（植物学专业论文）nacl处理下红树植物白骨壤和木榄的蛋白质差异表达与质谱鉴定.pdf

摘要 摘要 红树植物是生长在热带、亚热带海岸潮间带的木本挺水植物，长期生长于高 盐生境使红树植物具有一套独特的耐盐机制。应用蛋白组学方法对其耐盐性进行 研究，是研究红树植物耐盐机制的一个新思路，对于我们更好的理解红树植物耐 盐机理具有重要意义。 本研究以泌盐红树植物白骨壤和非泌盐红树植物木榄为研究对象。这两种红 树植物体内含有多种次生代谢物质和大量盐分，这些成分的存在都会影响到蛋白 质的提取以及等电聚焦的进行。因此，在进行蛋白组学研究之前，对蛋白质提取 方法和双向电泳体系的建立进行了摸索。比较了t c a 丙酮干粉法、t c a 丙酮沉 降法、丙酮沉降法、酚抽提法和磷酸缓冲液提取法5 种方法对白骨壤叶片蛋白的 提取效果，酚抽提法得到的蛋白样品纯度较高，再溶性好，除盐效果明显，得到 的2 d e 图谱蛋白点多，背景干净，基本上没有纹理。酚抽提法是非常适合于研 究红树植物蛋白质的提取方法。本实验过程中第一向等电聚焦采用的是载体两性 电解质电泳体系，经过实验条件的摸索得到红树植物蛋白质双向电泳的适宜条 件：单一的两性电解质( p h 5 - p h 8 ) 以及第一向等电聚焦总v h 为1 4 k v h ( 银染) 或1 6k v h ( 考染) ，该电泳条件下的2 一d e 图谱蛋白点丰富、分散、清晰，适用于 蛋白组学研究。 本实验研究了白骨壤和木榄在不同n a c l 浓度处理1d 和6 0d 的叶片全蛋白 2 - d e 图谱的变化，并对差异表达的蛋白质点进行m a l d i t o f 质谱分析。2 - d e 图 谱分析结果表明：n a c l 处理下白骨壤的差异表达蛋白点为3 5 个，木榄为3 3 个。 将差异蛋白点进行m a l d i t o f 质谱分析，分别得至l j 3 1 和2 8 个蛋白的肽质量指纹 图谱。通过m a s c o t 数据库比对，鉴定出白骨壤的差异表达蛋白3 个，木榄的差 异表达蛋白1 个。鉴定出的白骨壤差异表达蛋白主要为叶绿体蛋白：a t p 合成酶p 亚基、磷酸烯醇式丙酮糖羧化酶和成熟酶k 。这些蛋白与白骨壤通过改变光合途 径和加强光合作用来提高耐盐能力密切相关，并对盐处理下维持叶绿体及整个细 胞的功能都起到重要作用。鉴定出的木榄差异表达蛋白为a d p 葡萄糖焦磷酸化 酶小亚基，在盐处理下表达量下调。进一步对木榄叶片a d p 葡萄糖焦磷酸化酶 活性、可溶性糖和淀粉含量研究发现，a d p 葡萄糖焦磷酸化酶活性和淀粉含量 摘要 在盐处理下都表现为下降，而可溶性糖的含量则上升。淀粉合成减少，其合成原 料可溶性糖积累有利于木榄提高盐生环境下的渗透调节能力，是红树植物耐盐的 重要方式。 本研究对红树植物蛋白质的提取方法进行了优化，并用蛋白质组学方法解析 了白骨壤和木榄在n a c l 处理下蛋白质组的变化情况，鉴定了一些有价值的蛋白 质，为更好的理解红树植物耐盐机理提供了新的证据。 关键词：红树植物；n a c i 处理；蛋白质组学；m a l d i t o f m s a b s t r a c t a b s t r a c t m a n g r o v e sa r ea na s s o r t m e n to ft r o p i c a la n ds u b t r o p i c a lt r e e sa n ds h r u b s ，w h i c h h a v ea d a p t e dt ot h ei n h o s p i t a b l ez o n eb e t w e e ns e aa n dl a n d m a n g r o v e sf o r ma n u n i q u em e c h a n i s mo fs a l tt o l e r a n c e 弱t h e yg r o wi nh i g hs a l i n i t y e n v i r o n m e n t p r o t e o m i ca n a l y s i so fi t ss a l tt o l e r a n c ei so fg r e a ts i g n i f i c a n c ea n di san e wm o d ef o r u st ou n d e r s t a n dt h es a l tt o l e r a n c em e c h a n i s mo f m a n g r o v e s a v i c e n n i am a r i n aa n db r u g u i e r ag y m n o r r h i z aw e r eu s e di no r re x p e r i m e n t s t h e s em a n g r o v e sc o n t a i nv a r i o u ss e c o n d a r ym e t a b o l i t e sa n dal a r g ea m o u n to fs a l t ， a n dt h e s es u b s t a n c eh a v eb a de f f e c t so nt h ep r o t e i ne x t r a c t i o na n dt h ei s o e l e c t r i c f o c u c i n g ( i e f ) t h u s ，i ti sn e c e s s a r y t od e v e l o pa ne f f i c i e n tp r o t e i ne x t r a c t i o nm e t h o d a n dt w o d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ( 2 - d e ) c o n d i t i o n b e f o r ep e r f o r m i n gt h e p r o t e o m i ca n a l y s i s i nt h i s s t u d y , w ec o m p a r e df i v e d i f f e r e n tm e t h o d s ，i e t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ( t c a ) a c e t o n ep o w d e r , t c a a c e t o n ep r e c i p i t a t i o n ，a c e t o n e p r e c i p i t a t i o n ，p h e n o l e x t r a c t i o n ( p h e ) ，a n dp h o s p h a t eb u f f e re x t r a c t i o nt o d e t e r m i n et h e i re f f i c i e n c yi n e x t r a c t i n gt o t a lp r o t e i n sf r o ma m a r i n al e a v e sb y2 - d ea n a l y s i s u s i n gp h em e t h o d ， l l i g h q u a l i t ya n dl a r g e - n u m b e ro fp r o t e i n sc o u l db ee x t r a c t e da n ds a t i s f a c t o r y2 - d e m a p sw i t hh i g hr e p r o d u c t i o n ，r e s o l u t i o np o w e r o fp r o t e i na n dm o r ec l e a rb a c k g r o u n d w e r eo b t a i n e d i ts u g g e s t e dp h em e t h o dc o u l dr e m o v es a l tf r o mt h ep r o t e i ne f f e c t i v e l y a n dw a s p r a c t i c a b l ef o rm a n g r o v ep r o t e i ne x t r a c t i o n a m p h o l i n ew a su s e di ni e fi n t h i se x p e r i m e n t ，a n dt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o nf o rm a n g r o v ep r o t e i n s2 - d ew a s ：j u s t u s i n go n ea m p h o l i n e ( p h 5 p h 8 ) a n dt h et o t a lv hw a s14k v h ( f o r s i l v es t a i n i n g ) o r 16k v h ( f o rc o m m a s s i ab r i l l i a n tb l u e ) u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h ep r o t e i np l o t si n2 - d e m a p sw e r ea b u n d a n t ，d i s p e r s e da n dc l e a r , s u g g e s t i n g t h a tt h e2 - d et e c h n i q u e d e v e l o p e di nt h i ss t u d yc o u l da b s o l u t e l ym e e tt h er e q u i r e m e n to ff u r t h e rp r o t e o m i c s s t u d y t o t a lp r o t e i n sw e r ee x t r a c t e df r o ma m a r i n aa n db g y m n o r r h i z al e a v e s1da n d 6 0da f t e rn a c it r e a t m e n t w eh a du s e d2 - d ea n dm a t r i a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o n - t i m eo ff l i g h t m a s ss p e c t r o m e t r y ( m a l d i - t o f m s ) t oi d e n t i f yp r o t e i n s a b s t r a c t t h a ta r ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nr e s p o n s eo fn a c lt r e a t m e n t f r o m2 - d ed a t a , 3 5 r e s o l v e dd if f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n sw e r ed e t e c t e di na m a r i n aa n d3 3w e r e d e t e c t e di nb g y m n o r r h i z a s e l e c t e ds p o t sw e r es u b je c t e dt ot r y p t i cd i g e s t i o n f o l l o w e db yi d e n t i f i c a t i o nu s i n gm a l d i - t o f m s w ed e t e r m i n e d31a n d2 8p e p t i d e m a s sf i n g e r p r i n t i n g ( p m f ) r e s p e c t i v e l yi na m a r i n aa n db g y m n o r r h i z a s e a r c h i n g i nm a s c o td a t a b a s e ，3r e s o l v e dd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e di n a m a r i n aa n d1i nb g y m n o r r h i z a a l lo ft h ei d e n t i f i e dp r o t e i n si na m a r i n aa r e c h l o r o p l a s tp r o t e i n s ：a t ps y n t h a s eb e t as u b u n i t ，p h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y l a s e ( p e p c a s e ) a n dm a t u r a s ek t h e s ep r o t e i n sa r er e l a t e dt oi n c r e a s i n gt h es a l t t o l e r a n c eb yc h a n g i n gp h o t o s y n t h e s i sp a t h w a yo re n h a n c i n gp h o t o s y n t h e s i si na m a r i n aa n dt h e ya r ei m p o r t a n tf o rm a i n t a i n i n gt h ef u n c t i o no fc h l o r o p l a s tu n d e rn a c l t r e a t m e n t t h ei d e n t i f i e d p r o t e i n i n 且 g y m n o r r h i z a w a s a d p - g l u c o s e p y r o p h o s p h o r y l a s e ( a g p p a s e ) s m a l ls u b u n i t i t se x p r e s s i o n l e v e lw a sr e d u c e db y n a c l t h ea c t i v i t yo fa g p p a s ea n dt h ec o n t e n to fs o l u b l es u g a r sa n ds t a r c hw e r e d e t e r m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yo fa g p p a s ea n dt h ec o n t e n to fs t a r c h w e r ed e c r e a s e db yn a c la n dt h ec o n t e n to ft h es o l u b l es u g a r sw a si n c r e a s e db yn a c l t h er e d u c i n go fs t a r c hp r o d u c i n ga n dt h ea c c u m u l a t i n go fs o l u b l es u g a r sa r e p r o p i t i o u st oi n c r e a s eo s m o t i ca d j u s t m e n tu n d e rh i g hs a l i n i t ye n v i r o n m e n t ，t h a t i so n e o ft h ei m p o r t a n tw a yf o rm a n g r o v e st ot o l e r a t eh i 曲s a l i n i t y t h i ss t u d yo p t i m i z e dt h ep r o t e i ne x t r a c t i o nm e t h o do fm a n g r o v e s ，a n da p p l i e d p r o t e o m em e t h o dt os t u d yt h ep r o t e i n se x p r e s s i o np a t t e r no fa m a r i n aa n db g y m n o r r h i z au n d e rn a c lt r e a t m e n t s o m eu s e f u lp r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e d t h i sw o u l d c o n t r i b u t et ot h eb e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h es a l tt o l e r a n c em e c h a n i s m si nm a n g r o v e s k e yw o r d s ：m a n g r o v e s ；n a c lt r e a t m e n t ；p r o t e o m e ；m a l d i - t o f m s 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文 中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和 责任。 声明人：口卜专 2 w 7 年- 7 月2 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学 有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版， 有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书 馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学 位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( 彳 ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名： 导师签名： 日期：3 c 叼7 年1 月芩日 日期：2 卯7 年- 7 月岑日 前言 第一章前言 1 1 植物耐盐机理研究进展 盐分是限制植物生长，降低农作物产量的主要环境因子之一。高盐胁迫使植 物遭受盐离子毒害，以及渗透胁迫、氧化伤害和营养失衡等次生胁迫，干扰细胞 的生理生化功能正常进行，在外观上表现为植物生长受抑制，甚至死亡。长期以 来，关于如何提高植物的耐盐性，增加在盐胁迫下农作物的产量一直是人们十分 关注的问题。植物对盐胁迫的反应机制和耐盐机理的探明，是指导通过生物工程 方法或其它措施改造植物提高其耐盐能力的前提，因此对于植物耐盐生理的研究 成为当前植物生理学中的研究热点之一。大量生物化学和分子生物学研究技术的 发展和应用，使人们对植物耐盐机理的认识逐渐深入到了分子水平，但是由于植 物的抗盐性状涉及生理生化多方面的因素，是一个多基因控制的极为复杂的反应 过程，而且不同植物对盐胁迫的反应及其适应机制也不尽相同，全面深入地探明 植物对盐胁迫的适应机理将是一个长期的过程。 1 1 1 植物对盐胁迫的生理响应 1 1 1 1 渗透调节 由于土壤含盐量增加，土壤溶液水势大大降低，植物根系很难从土壤中吸收 水分，导致植物生理干旱。在这种情况下，植物细胞会主动积累一些渗透调节物 质，以降低水势，维持细胞继续从外界吸水。渗透调节是盐生植物和非盐生植物 适应盐胁迫的主要生理机制之一。渗透调节的方式主要有两种，一是吸收和积累 无机离子，如k + 、n a + 、c 1 、c a 2 + 、m 孑+ 等，二是合成有机相容性物质，如脯氨 酸、甜菜碱、可溶性糖、有机酸、多元醇等。 盐生植物从环境中大量吸收无机盐离子并转移到液泡中，降低液泡的渗透 势，同时避免无机离子对原生质的伤害。因此，这种利用无机盐离子调节渗透的 能力同时也是一种离子区隔化的保护机制。盐生植物如碱蓬和海蓬子等以无机离 子n a + 、c r 和k + 作为主要渗透调节物质进行渗透调节，降低渗透势【l 】。在红树 植物秋茄和白骨壤的总渗透调节中，无机渗透调节分别占8 7 8 和8 7 4 ，最主 要的是n a + 和c 1 4 1 1 。叶勇掣2 】报道在淡水条件下，3 种泌盐红树植物均具有比环境 盐度高得多的叶片组织液盐含量( 约2 ) ，这说明盐生植物有最大限度利用环境 中优势的离子用于渗透调节能力。 前言 但在细胞质中，植物主要合成小分子有机物渗透调节物，降低细胞质的渗透 势，也起到保护酶、蛋白质、生物膜的结构及功能的作用。如小花木榄积累可溶 性糖类、脯氨酸和多酚等渗透保护物质来调节水分 3 1 ，白骨壤在高盐条件下甜菜 碱的含量增加了2 倒4 1 ，而p o p p 等【5 1 对澳大利亚北昆士兰2 3 种红树植物的研究 则发现松醇和甘露醇是最重要的渗调物质。可见不同物种在盐胁迫下合成的小分 子有机渗透调节物质具有多样性。 1 1 1 2 对离子的选择性吸收和运输 在盐胁迫下，高浓度的n a + 、c l 。与各种营养元素相互竞争而造成矿质营养胁 迫，严重影响植物正常生长。植物耐盐性与植株地上部对n a + 和c l 。积累的限制 能力及高k + n a + e i - , 值保持能力有关。y a s u m o t o 6 】用n a c i 处理杯萼海桑( s o n n e r a t i a a l b a ) 后，其细胞内的n a + 和c l 含量显著升高，同时c 的吸收也增加以维持k + n a + 比不变。李银鹏等【7 】的研究也指出，木榄幼苗能够吸收大量的无机离子并保持对 k + n a + 的高选择吸收性是木榄适应海岸高盐生境的原因之一。陈德明等【8 】对盐胁 迫条件下不同小麦品种组织中k + n a + 比、钾一钠吸收和运输的选择性及钠在植 株体内的分布进行了分析，揭示了耐盐性较强的小麦品种的抗盐机制可能与其根 系抑制钠向地上部分的运输并维持茎叶适应的k + n a + 比值有关。对红树植物体 内元素分布特点与抗盐机理的研究表明，根系拒盐是所有红树植物最重要的排盐 机制，在满足细胞渗透调节的前提下，保持地上部分器官较低的盐分浓度是所有 红树植物的共同特点【9 】。 1 1 1 2 对植物光合作用的影响 盐胁迫可使植物的气孔导度下降，蒸腾和光合速率下降，光合酶的活力降低 及p si 和p s 的电子传递速率下降。n a c l 通过三种途径影响植物光合作用：一 是由于n a + 与c 1 的过量和k + 与c e + 的缺乏引起的离子伤害；二是盐胁迫造成的 水势降低引起气孔与非气孔效应从而影响光合作用；三是植物组织中糖分积累造 成的反馈抑制。对于后两种途径现在还存在争谢1 0 l 。 盐胁迫下叶片中的n a + 与c l 。浓度升高，使得类囊体膜糖脂的含量显著下降， 不饱和脂肪酸的含量也下降，从而破坏了膜的光合特性，而且使垛叠状态的类囊 体膜的比例减小，减小了基粒结构的比例，引起光合能力的下降【l l 】。n a c l 提高 叶绿素酶的活性，促进叶绿素降解，其中叶绿素b 降解大于叶绿素a 和类胡萝卜 2 前言 素，捕光色素蛋白复合体的结构与功能受损甚至发生降解，r u b p c a s e 活性和含 量降低。w a l k e r 等【1 2 1 的研究认为，叶肉细胞通过液泡离子区隔化作用而使盐离 子积累在液泡中，而叶绿体中大量积累对光合酶系统无毒害的相容性渗调物质来 维持渗透平衡，从而盐离子对光合系统的伤害。 一些耐盐植物还可以通过改变光合碳同化途径来适应盐渍环境。日中花 ( m e s ei n b r y a n t h e ) 在外界盐浓度增大时，c l 。活化细胞中p e p 羧化酶而抑制r u b p 羧化酶，引起c 3 光合途径向景天酸代谢( c a m ) 光合途径转变。耐盐植物红树 有着类似于c 4 植物的光合代谢途径【1 3 】，林栖凤等【1 4 1 的研究表明，红树中与c 4 光合代谢途径密切相关的活性高于c 3 植物茄子，而且p e p 羧化酶活性随着盐度 的增加逐渐升高，认为盐分有利于红树向c 4 植物的光合代谢转变。通过花粉管 通道途径将红树植物总d n a 导入茄子，获得的后代其耐盐性能明显增加，初步 表明红树d n a 的导入有可能使茄子的光合代谢途径由c 3 向c 4 型转变。 1 1 1 3 激素调节 盐胁迫下，植物体内的脱落酸( a b a ) 、细胞分裂素( c t k ) 、乙烯( e t h ) 、 生长素( i a a ) 和赤霉素( g a ) 等均发生不同程度的变化，以提高植物抗盐性。 目前盐胁迫信号传导研究最多的激素是a b a ，大多数植物在盐胁迫下表现出不 同程度的a b a 积累。m u n n s 1 5 】认为，在盐胁迫下a b a 作为最初调节过程的信 号调节植物对盐胁迫的适应性反应。研究表明，秋茄在初始盐胁迫4 h 时a b a 含量显著增加，并在长时期盐胁迫过程中维持较高水平，对其适应盐渍生境有重 要意义【1 6 1 。许多实验也证实外源a b a 能提高整体植株或离体细胞对盐分的适应 性和促进蛋白质的合成，增强植物抗盐性。赵可夫等【1 7 】发现脱落酸处理玉米幼 苗后可使n a + 大部分积累在幼苗根中，减轻其地上部分盐害。一般认为，盐胁迫 条件下，植物首先诱导合成了a b a ，而a b a 又诱导了许多抗盐基因的表达， a b a 对植物抗盐基因表达的调控主要发生在转录水平上。而且，人们也发现了 a b a 作用的a b a 顺式作用元件和a b a 反式作用元件，它们都含有一定的保守 序列。 1 1 1 5 生物膜系统对盐胁迫的适应 植物细胞的膜系统主要由膜脂和膜蛋白组成，其稳定性是细胞生命活动的基 础。盐胁迫对植物的伤害作用，在很大程度上是通过破坏生物膜的生理功能引起 前言 的。植物受盐胁迫时，体内会产生大量的活性氧( 包括单线态分子氧1 0 2 、过 氧化氢h 2 0 2 、超氧阴离子o 。2 ，和羟自由基o h 与h 0 2 等) ，加强膜脂的过氧化 伤害，造成膜蛋白损伤，从而破坏膜结构。植物体内抗氧化防御系统由一系列能 清除活性氧的酶系( 如s o d 、p o d 、c a t ) 和小分子抗氧化物质( 如a s a 、g s h 和类胡萝卜素等) 组成。当植物受盐胁迫时，抗氧化系统活动加强，以清除过多 的活性氧。在盐胁迫下，与非盐生植物相比，盐生植物s o d 、c a t 、p o d 活性 更高，因而更能有效地防止膜脂过氧化。p a r i d a 等 1 9 】研究发现盐处理使小花木榄 叶片中活性氧含量升高，但a p x 、g p x 、g r 和s o d 等活性氧清除酶的活性也 同时增加，膜脂过氧化产物m d a 的含量在不同盐浓度处理下变化不明显，表明 小花木榄能通过提高抗氧化酶和抗氧化物水平防御在盐胁迫导致的膜脂过氧化 伤害。 另外，植物膜脂组分也会影响植物的抗逆性。王洪亮【2 0 1 对河西走廊不同生 态型芦苇质膜特性进行比较研究，发现质膜膜脂中磷脂酰胆硷和双磷脂酰甘油含 量的增加和脂肪酸不饱和指数加大，与芦苇耐盐性有密切关系。 1 1 2 植物抗盐相关基因 盐胁迫除了引起植物体内一系列生理生化变化外，也使植物中许多基因的表 达状况发生改变，合成或抑制某些蛋白质的合成。植物的抗盐性是由多个基因控 制的数量性状，已发现的植物抗盐相关基因很多，主要分为两类：一类是在植物 的抗性中起作用的蛋白质基因，包括渗透调节因子( 如脯氨酸、甜菜碱) 的合成 酶基因；直接保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白( 如水通道蛋白、离子通道 蛋白等) 基因；以及自由基清除酶基因。另一类是在感应和传导胁迫信的基因( 如 m a p 激酶、核糖体蛋白激酶基因) 与调控基因表达的转录因子( 如b z 口) 的基 因，在基因表达过程中起调控作用。 1 1 2 1 渗透调节因子相关基因 渗透调节物的合成关键酶基因中研究最多的是脯氨酸合成途径中的限速酶 a 一吡咯啉- - 5 - - 羧酸合成酶( p 5 c s ) 基因。p 5 c s 基因由d e l a u n e y 掣2 l 】最早在 大豆中发现，后又从紫花苜蓿、豌豆、拟南芥、水稻等植物中克隆和鉴定，对这 些物种的研究表明，盐处理下p 5 c s 基因转录水平显著提高，并导致脯氨酸含量 上升1 2 2 1 。k i s h o r 等【2 3 1 将p 5 c s 基因导入烟草，发现转基因烟草中脯氨酸的含量比 4 前言 对照明显提高，且耐盐性也比照组相有所提高，表明通过基因工程手段在植物中 提高脯氨酸的含量可以改善植物的耐盐性。 另一个较多研究的渗透调节物质基因是甜菜碱脱氢酶( b a d h ) ，它是从胆 碱合成甜菜碱的最后一个催化酶基因。m c c u e 等2 4 1 从菠菜中克隆了b a d h 的 e d n a 片段，并发现甜菜碱的增加与b a d hm r n a 水平的提高有关，b a d h 基 因可增强植物的耐盐性。菠菜的b a d h 基因被先后转入烟草、草莓和小麦，经 盐胁迫试验表明，转基因植物不同程度积累甜菜碱，耐盐能力优于对照。 除甜菜碱和脯氨酸外，报道的其他渗透调节物的合成关键酶基因还有许多， 如：合成甘露醇相关的甘露醇一l 一磷酸脱氢酶( m t l d ) 基因和n a d p 依赖的甘 露醇脱氢酶( m t d h ) 基因；合成山梨醇的关键酶山梨醇一6 一磷酸脱氢酶( s t p d l ) 基因；果聚糖合成相关基因s a c b 以及从野生水稻品种中分离的肌醇合成相关基 因p i n 0 1 等。 1 1 2 2 离子区域化相关的基因 n “，旷反转运蛋白对植物的拒盐、隔盐和排盐等离子的区域化生理功能具有 重要作用。a t n h x l 是g a x i o l a 等【2 5 】在拟南芥中克隆得到的第一个高等植物的液 泡膜n d a - i + 反向转运蛋白基因。随后，a p s e 等【2 6 】证实了a t n h x l 定位于液泡膜， 过量表达a t n h x l 拟南芥的耐盐性提高。目前，已从盐地碱蓬、小麦、甜菜、 玉米等多种植物中克隆到了a t n h x l 同源基因。不同物种来源的n h x l 基因之 间同源性极高，但和质膜n a + h + 反转运蛋白基因之间的同源性就要低得多，表 明液泡膜n h x l 基因与质膜n a + 矿反转运蛋白基因的亲缘关系相对较远。s h i 等【2 7 1 从拟南芥中克隆了一个质膜n a * h * 反转运蛋白基因s o s l ，过表达s o s l 基 因使拟南芥植株n i 含量降低，耐盐性提高。s o s l 的表达受到s o s 调控途径 ( s a l t o v e r l y - s e n s i t i v ep a t h w a y ) 中的s o s 2 和s o s 3 的调控。 1 1 2 3 水通道蛋白相关基因 水通道蛋白( a q u a p o r i n ，a q p ) ，又称为水孔蛋白，是液泡膜和质膜上选择 性的高效转运水分子通道，可将离子或其它有机物拒之门外。a q p 的表达与逆 境胁迫之间的关系较为复杂，不能简单概括为上升或下降，其调节机制大致分为 两种：通过磷酸化等调节a q p 的活性；通过改变膜上a q p 的含量来调节跨膜水 运输。y a m a d a 掣2 8 1 从冰草中分离到编码水通道蛋白基因m i p a ，m i p b ，m i p c ， 前言 盐胁迫可引起它们m r n a 转录水平变化，且它们的表达具有组织特异性。p m 2 8 a 是菠菜叶细胞质膜上重要的内在蛋白，通过磷酸化和脱磷酸化调节其作为水通道 蛋白的活性，维持细胞的水平衡2 9 1 。h u a n g 等【3 0 境隆了红树植物秋茄的t 口的 全长e d n a ，与冬葡萄、花椰菜、拟南芥的t i p 同源性较高，该基因在盐胁迫下 表达下降，可能有利于降低液泡膜水分渗透保持细胞水分。 1 1 2 4 晚期胚胎发生富集( l e a ) 蛋白相关基因 晚期胚胎发生丰富蛋白( 1 a t ee m b r y o g e n e s i sa b u n d a n t ，l e a 蛋白) ) 分子量 一般约1 0 3 0 k d ，富含亲水氨基酸，具有较高亲水性和热稳定性，在种子发育晚 期胚胎中大量积累，也可在营养生长过程中被干旱、盐渍等非生物胁迫诱导表达。 人们已先后从棉花、大麦、小麦、水稻、油菜、番茄、大豆等多种植物中克隆到 了l e a 基因，并进行了基因转化研究。l e a 基因的表达具有三种途径：a b a 依 赖型、a b a 诱导型和非a b a 应答型。在大麦糊粉层中，a b a 诱导基因h v a l 和h v a 2 可以被干旱、盐和温度胁迫诱导表达。x u 等【3 l 】将大麦的h v a l 基因转 入水稻，获得了抗盐性明显提高的转基因水稻，而且耐盐性与h v a l 蛋白的积累 呈正相关，可见h v a l 蛋白可能对逆境中的植物起保护作用。 1 1 2 5 活性氧清除酶类基因 盐胁迫下植物体内产生活性氧大增，造成氧化伤害，但植物的抗氧化防御系 统能起到清除体内活性氧，使细胞免受毒害的作用。在各种抗氧化酶类中，研究 最深入的是s o d ，s o d 基因既有单拷贝系列，也有多基因家族，己从多种植物 中得到s o de d n a 克隆，并进行了转化植物研究。酵母线粒体m n s o d 在水稻 叶绿体中过量表达，转基因植株中s o d 和a p x 的活性都较对照提高了1 5 - - 2 倍，从而提高了转基因水稻对盐的耐受性【3 2 】。然而转f e s o d 基因的烟草，虽然 过量表达f e s o d ，但并未提高其对低温和盐胁迫的耐受性【3 3 1 。另一保护酶基因 n t g s t g p x 编码具有谷光苷肽s 转移酶与谷光苷肽过氧化物酶双重活性的酶， 在烟草中的过表达该基因提高了其耐盐性和耐寒性【3 4 】。 1 2 蛋白质组学主要研究技术 1 2 1 蛋白质组学的概念 随着多种生物全基因组测序的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因 组转向功能基因组，1 9 9 4 年w i l k i n s 和w i l l i a m s 首先提出蛋白质组( p r o t e o m e ) 6 前言 一词，意为p r o t e i n se x p r e s s e db y ag e n o m e ，即基因组表达的蛋白质，是指由一种 细胞、器官组织或一个基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质组学则是应用高通量、 高自动化程度的大规模蛋白质分离和鉴定技术研究蛋白质组的- f l 学科，内容包 括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用等。蛋白质组 研究的重要优势在于能够从整体水平上分析不同条件下机体或其细胞的蛋白质 活动的变化，揭示和阐明生命活动的基本规律。 在从基因到蛋白质的过程中，存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控。 研究发现m r n a 丰度与蛋白质丰度相关性并不好【3 5 】，而蛋白质的翻译后修饰、 蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质一蛋白质相互作用等也无法从d n a m r n a 水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，两者相互补充， 才能进一步阐明生命的生理活动的机理。 当前蛋白质组学的研究中，双向电泳、生物质谱和生物信息学被称为蛋白质 组研究的三大基本支撑技术，基于这三项技术的蛋白质组研究路线是目前应用最 多的研究策略。除上述基本技术外，新的蛋白质组研究技术也不断出现，各类高 通量，高灵敏度，高分辨率的色谱技术、质谱技术、蛋白质芯片技术的不断发展 并运用到蛋白质的组成、结构分析，蛋白质组学研究的技术手段还在不断完善。 1 2 2 蛋白质样品制备 。 蛋白质样品制备是蛋白质组学最基础也最为关键的步骤之一，制备样品的质 量会直接影响双向电泳结果【3 6 1 。由于蛋白质在电荷、疏水性、翻译后修饰和胞 内分布等方面的复杂性，目前还没有一个通用的可以提取整个蛋白质组的制备方 法。尽管制备方法是多种多样的，但都遵循这样的基本的原则，即能重复地提取 和溶解给定样品中的所有蛋白质成分，并最大程度避免杂质和造成人为假象。由 于抽提步骤的增多会导致蛋白质损失增加，重复性下降，所以对于比较蛋白质组 学，在尽可能少的步骤内提取尽可能多的蛋白质是最为常见的样品制备策略 【3 7 】 o 与原核生物和动物相比，植物材料的蛋白样品制备比较困难。植物细胞具有 坚硬的细胞壁、丰富的质体和酸性的液泡，植物材料中还富含多糖、脂类、色素、 多酚以及各种次生代谢物质，这些物质严重影响蛋白质的稳定性，并干扰蛋白质 的分离和分析。更为复杂的是，随植物的物种不同、组织部位不同、发育阶段不 7 前言 同，所含干扰物质的种类和浓度差异极大【3 8 1 。植物蛋白样品制备中一般用沉淀 法来去除这些干扰物质，常用的方法有三种：三氯乙酸( t c a ) 一丙酮直接沉淀 法、提取一沉淀法( 包括丙酮沉淀法和t c a 沉淀法) 和酚抽提法，裂解液直接 提取法很少被使用。t c a 一丙酮直接沉淀法【3 9 1 操作简单，能有效抑制蛋白酶和 去除色素、多酚等杂质，缺点是沉淀后的蛋白质再溶解性差，且去除多糖效果不 佳，因此对成熟植物组织的提取不是很有效，多用于提取植物幼苗蛋白质。提取 一沉淀法是先以缓冲液从植物样品中提取可溶性蛋白再进行沉淀，能较好的去除 多糖和多酚，但同样存在蛋白再溶解性差的缺点。酚抽提法【删是专用于从富含 次生代谢物的复杂样品中提取蛋白质的方法，它步骤较繁琐，但对成熟的植物组 织有很好的提取效果。p a r i d a 4 1 】使用酚抽提法从小花木榄叶片中成功地获得了高 质量的蛋白质样品。 人们在不同的植物中对以上提取方法的效果进行了比较研究。s a r a v a n a n 等【4 2 】 以番茄的叶和红色果实为材料的研究表明，酚抽提法的蛋白产率高，凝胶背景干 净，且对糖蛋白的提取效果较好；t c a 一丙酮直接沉淀法和提取一沉淀法( t c a 沉淀法) 效果较差。但在柑橘叶中的研究结果则与此不同，提取一沉淀法效果好 于酚抽提法【4 3 1 。 1 2 3 双向电泳技术 双向电泳方法( t w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) 是由o f a r r e l l 于1 9 7 5 年首先提出的。第一向等电聚焦( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，i e f ) 根据蛋白质 等电点进行分离；第二向s d s p a g e 根据蛋白的分子量进行分离。2 - d e 是目前 唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。较早出现的i e f 用载体两性 电解质( c a r t i e ra m p h o l i t e s ) 在电场中通过两性缓冲离子建立p h 梯度，重复性 很差，难以得到大量重复性好的2 - d e 胶。2 0 世纪8 0 年代初发展出来的固相p h 梯度( i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t s ，i p g ) 等电聚焦电泳技术，能获得固定的、不 随环境电场条件变化的p h 梯度，大大提高了2 - d e 的重复性和分辨率。在蛋白 质组学研究技术中，双向电泳因其无可比拟的高分辨率而成为首选的分离技术。 虽然2 - d e 技术不断的发展，依然存在一些不足，如分子量极大或极小的蛋白质、 疏水蛋白质、强酸性强碱性蛋白质以及低丰度蛋白质难以用2 - d e 进行分离检测， 操作耗时长，不易自动化，难以实现和质谱的直接联用等等。 前言 1 2 4 蛋白质的检测 蛋白质样品经双向电泳分离后，需要对胶上的蛋白质进行染色显示和图像 分析。胶上蛋白点的显示方法有多种，如考马斯亮蓝染色、银染、丽春红s 、氨 基黑、荧光染色法以及同位素标记等方法，其中最常用的是考马斯亮蓝染色和银 染法。 考马斯亮蓝( c b br - 2 5 0 和g 2 5 0 ) 染色操作简单易行，重复性好，不影响 后续的质谱分析，因而最为广泛应用，但其灵敏度较低( 4 0n g ) 。c a n d i a n o 等【删 改进了c b bg 2 5 0 染色法，使考染的灵敏度达到纳克级，接近一般银染的水平。 银染的原理是将附在蛋白点上的银离子还原成金属银，银颗粒沉积在蛋白点 上从而显示其位置。其灵敏度比考马斯亮蓝染色高1 0 0 倍( 9 9 ) 、琼脂糖( b b i ， c a n a d a ) ， 尿素u r e a ( 超纯级) 、碘乙酰胺、口巯基乙醇、d t t 、s d s 、t r i c i n e 、h e p e s ( a m e r e s c o ，u s a ) ， a m p h o l i n ep h 3 5 - 1 0 ，p h 5 8 ( a m e r s h a mb i o s c i e n c e ) ， 1 2 材料与方法 s e q u