，3 丁二醇的量；其次是 酵母粉，因为细胞对氮源的要求也比较高，一般需要丰富的氮源；氯化钙对2 ，3 丁二醇 也比较大，可能会影响菌体的代谢和2 ，3 丁二醇的得率；磷酸氢二钾影响最小。 以因素水平为横坐标，2 ，3 丁二醇的量为纵坐标作正交数据分析图，如图3 5 所示。 第三章2 ，3 丁二醇摇瓶培养基优化 a la 2 a 3b lb 2 b 3c 1c 2c 3d id 2 d 3 因素水平 图3 - 5 正交效应曲线图 f i g 3 - 5t h ec u r v eo fo r t h o g o n a lt e n d e n c y 从图3 。5 所考察的影响2 ，3 丁二醇的四个因素水平中可知：最佳配比为a 2 8 2 c 2 0 2 ， 即葡萄糖8 0g l 、酵母粉2 0g l 、磷酸氢二钾1 5g l 、氯化钙o 0 5g l ，此结果与单因 素时的结果基本一致，由于正交实验所确定的最佳条件并未被包含在正交实验表的九个 实验中，为了进一步确认实验结果，采用最佳的条件a 2 8 2 c 2 d 2 进行了试验验证，结果 见表3 8 。 表3 - 8 验证实验结果 t a b l e3 - 8t h ev e r i f i c a t i o no f t h ee x p e r i m e n t 由表3 8 可知：实验验证了最佳配比a 2 8 2 c 2 d 2 组合下产2 ，3 - 丁二醇的量处于正交实 验的较高水平，实验结果较为理想。所以在最佳配比下组合a 2 8 2 c 2 d 2 测定2 ，3 一丁二醇 的量为3 0 4g l 。 3 3 6 添加各种营养物质对茵体产2 ，3 一丁二醇的影响 考察发酵培养基中添加各种营养成分( 有机酸、氨基酸、维生素、醇类) 的影响。 3 3 6 1 添加各种有机酸对菌体产2 ，3 丁二醇的影响 在培养基中添加各种有机酸，结果见表3 - 9 。 从表3 - 9 结果可看出：发酵培养基中添加不同的有机酸时，对发酵产2 ，3 一丁二醇有 一定的作用，其中乙酸、柠檬酸、丙酮酸的促进作用是比较明显的，琥珀酸的添加量比 较低时能促进2 ，3 丁二醇的生成，苹果酸、丙酸作用不是很明显。原因可能如下： 汐 嚣 刀 衢 答 m (1毒簋卜nn 江雨大字坝士学位论又 表3 - 9 添加各种有机酸对茵体产2 ，3 一丁二醇的影响 t a b l e3 - 9e f f e c to fo r g a n i ca c i do n2 , 3 一b u t a n e d i o lp r o d u c t i o n 乙酸是2 ，3 丁二醇发酵过程中的副产物，2 ，3 丁二醇发酵过程中还会生成乙醇、 乳酸等多种具有抑制作用的副产物，其中乙酸支路是有利的，由于乙酸支路不消耗还原 物质n a d h ，却能产生生物能量a t p ，因而有利于菌体生长和2 ，3 丁二醇的产生，在代 谢通量一定情况下，如果乙酸代谢支路活性较高，乙醇代谢途径，特别是乙酰辅酶a 转 化为乙醇代谢支路活性必然会低，乙酸的增加势必会引起乙醇的减少，乙醇途径需消耗 还原当量n a d h ，所以对于2 ，3 丁二醇的生成是不利的，从而导致产率降低 4 0 训j 。 柠檬酸代谢中的四种酶( 柠檬酸裂解酶、乙酰乳酸合成酶、双乙酰还原酶、乙偶 姻还原酶) 的酶活受细胞是否以柠檬酸为碳源基质的影响，有些细菌虽然不能利用柠檬 酸为能源，但是却能被迅速的利用，且促进细胞的生长。乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸脱 羧酶、双乙酰还原酶、乙偶姻还原酶均存在于2 ，3 丁二醇合成的主要途径中，培养基中 加入柠檬酸结果表明柠檬酸可以有效的促进2 , 3 丁二醇的发酵，柠檬酸不但可以促进糖 耗、缩短发酵周期，加快细胞生长，而且总细胞量、目标产物2 ，3 一丁二醇产量及产物得 率均明显增加【5 8 】。柠檬酸对发酵的机理还需要进一步的研究。 丙酮酸是代谢途径中的关键中间产物，丙酮酸沿着不同的代谢途径产生目的产物 和副产物，丙酮酸有多个代谢途径可以生成不同的物质，丙酮酸在三种关键酶0 【- 乙酰乳 酸合成酶、a - z , 酰乳酸脱羧酶、乙偶姻还原酶的作用下生成目标产物2 ，3 丁二醇。丙酮 酸是生成2 ，3 丁二醇的前体物质，是生成2 ，3 丁二醇的重要的中间产物，增加丙酮酸势必 会增加2 ，3 丁二醇的的量。 琥珀酸是克雷伯氏杆菌产2 ，3 丁二醇途径中产生的副产物，琥珀酸支路虽然消耗 还原物质n a d h ，但是却产生生物能量a t p ，也利于2 ，3 丁二醇的生成【5 3 】。 3 3 6 2 添加各种氨基酸对菌体产2 ，3 丁二醇的影响 在培养基中添加各种氨基酸，结果见表3 - 1 0 。 第三章2 ，3 丁二醇摇瓶培养基优化 表3 - 10 添加各种氨基酸对茵体产2 ，3 一丁二醇的影响 t a b l e3 - 1 0e f f e c to f a m i n oa c i do n2 3 - b u t a n e d i o lp r o d u c t i o n 从表3 - 1 0 的结果可看出：添加低浓度的氨基酸比高浓度的氨基酸好，当添加的氨 基酸浓度较低时，一部分氨基酸可以起到促进的作用，如甘氨酸、丙氨酸；一部分氨基 酸对2 ，3 丁二醇合成影响不大，如苏氨酸、精氨酸、天冬氨酸；一部分氨基酸对2 。3 丁 二醇的合成有一定的抑制作用，如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。原因可能是： 低浓度的氨基酸作为一种氮源可被菌体利用又不至于使菌体长的过于旺盛，而且 培养基中加入了这些氨基酸时，菌体不再自身合成氨基酸，各种营养较多地用于合成2 ，3 丁二醇，而当添加的氨基酸的浓度较大时，一是灭菌时美拉德反应严重产生色素对细胞 有毒害作用，二是氨基酸浓度过大，菌体生长过于旺盛，各种营养物质较多用于合成细 胞物质而不利于产生2 ，3 丁二醇。 报道说在p h 6 5 时，亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸浓度在0 1m m 时反馈抑s f j 孚l 酸合成酶( a a l s ) 的活性，乳酸合成酶是合成2 ，3 丁二醇途径中的关键酶，活性的高 低影响着目标产物2 , 3 丁二醇的量【5 9 】。 3 3 6 3 添加各种维生素对菌体产2 ，3 丁二醇的影响 在培养基中添加各种维生素，结果见表3 1 1 。 从表3 一1 1 可知：添加硫胺素、烟酸可稍微的促进2 ，3 丁二醇的生成，原因可能如下： 江南大学硕士学位论文 表3 - 1l 添加各种维生素对菌体产2 ，3 一丁二醇的影响 t a b l e3 1 1e f f e c to fv i t a m i n so i l2 , 3 一b u t a n e d i o lp r o d u c t i o n 硫胺素是丙酮酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的辅因子，影响细胞生长、葡萄糖消耗和 丙酮酸合成的因子，在硫胺素缺乏的条件下，丙酮酸脱氢酶复合物的活性下降导致了丙 酮酸氧化脱羧受限，使得丙酮酸得以积累；然而硫胺素还是转酮酶的辅因子，也影响磷 酸戊糖途径，磷酸戊糖途径受损导致了n a d p h 合成速度降低，于是细胞物质合成速度 降低，细胞增殖速度缓慢，结果导致丙酮酸产率虽然很高，但是葡萄糖消耗速度非常慢， 也就是说酵解速度很慢，导致目标产物2 ，3 丁二醇的量降低。焦磷酸硫胺素还是乙酰乳 酸合成酶的稳定剂【5 9 1 ，所以当培养基中添加一定量的硫胺素时，能增加丙酮酸的量同时 也相应的提高了2 ，3 丁二醇的生成量。 烟酸( v b 5 ) 烟酸是合成烟酰胺嘌呤二核苷酸( n a d + ) 的重要前体，而n a d + 是糖酵解和三羧酸 循环不可缺少的辅助因子，对细胞生长和物质代谢有着极其重要的意义【5 1 1 ，当培养基中 缺少时，细胞生长因缺乏n a d + 受到限制，当培养基中增加n a d + 时葡萄糖的消耗速度 增加。 3 3 6 4 添加各种醇类对菌体产2 ，3 丁二醇的影响 在培养基中添加各种醇类物质，结果见表3 1 2 。 从表3 1 2 可看出：在培养基中添加各种醇类物质对克雷伯氏杆菌产2 ，3 丁二醇的影 响。正丙醇、正丁醇对菌体产2 ，3 丁二醇的影响不大，甲醇、乙醇显著抑制菌体产2 ，3 丁二醇。原因可能是醇类物质对细胞有毒害作用。 第三章2 ，3 丁二醇摇瓶培养基优化 表3 - 1 2 添加醇类物质对茵体产2 ，3 一丁二醇的影响 t a b l e3 - 1 2e f f e c to fa l c o h o l s0 1 12 , 3 - b u t a n e d i o lp r o d u c t i o n 3 4 本章小结 单因子培养基筛选试验结果表明：葡萄糖、酵母粉、磷酸氢二钾和氯化钙四个因 子对2 ，3 丁二醇发酵影响较大，因此以这四个因子作为发酵主要影响因子进行正交试验。 通过四因子三水平的正交试验极差结果表明：各因素对2 ，3 丁二醇影响次序为： 酵母粉 葡萄糖 氯化钙 磷酸氢二钾。 通过培养基优化试验的结果可知：发酵培养基配方为( g l ) ：葡萄糖8 0 ；酵母粉 2 0 ：k h 2 p 0 46 o ；k e h p 0 41 5 ：烈h 4 h s 0 43 ；柠檬酸钠4 0 ：m g s 0 4 7 h 2 00 1 ；c a c l 2 0 0 5 ：f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 5 ：z n s 0 4 7 h 2 00 0 0 5 ：m n s 0 4 7 h 2 00 0 0 5 ： e d t a0 0 5 。 考察了发酵培养基中添加有机酸、氨基酸、维生素和醇类物质对产2 ，3 丁二醇的 影响，结果发现：在培养基中添加乙酸、柠檬酸、丙酮酸作用是比较明显的；氨基酸中 甘氨酸、丙氨酸的效果比较好；维生素中硫胺素和烟酸比较好；醇类添加效果不佳。 江南大学硕士学位论文 第四章克雷伯氏杆菌摇瓶发酵条件的优化 4 1 引言 除了发酵培养基组成外，p h 、温度、接种量、装液量、摇床转速等发酵条件对菌体 生长和产物合成有很大的影响。培养基的p h 对微生物的影响比较大，微生物在不同的 生长阶段有不同的最适p h ，p h 影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响微生物 对营养物质的吸收，影响微生物细胞的结构，影响环境中有害物质对微生物的毒性以及 影响代谢反应中各种酶的活性，进而影响代谢的方向：最终影响细菌发酵产2 ，3 丁二醇 的产量【l3 1 。温度影响反应速率，影响发酵方向还可以影响发酵液的粘度、溶氧和传递速 率，高温会使微生物细胞内的蛋白质发生变性或凝固，同时还破坏了微生物细胞内酶的 活性，从而杀死微生物；而低温抑制微生物的生长，任何微生物的生长都有一个最适生 长温度范围，在此温度范围内，微生物生长繁殖最快，所以温度也是影响微生物生长繁 殖最重要的因素之一。对于溶氧敏感的微生物而言，溶氧浓度的改变可以引起微生物细 胞内代谢流的重新分配，溶氧浓度对菌体生长和产物形成的影响一般是不同的，因此需 要分别考察，搅拌速率和通气量是调节发酵体系溶氧浓度的两个主要手段，增大通气量 可以增加发酵液的溶氧量，增大气液比表面积，利用氧的传递，但是通过增加通气量 以提高氧的传递速率的效果是呈递减性的，即当气流速度较大时，再增加其速度对提高 氧的传质效率的作用变小，发酵体系溶氧对搅拌转速的改变更为敏感，也就是说，搅拌 对溶氧浓度的影响效果远远大于通气量对溶氧浓度的影响，搅拌速度较小时，溶氧量较 小，搅拌速度过快，会产生较大的剪切速度，容易对菌体细胞造成伤害，不仅影响菌体 的正常代谢还严重浪费能源，因此，溶氧作为发酵过程中的一个关键参数。接种量、装 液量等同样影响微生物的生长进而影响发酵生成2 ，3 丁二醇的量f 3 】，因此，要想提高微 生物生成2 ，3 丁二醇的产量，对发酵条件进行优化就显得尤为重要。 本研究在发酵培养基配方确定的情况下，通过对初始p h 、温度、接种量、装液量、 摇床转速等发酵条件的研究，确定生成2 ，3 丁二醇最佳的发酵条件。 4 2 材料和方法 4 2 1 茵种 供试菌种为2 ，3 丁二醇的产生菌k l e b s i e l l as p u n 7 9 。 4 2 2 培养基 斜面培养基、摇瓶种子培养基同2 2 2 。 发酵培养基采用3 2 2 中优化后的培养基。 4 2 3 主要试剂与仪器 同2 2 3 。 3 2 第四章克雷伯氏杆菌摇瓶发酵条件的优化 4 2 4 培养方法 同2 2 4 。 4 2 5 分析方法 同2 2 7 。 4 3 结果与讨论 4 3 1 初始p 对茵体产2 ，3 一丁二醇的影响 p h 在调节细菌的代谢过程中起着重要的作用，尤其是在含有大量复合产物的发酵 过程中，p h 对发酵结果的影响尤为明显。2 ，3 丁二醇发酵过程中含有相当多的副产物， 如3 羟基2 丁酮、乙醇、乙酸、乳酸等。2 ，3 丁二醇生成路线以及这些副产物生成路线 的相关酶最适p h 并不一致，因而发酵过程中p h 不仅会影响细菌的生长，还会影响细 菌的代谢过程【1 3 】，一般碱性条件有利于有机酸的生成，此时2 ，3 丁二醇的产量较低；而 在酸性条件下，有机酸的产量则下降至碱性条件下的1 1 0 ，产物中的主要成分为2 ，3 丁 二醇，2 , 3 丁二醇发酵过程中的最佳p h 与所使用的菌株以及底物相关，p h 值作为2 ，3 - 丁二醇发酵过程中的一个关键因素，因此有必要考虑p h 对菌体以及2 , 3 丁二醇的影响。 本实验将初始p h 值调至不同水平。取5 0m l 发酵培养基于2 5 0m l 三角瓶中，接种 3 的种子培养基，以3 0 的摇床培养温度，1 2 0r m 的摇床转速进行发酵培养4 8 h 后测 定发酵液的2 ，3 丁二醇、菌体量以及副产物乙酸等的量，结果见表4 - 1 。 8 拿 3 链 闷 声i 一 岛 癌 闷 d 、箩 磕 1 1 卜 咆 n 44 555 566 57 。7 5 8 p h 图4 - 1 初始p h 值对2 ，3 一丁二醇、乙醇、乙酸和茵体浓度的影响 f i g 4 - le f f e c to f p hv a l u eo ny i e l do f 2 。3 一b u t a n e d i o l 、e t h a n o l 、a c e t i ca n dc e l lc o n c e n t r a t i o n p h 值是重要的生态因子之一，不但影响发酵的代谢速率和生长速率，而且影响发 酵的类型，在正常的厌氧条件下，p h 值4 0 4 5 时往往发生乙醇型发酵，在p h 值4 5 3 3 鲐 如 笱 加 b m 5 o 5 4 5 3 5 2 5 l 5 o 4 3 2 l o 江南大学硕士学位论文 5 0 时往往发生丁酸型发酵，但也可以发生乙醇型发酵，p h 值在5 0 左右时，乙酸、丙 酸、丁酸和乙醇的量几乎相当，并随着氧化还原电位的高低主要产物的种类有所差异， 此时可成为混合酸发酵，p h 值5 5 时发生丙酸型发酵。 2 3 丁二醇、菌体浓度、乙酸和乙醇的变化如图4 1 所示：菌体的浓度随着p h 的增 加也增加，然而产物2 ，3 丁二醇生成的最佳的p h 范围是( 5 5 - 6 5 ) ，高于6 5 或者是低 于5 5 时，2 ，3 丁二醇产量都比较低，乙酸的浓度在p h 4 0 5 5 之间时比较低，但是当p h 值高于6 0 时，乙酸的量会迅速增加；乙醇的量变化不大，但是在p h 4 0 - 5 0 之间相对 高些。可能的原因是由于2 ，3 丁二醇是混合酸发酵，不同的p h 范围内生成各种产物的 酶的活性不同，生成副产物乙醇的最佳p h 值在4 0 5 0 ；生成副产物乙酸的最佳p h 值 在6 0 以上；生成2 ，3 丁二醇的最佳p h 值范围是5 5 6 5 。 4 3 2 温度对茵体产2 ，3 一丁二醇的影响 微生物对温度很敏感，温度影响到发酵过程中基质的反应速率和氧的溶解度，温度 主要通过改变酶反应速率来影响菌体的生长，温度还与菌体代谢、代谢产物的生产密切 相关。选择合适温度要考虑两个方面，即微生物生长的最适温度和合成产物的最适温度， 不同菌种、菌种不同的生长阶段以及不同的培养条件，最适温度都不同，最适发酵温度 是既适合菌体的生长又适合代谢产物合成的温度，随着菌种、培养基成分、培养条件和 菌体生长阶段不同而改变，本实验考察了不同的温度对菌体和发酵产2 ，3 一丁二醇的影响。 取5 0m l 发酵培养基于2 5 0m l 三角瓶中，调起始p h 值在6 0 ，灭菌。接种3 的种 子培养基，分别在不同的培养温度下，以1 2 0r m 的摇床转速进行发酵培养4 8 h ，测发 酵液的2 3 丁二醇和菌体的量，结果见图4 2 。 2 1 5 o 1 o o 2 5 3 0 3 23 53 74 04 5 温度( ) 图4 - 2 温度对2 ，3 一丁二醇和茵体浓度的影响 f i g 4 - 2e f f e c to f t e m p e r a t u r eo i ly i e l do f 2 ，3 一b u t a n e d i o la n dc e l lc o n c e n t r