（微生物学专业论文）真菌smo406的种属鉴定及其木聚糖酶的分离纯化研究.pdf

山东大学硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：盥豸 日期：出生。b 占 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：嵫 导师签名 山东大学硕士学位论文 摘要 半纤维素的主要成分是木聚糖，它是地球上第二大可再生碳源。自然晃中能 降解半纤维素的微生物种类很多，它们都能分泌多种木聚糖酶。木聚糖酶可将木 聚糖降解成低聚木糖和木糖等小分子物质，它在生物转化、食品、饲料、医药、 能源、造纸、纺织等行业中有着广泛的应用，具有广阔的开发前景。 本文以实验室内保存的一株可高效降解木聚糖的真菌s m 0 4 0 6 为目的菌株。 经土豆培养基培养后，s m 0 4 0 6 菌落形态为：圆形，凸起，干燥，无光泽，呈深 绿色，反正面颜色无差别。扫描电镜观察发现，s m 0 4 0 6 的菌丝细长，分叉少， 无横隔，表面光滑，直径约o 8 1 5t a n ；分生孢子梗呈帚状分支，至少2 级以 上轮生，分生孢子从顶端脱落；分生孢子呈短棒状，单生，孢子直径l 2l i i i l ， 长4 6t a n 。s m 0 4 0 6 能降解纤维素和淀粉，明胶的液化不明显。经过1 8 sr d n a 和部分i t s 基因序列的比对，本文分离到的这株真菌与m y r o t h e c i u ms p 属同源性 达到9 9 ，故命名为m y r o t h e c i u ms p s m 0 4 0 6 ( 以后简称ms p s m 0 4 0 6 ) 。 同时，本文研究了利用ms p s m 0 4 0 6 液体发酵生产木聚糖酶的最佳条件： 2 麸皮为碳源，o 1 硫酸铵为氮源，5 0 0m l 三角瓶中装培养基1 0 0 m l ，接种量 为3 ，培养时间为6 天。在上述条件下，发酵液中木聚糖酶的酶活可达到8 9 6 i u n l l 。 取脱s p s m 0 4 0 6 发酵的粗酶液，经过离心，超滤，分子筛层析和阳离子交 换层析后，得到了一个分子量大约为4 8k d a 内切木聚糖酶。从分子量看，该酶属 于糖基水解酶家族1 0 。该酶的最适反应温度为4 5 ，最适反应p h 值为p h6 5 ，最 适反应时间是1 0r n i n ，k n 狮为8 3 3e , l ，v 。为8 3 3 o l g m i n 。酶在p 85 5 7 5 的缓冲体系内比较稳定，酶活可以保持在8 0 以上，在p h6 时最稳定。n a + 、 k | + 、l i + 、b a 2 + 、m n 2 + 、m g z + 、c a 2 + 等金属离子对酶活有促进作用； z n 2 + 对酶活 的作用不大；而c u 2 + 、f c 2 + 离子对酶活有很强的抑制作用。酶活达到一半时的 n a c i 浓度为0 8 2m o l l ；e d l a 对酶促反应的影响不大。 关键词：漆斑霉菌，木聚糖酶，发酵优化，酶学性质 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t x y l a n ，t h em a j o rc o m p o n e n t o fh e m i c u l l u l o s e ，i st h es e c o n da b u n d a n tr e n e w a b l e e n e r g ys o u r c ei nt h ee a r t h i ts e r v e sa st h em a i nc a r b o ns o u r c ef o rv a r i o u sk i n d so f m i c r o o r g a n i s m sw h i c hc o u l ds e c r e tas e r i e so fx y l a n o l y t i ce n z y m e s t h e s e x y l a n o l y t i ce n z y m e sa c ts y n e r g e t i c a l l yt oh y d r o l y z et h ex y l a nt ox y l o o l i g o s a c c h a r i d e a n dx y l o s e x y l a n o l y t i ce n z y m e sh a v ep o t e n t i a la p p l i c a t i o n si naw i d er a n g eo f i n d u s t r i a lf i e l d s ，s u c ha sc o v e r i n gb i o c o n v e r s i o n 、f o o d 、a n i m a lf e e d 、p a p e ra n d p u l p 、 e n e r g ys o u r c e s 、m e d i c i n e 、w e a v ee ta 1 i nt h er e s e a r c h , t h es t r a i nn a m e ds m 0 4 0 6 , w h i c hw a s p r e s e r v e di no u rl a b , c o u l d s e c r e th i g ha m o u n t so f e n d o - x y l a n a s ew i t hr e l a t i v e l yh i g ha c t i v i t yt o w a r d sx y l a mt h e c o l o n yo fs m 0 4 0 6i n c u b a t e di nt h ep o t a t om e d i u mp r e s e n t e dd a r kg r e e n , r o u n d ， b u l g y , d r y , l a c k l u s t e r t h eh y p h ao ft h es t r a i ns m 0 4 0 6w a ss l i g h t n e s s ，l i t t l ef o r k , n o d i a p h r a g m ，s m o o t hs u r f a c e ，a n di t sd i a m e t e rw a so 8 1 5l a nw i t hs c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e ；a n de o n i d i o p h o r es h o wb r o o ms h a p e ，a n ds p o r e sp u tf o r t hf r o mt h et o p o f i t t h es h a p eo f t h es p o r ea s s u m e ds h o r ts t i c k , i t sd i a m e t e rw a sl 2l a na n di tw a s 4 6f a ni nl e n g t h t h es t r a i ns m 0 4 0 6c o u l dh y d r o l y z et h ec e l l u l o s ea n ds t a r c h b u ti t c o u l d n tf l u i d i f yg l u t i n t h e18 sr d n aa n dp a r t i a li t ss e q u e n c e sw a sc l o n e d , a n dt h e p a r t i a lr e s u l t so ft h e1 8 sr d n as e q u e n c eo fs t r a i ns m 0 4 0 6a l i g n e dw i t ht h e1 8 s r d n as e q u e n c e so fan u m b e ro fm y r o t h e c i u ms t r a i n si nt h eg e n b a n k e m b l ，t h e s t r a i nh a dh i g hs i m i l a r i t y 谢t l lt h ef i l l 画m y r o t h e c i u ms p ，a n dt h e r e f o r ei tw a sn a m e d m y r o t h e c i u ms p s m 0 4 0 6 ( ms p s m 0 4 0 6f o rs h o r t ) a tt h es a m et i m e ，t h el i q u i ds t a t ef e r m e n t a t i o nm e d i af o rx y l a n a s ep r o d u c t i o nb y ms p s m 0 4 0 6w a so p t i m i z e d t h eo p t i m i z e dm e d i u mc o n t a i n e dw h e a tb r a n2 ： f n i - 1 4 ：h s 0 40 1 ：e a c h5 0 0m lg u l a rf l a s kc o n t a i n i n g1 0 0m lo fm e d i u m , i n o c u l u m s i z e3 a n dah a r v e s tt i m eo f6d a y s u n d e rt h e s eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s x y l a n a s o a c t i v i t yo f8 9 6i u m lw a so b t a i n e d b yc e n t r i f u g a t i o n 、u l t r a f i l t r a t i o n 、g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h ya n da n i o n - e x c h a n g e ，a ne n d o - x y l a n a s ei w r i t sp u r i f i e df r o mt h ec r u d ec u l t u r ef i l t r a t eo fm s p s m 0 4 0 6 t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ep u r i f i e dx y l a n a s ew a s a p p r o x i m a t e l y4 8k d a 2 山东大学硕士学位论文 a si t sm o l e c u l a rw a sm o r et h a n3 0k d a t h i sx y l a n a s eb e l o n g e dt ot h ef i of a m i l y t h e o p t i m a lp hf o rt h ex y l a n a s eia c t i v i t yw a s a tp h6 5 ，a n dt h ex y l a n a s e1w a so p t i m a l l y a c t i v ea t4 5 c f u r t h e r m o r e ，t h eo p t i m a lr e a c t i o nt i m eo f t h ee n z y m ea s s a yw a s1 0r a i n t h ee n z y m ew a ss t a b l eo v e rar a n g eo fp h5 5t o7 5 ，a n dt h ea c t i v i t yc o u l dk e e p u p w a r d s8 0 nw a sm o s ts t a b l e a t p h6 0 t h ea t l z y m er e a c t i o nf o l l o w e d m i e h a e l i s - m e u t e nk i n e t i c sw i t hk m a p po f8 3 3g la n dv 删o f8 3 3 o 垤m i n ，a s o b t a i n e df r o mal i n e w e a v e r - b u r kp l o t m e t a li o n st e s t e dw i t l ld e m e t a l i z e de n z y m e s u g g e s t e dt h a tn a + 、k + 、l i + 、m 矿、b a 2 + 、m n 2 + a n dc a 2 + a c c e l e r a t e dt h ea c t i v i t yo f t h ex y l a n a s e ；z n 2 + h a dl i t t l ee f f e c ti nt h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m e ；h o w e v e rc u 2 + 、f e 2 + w e r es t r o n gi n h i b i t o r w h e ng e t t i n gt h eh a l fa c t i v i t y , t h ec o n c e n t r a t i o no fn a c iw a s o 8 2m o l l e d t ah a dl i t t l ee f f e c to nt h ed e m e t a i l i z e de n z y n l e k e yw o r d s ：m y r o t h e c i u ms p ，x y l a n a s e ，f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n , e n z y m i c e h a r a c t e r i s t i e s 3 山东大学硕士学位论文 第一章研究背景 1 1 研究背景 可持续发展是指既满足现代人的需求以不损害后代人满足需求的能力。换句 话说，就是指经济、社会、资源和环境保护协调发展，它们是一个密不可分的系 统，既要达到发展经济的目的，又要保护好人类赖以生存的大气、淡水、海洋、 土地和森林等自然资源和环境，使子孙后代能够永续发展和安居乐业。全球可持 续发展战略的五大要点是：环境保护、能源开发、绿色贸易、清洁水源、发展援 助。可持续发展的核心是发展，即是在严格控制人口、提高人口素质和保护环境、 资源永续利用的前提下进行经济和社会的发展。 资源开发和环境保护是2 1 世纪人类面临的两大难题。煤、石油、天然气等 不可再生资源是目前人类能源消费的主要来源，随着它们的逐渐枯竭，人类发展 的形势日益严峻。同时经济的快速发展，给环境带来了灾难性的后果，温室效应、 空气污染、化肥农药的大量使用等等严重威胁着人们的健康。因此，寻找新的可 再生资源，减少环境污染成为目前很多科学家研究的重点。 纤维素和半纤维素是自然界中含量最多的可再生资源，大量存在于在植物纤 维中。我国的植物纤维资源非常丰富，每年至少有5 亿多吨农作物秸秆，4 0 0 多 万吨甘蔗渣，1 0 0 多万吨森林采伐加工剩余物。但是，这些资源长期未得到合理 的开发，除极少量用作饲料外，其余都被焚烧，这既浪费了巨大的可再生资源， 又造成了环境的严重污染。那么怎样来有效利用这些资源呢，自然界就给我们提 供了很好的工具一一微生物。自然界中存在着很多种微生物，它们都能分泌纤维 素酶和木聚糖酶等复杂的酶系。这些酶系能将植物纤维中的纤维素和半纤维素降 解成小分子物质，这一作用使得很多工业生产的高效环保和可持续发展成为可 能。因此，利用微生物技术高效转化纤维素以及半纤维素，来生产人类急需的廉 价燃料、饲料及其它化工产品，具有及其重要的意义和广阔的发展前景。 1 1 1 木聚糖 木聚糖是半纤维素的主要组成成分，是植物细胞中主要的结构多糖，约占细 胞干重的3 5 。是自然界中含量仅次于纤维素的第二类多糖物质，约占地球上可 4 山东大学硕士学位论文 再生碳源的三分之- - 1 。木聚糖是以木糖单元通过b 1 ，4 d 毗喃木糖苷键连接 作为主链的多聚糖。侧链上连着多种不同大小的短小的取代基( 如图1 1 所示) ， 主要有0 乙酰基、4 - 0 一甲基- d 一葡萄醛酸残基、l - 阿拉伯糖残基等【2 】。因为短小 取代基的不同木聚糖可以分为线性均一木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡萄木聚糖、葡 萄阿拉伯木聚糖等。 木聚糖、纤维素、木质素是植物细胞壁中最主要的多聚体结构【3 】。在细胞 壁结构中，三种组分通过共价键和非共价键彼此相互结合，而这种结合在很多情 况下是通过木聚糖的短小取代基来实现的。木聚糖主要存在于植物细胞的次生壁 中，位于木质素和纤维素之间，对纤维聚合体和植物细胞壁的完整性起到非常重 要的作用【4 】。 一 不同植物所含的木聚糖多少也是有差别的，一般硬质木材中所含木聚糖比软 质木材中多，硬质木材中能占干重的1 5 3 0 ，而软质木材中只占到7 1 0 。 硬质木材的木聚糖是以o 乙酰- 4 o 甲基葡萄糖醛木聚糖形式存在的，软质木材 是以阿拉伯- 4 o 甲基葡萄糖木聚糖醛木聚糖形式存在。硬质木聚糖的聚合度 ( 1 5 0 2 0 0 ) 要远高于软质木聚糖的聚合度( 7 0 1 3 0 ) 。谷类的木聚糖是由d 一葡萄糖醛酸构成( 或者4 o 甲基或阿拉伯糖基化) 。另外，在一些一年生植物， 如小麦、甘蔗、棉花的子壳中，木聚糖的含量非常高，可达到3 0 以上。由于一 年生植物中胚乳阿拉伯木聚糖( 又称戊聚糖) 分支结构的存在，它在水和稀碱溶 液中的溶解度要远远高于来自木质纤维中的木聚糖，这就为我们筛选木聚糖酶发 酵的底物来源做好了铺垫 5 ，6 】。 1 1 2 木聚糖酶的结构及特性 木聚糖酶是一种糖基水解酶( 0 - g l y c o s i d eh y d r o l a s e s ：e c3 2 1 x ) 。它能水 解木聚糖内的b 1 ，4 - d 木糖苷键。它们在自然界中广泛存在，大量的生物体都 能产生这种酶，包括细菌、真菌、红藻、原生动物、软体动物和节肢动物等。该 酶在1 9 5 5 年才第一次被报道，开始时被称为p e n t o s a n a s e s 。在1 9 6 1 年被编入蛋白 库( e c3 2 1 8 ) ，才被i n t e r n a t i o n a lu n i o no fb i o c h e m i s t r ya n dm e l o e u l a r b i o l o g y ( i u b m b ) 承认。它们的公用名为内切一1 ，4 - 8 - 木聚糖酶，通常也称木聚糖 酶，内切木聚糖酶 7 ，8 】。 山东大学硕士学位论文 木聚糖结构的复杂性，使得木聚糖的完全降解需要木聚糖酶系的共同作用来 完成。主要分工是：内切l ，4 1 3 - d - 木聚糖酶( 1 ，4 - 1 3 一d - x y l a n o h y d r o l a s e ： e c 3 1 2 8 ) 主要切开木聚糖的主链；旺l 呋喃阿拉伯糖苷酶 ( a l a r a b i n o f u r a n o s i d a s e ：e c 3 2 1 5 5 ) 、c t - d - 葡萄糖醛酸酶( a d g l u c o n i d a s e ： e c3 2 1 1 3 9 ) 、乙酰木聚糖酯酶( a e e t y l x y l a ne s t e r a s e s ：e c3 1 1 7 2 ) 、阿魏酸酯 酶( f e r u l i ca c i de s t o r a s e s ：e c3 1 1 7 3 ) 、和酚酸酯酶( p - c o u m a r i ca c i de s t e r a s e ： e c 3 1 1 - ) 等酶将内切酶产生的木寡糖和木二糖上的侧链切掉 2 2 - 2 6 ；1 3 - d 一木糖 苷酶( 1 ，4 - 1 3 d x y l a n x y l o h y d r o l a s e ：e c3 2 1 3 7 ) 从切掉侧链的木寡糖和木二糖 的非还原性末端酶切产生木单糖【9 1 0 】。主要的酶切位点如图1 1 所示【1 3 ，1 4 】。 i 一 f i g1 1 ( a ) s t r u c t u r eo f x y l a na n dt h es i t e so f i t sa t t a c kb yx y l a n o l y t i ee n z y m e s ( b ) h y d r o l y s i so f x y l o - o l i g o s a e e h a r i d eb yb - x y l o s i d a s e 微生物往往能产生多种类型的木聚糖酶，而且这些木聚糖酶的特性也存在很 大差异。像最典型的产木聚糖酶的微生物a s p e r g i l l u s n i g e r ，能够产生1 5 种胞外 木聚糖酶，t r i c h o d e r m av i r i d e 能够产生1 3 种木聚糖酶 1 1 】。造成这种多样性的 原因很多：或者是不同基因的产物，或者是由于微生物分泌的蛋白酶的水解作用； 或者是由于不同程度的修饰作用如糖基化、酰胺化和聚合等 1 2 1 。 像纤维素酶一样，木聚糖酶也是由许多不同功能的结构域构成的，除了具有 多个催化结构域外，还有木聚糖结合结构域、纤维素结合结构域、 c e l l u l o s o m e d o c k i n g 结构域、热稳定结构域和一些功能未知的结构域【1 5 】。 6 b 世 山东大学硕士学位论文 ( 1 ) 催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) 。它是木聚糖酶分类的基础，承 担着酶的水解特性。木聚糖酶的氨基酸组成在数量上变化很大，但是其c d 在大 小上都趋于一致 2 2 】。通过三维结构分析、同源性比较和突变酶性质的分析表明， 木聚糖酶的作用机制可能是广义的酸碱催化机制，谷氨酸和天冬氨酸残基起到催 化残基的作用，它们与空间位置相近的其他极性氨基酸残基互相作用，维持两个 催化残基的离子状态及产物中间体的稳定性，维持酶的催化活性 2 3 1 。一般木聚 糖酶只含有一个催化结构域，但是也有例外，如生黄瘤胃球菌( r u m i n o c o c c u s f l a v i f a c i e n s ) 的x y n an 末端含有属于g 组木聚糖酶的c d ，而c 末端含有属于f 组 木聚糖酶的c d 2 2 1 。木聚糖酶与纤维素酶的c d 几乎没有同源性，表明两个酶是 从不同的祖先进化而来的 2 1 1 。一一 + ( 2 ) 纤维素结合结构域( c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i n ，c a d ) 。它在许多木聚糖 酶分子中也存在，它在功能和氨基酸组成上与纤维素酶分子中的c b d 相似 1 6 ， 1 7 。虽然c b d 对催化功能不是必需的，但它可以调节酶对可溶性和不溶性纤维 素底物的特殊活力 2 1 1 。 ( 3 ) 木聚糖结合结构域( ( x y l a n - b i n d i n gd o m a i n ，x b d ) 。目前对它的研究 较少，它可使酶与底物相接近，从而使木聚糖更有效地被降解。与c b d 相比， 在木聚糖酶分子中较少发现。其原因可能是，木聚糖多聚物中带有许多类型的取 代基，从而使形成能够结合所有类型木聚糖的进化成为不可能。到目前为止，唯 一的一个含有能与木聚糖特异结合的木聚糖酶是由粪肥纤维单孢菌产生的 x y n d ，x y n d 中的x b d 对木聚糖的结合有高度的特异性 1 5 ，2 4 。 ( 4 ) 热稳定结构域( ( t h e r m o s t a b i l i s i n gd o m a i n ，t s d ) 。并不是在所有的木 聚糖酶中都存在，只是在相应的嗜热和耐热的木聚糖酶中存在。现已发现有2 2 种含有多功能区域的耐热木聚糖酶含有t s d ，其中1 6 种的t s d 在n 末端( 3 种单一 区，1 2 种一前一后和一种含有3 个区) ，5 种含有单一c 末端热稳定区，只有1 种 含有中间和n 末端t s d 。值得注意的是含有n 末端t s d 的1 6 种木聚糖酶都属于f i o 族，而4 种含有单一c 末端t s d 的木聚糖酶为( 3 11 族中温木聚糖酶。因而有人认为 ( 3 11 族木聚糖酶本质上更耐热，不像第f i o 族木聚糖酶需要通过折叠方式而使它 们相对容易进化为嗜热酶【2 3 】。据报道，f 族中的解糖高温厌氧杆菌产生的x y n a 在n 末端有重复区( d l a 和d l b ) ，该区域可提高相应酶的最适作用温度。对该区域 7 山东大学硕七学位论文 基因的删除突变表明，该酶的活性不变，但是热稳定性丧失。对其它类似的木聚 糖酶的突变结果也是一致的，因此推断n 端的重复有利于蛋白抵抗热变性【2 0 】。 ( 5 ) c e l l u l o s o m e d o c k i n gd o m m n 。许多厌氧的降解纤维素的细菌产生的纤 维素酶和木聚糖酶聚集成与细胞壁相连的四级结构复合物称为c e l l u l o s o m e ，它可 将细菌细胞吸附于纤维素物质，使其迅速降解，并使菌体细胞快速有效地吸收水 解产物f 1 8 ，1 9 1 。 通过对木聚糖酶各个结构域的了解，利用分子生物学的手段，可以改造出工 业生产所需要的木聚糖酶。目前，已经分离到数量不少的木聚糖酶基因，并在大 肠杆菌中表达。其中细菌来源的木聚糖酶克隆较多，而真菌来源的木聚糖酶克隆 较少。一般在大肠杆菌中表达量要比在亲本中低，并且表达的产物限制在细胞质 内或周质腔内，很难从培养基中分离出来【2 l 】。后来好多科学家尝试利用分泌型 的芽孢杆菌、链霉菌、曲霉等作为生物反应器 1 0 3 】。2 0 0 5 ，l i l ye u r w i l a i c h i t r 等 把a s p e r g i l l u st e r r e u s ( b c c l 2 9 ) 中的一个木聚糖酶1 0 的基因成功地在p i c h i a p a s t o r i s 表达并分离纯化出来。通过对表达产物酶学性质地研究，该表达型的 木聚糖酶分子量为3 3 k d a ，酶活稳定性较高，具有工业开发地潜力 2 5 1 。 大多数微生物产生的木聚糖酶都是单亚基蛋白，分子量在8 1 4 5 k d a 之间， 等电点在3 1 0 之间。绝大多数木聚糖酶的最适p h 范围是4 7 ，p h 稳定范围是 3 1 0 ，最适反应温度4 0 7 5 c 2 1 。通常细菌可产生两种木聚糖酶：低分子量 的碱性木聚糖酶和高分子量的酸性木聚糖酶，而真菌通常只产生低分子量的碱性 木聚糖酶。连霉菌( 放线菌) 也一般产生两种木聚糖酶：低分子量木聚糖酶( 2 0 2 7 k d a ) 和高分子量木聚糖酶( 3 0 5 5 k d a ) ，一般最适p h5 5 8 0 ，最适温度5 5 6 5 【1 2 】。然而，也有一些木聚糖酶的最适反应条件是在极端的温度或p h 条件下。已报道过的木聚糖酶的反应温度范围是5 1 0 5 ，p h 的范围是2 1 1 ， 最高的耐盐量达至1 j 3 0 的n a c i 3 ，2 6 3 1 。在这些极性研究中，耐热，耐碱和耐 酸的木聚糖酶已经有比较多的研究，而耐冷的木聚糖酶研究的较少。 1 1 3 木聚糖酶的分类 以前，根据木聚糖酶的理化性质，w o n g 将其分为两大类：一种是小分子 量( m w 3 0 山东大学硕士学位论文 k d a ) ，p l 偏酸性( 主要为f 1 0 家族) 【3 2 】。可是，后来发现有好多现有分离出 的木聚糖酶不能按照此方法来进行分类。后来，又引进了一个更完整的分类方式， 它不仅可以对木聚糖酶进行分类，而且能对所有糖苷酶进行分类，现在已经成为 这些酶分类的标准。它的分类依据是水解结构域的基本结构和各种酶相关基因的 比较【3 3 】。到现在为止，已经发现了9 6 个糖苷水解酶家族。在这个分类系统中， 木聚糖酶主要存在于1 0 和1 1 家族中，后来发现在5 、7 、8 和4 3 家族中也有木 聚糖酶的存在 3 4 3 8 。它们的一些特性如表1 1 和图1 2 所示： t a b l e l 1g l y e 吲d eh y d r o l a s ef a m i l i e sc o n t a i n i n ge n z y m e sw i t had e m o n s t r a t e da c t i v i t yo i lx y l a t l t h e f o l d ，m e c h a n i s mo f a c t i o n a n dc a t a l y t i cr e s i d u e sc h a r a c t e r i s t i c t o e a c h f a m i l y a r e g i v e n 1 3 9 山东大学硕士学位论文 懿锄碜罐 f a m i l y5 f a m i l y8 f a m i l yi 0f a m i l yl i 鬻驽仰翘戳 f a m i l y 7 f a m i l y4 3 f i g 1 2 r e p r e s e n t a t i v es t r u c t u r e so f e n z y m e sf r o mv a r i o u sg l y c o s i d eh y d r o l a s ef a m i l i e s 1 3 ( a ) s m l 咖心o ft h ef a m i l y5n l z y m e , x y n a 1 3 9 1 c o ) s t r u c t u r eo ft h ef a m i l y8x y l a n a s e ，p x y l 4 0 】( c ) s t r u c t u r eo ft h ex y l a n a s es h o w i n gt h et y p i c a lf a m i l y1 0 - f o l d 4 1 】( d ) s t r u c t u r eo ft h e f a m i l y l i x y l a n a s es h o w i n gt h et y p i c a lf a m i l y 11 - f o l d 4 2 】( e ) s t m e t u r eo ft h ef a m i l y7 n o n - s p e c i f i ce g l 4 3 】( f ) s 仇i c t u r eo f t h ef a m i l y4 3a - l - a r a b i n a a a s e 【“】 ( 1 ) 第5 家族的木聚糖酶，它们都只有7 个氨基酸残基，其中包括亲核残 基和弱酸或碱性残基，并且在所有成员中都是严格保守的。它们没有很明显的底 物特异性 1 3 ，3 9 。主要的八种木聚糖酶来源于表1 2 中的所列菌株。 t a b l e2 2o r g a n i s m sp r o d u c i n gf a m i l y5e n z y m e sw i t had e m o n s t r a t e da e t i v i t i o nx y l a a o r g a n i s m p r e v o t e l l a ( b a c t e r o i d e s ) r u m i n o c o l a2 3 c l o s t r i d i u mc e l l u l o v o r a n s f i b r o b a c t e rs t l c c 饥o g e n e ss 8 5 r u m i n o c o c c u sa b u ss y 3 t r i c h o d e r m ar e e s e i ( h y p o c r e a j e c o r i n a ) e r w i n h 7 ( p e c o b a c t e r i u m ) c h r y s a n t h e m id 1 e r w 加i a ( p e c o b a c t e r i u 剜c h r y s a n t h e m is r l 2 0 a a e r o m o n a sp u n c a t a ( c a v i a e ) m e 一1 ( 2 ) 第8 家族中的主要有4 种木聚糖酶，其中三种来自于b a c i l l u s ，另一种来 自于北极洲的细菌p s e u d o a l t e r o m o n a s h a l o p l a n k t i s t a h 3 a ( 如表1 3 所示) 。它们 1 0 山东大学硕士学位论文 的分子量都比较大( 4 5 4 6k d a ) ，p i 偏碱性( 大约在p h9 5 左右) ，酶活的最 适p h 大约在6 5 左右。底物特异性较强，跟第l l 家族中木聚糖酶的相似处在于 它们都有至少6 个木糖结合结构域，而且水解位点位于中f 司 1 3 ，4 0 。 t a b l e1 3 0 r g a n i s m sp r o d u c i n gf a m i l y8e n 巧m e s o r g a n i s m b a c i l l u sh a l o d u r a n sc 1 2 5 b a c i l l u sh a l o d u r a n sm i r 3 2 b a c i l l u ss p k k - 1 p s e u d o a l t e r o m o n a sh a l o p l a n k t i st a h 3 a ( 3 ) 第1 0 家族中主要的木聚糖酶是e n d o - l ，4 - 1 3 - x y l a n a s e s 和e n d o 。1 ，3 b x y l a n a s e s 3 2 。底物特异性显示它们不只对木聚糖有活性，还能水解小分子量的 纤维素、a r y l 纤维二糖和纤维寡聚糖 4 1 】。一两个葡萄糖代替木糖就能抑制该家 族木聚糖酶的活性，从而导致了该家族酶的低水解效率。它对较短的木寡糖有很 高的活性，说明它们有小分子底物结合结构域 1 3 】。它们都具有较大分子量和酸 性等电点，有四或五个底物结合结构域 3 2 1 。它们主要的来源如表1 4 所示。 t a b l e l 4o r g a n i s m sp r o d u c i n gf a m i l y1 0c n z y m g , s o r g a n i s m c e l l u l o m o n a s ef u ，删 c e l l u i b r i ol a p 伽i c z 岱 c e l l u i b r i om i x t u s c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u mn c i b1 0 6 8 2 g e o b a c i l l u ss t e a ro t h e r m o p h i l u st - 6 p e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m u mb t 2 2 4 6 s t r e p t o m y c e sh a l s t e d i ij m 8 s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s s t r e p t o m y c e so l i v a c e o v i r i d i se 8 6 t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u s ( 4 ) 第1 1 家族中只含有木聚糖酶，它们对含有d 木糖的底物有专一的活性， 它们都是低分子量和等电点偏碱性的蛋白，并且有两个双置换水解机制【1 3 ，4 2 。 它们的主要来源如表1 5 所示。 t a b l e l 5o r g a n i s m sp r o d u c i n gf a m i l y1 0 纠m 嚣 山东大学硕士学位论文 o r g a n i s m a s p e r g i l l u sk a w a c h i i a s p e r g i l l u sn i g e r b a c i l l u sa g a r a d h a e r e n sa c l 3 b a c i l l u sc i r c u l a n s b a c i l l u ss u b t i l i sb 2 3 0 b a c i l l u ss u b t i l i ss u b s p s u b t i l i ss t r 16 8 c h a e t o m i u mt h e r m o p h i l u m d i c t y o g l o m u st h e r m o p h i l u mr t 4 6 b 1 n o n o m u r a e al l e x u o s a p a e c i l o m y c e sr a t i o t ib a i n i e r s t r e p t o m y c e ss p $ 3 8 刀陀r m o m y c e sl a n u g i n o s u s t r i c h o d e r m ah a r z i a u me 5 8 ( h y p o c r e al i x i ie 5 8 ) t r i c h o d e r m ar e e s e i ( h y p o c r e a j e c o r i n a ) ( 5 ) 第7 和第4 3 家族中的木聚糖酶研究的还很少，很多特性还不是很清楚。 1 1 4 木聚糖酶的应用 木聚糖酶作为单一酶制剂在国际市场上排第7 位，约占总销售额的1 0 。木 聚糖酶、纤维素酶和果胶酶共占世界酶制剂市场的2 0 左右。世界上仅有几个国 家工业化生产木聚糖酶，他们是日本、芬兰、德国、爱尔兰、丹麦、加拿大和美 国。木聚糖酶的主要生产菌株有：真菌有黑曲霉、木霉( t r i c h o d e r m as p ) 和 h u m i c o l ai n s o l e n s ，细菌主要是芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 。木聚糖酶的工业化应 用始于上世纪8 0 年代，最初应用于饲料，而后扩展到食品、纺织和造纸工业。近 年来，木聚糖酶在制浆造纸、食品、饲料等行业都有广泛的应用，特别是制浆造 纸工业是应用木聚糖酶最多的行业【1 2 】。在食品行业主要是果汁和葡萄酒的澄 清、香料和色素的提取、植物油和淀粉的生产、面团改良剂及功能性低聚木糖的 生产等。 ( 1 ) 木聚糖酶在饲料工业中的应用 我国的各种农副产品，由于利用率低，至今未被很好地在饲料方面进行开发 利用。这在一定程度上与含有抗营养因子有关，这种抗营养因子主要是戊聚糖。 戊聚糖的主要成分是木聚糖和阿拉伯木聚糖，一般而言，水溶性的木聚糖和阿拉 伯木聚糖的含量是与单胃动物生产性能密切相关的，因为一般单胃动物肠道内没 山东大学硕七学位论文 有分解这种戊聚糖的酶，而这种水溶性的戊聚糖易在肠道内形成较高的粘度，阻 止肠道消化液与食糜的充分混合，从而阻止蛋白质、脂肪的消化吸收，降低饲料 的转化率。同时高粘度的食糜将通过改变肠细胞转换速率、内源性酶合成速率、 微生物区系及球虫数量来影响生产性能，而且使动物的粪湿粘稠，易生肠道瘤病， 还对环境产生不利的影响 4 8 1 。在这种含有戊聚糖极高的谷物或其副产品作饲料 基础日粮时，添加含有分解这种戊聚糖的酶木聚糖酶可以显著减轻或改善这 一问题【4 6 】。在日粮中添加木聚糖酶可以降低畜禽肠道内容物的黏度，提高内源 性消化酶的活性，减少肠道有害微生物数量，降解植物细胞壁结构，促进营养物 质消化吸收，降低环境污染物质排泄，改善动物生长性能 4 7 ，4 9 。 然而，木聚糖酶要经济高效的广泛应用于饲料工业应具备一定条件。动物肠 胃中的p h 条件是不一样的，因此要求饲用木聚糖酶在p h 较广的范围内能保持 较高的活性。对于动物来说，食物停留时间最长的地方是在小肠中，而小肠的p h 是偏中性的，因此偏中性的木聚糖酶可以在动物进食中保持长时间的作用，增加 酶对饲料的处理效果1 5 1 1 。另