（微生物学专业论文）有机磷农药降解菌的筛选及降解特性研究.pdf

沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 有机磷农药的广泛使用造成的环境和食品污染，已直接威胁人类的生存和环境的可 持续发展，并成为发达国家设鬣绿色贸易壁垒的莺要手段，因此寻求降解有机磷农药的 方法，消除其引起的污染问题势在必行。 从长期受有机磷农药污染的土壤里采集土样，进行富集培养，分离筛选能降解有机 磷农药的细菌。采用分光光度法对所得到的有机磷农药降解菌的降解能力进行了测定， 其中菌株m 一5 和m 一1 5 降解率较高，降解率分别为7 0 4 和7 6 5 。对菌株的个体形态、 生理生化特点进行了分类研究，初步鉴定为m 一5 菌株为邻单胞菌属( p 膪s f 0 珊o ”甜s p ) ， m 一1 5 菌株为芽胞杆菌属( b 们f ss p ) 。研究表明，菌株m 一5 和m 1 5 能有效降解甲胺磷， 同时对敌敌畏、乐果也有较好的降解能力，菌株 f 一5 对敌孜畏、乐果的降解率分别为 7 3 5 、7 1 3 ，菌株m 一1 5 对敌敌畏、乐果的降解率分别为6 7 2 、6 4 1 ，表明菌株m 一5 和m 一1 5 具有广谱降解有机磷农药的能力。 测定菌株m 一5 和m 1 5 生长曲线和其对甲胺磷的降解曲线，发现甲胺磷降解曲线趋势 类似于菌株的生长曲线，说明菌体生长越旺盛，产生降解农药的酶量就越大。降解有机 磷农药的效果也就越好。对菌株m 一5 和m 一1 5 的生物学特性研究表明，菌株卅5 在4 0 0 n m 处有吸收峰，m 1 5 在4 2 0 n m 处有吸收峰；菌株m 一5 和m 一1 5 在发酵过程中的代谢变化规 律为：p h 在0 2 4 h 期间变化不大，之后呈下降趋势：还原糖一直呈下降趋势：氨基氮 呈先上升后下降趋势。 对菌株m 一5 和m 1 5 的培养条件和外加碳氮源对其有机磷农药降解率的影响进行了 研究，结果表明，菌株m 一5 的最佳培养条件为：温度3 7 ，摇床转速2 0 0 r m i n ，接种 量4 ( v v ) ，菌株m 一5 的最适外加碳源是麦芽糖，最适外加氮源是蛋白胨。菌株m 一1 5 的最佳培养条件为2 8 ，摇床转速2 0 0 r m i n ，接种量3 ( v v ) ，菌株m 1 5 的最适外加 碳源是葡萄糖，最适外加氮源是蛋白胨。 选择碳源、氮源、装液量、p h 四个因素进行正交试验，结果表明，碳源、氮源、装 液量、p h 四个因素对菌株甲胺磷降解率的影响都极显著( f 值 f o 0 1 ) 。菌株忙5 降解 甲胺磷的最优条件为p h 7 5 、装液量1 0 0 m l 5 0 0 m l 、麦芽糖0 2 、蛋白胨o 5 ，在这一 条件下菌株m 一5 的甲胺磷降解率为8 4 9 。菌株m 一1 5 降解甲胺磷的最优条件为p h 6 5 、 装液量1 0 0 m l 5 0 0 m l 、葡萄糖o 3 、蛋白胨o 4 ，在这一条件下菌株m 1 5 的甲胺磷降 解率为8 9 1 。 辆要 通过试验表明菌株赫一1 5 降解有机磷农药的能力稍好予菌株醚一5 ，因此选择菌株赫一1 5 逃行应用试验，结果表明菌株m 1 5 对土壤中的甲胺磷具有很好的降解作用，培养3 d 后 瓣自然壤中甲胶磷蛉隆鳃率达到6 7 。l 薨。 关键词：有机磷农药，甲胺磷，降解菌，筛选，鉴定，生物学特性，降解特性 2 沈阳农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t o 喈a n o p h o p h a t ep e s t i c i d e sa r eh i g m yt o x i ca n dw i d e l yu s e df o ri n s e c t sc o n t r o li nm a n y c o 吼丽e s h o w c v e r ，t h c s ep c s t i c i d e sa l s oc a l l s es e r i o u sp r o b l e m st o ( h ee n v i r o l l l t l e n ta n df o o d s a f c t y h o wt os o l v et h ep m b l e m h a sb e c o m ea p u b l i cc o n c e m i th a sb e e nk n o w nt l l a to 唱a n o p h o p h a t ec a i lb em i n e r a l i z e db ys o m em i c m o r g a j l i s m s n l e s t r a i n so fo 唱a i l o p h o p h a t e - d e g r a d i n gw e r ei s o l a l e df 如mt h ep o l l u t e ds o i l ，t h e r cw e r c2 0 s 仃a i n sc a l lg m wi no 唱a n o p h o p h a t ec u l t u r es o l u t i o na f t e rs c r c e n i n g n l eo r g a n o p h o p h a t e d e g r a d a t i o n r a t c so ft h c2 0s t r a i n sw e r em e n s l l r a l e db yu vs p e c t r o p h o t o m e 吼t h e o 唱a n o p h o p h a t ed e 伊a d a t i o nm t e so fs t r a i l l sm 一5a n dm 一1 5w e r eh i g h e rt h a no t h e r s ，t h e yw e r e 7 0 4 ，7 6 5 r e s p e c t i v e l ys t u d yo nt h c i rp h y s i o l o g i ca l l db i o c h e m i c a la n a l y s i sp r o v e dt h a t t h e y 盯e 口叩j f 船s p a 1 1 d 用8 占j d 肌。打黜s p t h e yc 柚d e g r a d en o to n l ym e t h a m i d o p h o sb u ta l s o p a r a t h i o na i l dd i m e m o a t ee 丘、e c t i v e l ya sw e l l t h eg r o 州ha i l dd e g r a d a t i o nc u r v es h o w c dt h a tt h e 柳oc u r v et r e n d sw e r es i m i la r t h e d e g r a d a t i o no fm e t l 姗i d o p h o sw a sa n r i b u t e dt ot l l ee m 叮m ep r o d u c e di nt h eg r o 、v t hp e r i o d s t u d yo nt l l e i rm e t a b o l i cc h a m c t e r i s t i c sp r o v e dt h a tt h e i ra b s o r b i n gw a v e l e n 昏ha r e4 0 0 m a n d4 l o n mr e s p e c t i v e l y t h e i rp hv a l u ed o s en o tc h a n g ei n0 2 4 h o l l r s ，t h e nd e c r e a s e s ；t h e r e d u c i n gs u g a rc o n c e n t r a t i o nd e c r e a s e s ；t h e 锄i n o n i 乜d g e n c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s et h e n d e c r e a s e si nt h ec o u s eo f p e 衄e n t s t u d yo nc u l t l l r ef a c t o r s ，a d d i t i o n a lc a r b o ns o u r c ea n da d d i t i o n a ln i t r o g e nw h i c ha f r e c tt l l e d e g r a d a t i o no f t w os t a i n s ，i tp r o v e dt h a tt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei s3 7 ，t 1 1 eo p t i m u m r o t a t e s p e e di s2 0 0 r m i n ， t h eo p t i m u mi n o c u l a t i o nc o n c e n t r a t i o ni s4 ，t h eo p t i m u ma d d i t i o n a l c a r b o ns o l l r c ei sm a l t o s eo p t i m u ma d d i t i o r m ln i t r o g e ns o u r c ei sp e p t o n ea sf o rs t a i no fm - 5 ； t h co p t i m u mt e m p e r a t l l r ei s2 8 ，t h eo p t i m u mr o t a t cs p e e di s2 0 0 r m i n ，t h eo p t i m 啪 i n o c u l a t i o nc o n c e n 仃a t i o ni s3 ，t h eo p t i m u ma d d i t i o n a lc a r b o ns o u r c ei sg l u c o n a t e ，o p t i m u m a d d i t i o n a ln i t r o g e ns o u r c ei sp e p t o n ea sf o rs t a i no f m - 1 5 p o u r c ds o l u t i o n 、p h 、c a r b o ns o u r c ea n dn i t r o g e ns o u r c ea r es e l e c t e da st h ef a c t o r so f o r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h er e s u l t si n d i c a t et h a t t h e s ef o u rf a c t o r sc a nr c m a r k a b l ya f i 、e c t d a g r a d a t i o n so ft 、v 0 s t a i l l se 虢c t i v e l y o p t i m u mo r g a n o p h o p h a t e d e g r a d a t i o nc o n d i t i o n so f s t a i nm 一5a r e p h 7 5 ，p o u r e d s o l u t i o n l o o m l ，s u c r o s e c o n c e n t r a t i o n o 2 ，p e p t o n e 3 昼鳖! 坠一 c o n c e n t r a t i o n 0 5 a n do p t i m u mo 耀a i i o p h o p h a t e 埘e g r a d a t i o nc o n d i t i o no fs t a i nm 1 5a r e p 6 5 ，p o u r e ds o l u t i o n l o o m l ，西u c o n a t ec o n c e n t r a t i o n0 _ 3 ，p e p t o n ec o n c e m r a t i o n o 4 ，t h e i r o r g a n o p h o p h a t e 。d e g r a d a l i o na r e8 4 。9 巍n d8 9 ，1 主nt h eo 嚣i m u 黻o r g 戤辩砖。蛹毪耄e * g 融 d a t i o nc o n d i t i o nr e s p e c t i v e l y o 玛器n o 痨。曲a 戋e - d e 辨d a l i o 拄o f 泰1 5i sh i 醢毂壕黼囊敷o fm 5 。蘩l es 协遍o f 氛重- 1 5 廷 l e c t e df o rt h ea p p l i c a t i o nt e s t i “sp r o v e dm a ts t a i no f m 1 5c a nd e g 趣d e m e m a m i d o p h o si n 诹es o i le 瓣c l l ya n di 毽m 确a m i d o 曲o s d e g f a d a 畦o nr a t i oi s6 7 1 疆e r3d a y s 1 。 ( 1 4 ) 3 7 水浴3 0 m i n 。 1 2 。4 。21 6 s r 溅矗扩蹭 方法一( 用提取的基因组d n a 作为模版进行扩增) 辩解蓠1 6 s r d 敞朗瓮r 扩增弓| 瀚： 5 端日l 物为5 a g a g t t ，r g a t c c t g g e t c a g 3 ( e s c h e r i c h i ac o l ib a s e s8t o2 7 ) ， 3 端弓i 物为5 一t a c c t t g t t a c g a c t t 3 ( e s c h e r i c h i ac 0 1 ib a s e s1 5 0 7t o1 4 9 2 ) 。 扩增反威体系为： l o t a q 聚合酶反应缓冲液4 l l l d k l p ( 2 5 鞋# b o l l )4 鼙l 5 端弓i 物( 2 5 p m o i 乩)4 “l 3 翡弓| 豹( 2 5 础o l 盹)4 江 自目体d n a ( 约5 0 n g l )4 “l 下a qd n a 聚合酶( 5 豫地)o 5 此 h 。0 ( 去离子水)3 9 5 蚌l 总体积5 0 u l 。 反疲条 孛凳：善轮反痤条箨变一建瓢i n ，9 4 2 疆i n ，5 5 l 糖 n ，7 2 i ，瓢i n 最后7 2 1 0 m i n ，冷却刹4 。 奉试验获爱零| 兹帮酶均薅癸予大连燮生物公司。 方法二( 直接水煮法) 第二章有机磷农药降解菌的鉴定 刮一环培养2 4 h 的斜面菌苔于1 5 m le p 管中( 管中含有去离子水) ，沸水浴煮5 m i n ， 振荡1 0 m i n ，离心( 1 2 0 0 0 r m i n ) 5 m i n ，取上清作为p c r 的模版，以后步骤同上。 1 2 4 3p c r 产物的纯化：用p r i m e r 纯化试剂盒，购买于大连宝生物公司。 1 2 4 41 6 s r d n a 序列测序委托大连宝生物公司测定。 1 2 4 5d n a 检澳4 ( 1 ) 主要试剂 琼脂糖凝胶：o 1 6 9 琼脂糖，加2 0 m l t b e ，微波炉加热熔解，琼脂糖浓度为0 8 。 5 t r i s 一硼酸( t b e ) ：称取5 4 酊r i s ，2 7 5 9 硼酸，溶于适量双蒸水中，加入2 0 m l o 5 m 0 1 le d t a ( p h 8 o ) 溶液，用双蒸水定容至l l ，高压灭菌，于4 冰箱贮存备用。 电泳时使用o 5 倍或1 倍t b e 溶液。 e b 溶液( 1ug m l ) ：戴手套谨慎称取溴化乙锭( e b ) ，按1 m g m l 浓度加双蒸水配制， 溶解后贮于4 冰箱备用。 核酸电泳上样缓冲液：称取溴酚蓝2 0 0 m g ，加双蒸水1 0 m l ，室温下过夜，待溶解后再 称取蔗糖5 0 9 ，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，混匀后加双蒸水定容到1 0 0 m l ，加 1 0 m 0 1 ln a o h1 2 滴，调至蓝色，于4 冰箱备用。 标准参照物：1 5 0 0 0m a r k e r 购自宝生物公司 ( 2 ) 电泳分析 胶板的制备 将胶槽洗净、晾干，并在固定位置插上梳子。将冷却至6 0 的琼脂糖凝胶液轻轻摇 匀，小心地倒在胶槽内。使胶液缓慢展开，注意不要产生气泡。室温下静置3 0 m i n ，凝 固完全后，轻轻拔出梳子，这时在胶板上即形成相互隔开的上样孔。将铺好胶的胶槽放 入含有电泳缓冲t b e 的电泳槽中备用。 加样 将上述提取的6 此d n a 与1 h l 上样缓冲液混匀后，用微量进样器分别加入胶板的样 品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孑l 周围的凝胶面。 电泳 加完样后在室温进行电泳，电压为8 0 伏。当溴酚蓝移动到距胶板下沿l c m 时停止电 泳。采用z f 卜i i 型紫外透射反射分析仪进行电泳分析。 2 试验结果 2 4 沈阳农监犬学颈士学证论文 2 ，1 试验菌株基阏组d 姒提取方法的确意 本章分别用两种方法进行细蔺基因组d n a 的提取，结果表明方法二熙适合所筛的菌 橡。采鬟方法一提取靛溅轰量少露旦缝发不裹荔耩解，瓣采弱方法二提毅戆豫轰塞大露 凰纯度商。 2 2 试验蘩撩 8 s r 器黻扩增方法确定 本章分别用两种方法进行1 6 s r d n ap c r 扩增，结果表明方法二优于方法一。可能是 采糟方法一时，所胡豹d n a 模袄含量多慧纯度差，和弓 物之间的特异性不强，鞠两造成 p c r 结果不是很好。 2 3 菌株分类鉴定结果 采用露规方法对菌株p 5 及聚一1 5 进行了形态戏察，生理生偬特征鉴迩，鉴定结果冤 表2 1 ： 表2 一 寿撬磺农药酶解蓥擞理生健蕊是豪 t a b l e 2 - l 确e i d c n 珏戴蛳i o n f e 蛳l t o r o 堪8 p 抽s p h 砒e d e 蓼a d a t i o n b a c 砖一a 注 “+ ”为阳性，“一”为阴馕。 第= 章有机磷农药酶解蘸的鉴定 ( 1 ) 经生理生纯鉴定麟一5 淹邻单藏藿滠( 尹纽如搬勰嚣难) ，酗1 5 为芽胞杼蔼蒲( 嚣韶搿淞 s p ) 。蘩株鼢5 黯辩1 5 翡1 6 s r 转黻熬序列瓣序委托大遘宝生物公司，磊葡溯序难在进行。 ( 2 ) 本章分剐用蓊种方法逮行降解菌株基因组d 撇静提取，结巢表明方法二更邋合所 筛豹菌株。 ( 3 ) 本章分别用两种方法进行降解菌株1 6 s r d n ap c r 扩增，结果表明方法= 优予方法 一a 嗣2 1 菌株崎简单染色 f i 9 2 1s j m p l es 嘶no f m 5 图2 3 菌株_ 一5 菌落形态 f i 簖* 3c o l o n ym o d a i 姆o f m 一5 围2 2 荫株_ 一15 简单搂色 f i 9 2 - 2s i m p i e 鼬i no f m - 1 5 嬲2 _ 4 楚拣h l5 菌藩形惑 f i 站- 4c o l 。n ym o d a | t y 醯醚* 1 5 沈戳表她走学硬士学位谂文 蹩2