（微生物学专业论文）瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ及其cbd的噬菌体表面展示.pdf

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l i n k e di m m t m o s o r b e n ta s s a y ，简称e l i s a ) 和s o m o g y i 方法对其活性进行验证。 被展示在噬菌体表面的e g i 依然具有纤维素的吸附能力和内切酶活力，其c m c ( c a r b o x y m e t h y ! c e l l u l o s e ) 酶活为7 , 0 x1 0 皤i u p i l l ，说明e g i 被成功展示在丝 状噬菌体表面。 然后再将e g i 的c b d 展示在噬菌体表面，通过e l i s a 方法验证被展示的 c b d 依然具有对纤维素的吸附特性利用易错p c r 的方法对c b d 基因进行随 机突变，建立了一个5 x 1 0 5 大小的、可用来进行噬菌体表面筛选的c b d 基因突 变菌种库。为进一步合理解释吸附后c b d 是如何与c d 和l i n k e r 相互作用降解 山东大学硕士学位论文 纤维素的问题提供了实验基础。 此外，利用含e g i 和c b d 基因的两种重组噬菌体感染大肠杆菌宿主 h b 2 1 5 1 ，在i p t g 诱导下表达游离型e g i 和c b d 。经过胞内、胞外、胞周质各 组分蛋白s d s - p a g e 电泳分析，发现游离型e g i 和c b d 主要分泌在大肠杆菌 h b 2 1 5 1 的胞外。进一步对c b d 进行了初步纯化。纯化后的c b d 将可以用来测 定吸附动力学参数，为探讨研究c b d 功能提供有力的实验数据。 关键词：瑞氏木霉内切葡聚糖酶i ，噬菌体表面展示，纤维素吸附结构域。 易错p c r 2 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t e n d o g l u c a n a s ei ( e g di sa l li m p o r t a n te r l z y l n eo ft r i c h o d e r m ar e e s e i ，i tc l e a v e s i n t e r n a lg l y c o s i d i cb o n d si nc e l l u l o s ec h a i n s e g ic o n s i s t so ft w od o m a i n sj o i n e d t o g e t h e rb yag l y c o s y l a t e di n t e r d o m a i nl i n k e rp e p t i d e t h el a r g e rc a t a l y t i cd o m a i n c o n t a i n st h ea c t i v es i t e ，w h i c hc a r r i e so u tg e n e r a la c i dc a t a l y z e dh y d r o l y s i so ft h e 肛l ，4 一g l y c o s i d i cb o n d si nc e l l u l o s e t h es m a l l e rc o l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i n ( c b d ) i m p r o v e sb i n d i n go f e n z y m e so n t oc e l l u l o s ea n de i l h a n c 圮si t se n z y m a t i cd e g r a d a t i o n a l t h o u g ht h eh y d r o l y s i sm e c h a n i s ma n dt h es u b s t r a t es p e c i f i c i t yo fe g i ，w h i l ei t i sc l e a v i n gt h ep l ，4 - g l y c o s i d i cb o n d si nc e l l u l o s e , h a v eb e e nb a s i c a l l yc l a r i f i e d , h o w c b dm o d u l ec o o p e r a t e sw i t hc da n dl i n k e rm o d u l e si nt h ep r o c e s so fc e l l u l o s e h y d r o l y s i sh a sn o tb e e nr e a s o n a b l ye x p l a i n e dy e t i nt h i st h e s i s , w eh o p eg e n e r a t eas e r i e so fh y b r i de n d o g l u c a n a s e s ，w h i c hh a v e t h es a m ec dm o d u l ea n dl i n k e rm o d u l ew i t he g ie x c e p tc b dm o d u l e a n e r r o r - p c rl i b r a r yo ft h eg e n eo fc b df r o me g ih a sb e e nc o n s t r u c t e d i tw o u l db e v e r yh a r dt ou s et h et r a d i t i o n a ls c r e e n i n gm e t h o dt oo b t a i nt h eg e n e so fc b do f d i f f e r e n tc e l l u l o s e - b i n d i n ga b i l i t y c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a ls c r e e n i n gm e t h o d ， p h a g ed i s p l a yh a sm o r ea d v a n t a g e s p h a g ed i s p l a yi sap o w e r f u lm e t h o df o rs e l e c t i n ga n de n g i n e e r i n gp o l y p e p t i d e s w i t hd e s i r e db i n d i n gs p e c i f i c i f i e s t h em e t h o dr e l i e s0 1 1t h ef a c tt h a ti fg e n ef r a g m e n t s e n c o d i n gp o l y l x p t i d e sa r ef u s e dt om 1 3 c o a tp r o t e i ng e n e s ，t h e s e f u s i o ng e n e s c a l l b ei n c o r p o r a t e di nb a c t e r i o p h a g ep a r t i c l e st h a ta l s od i s p l a yt h eh e t e r o l o g o u sp r o t e i n s o nt h e i rb n 1 r f a c o $ i nt h i sw a y , ap h y s i c a ll i n k a g ei se s t a b l i s h e db c “v c c np h e n o t y p ea n d g e n o t y p e u s i n gs i m p l e m o l e c u l a r b i o l o g yt e c h n i q u e s ，l a r g e a n dd i v e r s e p h a g e - d i s p l a y e dp o l y l m p t i d e l i b r a r i e sc a r lb e g e n e r a t e d p h a g ed i s p l a y i n g p o l y p e p t i d e sw i t had e s i r e db i n d i n gs p e c i f i c i t yc a nb es e l e c t e df r o ml i b r a r yp o o l sb y b i n d i n gt oa l li m m o b i l i z e dl i g a n d ，a n dt h es e q u e n c e so fs e l e c t e dp o l y p e p t i d e sc a nb e d e d u c e df r o mt h es e q u e n c eo f t h ee n e a p s u l a t e dd n a i na d d i t i o n , p h a g ed i s p l a ya p p l i c a t i o nt ot h ed i r e c t e de v o l u t i o no fe n z y m e si s b e g i n n i n gt oe m e r g e u n t i ln o w , t h er e s e a r c ho f p h a g e - d i s p l a yc e l l u l a s eh a sn o tb e e n 山东大学硕士学位论文 p u b l i s h e dy e t i fac e l l n l a s ei ss u c c e s s f u l l yd i s p l a y e do nt h es u r f a c eo fp h a g e , t h e r e 刚tw i l lb ec l e a r l yh e l p f u lt ot h er e s e a r c ho f p h a g ed i s p l a ya sat o o lf o rt h ed i r e c t e d e v o l u t i o no f c e i l u l a s e t h i si sa n o t h e re m p h a s i si nt h i sp a p e r a p h a g ee n z y m eo fe g i h a sb e e nc o n s t r u c t e df o rp r o v i n gt h ef e a s i b i l i t yo f p h a g e d i s p l a yi nc e l l u l l o l y t i ce n z y m e s t h ep h a g eg l l z y m ee g ih a sp r o v e dt ob ea c t i v e w h i c hn o to n l yh a st h ea b i l i t yo fb i n d i n gc e l l u l o s eb ye n z y m e - l i n k e di r n m u n o s u r b e n t a s s a y ( e l i s a ) b u ta l s oh a sc a t a l y t i ce f f i c i e n c yo ni n s o l u b l es u b s t r a t e 1 1 1 ev a l u eo f c m c a a c t i v i t yi s7 0 x1 0 。6 i u ，p f l l 1 kr e s u l t ss h o w e dt h ep h a g ed i s p l a yu s e di n c c l l u l l o l y t i c z y m e sw a sf e a s i b i l e d e s p i t ec o n s i d e r a b l ee f f o r t s ，t h ee x a c tr o l ea n df u n c d o no ft h ec b d si nt h e e n z y m a t i ca c t i o no fc o l l u l a s e sa r en o tw e l lu n d e r s t o o d i nt h i ss t u d y , c b dh a sb e e n d i s p l a y e do np h a g es u l f a e e ，w h i c hp r o v e dt oh a v et h ea b i l i t yo fb i n d i n gc e l l u l o s eb y e l i s a t h e na5 x 1 0 ss i z ep h a g el i b r a r yd i s p l a y i n gt h ec b d sd e r i v e df r o mt h eg e n e o f c b d e g ib ye r r o r - p r o n ep c rh a sb e e nc o n s t r u c t e d t h i sl i b r a r yw i l lb es c r e e n e df o r o b t a i n i n gd i f f e r e n tc b d so f b i n d i n ga b i l i t yt oc e l l u l o s eb yp h a g ed i s p l a y , t h e na s e r i e s o fr e c o m b i n a n te n z y m e sw i l lb ec o n s t r u c t e d c o m p a r et h e i rp e r f o m m c * sw i t ht h e c o r r e s p o n d i n gw i l d - t y p ee n z y m eo ns o l u b l ea n dc y s t a l l i n es u b s t r a t e s , a n dt h e nd i s c u s s t h er o l eo f c b di nc e l l u l o s ed e g r a d a t i o n f u r t h e r m o r e ，t h ee g ia n dc b dr e c o m b i n a n tp h a g e si n f e c t e de c o i h b 2 1 5 1 c e l l s i p t gi n d u c e de x p r e s s i o no fe g ia n dc b di ne c o l lh b 2 1 5 1c e l l s a f t e r a s s a y i l l gt h es u p e m a n t a n t , p e r i p l a s m i ce x t r a c t ，a n dw h o l ec e l le x t r a c t ，t h a ts o l u b l e e g ia n dc b dw e r ef o u n dt ob ep r o d u c e da n dc o n c e n t r a t e di nt h es u p e r i m n t a n ta n d c o n f i n e db ys d s p a g e s o m ee f f o r t so fp u r i 母i n gc b dp r o t e i nh a v ea l s ob e e n d o n e t h ep u r i f i e dc b dw i l lb eu s e dt om e a s u r et h ek i n e t i cp a r a m e t e r sf o rg e r i n g m o r eu s e f u li n f o r m a t i o n k e yw o r d s ：t r i c h o d e r m ar e e s e e n d o g l u c a n a s ei ，e r r o r - p r o n ep c r , p h a g ed i s p l a y , c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i n ( c b d ) 4 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 纤维素这一巨大再生资源的有效利用对解决环境污染、食品短缺、能源危机 具有重大的现实意义，利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素则是纤维 素利用的有效途径，故对纤维素酶的研究越来越引起人们的重视【。目前，纤维 素酶研究主要的工作是利用结构生物学及蛋白质工程的方法对纤维素酶分子的 结构和功能进行研究，包括纤维素酶结构域的拆分、解析、功能性氨基酸的确定、 水解的双交换机制的确立，分子折叠和催化机制关系的探讨。 噬菌体表面展示技术是近年来建立和发展的利用噬菌体表达外源基因的一 项新技术。从已知的报道来看，目前国内外还未有应用该技术对纤维素酶进行研 究的报道。本实验是将噬菌体表面展示技术应用于纤维素酶学研究的一次尝试。 本章将从以下几个方面介绍相关的研究背景。 1 1 纤维素结构 纤维素象淀粉一样是葡萄糖的多聚体，是通过b 1 , 4 葡萄糖苷键连接而成的 直链聚合体，链的一端是还原端，另一端是非还原端纤维素分子式可表示为 ( c 6 h l 0 0 5 ) l l ，n 为聚合度，表示纤维素中葡萄糖单元的数目。从化学反应来看纤 维素的降解只涉及水解作用及氢键的断裂，是一个简单的反应过程。但是作为植 物细胞结构材料的纤维素是由纤维二糖单元组成的螺条形的糖链，借氢键( 或其 它共价键) 相互作用定向平行排列和堆砌而形成结晶性的微原纤维，需在纤维素 酶系的协同作用下才能完全降解为葡萄糖。 图! - 1 纤维素的结构 山东大学硬士学位论文 1 2 纤维素酶分类 纤维素酶是作用在纤维素b 1 , 4 糖苷键上的水解酶，在许多糖苷水解酶家族 中都发现了纤维素酶 2 1 现今通过蛋白质氨基酸测序分析手段，将纤维素酶分属 到8 2 个糖苷水解酶家族中的1 3 个家族以序列起源为基础追溯到十个家族( 5 ，6 ， 7 ，8 ，9 ，1 2 ，2 6 ，4 4 ，4 5 ，4 8 ) ，以纤维素酶活力相似性为基础归入6 l 和7 4 家族。 表1 - 1 已公布的纤维索酶基因在糖苷水解酶家族中的分类 降解纤维素的微生物广泛存在于自然界中，细菌、放线菌和真菌都有产纤 维素酶的菌株。细菌产生的纤维素酶的量很低，主要是内切葡聚糖酶，大多数 对结晶纤维素没有作用，而且产生的酶主要是吸附在细胞表面，很少分泌到胞 外放线菌的纤维素酶研究很少真菌中的木霉属、曲霉属、青霉属是生产纤 维素酶的主要菌属其中瑞氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ，zr e e s e i ) 是一种研究 的很清楚而且非常有效的纤维素分解菌，最好的菌株可产生胞外纤维素酶蛋白 的量比一般细菌高几百倍刚它能产生多种纤维素酶组分，过去常根据这些酶 组分在纤维素降解过程中的作用，将其酶组分分为三类：1 内切b 1 , 4 葡聚糖 酶( e n d o 一1 , 4 - b - d - g l u c a n a s e ，e g ) ：作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解b 1 ， 4 糖苷键，将长链纤维分子截断为小分子纤维素；2 外切1 3 1 , 4 葡聚糖酶又称 纤维二糖水解酶( e x o - l , 4 - 肛d - g l u c a n a s e 或c e l l o b i o h y d r o l a s e s ，c b h ) ：作用于纤 维素线状分子，水解争l ，4 一糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子；3 b 1 , 4 葡 萄糖苷酶( 1 3 - g l u c o s i d a s e ，b g ) ：将纤维二糖和短链的纤维寡糖降解为葡萄糖。这 6 山东大学硕士学位论文 三类酶彼此相互协调，协同作用，共同完成纤维素的降解。 1 3 纤维素酶分子的结构与空间构象 通过三维结构分析，到目前为止，5 - 9 、1 2 、4 5 和4 8 家族的纤维素酶已经得 到了三维结构图f 4 珂。从1 9 9 0 年测定了第一个纤维素酶瑞氏木霉纤维素外切酶i i ( c e l 6 a ) 催化核心的三维结构1 6 1 开始，至今已经有2 0 多种不同的纤维素酶的三 维结构被测定发表。从三维结构上分析，尽管这些纤维素酶都是作用在纤维素p 1 , 4 葡萄糖苷键上，但是它们却拥有着不同的拓扑结构，如b 折叠，螺旋和a 邝管状结构。纤维素酶的一个明显特征是绝大多数纤维素酶分子都是由球状的 催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n s ，c d ) ，一个富含p r o 和或羟基氨基酸( s e r , t h r ) 的连接桥( l i n k e r ) 和纤维素结合结构域( c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i n s ，c b d ) 这三 部分组成。如图l - 2 所示，整个酶分子呈楔形，球状核区表示包含催化位点和底 物结合位点的c d 区，b 区代表了高度糖基化的连接桥( l i n k e r ) ，a 代表纤维素 结合结构域。 b 图1 2 纤维素酶分子结构模型 1 3 1 连接桥( l i n k e r ) 细菌纤维素酶的l i n k e r 富含p r o 、t h r ，而真菌纤维素酶的l i n k e r 富含g l y 、 s e r 、t h r ：细菌纤维素酶的c b d 与c d 夹角为1 3 5 。，而真菌为1 8 0 。；细菌纤 维素酶有两个酶切位点可将c b d 与l i n k e r 分别切去，而真菌纤维素酶一般只有一 个酶切位点可将c b d 与l i n k e r 一同切去由于纤维素全酶分子呈蝌蚪状，其 l i n k e r 高度糖基化且具有较强柔韧性，故很难得到结晶。而结构域的拆分使呈球 7 山东大学硕士学位论文 形催化域的结晶成为可能，为纤维素酶的结构和功能研究开辟了道路。 1 3 2 催化结构域( c d ) 用x 光衍射的方法，1 9 9 0 年r o u v i n e n f f l 对zr e e s e i 的c b h i i 的催化域、1 9 9 2 年j u y 对c t h e r m o c e l l u m l s l i c jc e l d 的催化域、1 9 9 3 年s p e z i o l q 对t f u s c a 的e 2 的催化域、1 9 9 4 年d i v n e 对zr e e s e i 的c b h i 的催化域进行了结晶和解析。三维 结构的研究为内切酶和外切酶底物的特异性作出了合理的解释：内切酶的活性位 点位于一个开放的c l e f t 中，它可结合于纤维素链的任何部位，并切断纤维素链： 外切酶的活性位点位于一个长l o o p 所形成的t u n n e l 里面，它只能从纤维素链的 非还原性末端切下纤维二糖。1 9 9 5 年m e i n k e l m 荆用蛋白质工程的方法将c f i m i 的外切酶c b h a 分子的l o o p 删除后，发现该酶的内切酶活性果然提高，这进一 步证实了上述有关催化域功能的研究。1 9 9 0 年s i n n o t t v l l 从化学机制的角度出发 论述了酶催化糖基转移的机制，他认为糖苷配基的离去是涉及到两个氨基酸残基 的酸碱催化的双置换反应，这实际与溶菌酶的作用机制是相似的。1 9 8 8 年至1 9 9 4 年采用定点突变技术和酶专一性抑制剂做了大量研究 1 2 d 6 】，终于证明g l u 位于细 菌、真菌的内切酶、外切酶、葡萄糖苷酶的活性位点；在异头碳原子位通过构型 的保留或构型的转化完成催化反应，其中两个保守的羧基氨基酸分别作为质子供 体和亲核试剂1 1 ”引，水解双置换机制得以证明 1 3 3 纤维素结合结构域( c b d ) c b d 是结构和功能都独立的非催化结构域，能特异结合纤维素链，可位于 肽链的n 端或c 端来自真菌t r e e s e i 的两个c b h 和e g i 、i v 的c b d 包含了 3 3 个氨基酸，这些残基中含有4 个c y s 形成的两个二硫键，而来自细菌的c f i m i 的c e x 、c e n a 的c b d 则含有1 0 8 和4 l 氨基酸，并且c e n a 中的c b d 的s - s - 非吸附所必需。但热纤梭菌( c t h e r m o c e l l u m ) 无c b d ，它依靠纤酶小体吸附纤维 素。一些细菌的c b d 顺序有一定的共同特点：a 带电氨基酸含量很低；b 。羟基氨 基酸含量很高；c 都含有t q , 、a s n 和g l y ，而且两个c y s 在n 、c 末端的位置 完全相同。 c b d 的分类：g i l k e s 和c o u t i n h o 等均曾根据氨基酸序列的同源性进行过c b d 山东大学硕士学位论文 的分类。r e i n i k a i n e n 等将c b d 分为5 类1 1 9 1 。来源自几种真菌如t r i c h o d e r m a r e e s e i ， h u m i c a l ai n s u o l w n s 等纤维素酶的小c b d ，被归为家族i ，其c b d 氨基酸长度为 3 0 3 6 个比较同一种微生物不同纤维素酶c b d 的氨基酸序列，可发现它们往 往具有序列同源性真菌c b d 的序列之间有更多的相似性。真菌c b d 的长度大 约是细菌c b d 的三分之一，两者之间还没有发现明显的序列同源性。 c b d 作为绝大多数纤维素酶都具有的结构，对其功能的研究一直是人们关 注的热点。从现有的研究情况来看，c b d 作用的多数信息是通过去除该结构域、 改变结构域或者进行定点诱变研究而得到的。c b d 的去除，对作用于可溶性底 物的纤维素酶只有很小的影响，但对结合和作用于不溶性底物的纤维素酶，则使 其活力大大降低。认为c b d 提高酶的活力是因其提高了底物表面有效酶的浓度 【2 0 】，或者可能是促进了纤维素表面单个葡聚糖链的增溶溶解 对瑞氏木霉外切葡聚糖酶c b h ic b d 引入单点突变，产生亲和力逐渐降低 的突变体，最终降低了对结晶纤维素的活力【2 ”有趣的是，加入高浓度的盐，在 短酶解时间内，部分突变酶的亲和力和活力可以恢复；但在长时间内无此作用。 认为高浓度的盐可能促进酶催化区与其最适宜位点起的起始结合，从而促进底物 最易接近的部位水解 2 2 1 。、 c b d 的主要功能是将酶分子连接到纤维素上c f i m ic e n a 和c e x 单独的 c b d 不具备对纤维素的水解能力，但能破坏棉纤维使成为短纤维，具有疏解结 晶纤维素的能力 2 3 1 定点诱变研究表明，瑞氏木霉c b h i 的两个酪氨酸残基( y 4 9 2 和y 4 7 7 ) 对c b d 的吸附功能有较大的影响当位于楔形c b d ( y 4 9 2 ) 顶端的 酪氨酸残基突变为丙氨酸或天冬氨酸时，c b d 对结晶纤维素的吸附能力完全消 失，催化能力也大大降低当y 4 9 2 突变为组氨酸时，酶对结晶纤维素的吸附催 化能力降低，但并未完全破坏。这表明芳香族氨基酸对c b d 的吸附作用具有重 要的意义。当4 7 7 位脯氨酸突变为半胱氨酸时，c b h i 对底物的结合和催化活性 都降低，表明c b h i 酶c b d 的两面都参与了纤维素的吸附作用。 在粪碱纤维单胞菌( c f i m i ) 的c e n a 的c b d 中，有四个高度保守的色氨酸 残基。至少在1 6 种细胞葡聚糖酶中存在这种保守性突变研究以及荧光资料表 明，其中w 1 4 和w 6 8 暴露在c b d 的外部，它们很可能在与纤维素表面的纤维 二糖残基的连接中起了特殊的作用 9 山东大学硕士学位论文 除去荧光假单胞菌x y i 认的c b d 并不改变该酶的催化性质1 2 4 】但当 c e l l “l o m o n a x 和c e n a 的c b d 区缺失时，酶水解纤维素的能力下降。另外， c e l l u l o m o n a s 的c b d 可以用蒸馏水从纤维素上大量洗脱，而p s e u d o m o n o a 的c b d 只有1 0 的s d s 煮沸才能从多糖上完全回收，只用蒸馏水不能洗脱。这两种酶 的c b d 虽然在序列上同源程度较高，但在结构与作用机制上都有较大的差别。 根据吸附动力学研究，c 伽f 的c e n a 的c b d 在纤维素表面上约占3 9 个纤 维二糖残基。其它族的c b d ，如热纤梭菌的结合蛋白a ( c b p a ) 的c b d 区， 可结合结晶纤维素与几丁质f 掬，同浓度的纤维二糖和羧甲基纤维素对c b d 蛋白 与结晶纤维素的结合无影响。 l i n d e r 等人的实验证实c b d 与结晶纤维素特异结合，而且两个c b d 相连后 对纤维素的亲和力比其任意一个单一亲本c b d 都高1 2 6 1 。c b d 中关键氨基酸t y r 突变后，酶对结晶纤维素的亲和力及活力会降低到不含c b d 的水平1 2 7 】然而， c b hi 和e gi i i 的c b d 被删除后，对滤纸的催化效率会显著降低【嚣l 。这说明c b d 可以提高纤维素酶对不溶性底物的亲和力和活力，但并不影响酶对可溶性底物的 活力。但是这些结果都是建立在对于单独或两个功能域混合物的研究的基础上 的，并不能反映这些结构域在原始酶中的真正作用另外，这两个结构域的连接 和相互作用也是理解纤维素酶功能的关键f 捌。s h e n 等删除c e n a 的链接区，降 低了酶对可溶性和不可溶性底物的活力，暗示着链接区在纤维素降解中起着一定 的作用 2 9 1 。瑞氏木霉c b h i 的链接区不同程度的缩短对酶性质的影响揭示：两结 构域之间足够的空间分布对c b h i 功能具有重要影响。 纤维素酶分子的结构与功能的研究，对纤维素分子肛l ，4 糖苷键作用的底 物的特异性、水解机制做出基本阐明，但关于c b d 是如何吸附到纤维素表面， 吸附后c b d 是如何与催化区相互作用降解纤维素的问题目前还未得到合理的解 释，因为这涉及到纤维素聚合物的解链、解聚等超分子结构的变化。这一问题的 解决将会为有效工程菌的构建、经济利用纤维素打下基础 3 0 1 。 1 4 瑞氏木霉内切葡聚糖酶i 的分子结构与性质 瑞氏木霉产生的内切葡聚糖酶组分至少有5 种( e g i 5 ) ，主要的有e g i i o 山东大学硕士学位论文 ( c e l 7 b ) 和e g i i ( c e l 5 a ) ，它们的基因序列和蛋白质一级结构已经清列3 。翊。根 据蛋白质氨基酸序列相似性分析瑞氏木霉e g i i 属于第5 家族，e gi 属于第7 家族f 3 3 1 e g h 由3 9 7 个氨基酸组成，其分子量是4 8 k d ，p i 值为5 i 。第3 2 9 位 谷氨酸残基是话性位点中的必需氨基耐蚓。在p h4 - 5 之间表现较高的活性。在 p h 4 8 时c m c 酶活性最高在瑞氏木霉产生的内切葡聚糖酶中，以e g i i 的催化 效率最高p 瓠成熟的e g i i 催化区位于蛋白质的c 末端，纤维素结合结构域位于 n _ 末端，成熟的e g i 由4 3 7 个氨基酸残基组成，另有2 2 个氨基酸的信号肽，与 e g i i 相反，它的催化区位于蛋白质的n - 末端，纤维素结合结构域位于c 末端。 分子量为5 0 k d l 3 1 翊，最适p h 也在4 5 之间。 e g i 与c b h i 有很高的同源性，一致率达到4 5 ，属于同一糖苷酶水解家族 7 ，都是通过构型的保留的催化机制。它的c d 结构域是以反平行的b 折叠形式 组成的“三明治”结构，e g i 的活性位点是沟状而非洞穴状，这种结构可以使葡 聚糖链随意地被降解成两个更短的葡聚糖链。 e g i 的c b d 结构是两组二硫键稳定多肽链的折叠，三个保守氨基酸g i n 7 、 a s n 2 9 和g l n 3 4 总是处于同纤维素表面形成氢键的一个平坦面上，表面暴露了几 个芳香族氨基酸及一些潜在的氢键形成的残基1 3 6 。目前人们推测：c b d 可能通 过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由c b d 上其余的氢键形成残基 与相邻葡萄糖链形成氢键将单个葡萄糖链从纤维素表面疏解下来。以利于催化区 的水解作用1 3 ：q 。但关于c b d 是如何吸附到纤维素表面、吸附后c b d 是如何与 催化区相互作用降解纤维素的问题，目前尚未作出合理解释。 1 5 本文的工作重点及意义 近些年来利用结构生物学及蛋白质工程的方法对纤维素酶分子结构和功能 进行的研究取得了一些结果，但是仍然存在一些需要继续解决的问题。 本文的工作设想是对c b d 如何吸附到纤维素表面、吸附后c b d 如何与催化 区相互作用降解纤维素的问题进行研究较之之前的研究。本文的侧重点放在不 改变一种纤维素酶的c d 和l i n k e r 的前提下，对c b d 进行随机突变，找到较之 野生型对纤维素吸附能力不同的c b d ，与前两者构建杂合酶，通过比较杂合酶 山东大学硕士学位论文 的性质进而得到更多的解释上述疑问的实验数据。如果要用传统的筛选方法对随 机突变后的c b d 基因进行纤维素吸附能力的筛选，无疑将是一项巨大而艰苦的 任务。噬菌体表面展示技术是一种新型的筛选方法，与传统筛选手段对比，该技 术更加高效。尤其是在亲和筛选方面可以很方便的得到与配体结合能力不同的受 体，而且筛选库的容量很大。因此该技术是一种很合适本研究目的的筛选方法。 另外，噬菌体表面展示技术近年来亦开始被应用到酶学定向进化的研究中，从目 前已知的情况来看，国内外尚未见有纤维素酶噬菌体展示的报道。如果可以将纤 维素酶成功的展示在噬菌体表面，无疑将会对应用该技术进行纤维素酶学研究提 供有力的帮助，这是本文的另一个工作重点 1 6 噬菌体表面展示技术概述 噬菌体表面展示技术( p h a g ed i s p l a y ) 是一种新的基因操作技术，它使表达 的外源肽( 或者蛋白质的结构域) 以融合蛋白的形式展现在噬菌体的表面。被展 示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性，借以研究多肽( 蛋 白质) 的性质、相互识别和作用，并据以从巨大的展示库中选择出特定功能的多 肽( 蛋白质) 结构。该技术出现不久即被广泛的用于人工抗体和疫苗的制备，以 及抗原决定簇的定位，蛋白质相互位点的确定，特异调节分子的分离，多肽药物 的研制，以及生物分子的实验定向进化等等近年来，该技术亦已开始应用于酶 定向进化方面的研究之中 1 - 6 1 丝状噬菌体的基本特征 丝状噬菌体属于单链d n a 病毒，包括n 、f d 和m 。它们只能感染含f 因子 的大肠杆菌，但噬菌体基因组能够转化无f 因子的大肠杆菌。噬菌体d n a 在细 菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，而且可分泌出大量成熟的噬菌 体颗粒( 每代约有1 0 0 个) 这种分泌出单链d n a 成为d n a 测序和突变分析的 理想材料，而胞内复制型的双链d n a 同样便于基因重组的操作1 3 ”9 】。 这类噬菌体的单链d n a 长约7 0 0 0 b p ，级结构极为相似( 9 9 0 同源性) ， 其基因组编码十种蛋白质，其中5 种为结构蛋白，这些蛋白质在分子量和拷贝数 上的差异很大，单链d n a 被包裹在大约2 7 0 0 - 3 0 0 0 个主要的衣壳蛋白p v u l 分 山东大学硕士学位论文 子组成的管状结构中，呈螺旋对称捧列。另4 种次要的衣壳蛋白为p i i i 、p v i 、 p v i i 和p i v 各有5 个拷贝。其中p v l i 和p i v 与噬菌体的组装有关，p i i i 通过 与大肠杆菌的f 菌毛结合而引起感染，是噬菌体感染宿主所必需的，p v i i i 与噬 菌体的成熟和稳定有关实验表明，除p i i i 和p v i i i 外，其他三种衣壳蛋白与 外源蛋白融合均影响噬菌体的完整性i 螂 p i i i 前体蛋白由4 2 4 个氨基酸组成，形成3 5 个拷贝，位于噬菌体的尾部， 它由4 个功能区组成。信号肽区( 1 8 个氨基酸) 引导p i i i 至细菌胞周间质，在 p i l l 分泌后被细菌蛋白酶水解，其后的穿膜区( p e n e t r a t i o nd o m a i n ) 与噬菌体的 侵入有关，受体结合区负责结合f 菌毛，而c 端的疏水区( 2 3 个氨基酸) 组装 前吸附在细菌内膜上，组装后这段氨基酸锚在噬菌体外壳上穿膜区是最外露的 区域，因而成为插入外源基因的理想位置 p v n i 前体由7 3 个氨基酸组成，其中信号肽区为2 3 个氨基酸，从构成外壳 的功能可分为4 个区，6 2 4 区域占据了噬菌体表面的大部分，在外壳上排列紧密， 2 5 3 5 区域高度疏水性，与噬菌体结构的稳定性有关。c 端( 3 5 5 0 位区域) 与 d n a 相结合，构成完整的内壁，其突变影响与d n a 相互作用，n 端( 1 - 5 ) 区 域为可活动的，外露在噬菌体表面的肽段，是插入外源基因的最佳位置。此外， 还对噬菌体的p v x 、p v i i 和p i x 蛋白展示的可能性进行了研究，结果发现，这些 蛋白展示方式并不优于p i i i 系统 1 6 2 噬菌体展示的基本原理和优势 噬菌体展示技术的建立基于以下三个基本事实：在p i i i 和p v i i i 农壳蛋 白的n 端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响和 干扰噬菌体的生活周期【4 ”，同时其保持的外源蛋白天然构象也能被天然的抗体或 受体所识别，这是成为噬菌体表面展示技术的基础和优势。利用固定于固相支 持物( 通常情况下如玻璃珠、酶标板等) 的靶分子( 或统称筛选剂或受体) ，可 以采用适当的p a n n i n g 方法( 亲和洗脱扩增亲和的循环步骤) ，洗去非特异性 结合的噬菌体1 4 2 】，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体( 或统 称配体) ，这成为该技术的关键。外源多肤或者蛋白质表达在噬菌体表面，其 编码基因作为病毒基因组中的一部分，可通过分泌型噬菌体的单链d n a 测序推 山东大学硕士学位论文 导出来，使得表达蛋白( 表现型) 和编码基因( 基因型) 之间完美的联系起来， 成为该项技术的另一优势因此，噬菌体表面展示技术