（微生物学专业论文）苏云金杆菌40718菌株的杀虫晶体蛋白基因研究与克隆.pdf

b t c p s c r y 基辫 e 嗽 s d s l p 1 1 g x * g a i p c r a e r b i s a p s 墨纛m 嚣蛰 凝 s s d s 。p a g 鼗 c l p s u b s p | i l l l l h ? g i e n s & 缩写表 苏云金轩蒴( 1 1 c i l l f “t m r n 棵i e n s i s ) 蓉虫藏体蛋白i n s e c t i c i d a lc r y s t a l 沦o t c i n s ) 杀虫晶体蛋白基嗣 ( i n s e c t i c i d a lc 1 2 ，s t a tp r o t e i n sg e n e ) 乙二胺掰乙酸 毯t h y l e n ( 1 i a l 柏i n e1 i l _ a a c e t i ca c i d ) 十_ t - 烷基磺酸媳( s o d i u md o d e c y ls u f l h l e 异丙基硫代一d - d - 半乳懿瞢 ( i s o p i 。o p y l t h i o 一- d g a l a c t o s i d c 5 一澳4 。氯3 ”雕哚- d - 半乳罐营 ( 5 一b r o m o 一4 一c h t o r o 一3 一i n d o l y l 一器- d - g a l a c t o s i d e l 聚合憋链及虚f 鹣 v l n e 嫩s ec h a i nr e a c t i o n l 蜀烯虢黢( a c r y l a m i d e ) 疆警基双两烯酰黢 m e t h y l e n e * b i s a c r y l a m i d e 避硫酸铵( a m m o n i u mp e r s u l t h t c ) 西甲基乙二艘 ( t e t r a m e t h y e t h y l e n ed i a m i n e ) 三羟甲基氨基甲烧 ( t r i s h y d r o x y n a e t h y l a m i n o l n e t h a n e ) 十二婉萋磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( s o d i u m d o d e c y l s u l f a t ep o t y a c l y l a m i d e g e l 小字肠碱瞧磷酸麓 ( c a l f i n t e s t i n ea l k t i n ep h o s p h a l a s e ) 二琉苏糖蹲( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) 苏云金亚转 s u b s p f i n i t i m u s s u b s p a l e s t i s u b s p k u r s t a k i s u b s p s o l t o s u b s p 。k e n y a e s u b s p g a l 肠t q a e s u b s p c m a d e n s i s s u b s p “詹“l i a i s u b s p 。i s r a e l e n s i s 幕虫亚种 阿莱亚种 库欺塔克亚张 猝倒亚种 卷尼亚皿辨 蜡螟亚种 加拿大亚静 鲇泽亚种 以色列受静 s u b s p ( 如，) l s t a d i e n s i s 达姆斯塔特亚种 a g m b a t e r i m n 、 农毒手萤 b a c i l l u ss u b t i l i s 枯草芽孢杆菌 b a c i l l u sc e r e l t s 媾状芽施抒菌 p s e u d o m o n a s m a l t o p h i a 假单孢杆菌 b a c h n e t h r i n 巨大芽孢耔蓄 l e p i d o p t e r a n s m鳞翅目 d i p t e r a n s双怒萄 c o l e o p t e r a n s鞘翅疆昆虫 p r o l o z o a l h s 原生动物门 n e m a t o d e s 线虫动物门 p h i t 2 l , h e h n i n t h s扁型动物门 m u w l l a x v l o s t e l l a ，l 菜蛾 h e t i c o v e ，p aa ，v n i g e r a棉铃虫 2 苏云金杆菌4 0 7 1 8 菡株的杀虫晶体蛋白 基因研究与克隆 摘要 苏云金杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s , 筒稳b t ) 4 。0 7 l8 菌株 ( c c t c cn o 2 0 0 0 1 6 ) 对小菜蛾( p l u t e l l ax y l o s t e l l a ) 和稀铃虫 ( t e l i c o v e r p aa m i g e a ) 等鳞翅墨昆虫具较高毒性，本研究分离并 掇纯了其杀虫晶体蛋白基因；运用p c r 方法分析4 0 7 18 菌株的基因 型，井进行了克隆。 实验结巢如下： 采弼改进的q r i t o nx - 1 0 0 温和裂解法进行b t4 0 7 1 8 菌袜酌质 粒d n a 的拙取，取 导较理想效果。周0 5 t r i t o n x - 1 0 0 和if l l o l ln a c 的混合液处理菌体，9 0i l l i f l 的裂解时间效果为好。提取的质粒d n a 受到的擐伤小，并且跨的抑制剂含量也较少。在0 5 琼脂糖凝胶电 泳中，质粒d n a 分离相当清晰。b l4 0 7 18 菌株含有4 个大小等的 质粒，依据其分子量大小顺序依次编号为p i 、p ，、p ，和p 。 采用几静不同的方法回收4 。0 7 1 8 菌株的鹱粒d n a ，主要有制备 挡板挖孔的方法、液氮冻融法和低熔点琼脂檐法。实验中对这三种回 收方法送行了不阁程度的改进，使它们皆可高质高效的酾收b t 4 0 7 l 8 菌株质粒d n a ，基本不受d n a 分子长度和量的限制。 霉蓠研究表明，苏云金杆菌c r y l 、c r y 2 和c r y 3 类基因编码的 杀虫晶体蛋白( i n s e c t i c i d a lc r y s t a l p r o t e l l l s ，麓稍：t c p s 或c r y 蛋白) 对鳞翅葡琵虫有毒性，并且我室的b t4 0 7 18 菌株对鳞翅垦昆 t 基盎项目：湖南省青年科技基金哽秘( 9 6 - 3 2 - 0 9 ) ；湖寨雀农业藿大攻美瑗 铥( 9 9 - 1 0 0 4 - 0 8 ) 虫有较强毒性。对g e n b a n k 中c r y l 一、c r y 2 一和c r y 3 一型基因的高 度保守区进行同源序列比较，设计了3 对通用引甥 c r y l f o n l 稼) u n l ( r ) 】、c r y 2 f u n 2 u n 2 ( r ) 】和c r y 3 ( u n 3 ( d ) t l j n 3 ( 1 h ) 】。并 根据cr y l - 和c r y 2 一型基因购高变区设计特异引物：s 5 1 i i t s3 u n l ( e r y l a a ，c r y l a b ，c r y l a c ，c r y l b ，c r y l c a ，t ：r y l o b )和 s 5 u n 2 s 3 u n 2 ( c r y 2 a a ，c r y 2 a b ，c r y 2 a c ) 。p c r 扩增结果表明质粒n 没有杀虫晶体蛋白基因，质粒p ，、p ：和p 。在周c r y l 【u n l ( d ) u n l ( r ) 】 和c r y 2 【u n 2 d ) t u n 2 ( r ) 】两对g 物扩增时分别产生了2 7 7 b p 和6 8 9 b p 的产物，分别对应c r y l - 和c r y 2 - 型基因；递用引物c r y 3 【u n 3 ( d ) u n 3 ( i - ) 】 没裔扩增出繇a 片段，说确质粒中不存有c r y 3 型基因。为了对4 。0 7 18 慧 株的驱类基毂型进行糖缎分析，必颓避一步的p c r 鉴定。质粒p j 用特 异引物扩增出1 6 4 1 、16 2 3 、1 2 1 9 b p 和14 7 1 b p 的d n a 片段，分别对 应于c r y i a c 、c r y l c b 、c r y 2 a c 和新的c r y 基西( 暂定名为cr y 4 。5 基因) 。质粒p ：扩增出购p c r 产物大小是1 6 3 5 、1 6 2 3 和1 2 t 9 b p ，分 别对应予c r y l a a 、c r y l c b 和cr y 2 a c 基因。质粒p ，扩增 “1 6 23 、15 57 和1 2 1 9 b p 纳产物，分别对应子c r y l c b 、c r y l a b 和c r y 2 a c 基因。p c r 扩增的数据表明，4 0 7 18 菌株含有多个与c r y 家族有关的蓉虫基因。 印含有c r y l h a 、c r y l a b ，c r y l h c 、c r y l c b 、cr y 2 a c 和新的c i y 基因 ( c r y 4 5 基因) 等基因型。像b t4 0 7 1 8 藩株这样基溜类登含蕈j 丰 富鸳b t ，鹭内外报道尚少，这诚明b t4 0 7 i8 菌株有重婴的硪究价 值和应用价值。 实验中采用i j a 撕f l i p s t i 双酶切质粒d n a ，寻找携带薪基因的片 段。发现薪基因c r y 4 5 在4 5k b 酶切片段上，另外还有一5 。0k b 片段携带c r y 基因。分别圄i 波甄片段，将它们与双功能栽体p l t t 3 0 4 进行重组，转化感受态细施ec o l id l l 5 a 。通过蘸白斑显色反应和 重组质粒酶切鉴定获缮重组子p b t 4 。 关键词： b t 质粒c r y 基爵p c r 基西克隆 c l o n i n g a n d a n a l y s i s o f c r y - t y p e g e n ef r o ma n o v e lb a c i l l u st h u r i n g i e n s i s4 0 7 1 8 a b s t l l a c t t h ei n s e c t i c i d a le l y s t a l p l o t e i n sg e n e sw e r ee x t r a c t e d t i o mal l o v e l b a c i l l u st l n o i n g i e n s i s4 0 718w i t ha ni m p r o v e dt r i t o n x 10 0g e n t l el y s i s ， w h i c hw e r ea n a l y s e db yp c r a n dt h ei n s e c t i c i d a lc r y s t a lp l o t e i n sg e n e s w e l ec l o n e d 1 、h er e s u l t ss h o w e da sb e l o w ： t h e i n a p t 。o v e dt r i t o n x * t 0 0 g e n t l el y s i sw a s u s e dt oe x t r a c tp l a s m i d s f r o man o v e lb a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s 4 0 718 t h i sm e t h o dw a st b u n d r e p r o d u c i b l ya n dr e l i a b l y w h e no 6 t r i t o n x 一1 0 0a n dim o l l ln a c l w e r eu s e d et oe x t r a c tp l a s m i d s ，a f t e r9 0 l y s i st i m e ，p l a s m i d sw e r e o b t a i n e d w i t hg o o d q u a l i t i f y d u r i n gt h i sc o u r s e ，t h ed a m a g eo fp l a s m i d sw e r el i t t l e a n dt h eh a b i t o i so f e n z y m e w e r eaf e w a n dp l a s m i dp r o f i l e sw e l c l e a t r e s p e c t i v e l yo na g a r o s eg e i ( o 5 ) ，w h i c hw e r en a m e dp l ，p 2 ，p 3a n dp 4 b y t h e i rm o l e c u l a r w e i g h t s i nt h i s s t u d y ,l - e c o v e r y m e t h o d so fd i g g i n g p o r e ，f i e e z i n g t h a w i n g 。l o wm e l t i n gg e lw e r eu s e dt oj - e c o v e rp l a s m i d sr e s p e c t i v e l y i n o r d e rt o k e e pt h eg o o dq u a l i t i e s o f p l a s m i d sa n d r e c o v e r p l a s m i d s e f f e c t i v e l y , t h e s em e t h o d sw e r ei m p , o v e do nad i f f e r e n tl e v e l ，f i n a l l y , t h e s em e t h o d sc o u l dr e c o v e l + t h e s ep l a s m i d se f l i ：c t i v e l y , i n s p i t e o ft h e i r l e n g t h sa n d c o n t e n t s t h em a i nt b c u si ns t u d i e so fb a c i l l u st l m r h 7 9 i e n s i s4 0 7l8s t r a i n i s t h ep r o d u c t i o no fi n s e c t i c i d a lc 1 3 , s t a li n c l u s i o n sd r , 1 i n gs p o i u f a t i o n f l h e s e c r y s t a l s w e l e c o m p o s e do l p l o t e i n s c a l l e d6 一e n d o t o x i n s o i c l y p r o t e i n s w o r k e r sh a v ed e s c l i b e dd i f l i e r e n tc r yp r o t e i n st h a te x h i b i tt o x i c a c t i v i t ya g a i n s t l a t v a eo f v e r yd i n 爸r e n ti n s e c t s ( t e p i d o p t e j a n s m ，d o ) t e r c m s ， a n dc o l e o p t e d j 似) ，a sw e l la so t h e ro r g a n i s m s ，i n c l u d i n gp l a o h e l m i n t h s ， 聍e m a t o d e s 、a n dp r o t o z o a n s t h ep r o t e i n s e n c o d e db yc r y1 一，c r y 2 一a n d c l y 3 一t y p eg e n e sw e t 。et o x i ct ol e p i d o p t e r a n s ，a , l dt h ei n s e c t i c i d a lc r y s t a l i n c l u s i o n sw i t h i nt h en o v e lb t4 0 718w e r ei b u n dt o x i ct ol e p k ) t e r a n s s o ，t h r e ep a i r s o fu n i v e r s a lp r i m e r sc r ylf u n 1 ( d ) u n1 ( r ) ，c r y 2 u n 2 ( d ) i u n 2 ( r ) 】a n dc r y 3 u n 3 ( d ) u n 3 ( r ) w e r ed e s i g n e d t o p r o b e t h em o s t c o n s e r v e dr e g i o n so fa l lk n o w uc r 3 l - ，c r y 2 一a n dc r y 3 一t y p e g e l l e s 、t h e p c r a m p l i t i e df r a g m e n t ss h o w e dp , ih a dt 1 0a n ye l y t y p eg e n e ，a n dt h e o t h e r so n l yh a v ec r y la n dc r y 2 一t y p eg e n e s f r o n lt h i s ，w ec o u l di d e n t i t ) b t4 0 7 18h a t b o r e dc r y l 一a n dc r y 2 一t y p eg e n e s o nt h i sb a s i s n i n es p e c i t i c p r i m e r sf s 5 u n l s 3 u n l ( c r y l a a ，c r y l a b ，c r y l a c ，c r y i b ，c r y t c a ，c r y i c b ) a n ds 5 u n 2 s 3 u n 2 ( c r y l a a ，c r y 2 a b ，c r y 2 a c ) 】w e r e d e s i g n e dt oa m p l i f y p 1 p 2a n dp 3 t h ep r o d u c t so fp c rs h o w e dt h a tp 1h a df o r 。c r y t y p e g e n e s ( e l y 1a c ，c r yic b ，c r y 2 a ca n dan o v e l c r y 4 5 ) ，p 2 h a dt h i n l e c r y t y p eg e n e s ( c r y 1a b ，c r y1c ba n d c r y 2 a c ) ，p 3 h a dt h e r e c l y - t y p e g e n e s ( c r y ia a ，c r y1c ba n dc r y 2 a c ) t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h en o v e l b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s4 0 718h a dp l e n t yo f c r y - t y p eg e n e s t h e l ew e r e f e wr e p o r t sa b o u tg e n e sa sm a n ya sb t4 ，0 7l8 t h i sg a v ee v i d e n c eo f a p p l i c a t i o na n d r e s e a r c hv a l u e s0 1 1b t4 0 718 b e s i d e s a n a l y s i so f t h ec r y t y p eg e n e so f p l a s m i d sw i t h i nb t4 0 7 1 8 ， t h e s ep l a s n m sw e r e d i g e s t e dw i t hr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sb a m l t l p s t l a n di tw a sf o u n dt h en o v e lc r y 4 5i nt h e4 5 k b 行a g m e n ta n d t h e5 , 0k b f r a g m e n ta l s oh a r b o r e dt h ec 秽g e n e t h e s et w of r a g m e n t s - w e r er e c o v e r e d f r o mt h e a g a r o s eg e l ，t h e nw e r el i g a t e dw i t h c o h e s i v ee n d s o f e x p r e s s i o n v e c t o rp h t 3 0 4 ，t r a n s f o n n e di n t oc o m p e t e n c ec e l l se c o l id i i 5 ( ) r h e c l o n e ds t r a i n sh a b o t i n gt h el i a g m e n t so l 4 5k ba n d5 0k bw e r e o b t a i n e d b y b l u e w h i t es e l e c t i o na n d d i g e s t e d w i t h1 1 e s t l i c t i o n e n d o n t l c l c a s e s b a m h l p s t i a n df i n a l l y , t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp b t 4 w a si d e n t i t i e d k e y w o r d s ：b tp l a s m i d s c r yg e n e s p c r g e n ec l o n i n g 前宦 苏云金芽憨抒蓉( b a c i l l u st h e i r i n g i e n s i s ，篱称b t ) 是一一种能 在芽孢形成期阍产生多神杀虫晶体蛋白( 1 n s e c t i c ；d a lc r y s t a t p r o t e i i s ，简称i c p s 或c r y 蛋白) 的革兰氏阳性夔。19 0 1 年盎日本 发现于家蚕的猝倒病，1 9 1s 年b e r li n e r 再次发现并定名为搀剑亚张 ( s u b s p s o t t o ) ，并于1 9 3 8 年在法酒首次成为商品“。它的杀虫晶体 蛋白分潮对鳞翅豁( l e p i d o pt e r a n s m ) 、双翅目( 口印t e l + a r t s ) 和鞘翅 霹昆虫( c o l e o p t e r a n 蓟以及琢生动物门( 角o l o z o a n 国、线虫动物门 ( n e m a i o d e s ) 和魔型动物门( p l a t y h e l m i n t h s ) 等类群巽有鞍淫的 毒杀作用和专一性“，对人蛮和裴翅昆虫( 如天数昆蔓t ；弦嚣安全， 是目前世界上应用最为成功的微生物杀虫剂，其巍品产量占整个生物 杀虫剂的9 5 0 0 ，而且具有增大趋势”、“。 b t 翼有离特异酌杀虫活性，主薅是因为它能产生一类杀虫蛋白， 其分子量麸2 7 l 3 8 k d 不等。“。当琵虫取食b t 杀虫蛋白质后，该 蛋叁矮可溶予琵变中肠内，并被中耨走的蛋囱酶切成5 0 6 0k i ) 的其 有杀虫活性的毒素，活化鲍毒素具有三个功能域( d o m a 强) 。d o t l l ai l t 作用于负电荷的膜袁蕊，d o m a ；n l l 卑受体的不可递结台或撼入臻黢有 关，d o m a i n l i i 的功能在于稳定毒蛋白的三维结构。毒紊与中肠上皮细 胞膜上的蛋白质受体结合，并插入细胞膜内，这可以导致细胞肿胀和 破袭，最后使昆虫死亡”。近年来，随蒲b t 遗传学和分子生物学的 错宠发展，人们对b t 杀虫餐自及其基因有了更深入的了群，已有2 5 枣 以上不疑活性盼b t 杀虫蛋囊凌被分离和纯化，l o o 多个8 tc r v 基因先后被克隆和测定其核苷酸序列。到蚕1 ；菪已分离剿1 8 ( 1 多个c w 蒸因，根据基因产物的圊源性大小掩其划分为2 8 爨。其申来蜜我髫 的基豳有c r y l a c l 0 、c r y l f b 3 、c r y 3 a a 7 、c r y l a b l 0 、c r y l e a 6 、c l _ y 2 a a 5 、 c r y 2 a a 6 、c r y 2 a a 7 、c r y l c a 6 和c r y 2 a b 3 等”_ “”。 近年来bt 翩荆已广泛用于防治多种重要的农林害虫，随着其应 用量的增大，在室内外已经发现多种害虫对b t 的伴胞晶体产生了不 同程度的抗性“，这样迫使人们一方面对害虫的抗性机理、抗性遗 传和进化等进行详细研究，以寻求阻止或克服害虫对b t 抗性的途径； 另一方面寻找高效的b t 菌株和新的c w 基冈资源，通过基冈工程技 术构建高效杀虫工程菌，拓宽b t 的杀虫谱，提高b l 的系虫活性，更 为有效地控制害虫。 1 c w 基因的分类 近年来，由于b t 的重要性，已有数千个b t 菌株被分离和纯化“”。 根据鞭毛抗原血清学反应的差异，现将b t 划分为5 5 个血清型，6 8 个亚种“”。进一步研究表明，同一菌株往往可产生多种bl 杀虫蛋白 基因，如丑t h u r i n g i e n s i ss u b s p n 玎j t a k ii l d 一1 就有5 种不同的 b t 杀虫蛋白基因，可产生5 种杀虫活性不同的蛋白质“。因此，仅 知道b t 的血清型或菌株，并不能准确的知道其c r y 基因和杀虫活性 及范围，而且由于不同的研究者经常使用不同的名字来命名它们克隆 到均基因，这样很容易造成混淆。鉴于此，19 8 9 年i l o f t c 等人根据 从克隆基因推导的杀虫蛋白质氨基酸序列的相似性和蛋白质的杀虫 活性，将它们分为5 类，l4 亚类，分别用罗马数字l 、i | 、1 i i 、i v 和v 等来命名，这些数字代表了bl 杀虫蛋白的杀虫范围( 如l 和l i 指明了对鳞翅目昆虫的毒性，i v 和v 分别代表了对鞘翅目和双翅目昆 虫的毒性等) 。在每一类型下用英文字母a 、b 、c 等代表不同的基因 型，然后用小写的英文字母表示同一基因型内由于核苷酸序列差异造 成的基因亚型。但随着新基因的不断发现，有的基因型与杀虫活性 谱按上述原则存在不一致性，很难归入该系统，如c l ，y e 的杀虫谱与 c i y i 相似，但其序列却有很大差别i l qo19 9 5 年，无脊椎病理学会( s i p ) 年会上成立的c r y 基因命名委员会，提出新的基因分类系统，基因的 鉴定只根据晶体蛋白的氨基酸序列同源性的差异，即氨摹酸序列相似 性4 5 、7 5 和9 5 ，将已知的9 4 种基因分为4 个等级，共17 群3 0 亚群 5 2 类9 4 个亚类基因“，到19 9 7 年底增至2 1 群4 4 亚群6 4 类1 1 6 个亚 类基因。 图1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白之问同源性关系的树状谱 f i g 1p h y l o g r a md e m o n s t r a t i n ga m i n oa c i ds e q u e n e ei d e n t i t ya m o n g 田蛐d 印p r o t e i n s 2 杀虫晶体蛋白基因的分布 b tc r y 基因含量极其丰富，这些基因分布在b t 不同菌株、不同 血清型、不同b t 亚种之间，c r y 基因数及种类均存在明显差异，1 6 个不等，女口s u b s p t a r s t s k ih d - i 、n r d i 2 、h d 一2 6 3 、h d 一7 3 基因 数分别1 5 个不等。即使分布于同一菌株的c r y 基因，也可能定位 于不同质粒，如s u b s p k u - s t a k ih d - 1 中的5 个杀虫晶体蛋白基因， c r y i a b 基因定位于4 5 m d a 上，而其他定位于l l o m d a 质粒上“”， s u b s p ，a z a w 5 t 川d l3 3 的c r y i c 和cr y l d 定位于大y - 1 1o m d a 质粒上， 两c r y i a b 基因定位于4 5 m d a 质粒上；露有的菌株内基阂多定位予溺 一质；| | 亟上，如s u b s p j 盯a e l e n s i s1 1 d - 3 6 7 莹株中鹭5 个e r y 婺西媸 都定位于? 5 m d a ；舜有的c r y 基因测定位子染色体土，如 s u b s p w u h a n o ，2 s s c r y l a a 基澄“”。s u b s p c z t l l 2 t d e n s i s i ) 一2 2 4 、 s u b s p 。d a z m s t a d i e a s i sl t d 一1 4 6 、s t l b s p k e n y a el t d - 2 9 3 ”等菌株中的 一些c r y 基禹定位子染色体上。稽反，同一e i y 基西不仅在不褥菌株 中可定位于不离凌粒上，而盈弼一蒲椿中定位于不同质粒上，即菌株 中不鬻质粒可包含简一c r y 基因，如s u b s p a i z a w a i7 2 9 菌株 e r y a b 鍪函定位于两个质粒上8 “。 3 o r y 基医的特点 自1 9 8 1 年s c h n c p f 和w h it e l o y 克隆了第一个c r y l a a 基因“”以 来，国际上已有18 0 多种c r y 基因得到克隆并进行了序列分析。这些 基删基本上都定位于一些大干3 sm 【) 的大质牲一ju ”“。掣l ：竞发嘎，l l 杀虫蛋白基因并不是随机分布予这些大质粒上，麓是仅定位于少数一 些质粒上，如在1 1 t h u l i n g i e n s i ss u b s p 。j 蹦a c t c n s i s 亚张，所有 编码杀虫蛋白的基因都集中在7 2 姻的大质粒上。b tc r y 基蹬的另 一个特点是冠一个b t 莹株可以存在多种c r y 基毽，如在k a l “s l a k i “d l ， s j a o o i l s i s , 8 7 绷搿，7 2 9 莹椿申至少存在5 种不同的e 。y 基蹬。此外还发现，在基露藕铡l k b 内往往存有一些插入序列和转位 因子( t r a n s p o s a b l ee t e l l l e l l t ) ，如t n 4 4 3 0 和t n 5 4 0 1 哪，它们有勘 于c r y 基因的重组和转位，已有证据表明在最l h l h - i n g i c n s i s s u b s p i s r a c l e n s i s 豫种中c r y 基两_ 可以转位，但一般的c i y 基因是 稻当稳定的”“。b t 杀虫蚤自基溺的另一个重要特征是它们都5 编码乐 虫蛋白质，这些蛋白质分子量从2 7 l4 0k d 不等，其氨基酸序列可 以从克隆基因的核苷酸序列推知。 4 b t 质粒的特点 质粒是染色体外能独立复制的遗传物质载体，通常是共价闭合环 捩载双链分子。鸯d e b a b o v 等1 9 8 7 ) 摄遥嚣l 中存在葳狡以来，吸 引了各翻学者桐继开展有关研究，并证明它在l jl 中鹊趟7 ，赶”。似 不弱亚秘不蘑蓥拣所含酶矮麓数和大夺各不糖商，有的萤椿质粒d n a 占细胞d n a 总璧的10 2 0 m 1 ，表明b t 菌株质粒丰富性和多样性的 孝螽点， 4 1 质粒类型 苏云金杆菌不同菌株中包含2 l7 个、大小为1 4 m i ) 1 8 0 m 1 ) ”7 戆不圈藏粒，萤撩之曩矮粒太小和数零均不捐筏。据大小和特性可将 其分为两类“。i 型：小质粒，分子赞小于15 m d ；相互之问及其与大 鼷粒、染色倦t ) i i a 部无笺漂幢，功镜不清楚；一般在菌栋中其高拷贝， 大多数按滚环( r o l l i n g c i r c l e ) 方式复制，在复制过程中出现单链 潍轰中阗体褥表瑰塞分离性s e g r e g a ti o n a1 ) 和结构土的不稳定性”。 如s u b s p 七珊s t a k i 的小质粒p i l b 2 、h d 2 6 3 菌株中的7 5 m d 质粒。l l 登：大震粒，分子量夫子 5m d ；相互之问存在d n a 序列的同源性； 大多数c r y 基因定位于这类质粒上”“1 ，在菌株问隧通过类结合 c o j u g a t i o n j i k e ) 方式转移t r a n s f e r ) ，一般在菌株内挡贝数低， 但结构稳定”“；一般按o 方式复制，不产生单链d n a “”，如l l ) 7 3 莹 秣中沟75 k b 质粒，t 1 1 ) - 2 6 3 菌株中的大质粒43 m r 、4 4 m i ) 和6 0 m ) ”“。 4 2 质艘多态性 苏云金秆菌不同亚种质粒数是不同e , j ，丽并非任何一种质粒在所 有亚静中都存在m 1 。s u b s p a e s t i 有1 2 13 个，分子量为2 。6 0 2 7 5 4 2 m d “”的质粒；s u b s p 厂i n i t j a m s 有4 个，分子量y , j 7 5m d 、 5 5 瓣d 、0 。9 8 鞋dj 0 7 9 m t ) 廖；羧，s u b s p 、妻f ，f 。s ，a k 葫6 6 个、 分子量为0 6 9 2 9 5 4 2m i ) ”昀质粒；s u b s l ) i b m j ，增? 州j n 9 t1 个分子萋为0 7 4 l 0 7 。15 醚釜麓凌粒81 ”：s t b s p 。删，办c 有3 5 舍分子量为3 。8 9 7 。7 2m d 的染色体外d n a ”3 ”；s u b s p s o t t o 则仅 一个履粒“t ”1 i 不仅不同亚糟震粒数及大小不同蕊且固一亚葶 1 不霹来 遐媳萤橡，质粒数及大小也不一致，如s u b s p k u l s t a k i 刁：圈蕊株质 粒数6 1 6 个不等，s u b s p 。t & h i n g i e n s i s 9 lt 个不等， s u b s p 。8 l o s f ，1 2 l3 令不等，s u b s 9 # ，z 口 谢? 7 3 个i ：等“。有 的驻静内不蹋萤株尽管质粒数枢弱但包含的是不溺大小鑫勺矮粒。 5 p c r 技术在b tc r y 基趿鉴定中的应用 5 i 特异复合p c r ( $ p c c i f i c - p c r ) 鉴定 美国北卡罗星纳c i 转a g e i g y 生物技术研究j 行铂r o z z j 等应用 p c r 技术快速预测b t 留袜的杀虫活性”。利用12 2 0 个针对c r y ia 、c r y l v 和c r y i v a 的特异引物，进行一次扩增，即可鉴别不同菌 株对鳞翅目、双翅目和鞘翅目的活性。加拿大l a v a l 大学b o ur q u c 等 混合使用c r y i h a 、cr y i h b 和c r y l a c 基因型特异引物，对新分离的 b t 菌株进行鉴定p c r 扩增o “，鉴定出菌株所含有的特异基因型。 5 。2 共同复合p c r ( c o - p c t ) 鉴定 3 、端共同引物和s 、端特异g 物复合一次扩增鉴定多秘基因型。 福建农业大学生物技术中心关雄等剩熙c r y 基因3 、端共嗣g l 壤秘 c r y i h a 、c r y l a b 、c r y ! a e 基因型5 、端特异性引黪，经p c r 扩增，对 b t8 0 1 0c r y t h 贬类基因进行了鉴定”。，华中农业大学农韭部徽生物 重点实验室刘子峰等利髑c r y i 基嚣3 、端共霹引耪和c r y l a 至c r y l f 8 辨鼗类5 、端特异性引物，对b 营养体矗接进行p c r 分斩”“，鉴定了 藩株翡c r y l 型基因。 5 。3 嚣次复奢p c r 嚣- p c r ) 篓定 需经两次扩靖才实现基因登的蘩定。1 9 9 5 年c e r o n 等运用一种 新静p c r 技术，快速鉴定己知的c r y i 和c 1 _ y l l l 基因型。以2 对通用 引物进行一次扩蹭分析，对含此类慕因型的菌株，用各种特异引物进 行二次扩增分析，可鉴定出1 0 种cr y l 基因型及5 种cr y l l t 基因型”。 法国c i r a d 的j u a i c z p e r e z 等创立了e - p c r ( e x c l l l s i v cp c r ) 技术” 良签定c r y 基因。以色列b s n - ( ；u r i o n 大学生命科学系b e n d o v 等运 用两次复合p c r ，快速鉴定对鳞翅目、鞘翅目和双翅露害虫有效的c l y 黎i 习”，浚 f 内5l ：；蔼用0 物，t j i 扩j 蒋日；2 0 币1 lc j + y j ，3 币 1 c iy 2 、4 矛 c i y3 ，2i t | cr y 4 。2g t c ly 7 以及3 母 cr y 8 基i 列! 矬的挂l ? l 蔓l 4 2 。， 后，以一套特异引物进行二次扩增分析，鉴定出其体的基因型。， 5 。4 p c r 产物暇稍性片段多态性( p c r - r f l p ) 鉴定 基因壁的鉴定有赖于扩增产物的限制性瓣切分析。日本北海道大 学农业部浅野真一郎等缀据c r yh 扩增产物的 f j t c l i 酶切片段长凌 多态性区分c r y i ia 与c r y i i b “。新西兰舆克兰嘲艺及食品研究院 g l e a v e 等从2 1 个b t 虫清型中扩增出麴7 个cr y v 类基匿扩增产物， 经k p n i 簿切分析，至少可将它们分为三个亚类“”。台湾圈立扬名大 学生令耪学学院k u o 和c h a k 爨确提出了p c r - r f l p 鉴定体系，并苔 先对成员众多的c r y i 类基因进行了系统鉴定“。19 9 8 年，中国农科 院缱物瘸虫害生物学国家重点实验室搴亮舞鼹了这方面工作，并遂一 步将k u o 和c h a k 所能鉴定的1 1 种c r y l 7 1 9 基因类型扩大到2 9 种”。 疑年，中山大学生物防治国家蓬点实骏室建立了c r y l 、c i y 2 、c l + y 3 、 c r y 4 、cr y 5 、c i y 6 、c r y 7 、c r y 8 、c r y 9 、c r y l9 、c y t t 和c y t2 等类 墅鍪毽秘鉴定体系“。该方法即可鉴定已知昀基因，并检测出未知的 基因。但也存在一些问题，如黼保守区阅非黪切位点部位的一些重要 变异可能被忽略。此外，p e r r f l i ，还可测定基因拷贝数及定量测定 转录水平的表达嚣差异。 p c r 签定本身存在诸如低拷贝c r y 基因可能被忽略、沉默的c r y 基因干扰杀虫活性的预测等缺陷，特另4 是为寻找对毙虫更有效或结合 靶虫不同受体的海蛋白时，无法提供齑接信息。但在鉴定i l 基因裂 时，p c r 方法比传统方法具快速麓便灵敏等傀点，鑫匕仍被广泛建t f ! l 来鉴定b t 的基因型。 6b t 杀虫蛋白的基因工程 每年都分离鉴定出耪的b t 杀虫蒲株，其中一些高效广诺酌菌株 逐步运用到生产l 申。但这些天然菌株不论在杀虫特异性、杀虫毒力及 持效方舀仍不能满足实际生产的需要。对予b t 杀女活性分子机理的 深入了鳃使我们能够运用分子生物学的方法改变b t 的杀虫潜能，这 些方法包括i c p s 编码质粒的遗传学操纵以