（微生物学专业论文）微生物处理玉米秸秆生产蛋白饲料的研究.pdf

摘要 硷、，从牛瘤胃中分离高产纤维素酶细菌，经纤维素刚果红平板初筛、摇瓶培养、 固态发酵复筛、得到一株芽孢杆菌x 。，该菌不仅可降解纤维素，且自身具固氮能 力。f 最适生长p h 为7 左右，最适生长温度为3 7 * ( 2 。在发酵过程中与其他菌株能 很好共生。同时从牛瘤胃中分离、筛选得酵母y 。，实验证明该菌株与其他发酵菌 株具良好配伍性，能利用混菌发酵产生的还原糖迅速生长，达到较高的生物量。 利用氨法和白腐真菌l i 对玉米秸秆进行前期处理，依据多种微生物共生及代 谢的特性，采用多菌种混合共发酵方式，将康宁木霉和选育出的高活性黑曲霉 s ，瘤胃细菌x 。酵母y 。，接种于前处理过的玉米秸秆上共发酵，利用正交试验， 得出：在发酵温度3 0 ，p h 5 0 发酵9 天后，粗蛋白含量达2 4 6 1 ，纤维素降 解率为4 8 3 7 。 对酵母y 。原生质体的制备、再生条件进行探索：采用对数生长前期( 约2 4 h ) 的菌体细胞，用1 5 蜗牛酶，o 1 b 一巯基乙醇，处理6 0 m i n ，原生质体形成率 可达9 5 ，用0 6 m l 1 蔗糖做渗透稳定剂，原生质体再生效果最佳，再生率为 6 3 2 。a 、 采用h e n e 激光诱变酵母y ：原生质体，获得一株是出发菌株产生物量1 3 l 倍的酵母y 2 。经酯酶同工酶谱分析，其酶带条纹数，迁移率等均发生了明显变 化，利用y 。和混菌共发酵实验结果表明，产物中粗蛋白可提高到2 8 1 0 ，此 时纤维素降解率为5 1 1 2 。 关键词：筛选；多菌种共发酵? 玉米秸秆i 蛋白饲料y 原生质体 h e - n e 激光；诱变 s t u d yo np r o d u c t l 0 n o fp r o t e l nf e e d f r o mc o r ns t r a wb yt r e a t m e n t o fm i c r o o r g a n i s m a b s t r a c t h i g h y i e l dc e l l u l a s e b a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o mr u m e n a t i e rt h e p r i m a r ys c r e e n i n gt e s tb yc e l l u l o s e c o n g or e da g a rm e d i u m ，t h es e c o n d o n eb yf l a s kc u l t i v a t i o na n dt h e ns o l i df e r m e n t a t i o n ，ab a c i l l u sx 4w a s o b t a i n e d t h i ss t r a i nn o to n l yw a s c a p a b l e o f d e g r a d i n gc e l l u l o s e ，b u ta l s o p o s s e s s e dt h ea b i l i t yt of i xn i t r o g e n t h eo p t i m u mp h o fi tw a sa t7 0 ， t h es u i t a b l et e m p e r a t u r ef o rt h eg r o w t ho f x 4w a sa b o u t3 7 t h es t r a i n x 4w a sa b l et o s y m b i o s i s w e l l w i t ho t h e rs e l e c t e ds t r a i n s i nt h e c o f e r m e n t a t i o n t h ey e a s tc a l l e dy 2w a ss e p a r a t e df r o mt u r e e nt o o t h e e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a ty e a s ty 2m a t c h e db e t t e rw i t hm i x e ds t r a i n s a n d i tg r e w q u i c k l y w i t h r e d u c i n gs u g a r w h i c hw a s p r o d u c e db y o t h e rs e l e c t e d s t r a i n si nt h ec o f e r m e n t a t i o nr e s u l t i n gi nh i g h e rb i o m a s s a c c o r d i n gt oc h a r a c t e r i s t i c so ft h em u l t i m i c r o o r g a n i s m ss y m b i o s i s a n dt h e i rm e t a b o l i s m ，t h ec o ms t r a w sw e r ep r e t r e a t e dw i t ht h ea m m o n i a a n dw h i t e - r o t n g l x ，t r i e h o d e r m ak o n i n g i io u dc 4 1 3 ，h i 【g ha c t i v i t y a s p e r g i l l u sn i g e rs y , r u m e nb a c t e r i u mx 4a n dr u m e ny e a s ty 2w e r e c a r e f u l l ys e l e c t e da n dw e r ei n o c u l a t e do np r e t r e a t e dc o r ns t r a w sp o w d e r f o rm u l t i s t r a i n sc o f e r m e n t a t i o n t h er e s u l to fo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s h o w e d ：w i t ht h ef e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e3 0 ，p h5 0 ，a f t e r9d a y s ， t h ec o n t e n t so fr a wp r o t e i n sr e a c h e d2 4 6 1 w h i l et h ed e g r a d a t i o nr a t i o o f c e l l u l o s ew a s4 8 3 7 t h es u i t a b l ec o n d i t i o no fp r o t o p l a s tf o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o no f y e a s ty 2w e r es t u d i e d t h er e s u l to fe x p e r i m e n ts h o w e dt h a t ：t h ee a r l y e x p o n e n t i a lp h a s ec e l l s ( a b o u t2 4 h ) w e r ee a s yt of o r mp r o t o p l a s t ，u n d e r t h ea c t i o no f1 5 s n a i le n z y m ea n d0 1 p ，m e r c a p t o e t h a n o l ，t h er a t i o o f p r o t o p l a s tf o r m a t i o nw a sa b o u t9 5 i n6 0m i n u t e s o nt h ec o n d i t i o n t h a t0 6 m o l ls u c r o s ew a su s e da so s m o t i cs t a b i l i z e r , t h er a t i oo f p r o t o p l a s t r e g e n e r a t i o nw a s t h eh i g h e s t t h er a t i oo fi t sr e g e n e r a t i o nw a s6 3 2 。 am u t a g e n i cs t r a i nc a l l e d y e 7 w a sa c h i e v e d u s i n gi r r a d i a t i n g p r o t o p l a s t sb y h e n el a s e rf 入= 6 3 2 8 n m ) i t sb i o m a s sy i e l di n c r e a s e da s m u c ha s1 31t i m e st h a nt h a to fs t a r t i n gs t r a i n a n di tm a t c he x c e l l e n t l y w i t ho t h e rm i x e ds t r a i n s t h ee s t e r a s e ( e s t 、i s o e n z y m ee l e c t r o p h e r e s i s b a n d so ft h em u t a g e n i cs t r a i ny 2 7 c o m p a r e dw i t ht h a to fs t a r t i n gs t r a i n c h a n g e dd r a m a t i c a l l y t h e r e s u l to fc o f e r m e n t a t i o n u t i l i z i n gy 2 7 i n d i c a t e dt h ec o n t e n to f c r u d e p r o t e i ni np r o d u c t i o nr e a c h e d2 8 1 0 w h i l e a tt h es a m et i m et h e d e g r a d a t i o n r a t eo f c e l l u l o s ec a m et o51 j2 k e yw o r d ：s c r e e n ；m u l t i - s t r a i n sf e r m e n t a t i o n ；c o ms t r a w ； p r o t e i nf e e d ；p r o t o p l a s t ；h e - n el a s e r ；m u t a t i o n ，j 独创性声明 y 互2 9 7 9 8 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得酉j 竖太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：歙 ，若 签字日期：3 j j ) 年c 。月f 日 第一部分前言 我国是一个农业大国，据粗略统计，每年约产农作物秸秆6 亿吨，但植物秸 秆因其茎细胞壁中含有木质纤维素而很难作为工业原料及饲料。目前用作饲料 的仅占1 5 左右，绝大部分农作物秸秆仍直接还田或作燃料用，既造成资源浪费， 又污染环境。近几十年来，国内外一直在寻找降解植物秸杆木质纤维素的最佳途 径，研究一般都集中于下面几个方面：将秸杆进行物理化学处理，如辐射、 蒸汽爆破、膨化、碾磨等“1 ；酶解，生物发酵1 ；将上述两个方面综 合考虑”“。但长期以来对秸秆的开发利用仍处于比较低的水平上，未用于工业 上大规模生产转化。如何提高秸杆的利用率研究仍是当今世界性的研究课题。 1 秸秆的结构特点 1 1 秸秆的结构及碳水化合物的构成 秸秆的主要成分是粗纤维，粗纤维是饲料中所有不溶于定浓度的稀酸，稀 碱，乙醇( 醚) 有机物质的总称。它包括纤维素、半纤维素、多缩戊糖及镶嵌物质 ( 木质素，角质) 等。表1 为几种主要农作物秸秆的碳水化合物的含量。 表1几种主要衣作物秸秆的碳水化合物的含量( 占有机物) 可见纤维素，半纤维素及木质素在碳水化合物中所占比例很大n 1 。 1 2 纤维素 纤维素属木质化天然纤维，其结晶度和聚合度均很高。是植物细胞壁的主要 构成成分，也是自然界中最大的有机物质。它的化学结构乃是由许多b - 1 4 糖苷 键连接而成的葡萄糖单位的聚合体，在葡萄糖单位上的第六碳原子呈反式连接， 从而导致整个纤维素结构呈稳定的扁带状的微纤维，除此以外，在微纤维之间还 有牢固的氢键连接，从而导致纤维素基本上不可溶。对于各种酶的作用也具有极 大抵抗力。 1 3 半纤维素 半纤维是许多不同的单糖聚合体的异源性混合体，包括葡萄糖，木糖，甘露 糖，阿拉伯糖与半乳糖等，各单糖聚合体间分别以共价键，氢键，酯键或醚键相 连接，因而呈现稳定的化学结构：此外，随着农作物秸秆的成熟，植物体内的半 纤维素逐渐增长，并参与其中，从而进一步增强了植物体的坚实性，也降 a t 它 们的可消化性。 1 4 木质素 木质素是一种杂聚物，基本结构单元苯基丙烷( p h e n y lp r o p a n o id ) 靠多种共 价键连接形成一种不溶性的，异质的，无光学活性的，不规则的，如晶体的，高 度分枝的三维网络大分子n 。它与纤维素，半纤维素一起构成细胞壁的主要成 分，其中8 0 存在于植物细胞壁中，2 0 分布于细胞间隙中，成为细胞联合的粘连 剂。木质素的惰性对于植物来说是极具价值的结构组成，但却是所有自然产物中 转化率最低的物质p3 。由于木质素分子间链键多为酯键或c c 键，非常稳定，其 连接单元不易水解，所以木质素降解过程是一系列酶催化和非酶催化的非特异性 氧化还原过程“。完整的木质组织中，木质素以一种物理屏障存在，包围纤维 素，成为外围基质，保护纤维素免遭微生物及酶的攻击，成为许多工业化过程中 有效利用纤维素的一个障碍。在木质组织中，木质素的降解必须先于纤维素的 分解。 2 秸秆类饲料开发利用的限制因素 长期以来对于秸秆的开发利用始终处于比较低的水平上，这主要是因为秸秆 类饲料存在着以下几个待解决问题。 2 1 粗纤维含量 植物在整个生长过程中，蛋白质、脂肪、可溶性碳水化合物等均由茎与叶 片向籽实集结，与此同时，茎叶逐渐变老，粗纤维含量逐渐增加，达3 0 4 5 ， 而除牛等少数草食家畜能消化纤维素之外，其它家畜都不能利用这部分能量， 而且由于纤维的存在，反而会影响其他营养物质的消化，从而降低饲料营养 价值“。 2 2 粗蛋白含量 秸秆类粗蛋白含量太低也是影响动物大量采食的一个重要限制性因素。如玉 米秸秆，反刍动物对玉米的消化率约为8 0 ，而对玉米秸秆的消化率仅为4 6 。玉 米中粗蛋白的含量约为g ，而秸秆中粗蛋白含量通常不超过5 。作为饲料喂牛， 玉米的增重净能为6 d 9 ，e - 焦耳k g ，而玉米秸秆增重净能仅0 7 5 兆焦耳l ( g ，是 玉米净能值的11 6 “。用未处理的秸秆作饲料，往往会出现氮的负平衡，即食 入氮小于排出氮。 2 3 木质素含量 秸秆类物质含有约1 6 2 5 的木质素，木质素作为一种物理屏障，成为纤维 素的外围基质，起着赋予纤维机械强度以及保护纤维素免遭微生物及酶攻击的作 用。这使得秸秆类饲料比较粗硬，适口性差，造成采食量有限。 2 4 维生素的含量匮乏 相比而言，秸秆饲料中维生素d 含量较多，其它维生素的含量很少，b 族维生 素极为缺乏，胡萝h 素几乎没有。 3 秸秆的加工处理方法及其效果 3 1 物理法” 秸秆的物理处理法包括切短，磨碎及蒸煮法等，较为简单，常作为其它方法 的前处理。物理法能提高秸秆的适口性，增加采食量。但是不能提高秸秆的营养 价值和消化率。另外还有高压蒸汽处理，膨化等。秸秆中的木质素在温度达至f 1 1 7 0 时才可以软化或是部分水解，这种处理需要特定的设备输送热量，控制温度， 成本较高。近年来，又见到一些关于用辐射技术处理秸秆的报道，当辐射剂量超 过2 o 1 0 7 能促使秸秆的细胞壁含量降低，提高体外消化率( 孟庆翔等，1 9 9 2 ) 。 3 2 化学法 3 2 1 酸碱处理法 1 9 0 0 年，k e l l n e r 和k o h l e r 用2 4 的n a o h 溶液在高压锅内煮黑麦秸秆，使 纤维素的消化率提高1 倍。1 9 2 2 年，德国的贝克曼用1 5 的n a o h 液浸泡秸秆2 4 小 时，然后冲洗。干物质损失仅2 0 ，纤维素几乎全部存在，冲洗中仅2 5 3 0 的 木质素及8 1 5 的五聚糖损失“。秸秆碱化作用的原理在于o h 一能削弱纤维素， 半纤维素之间的氢键，皂化半纤维素和木质素间的酯键，分离半纤维素与木质素 之间的醚键，溶解半纤维素，利于瘤胃微生物附着和消化“。但用碱性试剂处 理秸秆的意义并非使木质素溶解，或者使其与纤维素分离，而是中和秸秆潜在的 酸性，为纤维素分解菌的生命活动创造比饲料未处理秸秆时更为良好的条件。但 碱化法用碱量大，需大量水冲洗，易造成环境污染，生产中应用并不广泛。也 有人研究用酸处理秸秆，如硫酸、盐酸、磷酸、蚁酸等，酸处理秸秆的原理与碱 化处理基本相同，但效果不如碱化。 3 2 2 氨化法 从3 0 年代开始，氨化法在欧洲流行起来。氨化通常使用的是液氨，氨气及尿 素。氨化的原理：含氮量较低( 1 ) 的低质粗饲料与氨相遇时，其有机物与氨 发生氨解反应，其中的木质素与多糖间的酯键结合遭到破坏，并形成铵盐。铵盐 则为牛羊瘤胃内微生物的氮源m 1 。另一方面，氨溶于水后形成的氢氧化铵对粗 饲料具碱化作用。一般认为氨的经济用量为2 5 3 5 ，含水率以4 0 左右为宜。 欧洲及北美多用氨水或液氨处理，在我国尿素来源比较方便，也无需用水冲洗， 所以多采用尿素氨化秸秆。 3 2 3 氧化剂处理 氧化剂处理是针对植物的木质化纤维素对氧化剂比较敏感而提出的，主要是 指二氧化硫( s o 。) ，臭氧( 0 。) 及碱性过氧化氢( a h p ) 处理秸秆的方法。氧化剂能破 坏木质素分子间的共价键，溶解部分半纤维素和木质素，使纤维素基质中产生较 大空隙，从而增加纤维素酶和细胞壁成分的接触面积，提高饲料的消化率。 3 2 3 is 0 2 处理1 s o ：的处理可使秸秆中的多聚糖和纤维素，麦秸中的高锰酸木质素 ( p e r m a n g a n a tl i g n i n ) 溶解。d r y d e n ( t 9 8 8 ) 的试验证明，s 0 。处理对细胞壁成分 无影响。但用s o 。和n h 。o h 共同处理可使秸秆细胞壁有机物含量从7 5 4 m g g 干物质降 至l j 5 2 0 m g g 干物质，纤维素和木质素含量也相应下降，但对半纤维素的含量无影 响。b e n 用s 0 ：处理麦秸后，细胞内容物和纤维素含量比未处理麦秸分别提高2 0 4 和2 4 ，半纤维素，木质素和不溶性灰分含量比未处理麦秸分别降低2 1 o ，1 1 ， 0 9 。但用s o ：处理麦秸不影响总氮含量。用s o 。处理存在许多问题，如秸秆的适 口性降低，v b 。遭到破坏，而且会加重家畜酸的负担，使能量代谢受到影响。 3 2 3 2o ，处理1 用臭氧处理秸秆可使木质素，半纤维素含量分别降t 氐5 0 和5 ，而纤维素含 量变化很小( b e ng h e d a l i a ，1 9 8 0 ) 。b e n ( 1 9 8 3 ) 比较了0 。和n a o h 处理秸秆的效果， 结果表明，0 。处理组日粮的有机物表现消化率是n a o h 处理的1 1 7 倍。由此可看出， 0 。处理能从根本上解决粗饲料营养价值低的问题，是一种比碱化更有效的手段。 但用0 池会引起一些副作用，如木质索降解时会积累一些有毒的酚类物质，长期 饲喂会导致家畜中毒。另外，臭氧处理能量投入太高，所需臭氧量大，约l g s g 秸秆，效益不佳，这些因素导致臭氧目前仍不能在生产中应用。 3 2 3 3a h p 处理1 过氧化氢处理秸秆时，p h 值大于1 1 的条件下才能保证木质素的降解。相比而 言，碱性过氧化氢( a h p ) 处理效果更明显。k e r l e y ( 1 9 8 5 ) 用a h p 处理玉米芯、玉米 秸和麦秸，测出d m 消化率从处理前的每小时3 7 6 、4 3 4 和2 9 8 上升到处理后 的e g 、7 1 8 鼎：0 g 。m i r 姓恐j 使秸秆氮含量稍有降低，t 物质，糖及酚类 物质有一定损失，可溶于硝基苯提取物的酚单位含量下降，萄萄糖含量提高，同 时部分地消除细胞壁多糖，改变木质素的组成，利于瘤胃微生物对细胞壁碳水化 合物利用率提高。 h ：o 。处理粗饲料的机制主要依赖t p h ，因为h z 0 ：分解产生如下两个反应：h 2 0 2 = h + + h 0 0h ! o ：+ h 0 0 = o h + o 。+ h ：0 。这两个反应主要依赖于溶液的碱性。提高溶液的 p h ，可加速h 。0 。分解成h 0 0 进而促进o h 的形成，加快脱木质素的速度。a h p 处理木 质素的影响因素包括p h ，搅拌，h 。0 ：和n a o h 的浓度，h ! o 。和秸秆的比例等。用氧化 剂处理秸秆，能从本质上破坏木质素与纤维素的结合，明显提高秸秆的消化率。 从长远来看，秸秆的处理可能会转向氧化剂的处理，但因成本太高，目前还不能 在生产中推广应用。 4 生物处理法 4 1生物处理应用的主要微生物 4 1 1 降解木质素的主要微生物 降解木质素的细菌，目前研究较多的是放线菌，尤其是s t r e p t o m y c e ss p 的s t r e p t o m y c e sv j r i d o s p o r u s 4 翻s t r e p t o m y c e ss e t o n i i 可使松木中木质素降解 3 2 4 4 “盯将冀v i r i d o s p o r w s 降解松木皮部的木质素分离出发现其特征类似于 白腐真菌降解木质素后的产物。“钉应用1 1 c 标记技术发现：诺卡氏菌( k b c a r d i r ) ， 巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) ，链霉菌( s t r e p t o m y c e 曲假单胞杆菌 ( p s e u d o t a o n a s ) 等可分解球磨木素和二氧杂环烷木素，但将其作为唯一碳源或在 葡萄糖存在特殊条件下才能降解。 可降解木质素的真菌按其分解木材组分的不同变化，可分为软腐真菌 ( 踟nr o tf u n g i ) ，褐腐真菌( b r o w nr o tf u n g i ) ，和白腐真菌( w h i t e 埘t f u n g i ) 三类凹。软腐真菌主要是一组子囊菌和半知菌，它们在潮湿条件下对 木材表面发生降解作用。褐腐真菌是一组优先攻击软木的担子菌。白腐真菌绝 大多数为担子菌，少数为子囊菌和半知菌n 。白腐真菌可将木材中木质素和 纤维素彻底降解为c 0 2 和h 2 0 。p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mb u r d s a l l ( 黄孢 原毛平革菌) 为典型种，因其较强的降解能力而倍受重视n 们叫2 “。它普遍分 布于北美，但在我国尚无分布n 。英国a s t o n 大学最近从秸杆堆中分离出一株 白腐真菌，只降解木质素，不降解纤维素，可使秸杆的体外消化率从1 9 6 3 提高到4 1 1 3 2 “。 4 1 2 降解纤维素的主要微生物 能产生纤维素酶的微生物均能降解纤维素。这类微生物在自然界中是非常多 的，分解纤维素的细菌有噬纤维菌属( c y t o p h a g a l ) ，纤维多囊菌( p o l y a n g j u m c e l l u l o s u r n ) ，生成噬纤维菌属( $ o r o c y t o p h a g a ) ，梭菌属( c l o s t r j d i m n ) 中的热 纤梭菌( c j d s t r i d i m nt h e r m o c e l l u m ) ，此外芽孢杆菌属( & c i l l u s ) 中的某些菌株 也具有分解纤维素的能力”。美国农业部下属研究所研究人员从2 0 0 多种细菌中 筛选出既可固定空气中的氮，又能利用农作物秸秆的纤维作为唯一碳源的菌种， 可使秸秆经发酵后所含蛋白质比原来提高3 4 倍凹。我国东北师大刘东波” 3 等人分离出一株纤维素诺卡氏菌( n o e a r d i a e e l l u l a n sh d 一8 6 ) 也是以纤维素 为唯一碳源进行固氮生长的固氮菌。每降解1 9 纤维素可固氮8 6 m g ，在农业应用 上极具潜力。 真菌是分解自然界纤维素的主要力量，绿霉属的康宁木霉( 肌c h o d e r m a k o n i n g e jo u d ) 绿色木霉( y r i o h o d e r m av i r i d e 忍耶e x f r ) 。曲霉属的黑曲霉 ( a s p e r g i l l u sn i g e r v a nh e g h e m ) ，米曲霉( a s p e r g j l l u so r y z a e ( a h l b u r g ) c o 由n ) 漆斑霉属的庞孢漆斑菌 m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a ( a l b e r t i n i 毋s c h w e i n i t z ) d i t m a r ，以及青霉属( p e n i c i l i u ml i n 七) 的部分菌株，在大型真菌中有我们日 常食用的草茹( v o l v a r i av o l v a e e a ( b u l l , ) 成) ，香茹( l e n t i n u se d o d e s ( b e r g ) “，动等等汹“1 。近几年来，国内外均诱变选育出来许多新优良菌株，如 美国里氏木霉q m 9 4 1 4 ，e a 。8 6 7 ，n r r l1 1 4 6 0 ( r u t c 。) ，q m y l ”m c g 7 7 等，中科 院上海植生所的e a 3 , 8 6 7 ( fp s e u d o k o n j n g i i ) 和n 2 7 8 ( fp s e u d o k o n i n g i i ) ，浙江农 科院的木霉t 一6 8 及c d r 一2 2 2 2 等等。 4 2 微生物处理农作物秸秆存在问题 虽然木质纤维素分解菌及其酶类在发酵工业应用已研究了几十年，但迄今还 没有一种微生物或一套酶系可按传统方法用于大规模降解纤维素，并在经济上取 得效益，这主要是因为存在着下述一些问题。 第一纤维素酶的合成受其自身降解物的阻遏。现已证明，各种水溶性碳源 和葡萄糖，纤维二糖、蔗糖、淀粉、甘油等对真菌和细菌纤维素酶的合成起降解 物阻遏作用。例如构巢曲霉( d s p e r g i l l u s n i d u l a n s ) 的外切葡聚糖酶，内切葡聚 糖酶，b 一1 4 葡萄糖营酶受到5 甘油或葡萄糖的降解物阻遏口“。 第二纤维素酶的催化功能受其酶促反应终产物的反馈抑制。有实验证明里 氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i 、) 的内切与外切葡聚糖酶的活性受到纤维二糖的抑 制口“，而葡萄糖则可以抑制各种纤维素酶的活性。由于纤维素酶作用受到反馈 抑制，所以酶解液生成葡萄糖的浓度不高”“。 第三纤维素酶在酶促反应体系中不稳定，易失活。一般纤维素酶在酶促反 应体系中工作2 0 t j , 时之后开始部分失活，一般酶解需要2 4 1 2 0 小时，随着时间 的延长，酶失活加重“。 第四秸秆的纤维素，木质素与蜡质紧密结合在一起，防止和降低了各种酶 的活性。 4 3 自然发酵法处理玉米秸秆 自然发酵法比较普遍，利用秸秆本身携带的微生物发酵，加一定的添加剂， 密闭若干天后，取喂。也称秸秆青( 黄) 贮法，青贮添加剂一般有以下几类。 4 3 1 抑制不良发酵的添加剂 这类添加剂用的较多的有甲酸、甲醛。b e c k ( 1 9 6 8 ) 指出，甲酸对梭菌及肠杆 菌有显著的抑制作用，其用量大约在2 5 升吨。甲醛则对所有的菌都有抑制作 用，其添加量一般占至i j d m 的1 5 3 。添加甲酸、甲酸、甲醛( 或其混合物) 费 用较大，在我国目前还难以推广。此外，添加丙酸、已二烯酸、丁酸及甲酸钙能 防止发酵中的霉变，这类添加剂量一般为0 1 。 4 3 2 营养添加物 补充w s c ( 可溶性碳水化合物) 的玉米面、糖蜜、胡萝i - ，补充粗蛋白质含量 的氨，尿素，补加矿物质的碳酸钙及镁剂等，都属于这一类添加剂，这类添加剂 可以改善青( 黄) 贮的营养价值。 4 3 3 酶制剂 青贮中添加的酶主要是纤维素酶，其他还有半纤维素酶，b 一葡聚糖酶、植 酸酶、果胶酶等。酶的反应往往发生在细胞壁表面，对细胞壁结构的破坏效用不 大，所以必须要有相应的前处理过程。否则必然提高酶制剂应用于秸秆调制上的 处理成本，难在生产中推广。 4 3 4 微生物制剂 一般作物秸秆所含乳酸菌数量极为有限，添加乳酸菌能加快作物的乳酸发 酵，抑制和杀死其他有害微生物，达到长期酸贮的目的。在青贮中，常添加的是 同质乳酸菌，如植物乳杆菌，干酪乳杆菌，啤酒片球菌，粪链球菌等。同质乳酸 菌发酵产生容易被动物利用的l 一乳酸( 蔡义明，1 9 9 4 ) 。 在秸秆的发酵过程中，必不可缺的一点就是要有足够的可溶性碳水化合物 ( w s c ) 作为微生物作用的底物，对于营养价值低劣的秸秆，其w s c 的含量很少，光 靠添加微生物制剂是没有用的。 4 4 加曲( 混菌) 发酵玉米秸秆 4 4 1 混菌发酵木质纤维素 在选择发酵农作物秸秆生产蛋白饲料的微生物菌种方面，人们越来越倾向于 采用混合菌发酵体系，在双菌或多菌混合发酵中，酶促作用生成的糖立即被发酵 糖的微生物所利用，这样就维持了降解物质的浓度，消除了酶合成作用受到的降 解物的阻遏作用。同时，也解除了反应终产物对酶的反馈抑制。 混合菌发酵法也称同时糖化一发酵法( s s fs i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o n a n df e r m e n t a t i o n ) 或水解一发酵并行法( c h fc o m b i n e dh y d r o l y s i s a n d f e r m e n t a t i o n ) 。1 9 2 3 年l y n n 等。首次报告木质纤维素混合菌发酵法。他们用 嗜热菌混合培养法将亚硫酸纸浆废液发酵成乙醇。1 9 3 0 g ，s c o t t 等n 明用混合菌 发酵法将纤维素转化成乙酸。7 0 年代以后，混合菌发酵法研究进展很快，目前国 外已有每天将2 0 0 0 吨木质纤维素转化成乙醇的工厂口。国内郭维烈等人开发的 转化甜菜、木薯废渣的4 3 2 0 菌体蛋白技术效果非常显著口“。目前已进入规模化 生产阶段。 4 4 2 混合菌发酵优势 混合发酵有三个突出优势”1 ： 一、充分利用培养基、设备、人员和时间，可以在共同发酵容器中经过同一 工艺过程，提高所需产品的质和量，或获得二种、多种产品。即可做到三少一多： 生产人员少，原材料和能源消耗少，设备和器材少，而生产的产品的效益高或种 类多。 二、混合发酵能够获得一些独特产品，而纯种发酵很难做到。 三、混合多菌种，增加了发酵中许多基因的功能，通过不同代谢能力的组合， 完成单个菌种难以完成的复杂代谢作用，可以代替某些基因重组工程菌来进行复 杂的多种代谢反应。或促进生长代谢，提高生产效率。 4 4 3 混合菌发酵法的三种体系 4 4 3 1 液态混合菌体系 近十几年来，人们对秸秆类纤维素液态混合菌体系发酵转化单细胞蛋白进行 了大量的研究，建立了多种混合菌液态发酵体系，取得很多成果。g l a n c e h ”“1 报道，选用只s 如i t i s 和fp e n i c i l l a t u n ? 混合培养，可将玉米秸秆的稀酸水解物 转化成菌体蛋白，降解木质素并降低c o d 。选用zf e r m e n t a u s 和p t a n n o p h i u s 混合培养也产生类似效应。p & 功i t i s 和只t a n n o p h i l u s 分另f j 将木糖发酵成乙 醇，zp e n i c i l l a t u m n 和zf e r m e n t a u s 以乙醇为生长碳源，混合菌中二菌间建立 了互生关系。 陈庆森“”3 等亦研究了秸秆纤维素液态混合菌体系的蛋白转化。在以氨法 处理的玉米秸杆为底物的混菌发酵中，总纤维素转化率达7 0 以上，粗蛋白含量 达2 4 1 4 。 4 4 3 2 固态混合菌体系 固态混合菌发酵体系有下列优点n “：( 1 ) 发酵过程无须严格无菌条件；( 2 ) 用木质纤维和粗淀粉质f 1 为原料不必特殊前处理；( 3 ) 固态发酵后的全部产物勺 能用于饲料，后处理简单，得率高；( 4 ) 设备投资少；( 5 ) 发酵全过程无废水或很 少废水排放，无环境污染。 固态混合菌发酵体系选用微生物必须是能够分解纤维素和富含蛋白质的真 菌或酵母。张博润等m 3 利用白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d a ) 7 - 4 ，热带假丝酵母 ( c a n d i d at r o p i c a l i s ) z - 1 4 和木素木霉( y r i c h o d e r m al i g n o r u m ) z - 2 0 混菌发酵白 酒糟生产饲料蛋白，粗蛋白含量高达3 2 1 ，v b v b 。含量分别为2 2 m g k g ，和 5 2 6 m g k g 。具较高纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶活性。李发生等啡1 利用l 株 霉菌j z 一1 和l 株大型食用真菌j z 一2 组成双菌联合固态发酵体系亦对白酒糟进行高 蛋白菌体饲料生物转化。粗蛋白含量接近3 3 ，粗纤维 1 4 ，氨基酸种类齐全， 为一种良好的饲料来源。 4 4 3 3 固一液态混合菌体系 徐坚平等“7 1 报道了固一液态混合菌体系发酵纤维素合成单细胞蛋白的研究。 他们以稻草为原料，选择绿色木霉和饲料酵母混和共发酵，培养物中蛋白质含量 提高到2 0 2 5 ，纤维素转化率达5 1 。混合菌共发酵与单一菌种发酵比较实验 表明：绿色木霉与饲料酵母混合发酵明显优于单一菌种发酵。 4 5 其他秸秆生物处理法 利用食用菌制作菌糖饲料。由于担子菌( t y a s i d l o m y c e l e ) 对纤维素、木质 素有很大的分解力，可用秸秆作培养源栽培食用菌。据报道用白腐菌发酵麦 秆5 6 周后秸秆消化率可提高2 3 倍。此外，还有仿造反刍动物瘤胃环境的 人工瘤胃发酵饲料。自俄罗斯利用植物细胞死亡后自溶的特点研究出新型的 秸秆白溶工艺”“。 4 6 微生物处理农作物秸秆生成蛋白饲料应用前景及发展趋势 4 6 1 微生物发酵农作物秸秆生产蛋白饲料的优点 以农作物秸秆为能量，经微生物发酵生产单细胞蛋白，可作为蛋白饲料，不 仅提高农作物秸秆的消化率，也提高了畜禽对蛋白质的利用率。生成的各种氨基 酸，提高了饲料的适口性及营养力。发酵过程产生的各种有用的代谢产物，如抗 生素、维生素、有机酸、激素等，有的能增强动物抗病力( 抗生素) ，促进新陈代 谢( 激素、维生素) ，有些对饲料具防腐能力( 各种有机酸) 。此外，有些活体微生 物可促进有益菌群生长繁殖，抑制致病菌的生长。 4 6 2 农作物秸秆开发利用工作重点及发展前景” 今后几年微生物发酵农作物秸秆生产蛋白饲料的研究开发重点侧重于以下 几方面： 、对术质素、纤维素酶基囚的结构组成及调节机制的研究。 二、对木质素、纤维素酶的分子结构及作用机理的研究。 三、对热纤梭菌及热解糖梭菌的分离、改造及开发研究。 四、采用分子生物学方法构建具有木质素解聚糖酶基因和纤维素酶基因的 工程菌。 五、有关微生物发酵农作物秸秆生产蛋白饲料生产配套工艺的研究。 目前我国秸秆利用率还很低，开发研究潜力还很大，而微生物发酵秸秆技术 可谓是农业生物技术的重要组成部分，是农业微生物理论成果走向实际应用创造 经济效益的纽带。可以预见，随着研究的深入，微生物发酵农作物秸秆生产蛋 白饲料的应用前景必定是更加广阔的。 5 诱变育种 诱变育种是利用物理、化学等诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其 突变频率大幅度提高，然后通过简便，快速和高效的筛选方法，从中选出少数符 合育种目的的突变株。在诱变育种过程中选择简便有效的诱变剂最为重要。在物 理因素中，有非电离辐射类的紫外线、激光及能引起电离辐射的x 射线、y 射线 和快中子等。化学诱变剂种类极多，主要有烷化剂，碱基类似物和吖啶类化合 物。本文着重讨论激光的诱变育种。 5 1 激光诱变育种嘞1 几乎与激光器问世的同时，人们就以激光作为研究手段进行生物学研究。 1 9 6 1 年l r s o l o n 等发表了“激光的生理作用”，这是有关激光生物学的第一次 报道。以后随着激光研究成果的发展，国内外近几十年来有关激光生物学方面的 研究报道越来越多。激光对各种生物均能产生生物学效应。一般公认，激光对生 物组织的效应有热，压力、光和电磁场四种。 1 热效应当激光照射细胞时，从微束照射观点分析，激光的光分子作用 于生物分子，后者吸收光子并被激活，被激活分子与其他分子多次碰撞后转化所 获能量为热能。使被照物体温度升高，若温度上升持续时间较长，会使蛋白变性， 酶失活。即使时间很短，也能大大降低一些酶的活性。导致生物生理、遗传变异。 2 压力效应以能量密度高的激光照射生物体，可产生一次压力与二次压 力效应，当聚焦脉冲以激光作用生物体上某点时，其光能瞬时转化为热能，引起 该处组织内压强急剧升高，使得组织分裂，从而引起生理及遗传变异。 3 光效应光对于生物分子作用主要取决于分子的能级和波长。因吸收激 光被激活的生物分子，可将能量暂时贮存，进行光合作用。或用于提供异构作用， 聚合作用，及生物分子离解所需的自由能。一旦这些不同波长的激光被生物组织 细胞选择性地吸收，生物分子内就会发生分子能级跃迁，出现激活或损伤，产生 相应的生物效应。 4 电磁场效应激光是强电磁波，其产生的电场，可使生物偶极子发生二 次或三次谐波。使生物组织细胞变性，产生自由基。强烈的反应对细胞内的染色 体，d n a 及蛋白质造成刺激或损伤，从而引起生物体突变。 1 9 6 8 年，匈牙利e m e s t e r 提出小剂量激光辐射对生物有刺激效应，生物分子 吸收不同波长的激光，导致分子激活，产生新的化学反应或损伤，从而引起生物 体突变。 在低功率激光中位于可见光范围内的氦一氖( h e n e ) 激光是目前应用最广泛 的激光。它的主要生物学效应在于： ( 1 ) 刺激及抑制作用，k a p h o 普通过实验证明，在一定能量密度范围内，h e n e 激光对细胞f q d n a 合成有刺激作用，即加快细胞f q d n a 合成速率”“。 ( 2 ) 诱变作用。h e n e 激光可以诱发染色体畸变，破坏染色体，造成d n a 分 子损伤或突变。有报道表明用h e n e 激光处理e c o l i 造成d n a 分子突变。 ( 3 ) h e n e 激光对生物体蛋白质的合成也有一定的影响。 激光生物学研究应用于农作物育种方面取得了显著成绩，近十几年来，微生 物学者逐渐将其引入微生物育种领域。如为得到高产菌株，吴振昌”“曾用铜蒸 气激光辐照棘孢小单孢菌，得到发酵单位提高1 0 的激光辐照株。同时在龟裂链 霉菌的激光照射中，得到发酵单位提高6 6 以上的新菌株。迄今为止，在实验条 件下已育种成功的突变菌株有：白僵菌、纤维素酶产生菌、果胶酶产生菌、赤霉 素产生菌、龟裂链霉菌、黑曲霉、米曲霉、青霉素产生菌、啤酒酵母、大肠杆菌 等。常用的激光器有：染料激光、铜蒸汽激光、c o 。激光、h e - n e 激光等。诱变材 料多为菌体、孢予，也有原生质体。 5 2 原生质体诱变育种 微生物在一定酶的作用下，脱去细胞壁，只能在高渗透压培养基中存活，并 在合适的培养基中恢复细胞壁而再生。由于原生质体失去了细胞壁的屏蔽，故对 诱变剂更为敏感，诱变效果较传统方法理想。 有关原生质体诱变育种的研究开始于1 9 8 3 年，r y u 等人用n t g 做诱变剂首次诱 变了小单孢菌( 膨c ，蝴r e r o s a r i a ) 的原生质体，诱变后获得的营养缺陷型 比例为4 。 1 9 8 5 年，杜珠还等哺1 用u v 与l i c i ( 0 3 ) 复合处理赖氨酸的产生菌：北京棒 杆菌a s l 5 3 9 0 的原生质体，选出了一株产酸量高于原株6 5 的菌株，经用菌体细 胞作诱变对照时，试验结果表明，原生质体的正变株大大高于菌体细胞，从其产 量变化幅度来看，原生质体的正变幅度也大于菌体细胞，说明了原生质体诱变较 菌体诱