（微生物学专业论文）煤矸石中脱硫细菌的分离及其特性研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学忙论文 否如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做7 明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：稍印蔚时间：p g年彳月，日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，3 r 以呆用影印、缩印或扫描等复制手段保 存 7 2 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传 播学位论文的全部或部分内客 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位黻储张钥俞 导：建忒 签名日期：知喏年6 月2 2 日签名日期：之i g 年6 月己z 日 华中农业大学硕七学位论文 摘要 煤矸石是煤炭生产加工过程中产生的固体废弃物，随着煤炭的大量开采，煤矸 石的排放和堆积也r 益增加。煤矸石的长期堆存后会引发自燃，污染大气和地下水 质。煤矸石污染环境的主要污染源是硫。本文针对容易引发自燃的高硫煤矸石开展 微生物脱硫实验，在脱硫微生物的筛选及鉴定的基础上研究了其生物学特性及煤矸 石脱硫的影响因素。 通过比较富集培养和传代纯化获得纯培养菌株的氧化硫的能力，从宁夏大武口 煤矸石浸水中筛选出能迅速氧化单质硫及低价含硫化合物的菌株c m t l ：3 2 。1 6 s r d n a 序列同源性分析结果结合形态和生理生化特征可确定分离的c m t t - 3 2 为硫杆 菌属的嗜酸氧化硫硫杆菌翻c i d i t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) 。c l u s t a l w 程序绘制的 系统发育树得出c m t t - 3 2 和a t h i o o x i d a n sa t c c l 9 3 7 7 进化关系最为接近。培养过 程中测定了溶液p n 变化和硫酸根浓度的变化，结果表明c m t r - 3 2 菌株极端耐酸， 培养基p h 值可下降到0 8 左右，产硫酸能力可达3 0g l d 。最适生长温度为2 8 ， 最适生长p h 为2 呲5 。脉冲电泳结果表明该菌可能含有大质粒。 研究了不同矸石粒径，不同初始p h 条件，不同细菌浓度，不同矸石加入量对 细菌的矸石脱硫的影响情况，结果表明：大粒径煤矸石的细菌浸出脱硫量明显低于 小粒径；细菌接种量越大，硫酸根浓度的增加也越明显；煤矸石的加入浓度越小， 测得的单位矸石脱出的硫酸根浓度越高；初始p a 对微生物矸石脱硫的效率影响较 大，随着初始p h 的降低，细菌浸出的脱硫率增高，在初始p h 为1 5 时，1 4d 生物 浸出后得到8 4 5 的脱硫率，脱硫量为2 7 2 9 l 。x r a y 衍射分析结果表明脱硫前后 煤矸石的衍射峰强弱和出峰数都有较大改变，证明了煤矸石中的成分和结构的改变 是由细菌的吸附氧化造成的。 通过富集培养和传代驯化，从煤矸石浸液中分离出能迅速氧化亚铁的细菌 n f 0 1 ，生理生化特征鉴定结果表明该菌株为氧化亚铁硫杆菌。该菌在培养过程中 p h 先上升后下降最后稳定在2 0 左右，6 0h 培养后溶液中的亚铁离子浓度降至检测 范围以下，同时生成含有三价铁的褐色沉淀。在煤矸石的细菌脱硫过程中，溶液中 铁离子的浓度形成有起有落的动态过程。矸石粒径和初始p h 对细菌n f 0 1 脱硫的 影响和c h t - 3 2 菌株脱硫结果变化趋势一致，但接种量的结果表明n f 0 1 在2 5 接种时达到最大，1 0 和5 0 接种时浸出脱硫率降低。 n f 0 1 和c m l t - 3 2 共同作用可以加速黄铁矿的浸出和煤矸石的脱硫反应，随着 细菌浸出时间的延长，不同混合接菌比例的脱硫差异逐渐明显，实验结果表明细菌 接种比例n f 。0 1 ：c m t t - 3 2 = 2 ：3 时脱硫效果最佳。 关键词：煤矸石分离嗜酸氧化硫硫杆菌氧化亚铁硫杆菌生物脱硫特性 华中农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t c o a lw a s t e sa l es o l i dw a s t e si nc o a lm i n i n ga r e a s w i t ht h ee x c e s s i v ee x p l o i t a t i o no f m i n i n g ，t h ec o a lw a s t e sh a v ei n c r e a s e ds h a r p l y t h ee x i s t e n c eo f c o a lw a s t e sh a v ea l r e a d y c a u s e dg r e a td a m a g eo nt h ee n v i r o n m e n t ：m u c hl a n do c c u p i e d ，a t m o s p h e r ea n d u n d e r g r o u n dw a t e ra r e a 8p o l l u t e db yt h es p o n t a n e o u sc o m b u s t i o n , t h e r e f o r ec o a lw a s t e s a r er e g a r d e da sm u l t i - d e l e t e r i o u si n d u s t r i a lw a s t e s t h ed o m i n a t i n gs o u r c eo ft h e e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o ni ss u l p h u r t h i sp a p e rs t u d i e st h eb i o d e s u l p h u r i z a t i o no f t h ec o a l w a s t e s ，e s p e c i a l l yt h eh i g hc o n t e n ts u l p h u rw a s t ew h i c hi sp r o n et oc a u s es p o n t a n e o u s c o m b u s t i o n 、 c h e m o l i t h o a u t o t r o p h i cs u l f u ro x i d i z i n gb a c t e r i aw e r ei s o l a t e db yt h ee n r i c h m e n ta n d p u r i f i c a t i o nf r o mt h ea c i dc o a lw a s t em e ks l u r r y i nt h ed a w u k o uc o a lm i i l i n ga r e a s ， n i n g x i ap r o v i n c ei nc h i n a s t r a i nc m t t - 3 2w e r ec h o s e nb yc o m p a r i n gt h eo x i d i z i n g a b i l i t y i ti so b l i g a t ec h e m o l i t h o a u t o t r o p h , e x t r e m e l ya c i d o p h i l i ca n dh a st h ea b i l i t yt o o x i d i z et h e s u l p h i d e a n ds u l p h u r m o r p h o l o g i c ，b i o c h e m i c a la n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i ca n dt h e1 6 sr d n as e q u e n c ea n a l y s i s t h i si n d i c a t e dt h a tc m t t - 3 2b e l o n g t ot h eb r a n c ho f a c i d i t h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s ，p h y l o g e n e t i ct r e ew a sc o n s t r a c t e db yt h e c l u s t a l w p r o g r a mo nl i n e i nt h ep h y l o g e n e t i ct r e ec m t t - 3 2w a st h ec l o s e s tr e l a t i v e t oa t h i o o x i d a n sa t c c l 9 3 7 7 t h er e s u l t so fp ha n ds u l p h a t ec o n c e n t r a t i o nv a r i a t i o n s h o w e dt h a tt h i ss t r a i nc a nt o l e r a t ee x t r e m ea c i dc i r c u m s t a n c e ，p hv a l u ed e c l i n e db e l o w 1 0 ，s u l p h a t ep r o d u c t i o nr e a c h e sa sh i 曲a s3 0g ，ld t h eo p t i m a lg r o w t ht e m p e r a t u r ef o r s t r a i nc m t t - 3 2w a s2 8 ；o p t i m a lp hw a s2 m 之5 e x p e r i m e n t so fc o a lw a s t e sb i o d e s u l f u r i z a t i o nb yc m t t - 3 2h a db e e nc a r r i e do u ti n d i f f e r e n tc o n d i t i o n s ，p a r t i c l es i z e ，i n i t i a lp hv a l u e ，i n o c u l a t i o nc o n c e n t r a t i o n s ，p u l p d e n s i t y i ns p i t eo fp a r t i c l es i z e ，t h el e a c h i n gs u l p h a t ec o n c e n t r a t i o nw a si n c r e a s e da f t e r b i o d e s u l f u r i z a t i o n t h eb i g g e rs i z eh a sl o w e rd e s u l f u r i z a t i o nr a t es i g n i f i c a n t l y l e a c h i n g s u l p h a t ec o n c e n t r a t i o nw a si n c r e a s e dw h e ni n o c u l a t i o nc o n c e n t r a t i o n ss u p e r i n d u c e d , d i f f e r e n c eb e t w e e n2 5 a n d5 0 i n o c u l a t i o nw a sn o to b v i o u s l ya f t e rs e v e r a ld a y so f b i o l e a c h i n g c o n s i d e r i n gt h el e a c h i n gc o s ta n de f f e c t2 5 i n o c u l a t i o ni nt h eb i o l e a c h i n g w a sm o r ea p p r o p r i a t e l o w e rp u l pd e n s i t yc a u s e dh i g h e rd e s u l f u r i z a t i o nr a t ep e rg r a mo f c o a lw a s t e i n i t i a lp hw a sas i g n i f i c a n ti m p a c to fm i c r o b i a ld e s u i f u r i z a t i o ne f f i c i e n c y ；t h e b i o d e s u l f u r i z a t i o nr a t ew a sh i i g h e rw i t ht h el o w e ri n i t i a lp h i nt h ei n i t i a lp ho f1 5 ，t h e r e m o v a lo fs u l f u rr e a c h e d2 7 2 9 la f t e r1 4d a y sc u l t u r e da n di t sd e s u l p h u r i z a t i o nr a t e r e a c h e d8 4 5 p o w d e rx - r a yd i f f r a c t i o n ( x r d ) p a t t e r n so fc o a lw a s t e ss a m p l e ss h o w e d n o t a b l ed i f f e r e n c eb e f o r ea n da f t e rb i o d e s u l f u r i z a t i o n ：i n t e n s i t ya n da m o u n to f p e a k sw e r e 2 华中农业大学硕十学位论文 c h a n g e d i ti l l u m i n a t e dt h es u r f a c ec r y s t a ls t r u c t u r ea n d t h ep r o p o r t i o no ft h ei n g r e d i e n t s o fc o a lw a s t e sh a db e e na l t e r e d ，w h i c ha t t r i b u t et ot h ea d s o r p t i o na n do x i d a t i o nf u n c t i o n o f t h eb a c t e r i a f e r r o u so x i d i z i n gb a c t e r i a ls t r a i nn f - 0 1w e r ei s o l a t e db yt h ee n r i c h m e n ta n d p u r i f i c a t i o n o ft h ea c i d c o a lw a s t er o c k s l u r r y m o r p h o l o g i e ，b i o c h e m i c a la n d p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r sr e v e a l e dt h a tt h i ss t r a i nb e l o n g st o t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s 1 h ep hv a r i a t i o nw a sd e t e c t e dd u r i n gc u l t i v a t i o n , f i r s tp hr i s e da n ds u b s e q u e n t l yf e l la n d f i n a l l ys t a b i l i z e da t2 0m o r g o rl e s s a f t e r6 0h o u r sc u l t i v a t i o n , t h ec o n c e n t r a t i o no ff e 2 + c o u l dn o tb e e nd e t e c t e d , b r o w nd e p o s i ts u b s t a n c ec o n t a i n e df d + w a sc r e a t e di ns t e a d i n b i o d e s u l f u r i z a t i o np r o c e s so fc o a lw a s t e s i r o nc o n c e n t r a t i o nh a dk e p ti nad y n a m i c e q u i l i b r i u m e 腩c t so fp a r t i c l es i z ea n di n i t i a lp hv a l u eo nt h eb a c t e r i a ld e s u l f u r i z a t i o n h a dt h es a m et r e n dw i t hc m t t - 3 2 w h e r e a st h eo p t i m u mi n o c u l a t i o no f n f 0 1o c c u r r e d a t2 5 ，e i t h e r1 0 o r5 0 i n o c u l a t i 0 1 1c o n c e n t r a t i o nc o u l dc a l l 8 el o w e rd e s u l f u r i z a t i o n t h em u t u a li n t e r a c t i o no f n f 0 1a n dc m t r - 3 2c a l la c c e l e r a t et h el e a c h i n go f p y r i t e a n dt h ed e s u l f u r i z a t i o no fc o a lw a s t e s ，w i t ht h ee x t e n s i o no fb a c t e r i a ll e a c h i n gt i m e ，t h e 最 d e s u l f u r i z a t i o nr a t ed i f f e r e n c e sb e c a m ec l e a rg r a d u a l l y n eb e s ti n o c u l a t i o np r o p o r t i o n r a t i oo f n f 0 1a n dc m r r - 3 2w a s2 ：3 k e yw o r d s ： c o a l w a s t e s ；i s o l a t i o na c i d i t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ；t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n a ；b i o d e s u l p h u r i z a t i o n ；c h a r a c t e r i s t i c 华中农业大学硕l 学位论文 l 前言 1 1 研究背景及必要性 高度发达的科学技术和工业文明将人类带入了一个迅速变革的时期，能源和环 保是当今世界面临的主要问题。酸雨、全球气候变化、森林面积的减少、土壤退化 加速、大规模的生态破坏正日益严重，环境问题已成为影响经济可持续发展的最重 要因素。我国是世界上最大的煤炭生产国和消费国，长期以来，在我国能源生产与 消费结构中煤炭一直占主导地位，巨大的能源消费规模和以煤为主的能源消费结构 引起的环境污染已使国家不堪重负。随着煤炭的大量丌采，其生产加工过程中产生 的固体废弃物一煤矸石也日益增加，煤矸石每年的排放量约为当年煤炭产量的1 0 2 0 左右，目前全国煤矸石的总积存量已达3 0 亿t 以上，形成矸石山1 0 0 0 多座( 宋焕 斌和张文彬，2 0 0 0 ) 。煤矸石的长期堆存，占用大量土地，同时造成煤矸石堆自燃， 污染大气和地下水质，被视为固、气、液三害俱全的“工业废料”。 煤矸石污染环境，其主要污染源是硫。煤矸石山中硫以硫化物为主，主要赋存 在黄铁矿中，也存在于少量的白铁矿、方铅矿、闪锌矿、黄铜矿等会属硫化物中， 长时间暴露在空气中时，硫铁矿会氧化析出硫磺( 李松，2 0 0 2 ) 。单质硫( s o ) 会进 一步在空气中氧化，产生大量热量而引发自燃，并引起矸石中残煤的燃烧，产生s 0 2 、 h 2 s 和c o 等有害气体，诱发大气污染、酸阿、温室效应等一系列环境问题以及地质 灾害。目i i i ，我国数量巨大的煤矸石山中约有l 4 发生过自燃或正在发生自燃( 刘 培云和王明建，2 0 0 0 ) 。2 0 0 0 年我国s 0 2 排放为1 9 9 5 i t ，排放量超过西方发达国家和 美国，居世界第一位；二氧化硫的排放使我国酸i 对面积占到国土面积的3 0 ，成为世 界三大酸雨区之一( 孙荣庆等，2 0 0 3 ) 。s 0 2 危害人体健康，会引起严重的呼吸系统 疾病；对植物的生理机能也会造成破坏，减缓农作物及森林生长；同时使土壤湖水 酸化、抑制鱼虾生长；s 0 2 形成的酸雨腐蚀桥梁、建筑和材料，我国每年因酸雨和二 氧化硫污染造成的经济损失在1 1 0 0 亿元的基数上还在持续不断地增加( 范小克， 2 0 0 4 ) 。 煤矸石的硫污染严重地破坏了矿区的生态环境，造成矿区大面积的空气水质状 况的恶化，影响矿区的植被生长，使矿区的生态重建受到阻碍( 毕银丽等，2 0 0 3 ) ， 间接导致工程灾害加剧、资源浪费、矿农关系紧张，给社会、环境、人民生活健康 造成极大影响，严重阻碍了矿区经济的可持续发展。因此，如何解决煤矸石的硫污 染引起的一系列问题是矿区环境治理的重点，寻找既经济又有效的方法脱除煤矸石 中的硫是解决问题的关键。煤矸石脱硫后，不仅可以减轻对环境的污染，为矿区的 生态恢复提供条件，还可以提高煤矸石的利用价值，变废为宝，使煤矸石成为发电、 4 毕中农业人学硕+ 学位论文 制砖、改良土壤的重要原材料( 李海英和杨文才，2 0 0 2 ；李剑等，2 0 0 0 ) ，具有重大 的环境生态效应及社会和经济效益。 1 2 文献综述 1 2 1 生物脱硫概述 生物脱硫( b i o d e s u l f u r i z a t i o n ，b d s ) 就是在温和的条件下利用各种适宜的微生物 菌群将化合态或有机态的硫释放出来的过程，主要利用的是特殊的微生物对含硫的 环境污染物或者含硫矿石有独特的消化能力的特点，使本来存在于化合物中的硫成 为水溶性的化合物。早期的物理和化学的脱硫方法虽然步骤简单但是成本巨大，需 要在高温、高压并使用腐蚀性沥滤剂等严格的条件下进行，设备复杂，并容易引发 二次污染。和传统的物理化学法相比，生物脱硫技术具有可在常温、常压下进行， 生产成本低，耗能少，专一性强，二次污染小的优点，是目前国内外脱硫研究的焦 点( b e v e r l y , 1 9 9 9 ) 。 生物脱硫按照硫元素存在方式的不同可分为脱无机硫和有机硫两种。二苯并噻 吩( d b t ) 是化石燃料中含量最高、难降解的有机硫化物的典型代表，目前分离得到 可选择性的从d b t 中脱除有机硫的细菌包括假单胞菌，红球菌，棒杆菌，短杆菌， 戈登氏菌，诺卡氏菌等。其中，1 9 8 9 年美国天然气研究所分离得到紫红红球菌i g t s 8 是研究最多的菌种( 黄彦君等，2 0 0 3 ) 。2 0 0 1 年美国e b c 公司投产了日处理量5 0 0 0 桶的柴油的生物脱硫中试工厂，证明了生物脱硫的可能性。我国生物脱硫起步较晚， 近年来专一性脱硫菌菌种筛选得到的有红平红球菌、短小芽孢杆菌、球型诺卡氏菌， 德氏假单胞菌等，使用这些微生物进行的实验室规模的脱硫试验也取得了较大的进 展( 堠仲轩等，2 0 0 2 ) 。 生物脱无机硫是利用无机化能自养菌的生物氧化还原反应过程进行脱硫的技 术。该技术它是从分离得到氧化亚铁硫杆菌以后发展起来的，氧化亚铁硫杆菌 ( t f , t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ) 是极端嗜酸性的专性自养细菌，从1 9 4 6 年发现煤矿 废弃物中产生的硫酸对环境的腐蚀性开始，1 9 4 7 年美国科学家c o l m e r 和h i n k l e 就 分离纯化了这种氧化亚铁硫杆菌并命名。氧化亚铁硫杆菌能氧化黄铁矿使其中固体 形态的硫转化为可溶性的硫酸根。此后人们又分离出氧化硫硫杆菌( t h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s ) ，包括嗜热硫叶菌( s u v o b a c i l l u s ) 、喜温硫杆菌( h a l l b e r ga n dl i n d s t r , 1 9 9 4 ) 和氧化亚铁钩端螺旋菌( l f e r r o o x i d a n s ) 等用于脱硫实验。8 0 年代后，国外开始把微 生物脱硫研究工作转向应用性研究和实验，并成立了一些公司，如美国a r t e c h 公司 和h a t t e l l e 公司。在此基础上，由欧共体资助，德国e s s e n 的d e u t s c h em o n t a n t e c h n o l o g i e ( d m t ) ，意大利c a g l i a r i 大学的采矿和矿物处理系、荷兰d e l f t 技术大学 和英国的实验室共同合作，在1 9 9 1 年意大利的e l l ic h e ma n i c 煤矿开展了浸出法 微生物脱硫的连续性中试研究( 康淑云，1 9 9 9 ) 。我国微生物脱硫的研究起步较晚， 华中农业大学硕士学位论文 近年来，一些实验室分离得到一些脱无机硫的菌种，如螺旋状专性化能自养铁氧化 细菌和中度嗜热嗜酸硫氧化杆菌，并做了分子水平的鉴定及发育分析( 刘缨等， 2 0 0 4 a ，b ) ；还有学者将分离得到的脱氮硫杆菌应用到有毒气体h 2 s 的脱硫中，研究 了脱硫菌生长的主要影响因素( 马艳玲等，2 0 0 4 ) ，这些工作都为脱硫菌种资源的开 发打下了基础。在煤炭及烟气( s 0 2 ) 的生物脱硫实验方面也做了很多尝试，取得一 些成果( 赵郁超等，2 0 0 2 ；周志付，2 0 0 2 ；邸进申等，2 0 0 3 ) ，但都还未能产业化应 用，而有关煤炭废弃物一煤矸石的生物脱硫还未见报道。 1 2 2 脱硫微生物一自养硫杆菌的生物学特性 氧化亚铁硫杆菌( t f , t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ) 和氧化硫硫杆菌( t t ，t h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s ) 是无机自养硫杆菌中研究和应用最为广泛的两种，分布于硫化矿床， 酸性矿水及土壤中。氧化亚铁硫杆菌是硫细菌中唯一能氧化亚铁的微生物，在微生 物湿法冶金( b i o h ) ，d r o m e t a l l u r g yo rb i o l e a e h i n g ) 领域一直受到很大的重视，特别适 合于从低品位的矿石中浸出和回收稀有贵重金属，有低成本、低能耗、无污染等特 点，是该领域罩应用最广用量最大的微生物。氧化硫硫杆菌是1 9 4 9 年美国科学家 l e a t h e na n dm a d i s o n 从犹他州宾厄姆峡谷矿水中分离得到的。它是一种具有很强的 氧化单质硫能力的化能自养细菌，也氧化部分还原的硫化物。 自养硫杆菌区别与其它异养微生物的特点有： 1 化能无机营养：靠氧化亚铁离子或单质硫及还原态的硫化物获能，依靠f e ” 氧化成f e ”或s o 氧化成s o ? 。或其他无机物的电子传递过程获得能量。无机物中的 能量是一种迟效能源，1 8 5 m o lv e 2 + 固定l m o l c 0 2 需要5 0 0 2k j 能量，能量利用率仅 在3 2 3 0 之问化能无机营养菌被认为是没有效率的，就是因为比其化能有机营 养菌，它的生长率低，代谢周期长( n e m a t ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 2 自养性：仅以空气中的c 0 2 为唯一碳源，吸收氮、磷、钾基本元素及m g 、 n a 、c a 、c o 等微量元素无机营养，合成菌体细胞，通常在特殊能源缺乏时，它们 不能在有机培养基上生长( 郑士民和颜望明，1 9 8 3 ) 。 3 嗜酸性：在酸性条件下最适生长，最适p h 在2 0 - - 2 5 之间( l e d u ce t a l 1 9 9 3 ) ， 在中性条件下无法生长。这两种有代表性的硫杆菌生长过程中的影响因素很多，大 部分研究集中在以下四个方面： 1 2 2 1 环境p h 值的影响 z f 氧化元素硫的过程包括微生物的细胞对元素硫粒子的附着，元素硫氧化成亚 硫酸盐及其它胞外代谢物，最后形成硫酸盐，这些位于细胞膜上的生化反应都会受 到p h 值的影响。z f 能在p h = l 9 相当宽的范围内氧化元素硫，然而只有在酸性范 围p h = l 5 内生长，在p h 6 0 ，微生物几乎是不生长的。因此z f 生长 的最适p h _ 2 o o 2 8 0 ( 姜国芳等，2 0 0 5 ) 。z f 在氧化亚铁及低价硫化物时环境的 p h 也能影响整个吸附和反应底物的化学状态，p e s i c 用氧化还原手段研究了p h 对生 6 华中农业大学硕士学位论文 长的影响，结果表明p h 在1 5 之间时，夏厂的生长不受影响，但如果p h 小于1 5 或高于3 5 将对生长有害。s m i t h 认为在p h 在1 9 - 2 4 之间适合生长，在p n 接近1 0 和4 0 时会受到强烈的抑制( n e m a t ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这两种细菌生长时的环境p h 值都 是强酸性的，都属于极端嗜酸类细菌。也发现过个别种有着对环境极端酸性p h 更 耐受或者生长p h 范围更大的不同表型，这是由于分离细菌生长的环境差异造成的， 推测这和细胞膜表面的特殊结构及通透性有关，也有研究认为z 厂最适p h 的差别和 可转座的d n a 有关系( s c h a r d e ra n dh o l m e s 。1 9 8 8 ) 。 1 2 22 环境温度 z f 和互厂都属于中等嗜温菌，在2 0 4 0 范围内都能生长，温度过高和过低都 会影响细菌的生长速度和氧化速度。z ，能够在7 5 0 的范围内保持活性，但它 的最佳生长温度是2 8 3 0 。在低于4 c 时z f 活性下降，而在5 0 8 0 时则 会引起细胞死亡( 姜国芳等，2 0 0 5 ) 。2 8 3 5 适宜互厂生长，正厂在3 3 生长最 为合适，再提高温度则亚铁氧化率会开始下降。最适温度和环境的p h 有相关性， 低的p h 环境会使最适温度也降低，在p h 为2 5 - - 3 5 时细菌生长的最高耐温能达到 4 5 ，但当p h 为1 5 时最高耐温只有3 5 ，分离菌株的不同，特性也有不同，h a r r i s o n 曾在铀矿中发现在5 c 下也能生长的z 力温度同样对细菌氧化低价化合物有影响， 在细胞内部发生的生化氧化所需要的基础能量代谢值要比短期的化学氧化要高得 多，高能值也意味着生化反应要限制在较低的温度，高温也会使生物体内各种氧化 酶系丧失活性，使细菌的新陈代谢系统受到破坏而死亡( l e d u ca n df e r r o n i ，1 9 9 4 ) 。 1 2 2 0 氧气和二氧化碳浓度 自养硫杆菌都是专性好氧的微生物，0 2 是电子氧化铁和元素硫的唯一的电子受“ 体，足够量的氧是硫杆菌生长的必要条件。z r 氧化元素硫的氧化率随0 2 的浓度的 增加而增加。在i - - 3 3 ，p h - 3 0 的条件下，氧气浓度大约为7 5 m g d m 3 1 0 m g m 3 ， z f 的生长达最佳状态，z f 的蛋白质浓度大于9 0 l ag m e 。当温度和p h 值都不在最 佳条件下时，z r 的蛋白质浓度随0 2 浓度变化不大( 姜国芳，2 0 0 5 ) 。溶解氧浓度少 于0 2 9 m g l 时会对可生长产生抑制，小于0 2 m g lt f 将停止生长。当t f 在5 0 0 m l 三角瓶中含有2 0 0 m l 培养液在2 4 0 r m i n 转速下培养时，0 2 浓度不再为限制性因素 ( s h r i h a r ia n dg a n d h , 1 9 9 0 ) 。 二氧化碳对自养细菌来说是唯一碳源，但并不是只要c 0 2 浓度越高细菌生长速 度也越快，c 0 2 对z f 影响分为三个阶段，当液体中的c 0 2 浓度从0 到4 0 6 0 m g d m 3 时，细菌氧化硫的速度和细菌的生长浓度都随着c 0 2 浓度的增加而增加，当细菌生 物量和氧化速度达到最大值之后，c 0 2 浓度的增加则会造成细菌氧化速度和生物量 的减少，当c 0 2 浓度从超过l o o m g d m 3 之后则对细菌生长和硫的氧化都没有影响 ( j a w o r s k aa n du r b a n e k , 1 9 9 7 ) 实验发现t f 生长所需要的最佳c 0 2 浓度为7 0 , - 8 ， 尽管最大的细胞生物量对应的浓度在这个浓度以上，但超过这个浓度会细菌的生长 会受到一定的抑制( b 姗na n dl u e c k i n g ，1 9 9 0 ) 。 7 华中农业大学硕卜学位论文 可以看出硫杆菌在生长过程中的0 2 、c 0 2 都是重要的影响因素，在实验培养和 工业应用时需要通过振荡、搅拌或者充气来获得空气中的0 2 、c 0 2 来生长，如果利 用硫杆菌进行浸堆氧化实验，从获取空气中的0 2 、c 0 2 来说是不能满足细菌的生长 需要的，因此所需要的时间会延长数倍，通常的堆浸实验的都长达数月甚至数年。 1 2 2 4 金属离子影响因素 z f 能从环境中催化氧化硫化矿使金属溶解，因此z f 能够在相当高的金属离子 浓度范围生长。但是高浓度的金属盐的存在会降低0 2 的转移率和胞外代谢物的去除 率，从而对z ，的生长产生毒性。任何高浓度( 2 0 0 r a m ) 的金属盐离子都会抑制z t 氧 化元素硫，一价金属阳离子k 、n a 对z f 氧化元素硫的抑制作用比二价金属阳离子 c u 、z n 、m g 对z f 的元素硫氧化率的抑制作用强，这可能是由于一价、二价金属阳 离子渗透压不同的原因陈博彦等人报道了不同重金属对z f 的生物毒性效应。在起 始p h = 4 0 ，菌体维持生物活性的最大可容忍金属临界浓度，c d 及c u 分别为 2 4 7 2 9 8 p p m 与3 0 0 3 5 0 p p m ：极低浓度的c d 及c u 即能产生显著的生长抑制及酸 化迟滞现象；另外发现z n 对z f 是毒性最低的金属，当其添加浓度至2 0 9 l 时才出现 明显的活性抑制现象，得出毒性序列为镉 铜锌( c h e ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 。这个结论同 有关z f 对金属离子的吸附作用的相关结果有一致性，l i u 等( 2 0 0 4 ) 研究发现t t 对z n ( i i ) 和c u ( 1 i ) 都有很强的生物吸附能力，溶液的初始p h 和温度对细菌的 吸附的能力有很大的影响，这和细菌在较低p h 状态下的质子化以及溶液中存在的 各种化学物质对细菌细胞壁的影响有关系，同时培养的温度升高也能显著增加细菌 的吸附能力，在p h 6 0 ，4 0 下，每克细胞干重平均能吸附1 7 2 4 m g 的z n ( i i ) ，相 对来说对c u ( i i ) 的吸附量只有3 9 8 4 m g ，两种金属的最佳吸附条件各不相同，当 两种金属同时加入时吸附量则都会减少，吸附特性的不同可能和细菌细胞壁上的特 殊的金属离子吸附位点有关。 形与zf 一样，溶液中金属浓度的增加会不同程度上影响细菌的氧化效率，t - f 耐受的铜、镍、砷、钴等金属离子的浓度相对高些，一般金属对z 厂毒性大小为a g 、 h g m o u c u 。l e d u c 和f e r r o n i 报道r f 能忍受8 0 2 0 0 m m c u 、1 6 0 m m n i 。2 0 0 1 年， m i s a m p s o n 和c v p h i l l i p s 报道了基底金属铜、镍、钴对正厂氧化能力的影响，毒性大 小的顺序是铜 镍钴。李洪枚和柯家骏( 2 0 0 0 ) 在一定条件下研究了c u 2 + 对正厂生 长活性的影响，发现c u ”使正厂生长活性下降，表现在细菌生长的停滞期和对数期均 较长，f e 2 + 的氧化速度较慢；经驯化后的z 厂在p ( c u 2 + 户2 0 3 0e v e 的培养基中生长 活性有提高，对f e 2 + 的氧化速率加快。金属对正厂的毒性主要受细胞的生理状态、矿 物的化学状态和细菌与周围环境相对作用的程度的影响：例如a s ( v ) 的毒性就比 a s ( i i i ) d , 。f e 升的浓度超过2 0 9 l 将阻止f e 2 + 的氧化，引起细胞的溶解( 乐长高等， 2 0 0 3 ) 。 8 华中农业大学碗十学位论文 1 2 3 自养硫杆菌脱硫机制研究 自从发现这类自养硫杆菌独特的氧化脱硫能力之后，其生物氧化机制就受到关 注，目前国内外有关自养硫杆菌脱硫机理的研究已有不少报道，不同研究者从生理 代谢、物理吸附，电化学、生物酶学、基因定位等各个方向探讨了其生物氧化机制， 但氧化过程中的具体细节至今仍然还不清楚，还有待深一步的研究。现分述如下： 1 2 3 1 硫氧化机制 硫杆菌的硫氧化系统的机制是类似的，氧化单质硫和含硫化合物的机制可归纳 为图i 1 所示。 舅i 孵 8 m ) s 匕s _ 双j - 搿) 产 图1 - 1 硫杆菌无机硫氧化机制 f i g1 - 1m e c h a n i s mo fo x i d i z i n gi n o r g a n i c s u l f u rb y t h i o b a c i l l u ss n p 图中可以看出硫代硫酸盐是单质硫生物氧化过程的中日j 产物，它是由反应s o + s 0 3 。一s 2 0 3 2 - 产生，总的反应式为：s o + 0 2 + h 2 0 h 2 s 0 3 ，由于该反应式需要氧，并将 0 2 中的2 0 结合入s 中，因此称该酶称为硫双加氧酶，也可称做硫氧化酶。硫杆菌在 好氧情况下氧化单质硫都是通过硫双加氧酶催化完成的( r o h w e r d e ra n ds a n d ， 2 0 0 3 ) 这个过程中，生成了硫代硫酸盐之后就进入生成亚硫酸盐循环，反应的副 产物是硫，以上这些氧化硫的途径中并没有发现铁离子的参与，这可以说明为什么 氧化硫硫杆菌能氧化单质硫却不能氧化亚铁离子的原因( s c h i p p e r sa n ds a n d ，1 9 9 9 ) 。 氧化亚铁硫杆菌在硫基质生长时其硫氧化酶催化反应需要有还原型谷胱苷肽( o s h ) 存在。从以亚铁基质上生长的氧化亚铁硫杆菌中纯化到一种性质独特的酶，即在好 氧条件下它依反应式( a ) 反应，而在厌氧条件下f 一+ 可以取代0 2 作为电子受体使硫发 生氧化。它的这种酶需要g s h ，被称为硫化氢f c 3 + 氧化还原酶( 何正国等，2 0 0 0 ) r o h w e r d e ra n ds a n d ( 2 0 0 3 ) 在总结了所有相关报道的基础上构件了嗜酸硫杆菌 属硫杆菌氧化单质硫的生化模型，如图1 2 所示。图中可以看出细胞外的单质硫( s 8 硫颗粒的晶体结构) 被细胞外膜上特殊的外膜结构固定住，以硫基的形式进入细胞 内，这个和硫氧化密切相关的外膜蛋白目| j 研究得还不是很清楚，硫基进入细胞内 后被细胞周质空间的硫氧化酶( s d o ) 氧化成亚硫酸，然后被亚硫酸氧化酶( s o r ) 氧化生成硫酸盐，这个氧化酶可能需要细胞色素( c y t ) 做为电子受体。因氧化单质 9 华中农业大学颈十学位论文 硫产生的6 个电子只有两个进入了呼吸链，整个由单质硫完全氧化成为硫酸的自由能 无法被全部储存，这样对细胞生长和硫的氧化来说似乎是不必要的能量浪费，开始 人们假设存在一种反向的亚硫酸还原酶，相关研究4 0 多年却只发现硫双加氧酶是硫 转化过程中唯一的酶，再没有发现其他的代谢途径，可以看出由亚硫酸盐氧化形成 硫酸盐的能量已对于细菌的无机生长足够了( l i s s e t t ee ta 1 。2 0 0 6 ) 图1 2 嗜酸硫杆菌属氧化单质硫的生化模型 f i g1 - 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