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白蚁内切一口一1 ，4 一葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 白蚁内切b 1 ，4 葡聚糖酶基因的分子进化及其酶学性质的研究 摘要 纤维素是地球上含量最丰富的可再生物质，纤维素酶能够将其水解为 葡萄糖，为食品和能源提供原料，然而目前的纤维素酶活力低、热稳定性 差、成本高，其产业化应用受到严重制约，因此有必要对已有的纤维素酶 进行改造，使其性能有所改善。本研究同时采用随机突变和定点饱和突变 的方法对台湾家白蚁内切葡聚糖酶c f e g 进行了分子进化。 运用易错p c r 构建随机突变库，筛选到两株突变子k 2 8 e 和f 2 4 1 l 。k 2 8 e 的最适p h l i , 原始酶提高了o 5 个单位，f 2 4 1 l 的t m 值下降了近4 。 采用半理性设计方法，在网站s w i s s m o d e l 上以p d b 数据库中高山象 白蚁内切纤维素酶n t e g ( p d bi d = 1 k s 8 ) 的三维结构为模板，对c f e g 进行三 维结构同源建模( 二者氨基酸的同源性为7 9 ) 。比较同源建模预测的三维 结构和模板n t e g 的三维结构，在此基础上通过计算机辅助设计软件 p r o s a 2 0 0 3 ，根据能量变化确定了c f e g 活性中心内的六个饱和突变位点 d 5 3 、d 5 6 、e 4 1 1 、d 1 2 2 、r 3 6 0 及y 4 0 7 ，其中d 5 3 、d 5 6 、e 4 1 1 分别与n t e g 的催化残基d 5 4 、d 5 7 、e 4 1 2 重合。对位点k 2 8 、f 2 4 1 也做了饱和突变以进 一步筛选突变子，此外，根据多序列比对做了定点突变h 3 0 5 y 。 定点( 饱和) 突变库共得到1 8 个突变子。突变子d 5 3 e 、d 5 6 c 的羧甲基 纤维素酶活提高了2 0 ，叠加突变d 5 3 c d 5 6 c 、d 5 3 e d 5 6 c 则丧失了活力， 双突变子d 5 3 l d 5 6 i 、d 5 3 e d 5 6 s 的比活比原始酶分别提高了近2 倍和1 4 5 倍。e 4 1l 饱和突变子库均没有活性，进一步将其替换为近似氨基酸的 e 4 11d 、e 4 11q 定点突变子也丧失了酶活。由突变结果可推断，位点e 4 11 为该酶行使功能的必需残基。d 1 2 2 、k 2 8 、f 2 4 1 位点的突变子均酶活降低 白蚁内切一卢- 1 ，4 - 葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 或失活，r 3 6 0 及y 4 0 7 位点突变子的比活和野生酶相差不大。与野生酶相比， 突变子d 5 3 e 、d 1 2 2 c 、d 1 2 2 e 的酶活最适温度下降了5 ；突变酶d 5 6 c 的 最适p h 提高了1 5 个单位，d 5 3 l d 5 6 i 、d 12 2 c 、r 3 6 0 k 和k 2 8 e 的最适p h 提 高了0 5 个单位，y 4 0 7 v 和k 2 8 h 的最适p h 下降了o 5 个单位；突变酶d 5 3 c 、 d 5 6 c 的t m 值升高了4 ，d 1 2 2 c 、d 1 2 2 e 的t m 提高了约2 ，而y 4 0 7 v 、 f 2 4 1 l 的t m 值降低了近4 。 本研究通过蛋白质分子进化探索获得新酶的有效途径，通过分析比较 获得的突变酶的性质变化，积累对工业用酶分子改造的经验，此外，对研 究台湾家白蚁内切葡聚糖酶的结构与功能的关系也具有非常重要的意义。 关键词：台湾家白蚁 内切1 3 1 ，4 葡聚糖酶随机突变饱和突变定点突 变双突变 广西大掌硕士论文 白蚁内切一口一1 ，4 一葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 s t u d i e so nm o l e c u l ee v o l u t i o na n dt h ee n z y m e p r o p e r t i e s o ft h ee n d o b l ，4 - g l u c a n a s eg e n e y r 吣c o p t o t e r m e sf o r m o s a n u s a b s t r a c t c e l l u l o s el st h em o s ta b u n d a n tr e g e n e r a t e dm a t e r i a lo ne a r t h c e l l u l a s ec a n h y d r o l y s i sc e l l u l o s et oi n d i v i d u a lg l u c o s ea n dp r o v i d et h em a t e r i a lf o rf o o da n d e n e r g ys o u r c e s t h ee x i s t i n gc e l l u l a s ei s l o wt h e r m o s t a b i l i t ya n dl o wa c t i v i t y a n dc o s to fp r o d u c t i o ni sh i g h ，t h e s eh a v ea c u t e l yh a m p e r e di n d u s t r i a l i z a t i o no f c e l l u l a s e ，t h e r e f o r e ，i ti sn e c e s s a r yt op e r f o r mf u n c t i o n a li m p r o v e m e n tt o c e l l u l a s e 。t h i s p a p e rr e p o r th e r et h es t u d i e so nm o l e c u l ee v o l u t i o no fa n e n d o g l u c a n a s e ( c f e g ) f r o mt e r m i t ec o p t o t e r m e sf o r m o s a n u su s i n gr a n d o m m u t a g e n e s i sa n ds a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s t h eg e n eo f gw a sd i r e c t e de v o l v e db ye r r o r - p r o n ep c r ，a n dt w o m u t a t i o n s ( k 2 8 e ，f 2 4 1l ) w e r eo b t a i n e d t h eo p t i m u mp ho fk 2 8 ew a s i n c r e a s e db y0 5u n i t s t h et h e r m o s t a b i l i t yo ff 2 41ld e c r e a s e da b o u tf o u r d e g r e e s m a n i p u l a t i o no fh a l fr a t i o n a ld e s i g nw a sp e r f o r m e da tt h es a m et i m e f i r s t l y ，t h ed i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo fc f e gw a sb u i l tv i ah o m o l o g ym o d e l i n gb y u s i n gac l o s e - r e l a t e d ( 7 9 h o m o l o g yi ns e q u e n c e ) e n d o p 一1 ，4 - g l u c a n a s e ( n t e g ， p d bi d = lk s 8 ) f r o mh i g h e rt e r m i t en a s u t i t e r m e st a k a s a g o e n s & a sat e m p l a t e s e c o n d l y ，s i xa m i n oa c i dp o s i t i o n sa tt h ea c t i v es i t eo fc f e g ( d 53 ，d 56 ，e 4 11 ， d12 2 ，r 3 6 0a n dy 4 0 7 ) w e r es e l e c t e d b ys t r u c t u r a ls u p e r p o s i t i o no n t on t e g c o m b i n e dw i t he n e r g yc a l c u l a t i o n b yt h ec o m p u t e r - a i d e dd e s i g n s o f t w a r e p r o s a 2 0 0 3 ，w h i l et h r e eo ft h o s ew e r ei d e n t i f i e da sp u t a t i v ea m i n oa c i d sf o rt h e a c t i v es i t eo fc 砸g ，i e ，d 5 3 ，d 5 6a n de 411 t h e s es i xa m i n oa c i da n dk 2 8 ， 广西大学硕士论文 白蚁内切一口一l ，4 一葡聚糖酶基因的分子进化及其酶学性质的研究 f 2 41w e r es u b j e c t e dt os a t u r a t i o nm u t a g e n e s i su s i n gd e g e n e r a t ep r i m e r s e i g h t e e nm u t a n t sw e r eo b t a i n e df r o mt h es a t u r a t i o nm u t a n tl i b r a r y d 5 3 e a n dd 56 cs h o w e d2 0 h i g h e ra c t i v i t i e st h a nt h ew i l d t y p e ，b u tc o m b i n a t i o no f t h e s em u t a n t sd 5 3 c d 5 6 c ，d 5 3 e d 5 6 cl o s e a c t i v i t y d o u b l e m u t a t i o n d 5 3 e d 5 6 s ，d 5 3 l d 5 6 is h o w e dn e a r l y1 4 5a n d2 - f o l d i n c r e a s ei ns p e c i f i c a c t i v i t yr e s p e c t i v e l y s a t u r a t i o nm u t a g e n e s i st ot h ep o s i t i o ne 4 1l p r o d u c e dn o a c t i v em u t a n t ，e v e nc h a n g i n ge 411 e x p l i c i t l yi n t oi t ss i m i l a ra m i n oa c i d ss u c h a s e 411da n de 411qc o u l dn o tr e s u l t i na n ya c t i v em u t a n t t h e s ei m p l yt h a t p o s i t i o ne 4 11c o u l db ee x t r e m e l yi m p o r t a n ta n dt h e r e f o r ei n d i s p e n s a b l ef o r c f e gf u n c t i o n a l i t y m u t a n sa tp o s i t i o n sd12 2 ，k 28a n df 2 41s h o w e dn oo r l o w e ra c t i v i t y ，s p e c i f i ca c t i v i t yo fm u t a n sa tp o s i t i o n sr 36 0a n dy 4 0 7w e r e n e a r l ya ss a m ea st h ew i l dt y p e t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fd 5 3 e ，d 12 2 c ， d12 2 ew e r ed e c r e a s e d5 c t h eo p t i m u mp ho fd 56 cw e r ei n c r e a s e d1 5u n i t s c o m p a r e dw i t ht h o s eo ft h ew i l d t y p ea n dd 5 3 l d 5 6 i ，d 12 2 c ，r 3 6 0 ka n d k 2 8 ew e r ei n c r e a s e d0 5u n i t s ，t h ey 4 0 7 va n dk 2 8 hw e r er e d u c e d1 5u n i t s t h et h e r m o s t a b i l i t yo f m u t a n td 5 3 c ，d 5 6 ci n c r e a s e df o u rd e g r e e st h a nt h a to f t h ew i l dt y p ea n dd12 2 c ，d12 2 ei n c r e a s e dt w o d e g r e e s ，w h i l ey 4 0 7 v , f 2 4 1l d e c r e a s e da b o u tf o u rd e g r e e s t h i ss t u d ye x p l o r e dn e wa n de f f e c t i v ew a yt og e tn e we n z y m et h r o u g h m o l e c u l a re v o l u t i o n i tw i l lb e c o m ea c c u m u l a t i o no fe x p e r i e n c eo nt h er e f o r mo f i n d u s t r i a le n z y m e ，a n dm a k es e n s ef o ri n v e s t i g a t i o nt h er e l a t i o n g s h i pb e t w e e n s t r u c t u r ea n df u n c t i o no fc f e gb ys t u d y i n ga n d a n a l y z i n gc h a n g e sa b o u t e n z y m ep r o p e r t i e so fm u t a n t sc 砸g k e yw o r d s ：c o p t o t e r m e sf o r m o s a n u s ；e n d o b - 1 ，4 - g l u c a n a s e ；r a n d o m m u t a g e n e s i s ；s i t e - - s a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s ；s i t e - - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ；c o m b i n e d m u t a t i o n i v 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 做储戤哳葡年 砌产g 月勿日 j 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 礅p 时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 俪寄新签嗤毋f 好g 啪日 广西大掌硕士论文 白蚁内切- 口- 1 , 4 - 葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 第一章前言弟一早月u 百 纤维素酶早已在人们生产生活的各个领域得到广泛应用，而当今社会面临日益严 重的能源与环境危机，人们正在积极寻求清洁可再生的能源用以替代化石能源。在此背 景下，纤维素凭借其含量丰富且清洁可再生的特性进入了人们的视线。近年来，纤维素 在生产工业酒精和生物质能源的领域有了飞速进展，纤维素酶的应用价值得到进一步肯 定，它的市场前景也愈加广阔了【。 1 1 燃料乙醇与纤维素 当今世界面临着严重的环境与能源危机，国际社会上已达成发展燃料乙醇作为化石 能源的替代品的广泛共识。依据生产原料的不同，燃料乙醇被划分为两代，第一代燃料 乙醇以玉米等粮食作物为生产原料，存在与人争粮、与粮争地的问题。从长远看，第二 代燃料乙醇以自然界木质纤维素类物质( 包括农作物秸秆和木材废料在内) 为生产原料 是最具前景的。我国幅员辽阔，木质纤维素资源丰富，仅农林废弃物就达每年约1 0 亿吨， 而我国人口众多，能源短缺严重，能有效解决这一系列问题的方法之一就是发展纤维素 乙醇【2 j 。经研究发现，自然界中纤维素生长花费一个单位价值的能量，就可以得到约5 5 个单位价值的乙醇，比用谷物生产乙醇的效率更高。纤维素乙醇排放的是主要温室气体 二氧化碳，其排放量比谷物基乙醇的排放量少得多。纤维素乙醇与普通的汽油相比，排 放二氧化碳的量少了8 0 ，而谷物基乙醇的二氧化碳排放量仅比汽油的少2 0 。上述效 益可看出投资纤维素乙醇的发展机遇。其中巴西石油公司计划于2 0 1 5 年起开始商业化 生产植物纤维素乙醇。 把纤维素水解为葡萄糖( 即纤维素的糖化过程) 是纤维素生产乙醇工艺的关键步骤。 工业上对纤维素的糖化过程较多采用酸水解法与酶水解法【m l 。酸水解法中，稀酸水解 纤维素得到的糖化率不够高，虽然高浓度强酸水解纤维素很有效，但是其腐蚀性对人体 有害，并且所需工艺条件苛刻，对设备要求也很高。而用纤维素酶来水解纤维素，在常 温、常压的条件下就可以进行。因此，目前纤维素利用研究中的热点之一就是用纤维素 酶降解纤维素。但是由于天然纤维素是结晶状，不溶与一般溶剂，以及尚未清楚纤维素 酶降解纤维素的水解机制，使得目前纤维素酶降解天然纤维素的效率较低，需要加大单 位用酶量，从而提高了生产成本，使纤维素酶降解纤维素生产乙醇无法实现规模化产业 白蚁内切一口一l ，4 一葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 应用。因此，提高纤维素的酶解效率需要进一步了解纤维素酶降解纤维素的机理，是更 加高效利用纤维素资源的重要途径。目前已获得的纤维素酶存在比活力较低，酶稳定性 差，酶解效率低的问题7 ，8 1 ，纤维素酶的生产效率低、成本较高是纤维素乙醇产业化亟 待解决的关键技术之一。中国科学院启动的“纤维素乙醇的高温发酵和生物炼制”重大项 目的子课题之一便是新型木质纤维素降解酶系的发现、改造与应用。 1 2 纤维素与纤维素酶 1 2 1 纤维素的结构 纤维素( c e l l u l o s e ) 是植物细胞壁的主要组成成分，占植物界碳含量的一半以上， 是世界上含量最丰富的可再生有机物质。纤维素不溶与水及一般有机溶剂，是b l ，4 一糖 苷键连接d 葡萄糖组成的大分子多糖【9 0 1 ，分子式可简写为( c 6 h l 0 0 5 ) n 。分子量约为 5 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 ，相当于3 0 01 5 0 0 0 个葡萄糖基。纤维素是由结晶区和非结晶区( 又称 无定型区) 两部分共同组成的，结晶区的结构规则稳定、密度大，微生物很难对其完全 降解【1 2 1 ，结晶度一般占总量的3 0 - - - 8 0 ；无定型区的结构则相对不规则、疏松而 密度小，微生物很容易对其进行降解【l3 1 。目前，对纤维素的清洁、高效降解还是纤维素 利用研究中尚待解决的难题。 1 2 2 纤维素酶的组成及作用机制 纤维素酶是能水解纤维素为纤维二糖和葡萄糖的一系列复杂酶系的总称，又称纤维 素酶系【1 4 1 5 1 。纤维素酶系中各酶之间的功能存在很大差异，主要有三大类纤维素酶【1 6 】： 外切葡聚糖酶( e c 3 2 1 9 1 ，e x o l ，4 p d g l u c a n a s e ) 、内切葡聚糖酶( e c 3 2 1 4 ， e n d o 一1 ，4 一d - d g l u c a n a s e ) 以及p - 葡萄糖苷酶( e c 3 2 1 2 1 ，p - g l u c o s i d a s e ) 。 目前仍未清楚纤维素酶水解纤维素为葡萄糖的详细过程，普遍认为是由纤维素酶系 的各组分酶协同作用完成的。水解过程如图1 1 ：内切葡聚糖酶( e g ) 在纤维素分子的 内部随机水解无定型区的糖苷键，将纤维素长链分子切割为带非还原性末端的纤维素小 分子；外切葡聚糖酶( c b h ) 贝f j 是从长链纤维素分子末端水解p 1 ，4 糖苷键，释放纤维素 的基本组分纤维二糖分子，目前也尚未弄清外切酶和内切酶作用的先后顺序，只有当二 者共同作用时才能彻底水解结晶纤维素；最后纤维素水解的终止是由b 葡萄糖苷酶( b g ) 2 白蚁内切一口一1 ，4 - 葡聚糖酶基因的分子进化及其酶学性质的研究 水解纤维二糖为葡萄糖1 7 1 而完成。 必须含有这三种纤维素酶组分才是完整的水解系统，瑞士木酶就同时含有四个内切 葡聚糖酶( e g ) 、两个外切葡聚糖酶( c b h ) 和一个d 一葡萄糖苷酶( b g ) 【1 引。协同假说 认为这三种酶之间也存在着协同作用，有三种类型的协同方式已经被证实：第一种即内 切一外切协同，内切酶通过随机剪切，产生大量长链末端，外切酶可结合上去而发挥外 切作用；第二种是外切一外切协同，即两种外切酶在水解过程中有协同作用于底物的趋 向，w o o d 就发现青霉( 户f u n i c u l o s u m d e ) 与瑞氏木霉( lr e e s e i ) 两者各自的外切酶协 同作用于水解棉纤维素和微晶纤维素【1 9 】；第三种则是分子内的协同，体现在纤维素酶的 催化域与底物结合域的相互影响，当把催化域与结合域分离后，催化域的水解效率就会 大大降低【2 0 1 ，而各结构域单独作用的效率也远远低于全酶分子的协同作用【2 ，第三种分 子内的协同作用和纤维素酶分子结构之间的关系是密不可分的。 目前研究的较多的是内切葡聚糖酶，已有多种各类生物的内切葡聚糖酶基因被克隆 并实现有活力地表达，所用底物大多为纤维素类衍生物如羧甲基纤维素钠等，而对结晶 性纤维素有水解活力的内切葡聚糖酶还发现得很少。 垴藏q 。( 二艋魄 = i 三三三三三三三墨塑g 焉暴= l i s i 4 内蛹葡紧钷搬g s 三兰兰兰娃 1 ，刀一 r， i i s - i 4 蚪切秘聚t t f 陬c b h s ) o _ 一 p 一葡萄德侍陡 譬；乒二二i 褥濂 图卜1 纤维素酶各组分的协同作用【1 9 】 f i g 1 1c o o r d i n a t e dd e g r a d i n go fc e l l u l o s eb yc e l l u l a s e 白蚁内切一口一1 ，4 一葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 1 2 3 纤维素酶的来源及分子结构 纤维素酶在植物和微生物中广泛存在，一部分细菌和真菌体内含有的复杂的纤维素 水解系统，可以将纤维素有效地水解，例如梭状芽孢杆菌( ct h e r m o c e l l u m ) r 扣就具有各 纤维素酶组分构成的多纤维素酶体；植物本身的最大组分就是纤维素，它自身的纤维素 酶在其发育的不同阶段起着水解细胞壁的作用，例如果实成熟、蒂柄脱落等过程都是纤 维素在发挥作用瞄l 。对于动物而言，最初认为动物能利用纤维素，是因为动物的消化系 统内部存在着大量的原生动物以及共生的细菌和真菌，而这些共生生物能够分泌纤维素 酶分解纤维素2 2 , 2 3 】，提供给动物可以吸收利用的营养物质。后来，人们陆续通过不同的 实验从动物体内得到了动物内源性的纤维素酶基因，从而证实了在线虫、白蚁、贻贝、 鲍鱼、甲虫、福寿螺等动物体内也广泛存在纤维素酶 2 4 讲1 。 大多数的纤维素酶都是由催化域( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) 和底物结合域( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 这两个结构域组成，二者均为独立活性，由一段连接桥( 1 i n k e r ) 相连接【2 8 ，2 9 1 。整个纤维素酶分子为楔形，包含催化位点与底物结合位点的催化域表示为 球状核区1 3 0 1 。目前仍未清楚底物结合域的作用机理，而且只有少数微生物、高等植物和 动物产生的纤维素酶不具有结合底物的结构域，如瑞氏木霉( t r e e s e i ) 的外切酶c b h i 就没有c b d 结构域，其内切酶e g i 在没有底物结合域的情况下也仍具有水解纤维素的活 性【3 l j 。实验证明，在有些内切酶和外切酶中，酶行使催化活力没必要有底物结合域【3 2 1 。 纤维素酶共分布在糖基水解酶的1 2 大类中，处于不同糖基水解酶分类的纤维素酶， 其氨基酸序列相差很大，一种生物产生的不同种纤维素酶，也有很大的差别；而同一类 纤维素酶的活性位点氨基酸是保守不变的；内切酶与外切酶的活性中心结构则完全不一 样，决定了它们各自对纤维素底物的不同的作用方式 3 3 , 3 4 j 。 1 3 纤维素酶的分子进化研究进展 1 3 1 酶分子进化技术 自从上个世纪发现纤维素酶以来，对纤维素酶的研究现已进入到利用蛋白质工程的 方法对纤维素酶进行活性氨基酸残基的确定、酶蛋白结构与功能的解析与催化水解机制 的推测等的阶段。蛋白质工程是一种新兴的基因工程技术，它作为用来研究酶的催化机 制的一种工具，部分研究内容就是体外分子定向进化、对潜在活性氨基酸进行定点突变 4 白蚁内切一口一1 ，4 - 葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 和对突变酶进行酶学性质测定。可以用蛋白质工程技术来鉴定酶的催化氨基酸、推测酶 的反应机制和改善酶的酶学特性。目前对一些纤维素酶的基本结构和活性部位已基本弄 清，所以利用定点突变方法对纤维素酶蛋白分子进行设计和改造是完全有望实现的。改 造现有的纤维素酶分子，不仅是为了获得对纤维素水解活力提高的突变酶，以提高对大 自然中纤维素类物质的利用效率，也是为了提供新的基因源。截至目前，在被克隆的1 0 个糖苷水解酶类家族的纤维素酶中，已经进一步用蛋白质工程技术进行了研究的就有第 5 、6 、7 、8 、9 、4 5 共六个家族【3 5 l ，从中鉴定了相关活性氨基酸残基、得到了性质得到 改良的突变酶等。 1 3 2 纤维素酶的定点( 饱和) 突变 定点突变( s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ) 是插入、替换、或删除基因序列中特定核苷酸， 从而改变酶蛋白一级结构中的对应氨基酸残基的技术，饱和突变( s a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s ) 则是将d n a 序列中的一个或几个氨基酸分别一一替换为另外1 9 种氨基酸的技术，其中用 简并引物n n n 通过反向p c r 介导的突变是将待突变位点随机突变为任意氨基酸。定点突 变是一种理性设计方案，其时至今日仍被广泛应用于蛋白质改造中。利用定点( 饱和) 突变技术已经获得了成功研究的方面包括有：改造天然酶蛋白的催化活性、底物专一性、 拓宽酶作用底物的范围、稳定性以及抗氧化性等【3 6 训】。理性设计( r a t i o n a ld e s i g n ) 需要 知道蛋白质结构，尤其是具有催化功能的结构或者以结构为基础的分子建模，以及详细 的了解理想的结构与其功能之间的关系。理性设计策略已经在研究纤维素酶分子中特定 氨基酸残基与其功能之问的关系，以及在纤维素酶分子的定向改造等方面得到广泛应用 f 4 2 】，通常是利用定点突变技术确认典型纤维素酶家族序列的不变残基和三维构象。 w i l s o n 和w i t h e r 做的许多相关研究就是通过定点突变提高了纤维素酶的酶活、研究了纤 维素酶的作用机$ 1 j 4 3 , 4 4 】。h a k a m a d a 等人用定点突变的方法将细菌碱性纤维素酶的 g l u l 3 7 、a s n l 7 9 和a s p l 9 4 突变为l y s ，其热稳定性得到了提耐4 5 1 。几乎还没有人能成功 地通过定点突变获得利用难溶底物的纤维素酶酶活提高的突变子m j ，目前只有b a k e r 获得活力有一定提高的a c i d o t h e r m u sc e l l u l o l y t i c u s 切酶c e l 5 ( 其三维结构于突变研究之 前就已获得) 突变子【4 7 】。这是因为尚未完全搞清楚纤维素酶之问竞争协同的关系和纤 维素酶与难溶纤维素底物之间的动态关系等因素【1 】，突变技术在这方面的研究还没找到 统一的规律。 5 白蚁内切- 口一1 ，4 - 葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 1 3 3 纤维素酶的定向进化 目前仍有许多纤维素酶的三维结构没有得到解析，即使对于三维结构得到解析的 纤维素酶蛋白而言，其结构与功能之间的关系也存在很多没有搞清楚的问题。而定向进 化技术不依靠酶蛋白的结构信息，它也因此发展起来并日益受到人们的关注【4 2 1 。定向进 化是在扩增待进化蛋白质基因的p c r 反应体系中，人为创造适当条件并利用t a q d n a 聚 合酶不具有3 5 校对功能的性质，向目的基因中引人较低比率的突变，构建随机突变库 后利用特定的定向选择方法，筛选出符合预期需要特性的突变酶。定向进化的实质就是 随机突变加上选择，它与自然进化不同的是：它的整个过程都在人为控制下进行，而且 还能随机拼接d n a ，以加速蛋白质的进化。 定向进化不需要事先搞清楚酶的结构，也无需弄清酶与底物间的关系，在不了解酶 的结构和作用机理的情况下也能获得功能突变体，而成功的关键就是要有高灵敏的能找 到所需功能基因的筛选方法【4 引。已经有许多研究通过定向进化的方法成功改善了纤维素 酶的活性：v o u t i l a i n e n 等人 4 9 1 对膨a l b o m y c e s 的纤维素酶c e l 7 b 进行随机突变，获得了 最适温度、酶活力和t m 值分别得到一定提高的两个突变子；仅在内切酶上，用羧甲基纤 维素钠底物和刚果红染色法就筛选获得四个成功定向进化的例子【5 0 鄹】，g a o 5 川等通过易 错p c r 获得瑞氏木霉内切葡聚糖酶e g i i i 的突变子，其耐酸性得到很大程度提高，在p h 5 4 时酶活没有降低。 易错p c r 定向进化方法的不足之处是较为耗时、费力，此外，易错p c r 出现碱基转 换的频率大大高于碱基颠换，同时由于引入突变的频率很低，最终的突变体会因为是沉 默突变而翻译成和原来一样的蛋白质，即易错p c r 只能使野生型蛋白质中很小的序列空 间发生突变。不过对于初次涉入定向进化领域的研究者，易错p c r 也算是一种实用而有 效的分子进化方法。 1 4 白蚁纤维素酶 白蚁以啃食木质纤维素类物质为生，开始人们认为是其体内的共生生物能分泌纤 维素酶，能水解消化纤维素供白蚁吸收利用，如牛胃中就存在大量产纤维素酶的微生物。 随着动物内源性纤维素酶的发现，白蚁内源性纤维素酶也成为人们关注和研究的热点。 n a k a s h i m a 于2 0 0 0 年利用浸提的方法得到了台湾家白蚁的内切一p 一1 ，4 一葡聚糖酶，并对其 6 白蚁内切- 口- 1 ，a - 葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 进行了纯化和酶学性质研究酬。 1 4 1 白蚁纤维素酶的克隆与表达 搜索n c b i 的g e n b a n k 数据库( h t t p ：l l w w w n c b i n l m n i h g o ，) 发现，已经得到克 隆的白蚁纤维素酶基因主要是内切葡聚糖酶基因，分别是鼻白蚁科、白蚁科、木白蚁 科和澳白蚁科的几种白蚁的e g 【5 5 1 ( 见表1 1 ) 。序列同源性分析表明，白蚁内源性内切 一d 一1 ，4 葡聚糖酶基因在序列上的相似性比较高。n a k a s h i m a ：等人【5 6 j 于2 0 0 2 年克隆到 台湾家白蚁的五个内源性内切葡聚糖酶基因，分别是c f e g l a 、c f e g l b 、c f e g 2 、 c 甩g 3 、c f e g 4 ，它们之间的相似性很高，都只有个别核苷酸的差异。高山象白蚁与 台湾家白蚁的的内切一p 1 ，4 一葡聚糖酶已经分别在大肠杆菌中得到表达【5 7 5 引。 1 4 2 白蚁纤维素酶的分子结构与反应机制 截至目前，所有发现的白蚁纤维素酶都属于糖苷水解酶第9 家族，研究该家族中部 分纤维素酶的晶体结构发现，此类酶分子都只含有单一的催化结构域，三维构象是一个 ( 伍旭) 6 折叠桶，在异头碳原子位通过构型的转化( i n v e r s i o n ) 来进行催化反应【5 9 1 。这种 机制产生的纤维素链新还原端异头碳原子的构型是将原构型反转了的，需要酶分子上的 两个羧基碳发挥作用( 如图1 2 ) ，其中一个羧基碳( 一般为天冬氨酸) 是催化碱，它 攻击异头碳原子，使其改变构型；另一个羧基碳( 一般为谷氨酸) 是催化酸，它提供一 个质子给糖苷氧【删，利用这种机制的酶没有转糖苷酶活性【6 1 1 。 1 4 3 白蚁纤维素酶的分子进化研究进展 目前已有4 科6 属共8 种白蚁的纤维素酶基因被克隆【5 5 1 ，其中n t e g 的三维结构已 通过核磁共振方法获得【6 2 1 。国内对白蚁体内内源性纤维素酶的研究阶段基本上都还是利 用生物化学的方法对其进行分离纯化【6 3 彤l ，真正利用蛋白质工程的方法对白蚁纤维素酶 进行改造的只有一篇定向进化的文献报道m j ：以r s e g ，n t e g ，c f e g ，c a e g 四个直系 同源基因为亲本进行基因家族改组( d n af a m i l ys h u f f l i n g ) ，筛选到能在大肠杆菌胞内 过量表达，并且酶活比亲本酶提高了2 0 一3 0 倍的重组子。国内外还尚未发表有关于单独 对台湾家白蚁内切葡聚糖酶分子进化方面的报道。 7 白蚁内切一口一1 ，4 - 葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 b 螺 脯 l n ，椭n 誊h 曩皇c h - n k m l n ，椭n 盘n l t 曲n i r n 图卜2 纤维素酶的构型转化机制1 6 7 1 f i g 1 - 2i n v e r s i o nm e c h a n i s mo fc e l l u l a s e 表1 1g e n b a n k 中收录的白蚁纤维素酶基因【5 5 】 t a b 1 - 1c e l l u l a s eg e n e so f t e r m i t e si nt h eg e n b a n k 基ng e n e 科f a m i l y 基因来源g e n es o u r c e r s e g c f e g c q e g n t e g n 协e g m d e g n k b g 鼻白蚁科 白蚁科 木白蚁科 澳白蚁科 木白蚁科 栖北散白蚁 台湾乳白蚁 c a c i n a c i f o r m i s 高山象白蚁 w a l k e r i g l y p t o t e r m e s 达尔文澳白蚁 恒春新白蚁 8 白蚁内切口1 ，4 一葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 1 5 本研究的目的和意义 截至目前，已经得到克隆表达的纤维素酶基因有很多，但是真正能用于工业化生产 的却很少，主要是因为它们都存在一些缺点：催化效率不够高、热稳定性较差、不耐强 酸强碱等各种极端条件等。有两种可行的途径来提高纤维素酶降解天然纤维素的效率： 进一步研究纤维素酶的结构与功能以及纤维素酶的作用方式，进而对其进行有效改造： 或者通过筛菌找到新的产酶菌种，发现具有开发潜力的新酶源【6 引。总之，纤维素酶有着 巨大工业和市场潜力，但是也是目前糖苷水解酶类中惟一还有大量问题尚未解决的酶。 提高纤维素酶水解天然纤维素的比活力，研发适应不同温度( 低温或高温) 的纤维素酶， 进一步弄清楚纤维素酶的结构与功能及结构与功能之间的关系等是纤维素酶当前主要 的研究趋势j 。 改造现有的纤维素酶，不只是能快速得到适合工业应用的新酶，并且是研究纤维素 酶的结构与功能及二者之间的关系的有效手段。首先利用定向进化、半理性设计、和各 种蛋白质分子进化技术改造纤维素酶系各单体酶，获取性质优良的突变酶，然后重新组 合酶组分，最终得到降解天然纤维素活力提高的纤维素酶系。对各纤维素单体酶的改造， 以期获得水解各种不同纤维素底物的效率更高、酶学性能更优良的突变菌株，最终目的 都是为了能更好的服务于实际生产，直接降低酶的生产成本，间接降低产品的整体生产 成本，提高经济效益，促进纤维素酶更广泛地应用于各个生产生活领域【4 2 1 。 因此有必要对已有的白蚁纤维素酶进行改造，使其工业性能有所改善，同时，为研 究其结构与功能以及二者之间的关系打下坚实的基础。本实验室已克隆得到台湾家白蚁 的内切p 1 ，4 葡聚糖酶基因【5 7 1 ，与g e n b a n k 数据库上公布的台湾家白蚁内切纤维素酶 基因( c f e g ) 相似性为9 9 ，蛋白序列相似性为1 0 0 ，重组质粒p s e 3 8 0 c f e g 在大 肠杆菌中表达出羧甲基纤维素酶( c m c a s e ) 活性。经测定，台湾家白蚁纤维素酶除能 水解羧甲基纤维素钠外，还对w h a t m a nn o l 滤纸具有微弱的水解活性，粗酶活力大约 为0 0 3 u m l ，考虑到滤纸酶活活力太低，后续研究测定的相对误差会更大，而且测定 滤纸酶活的步骤更繁琐、时问耗费更多，加上有研究报道纤维素酶的羧甲基纤维素酶活 性与滤纸酶活有一定正相关性，所以下一步的分子进化研究均采用羧甲基纤维素钠为底 物来测定酶活。通过分子进化对c f s g 进行改造，是为了迸一步提高台湾家白蚁内切纤 维素酶的比活、耐热性、改变其最适反应温度、最适p h 等性质，以获得高活力、高稳 定性等优良酶学性质的突变酶，利于下一步实现其工业利用，具体采用非理性和半理性 9 白蚁内切一口一1 ，4 一葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 两种方案： 一是易错p c r ，易错p c r 是定向进化研究的方法之一，它被最早采用来构建基因 随机突变文库【7 0 ，7 1 1 。对于三维结构尚未得到解析的酶，易错p c r 是一种值得尝试的方 法，然而非理性设计存在很大的盲目性，并且筛选的工作量大。定向改造技术随着高通 量和自动化筛选方法的进步而得到了广泛应用。 二是定点( 饱和) 突变，由于目前已有高山象白蚁的内切d 1 ，4 葡聚糖酶( n t e g ) 的三 维结构得到解析，而台湾家白蚁内切纤维素酶基因( c f e g ) 与其同源性高达7 9 ，故可 以采取半理性设计【7 2 川1 的方法，通过同源建模，分析研究酶的三维空间结构，然后采用 定点突变技术改变酶蛋白分子中个别或某几个氨基酸残基，产生新性状的酶，并且构建 突变型c f e g 的三维结构，从三维结构上分析突变型c f e g 结构上的变化对酶学性质的影 响，为今后研究台湾家白蚁内切纤维素酶的结构和功能提供有用的数据和信息。 l o 广西大掌硕士论文 白蚁内切- 口- 1 ，4 - 葡聚糖酶基因的分子进化及其酶掌性质的研究 1 6 技术路线 以重组质粒p s e 3 8 0 一唧为模板 易错p c r 扩增目的基因 上 上 同源序列比对分析 三维结构模型分析 p r o s a 2 0 0 3 能量分析 以重组质粒p s e 3 8 0 - 卿为模板 匦一坚些子一上匦 i纯化重组蛋白 习 白蚁内切一口一1 ，4 一葡聚糖酶基因的分子进化及其酶学性质的研究 2 1实验材料 2 1 1 质粒与菌株 p s e 3 8 0 表达载体 p s e 3 8 0 一c f e g ( h i s ) e c o l ij m l 0 9 e c o l ix l l 0 - g o l d e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 2 1 2 酶与试剂 第二章材料与方法 购自i n v i t r o g e n 公司 本实验室构建 本实验室保存 本实验室保存 本实验室保存 p r i m e r s t a rd