（微生物学专业论文）利用游离和固定化铬vi还原菌除铬的研究.pdf

利用游离和同定化铬( v 1 ) 还原菌除铬的研究 摘要 铬及其化合物在工业中被广泛使用，导致大量含铬废水、废渣产生，对环境 造成严重污染，危及民众健康。在铬污染废水中，六价铬最难去除，将毒性极强的 可溶性六价铬还原为毒性较小的三价铬沉淀是含铬废水处理的关键步骤。自然界 中一些微生物具有还原c r ( ) 至c r ( i i i ) 的能力，因而用微生物法治理铬污染已受 到人们的广泛认可。 本研究从锰污染土壤中筛选出三株铬( v i ) 还原菌并对一株新型铬( v i ) 还原菌 q 5 1 进行了除铬研究。经过形态学和生理生化特征检测，以及1 6 sr r n a 基因序 列分析，该菌株被鉴定为间孢囊菌( i n t r a s p o r a n g i u m ) ，编号为i n t r a s p o r a n g i u m s p q 5 1 。q 5 1 菌株具有1 7m m o f l 的铬( v i ) 的高抗性，在好氧条件下生长并进行 铬( v i ) 还原。 在q 5 1 细胞生长的情况下，对菌株还原铬( v i ) 的影响因素如培养基初始p h 值、 铬( v i ) 初始浓度和重复添加的相同浓度的铬( v i ) 等进行了研究。结果表明，q 5 - 1 菌生长和还原的最适p h 均为8 o 。在初始浓度为2 、3 、4 、5m m o l l 铬( v i ) 的还 原中，还原时间随着铬( v i ) 浓度的增大而延长。该菌株可以连续添加3 次1m m o l l 铬( v i ) 并且完全还原。静止状态收集的q 5 1 菌体细胞也可以进行铬( v i ) 还原。在 该条件下，对q 5 1 细胞添加不同碳源，检测其铬( v i ) 还原能力，其中，醋酸钠是 对其还原促进作用最大的一种。为了应用菌株q 5 1 去除水中的铬( v i ) ，对菌体细 胞进行了4 因素3 水平的固定化组合正交试验，得到了4 聚乙烯醇，3 海藻酸 钠，1 5 活性炭和3 的硅藻土的组合的固定化包埋细胞剂最稳定且还原效果最 好，其铬去除效果接近于游离的未包埋细胞。并且固定化细胞与游离细胞相比， 具有更稳定，更易于回收利用等特点。 该研究为铬( v i ) 污染的微生物净化提供了有较大应用潜力的铬还原菌，并且 q 5 1 铬( v i ) 还原机制提供了一些基本的实验依据。 关键词：铬i ) ；铬去除；铬( v i ) 还原细菌；间孢囊菌：固定化细菌 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 a b s t r a c t c h r o m i u ma n di t sc o m p o u n d sa r ew i d e l yu s e di nm a n yi n d u s t r i e sa n dal a r g e q u a n t i t yo fc r ( v i ) 一c o n t a i n i n gw a s t e sa r er e l e a s e di n t ot h ee n v i r o n m e n t c h r o m i u m ， e s p e c i a l l yh e x a v a l e n tc h r o m i u m c h r o m a t e ，c r ( v i ) 】h a sp o s e dg r e a t t h r e a to n e n v i r o n m e n t a ls a f e t ya n dh u m a nh e a l t h c r ( v i ) i sv e r yd i f f i c u l tt or e m o v ef r o m i n d u s t r i a lw a s t e w a t e r t h u s ，r e d u c t i o no fq u i t et o x i cc r ( v i ) i n t ol e s st o x i ct r i v a l e n t c h r o m i u m c r ( i i i ) i st h ek e ys t e pi ni n d u s t r i a lw a s t e w a t e rt r e a t m e n t s m a n yb a c t e r i a l s p e c i e sh a v eb e e nf o u n dt ob ea b l et or e d u c ec r ( v i ) t oc r ( i i i ) a n dm i c r o b i a l b i o r e m e d i a t i o nh a sb e e nr e g a r d e da sap r o m i s i n ga p p r o a c hf o rt h et r e a t m e n to f c h r o m i u mp o l l u t i o n i nt h i s s t u d y , t h r e e c h r o m a t e r e d u c i n g b a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o m m n - c o n t a m i n a t e ds o i l ，a n dt h ec h r o m a t er e d u c t i o na b i l i t yo fan o v e lc h r o m a t e - r e d u c i n g b a c t e r i u m q 5 - 1 w a ss t u d i e di nd e t a i l b a s e do n m o r p h o l o g i c a l ， p h y s i o l o g i c a l b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d16 sr r n ag e n es e q u e n c ea n a l y s e s ，t h i s s t r a i nw a si d e n t i f i e da si n t r a s p o r a n g i u ms p q 5 1 t h i sb a c t e r i u mh a sh i 曲c r ( v i ) r e s i s t a n c el e v e lw i t ham i co f17m m o l la n dg r o wa n dr e d u c ec r ( v i ) a e r o b i c a l l y i na e r o b i cc r ( v i ) r e d u c t i o nb yg r o w i n gc e l l so fs t r a i nq 5 1 ，t h ep a r a m e t e r s a f f e c t i n gc r ( v i ) r e d u c t i o nb ys t r a i nq 5 - 1w e r ei n v e s t i g a t e d ，s u c ha si n i t i a lp hv a l u eo f l i q u i dm e d i u m ，i n i t i a lc r ( v i ) c o n c e n t r a t i o na n dr e p e a t e d - a d d i n go fc r ( v i ) a l i q u o t s t h e r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h eo p t i m a lp hv a l u eo ft h eg r o w t ha n dc r ( v i ) r e d u c t i o nf o r q 5 - 1i sp h8 0 w h e na d d i n g2 ，3 ，4a n d5m m o l lc r ( v i ) ，w i t ht h ei n c r e a s i n gc r ( v i ) c o n c e n t r a t i o n ，t h er e d u c t i o nt i m ei se x p a n d i n g q 5 1c o u l dc o m p l e t e l yr e d u c e 3a l i q u o t s r e p e a t e d a d d i n go f1m m o l lc r ( v i ) s t r a i nq 5 - 1i sa l s oa b l et or e d u c ec r ( v i ) i n r e s t i n g ( n o n g r o w t h ) c o n d i t i o n su s i n gav a r i e t yo fc a r b o ns o u r c e sa sw e l la si nt h e a b s e n c eo fac a r b o ns o u r c e a c e t a t e ( 1m m o l l ) i st h em o s te f f i c i e n tc a r b o ns o u r c ef o r s t i m u l a t i n gc r ( v i ) r e d u c t i o n i no r d e rt oa p p l ys t r a i nq 5 1t or e m o v ec r ( v i ) f r o m w a t e r , t h eb a c t e r i a l c e l l sw e r ei m m o b i l i z e dw i t hd i f f e r e n tm a t r i c e sw i t l l f o u r - f a c t o r - t h r e e l e v e l o r t h o g o n a le x p e r i m e n t s q 5 - 1 c e l l se m b e d d e dw i t h i i 利用游离和固定化铬( v 1 ) 还原菌除铬的研究 一 一二i 一 c o m p o u n d i n gb e a d sc o n t a i n i n g4 p v a ，3 s o d i u ma l g i n a t e ，1 5 a c t i v ec a r b o na n d 3 d i a t o m i t ei sv e r ys t a b l ea n ds h o w e das i m i l a rc r ( v i ) r e d u c t i o n r a t et ot h a to ft h e 丘c e l l i na d d i t i o n , t h ei m m o b i l i z e dq 5 1c e l l sh a v et h ea d v a n t a g e so v e r f r e ec e l l si n b e i n gm o r es t a b l e ，e a s i e rt or e u s e t h i s s t u d yp r o v i d e sp o t e n t i a la p p l i c a t i o n s o fan o v e l h i g h e f f i c i e n c y c h r o m a t e r e d u c i n gb a c t e r i u m f o rc r ( v i ) b i o r e m e d i a t i o n , a n dp r o v i d e ss o m eb a s i c k n o w l e d g eo ft h eq 5 1c h r o m a t e r e d u c i n gm e c h a n i s m s k e yw o r d s ：c r ( v 1 3 ；c r ( v i ) r e m o v a l ；c h r o m a t e - r e d u c i n gb a c t e r i u m ；i n t r a s p o r a n g i u m ；b a c t e r i a l i l l 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 一二二一一 缩略名词表( a b b r e v i a t i o n s ) 一一l - - - _ _ - - - - _ l _ - _ _ _ l i _ _ - i _ _ - l _ _ _ l _ _ - l l _ l _ - _ - - - _ - _ - 一 缩写 英文全称 中文全称 ：一 p v a p o l y v i n y la l c o h o l 聚乙烯醇 s a c a 洲 p e g i m o n a d h “s p c r s e l 心i t p b p o d s o d i u ma l g i n a t e c a l c i u ma l g i n a t e p o l y a c r y l a m i d e p o l y e t h y l e n eg l y c o l i m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m s 海藻酸钠 海藻酸钙 聚丙烯酰氨 聚乙烯乙二醇 固定化微生物 n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e - r e d u c e d 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 d i s o d i u ms a l t - t r i h y d r a t e t r i h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 扫描电子显微镜 d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核苷酸 b a s ep a i r o p t i c a ld e n s i t y 碱基对 光密度 m i c m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n 抗性用最小抑制浓度 一一_ _ - - l l l - - _ - - l l - - _ _ 一 w 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 2 口叩年乡月彦日 是否保密 否如需保密，解密时间 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生张杨辟霞 帆, z 0 0 7 年占月j 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 撇蝴始初评惺槲名：群斤 签名帆川7 年占月杏日签名吼卅年g 月4 石 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 利用游离和固定化铬( v 1 ) 还原菌除铬的研究 1 前言 1 1 铬的环境污染及危害 铬在自然界中分布广泛，其中以大气、水、土壤和食品为主。土壤中平均含 铬约1 0 1 5m g k g ，不同地区和不同土质的含铬量不同。河流水中铬含量约0 7 8 4p l 海水为 8 利用游离和固定化铬( v i ) 还原菌除铬的研究 a 矿 c u 2 + c d 2 + z n 2 + n i 2 + c 0 2 + l v i r l 2 + 。而且如果以上几种金属同时存在的情况 下，其影响会进一步加强( h a r d o y oa n do h t a k e ，1 9 9 1 ) 。 1 6 固定化细菌除铬( v i ) 的研究 目前，国内外的研究者对含铬i ) 废水的处理已经做了很多方面的研究，取得 了很多卓有成效的结果，证明利用铬( v i ) 还原微生物来处理环境当中的铬( v i ) 是具 有极大的发展潜力的，其中，固定化细菌处理含铬( v i ) 废水便是一种较好的方法。 固定化微生物技术( i m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m s ，i m o ) 是现代生物工程领域中 的一项新兴技术，是通过化学或物理手段将游离细胞或酶定位于限定的空间区域 内，使之保持活性并可反复利用的方法与技术( 王建龙，1 9 9 9 ) 。与传统的悬浮生物 处理法相比，固定化微生物技术具有效率高、反应易控制、细胞密度高、固液分 离效果好、对环境的耐受力强( 如p h 、温度、有机溶剂、有毒物质) 等优点，因而 在废水处理中受到重视，特别是在重金属废水处理中，表现出良好的效果，2 0 世 纪7 0 年代后迅速成为生物、环境等领域的一个研究热点。 1 6 1 固定化微生物的方法 固定化微生物技术处理重金属废水主要是利用重金属离子在固定化细胞载体 表面的吸附作用、重金属离子向载体内部的扩散传质作用、微生物细胞对重金属 离子的吸附作用及生物离子交换树脂作用等去除废水中的重金属离子。国内外研 究工作者一般认为制备固定化微生物的方法有4 种，即吸附法、共价结合法、交 联法和包埋法，而在实际应用中常常是上述二种或几种方法结合起来使用，其中 吸附法和包埋法是目前研究最广泛的方法。考虑到微生物的特性，微生物的固定 应该尽可能地在温和的条件下进行，以免细胞活性降低( 沈耀良等，2 0 0 2 ；胡庆吴 等，2 0 0 3 ) 。 吸附固定化，是微生物细胞通过自然附着力( 物理吸附、离子吸附) 等方式，固 定在载体表面和内部以形成生物膜。物理吸附是通过物理方法将微生物细胞吸附 到载体表面使之固定化。该法操作易行、反应条件温和、载体可重复使用，但细 胞结合不牢易脱落。化学吸附指通过离子键合作用将微生物细胞固着于带有相异 电荷的离子交换齐u ( d e a e 纤维、d e a e s e p h a d e x 、c m 一纤维等) 上。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 共价结合法，是利用细胞表面反应基团( 氨基、巯基、烃基、咪唑基等) 与已活 的无机或有机载体相反应，形成共价键来制得固定化细胞。此法中，微生物大多 死亡，应用并不广泛。 交联法微生物反应活性损失较大，且采用的交联剂大都比较昂贵，因此应用 受到一定限制。 包埋固定化，是将微生物包埋在凝胶的微小格子或微胶囊等的有限空间内， 微生物被限制在该空间内不能离开，而底物和产物能自由地进出这个空间。常用 的有凝胶包埋法、纤维包埋法和微胶囊法。包埋法是最常见的细胞固定化方法， 其操作简单，对细胞活性影响小且制备的固定化细胞球强度高，被广泛用于废水 处理研究。 1 6 2 固定化微生物的载体 用于微生物固定化的载体应具有对微生物无毒、抗微生物分解、机械强度高、 传质性能好、载体最好能再生并重复利用、固定化收率高、制备工艺简单、价格 便宜等一系列优点。目前用于吸附固定化的载体主要有：碎石、卵石、煤渣、焦 碳、硅藻土、多孔砖、石英砂、硅胶、沸石及活性碳等，其中以硅藻土和活性炭 应用最为广泛。用于包埋固定化材料有聚乙烯醇( p v a ) 、聚丙烯酰氨( p a m ) 、聚乙 烯乙二醇( p e g ) 、琼脂、海藻酸钙( c a ) 、角叉菜胶和聚丙稀酸等凝胶，其中以聚乙 烯醇和海藻酸钙应用最为广泛。用于交联固定化常用的交联剂有戊二醛、甲苯二 异氰酸脂、双偶联苯胺等( 王洪柞和刘世勇，2 0 0 5 ) 。固定化载体按成分可以分为天 然材料( 如琼脂，硅藻土，海藻酸钙等) 和化学合成材料( 聚乙烯醇，聚丙烯酰胺等) ， 天然材料的缺点是易被磨损和易降解，而化学合成材料可以在一定程度上弥补。 聚乙烯醇( p v a ) 是一种新型的微生物包埋固定化载体，具有机械强度高、化学稳定 性好、抗微生物分解性能强、对微生物无毒、价格低廉等一系列的优点，是一种 具有实用潜力的包埋材料( p a t t a n a p i p i t p a i s a le ta 1 ，2 0 0 1 ；p o o p a la n dl a x m a n ，2 0 0 8 ) 。 1 6 3 固定化细菌处理重金属废水的应用 与固定化藻类和固定化真菌相比，关于固定化细菌处理重金属废水的报道相 对较少。m i c h e l 等用聚丙烯酰胺包埋固定的柠檬酸细菌( c i t r o b a c t e rs p ) 处理重金属 l o 利用游离和固定化铬( v i ) 还原菌除铬的研究 废水，结果表明，在适宜的条件下，该固定化菌体能长期使用；使用单级固定化 细胞反应柱可去除废水q 9 0 以上的c d 2 + 、c u 寸、z n 2 + 、a u 3 + 等金属离子；使用三 级固定化细胞技术反应柱，金属去除率达1 0 0 ( m i c h e le ta 1 ，1 9 9 6 ) 。b r i e r l e y 等对 工业发酵中废弃的芽胞杆菌( b a c i l l u ss p ) 菌体加碱处理后进行交联固定化，用于 重金属废水的处理，结果表明，该固定化菌体可选择性的去除污水中的c d 、c r 、 c u 、h g 、n i 、p b 、u 、z n 等重金属，去除率高达9 9 以上，菌体吸附的重金属占 细胞干重的1 0 ( b r i e r l e y e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。但是，利用固定化微生物处理含铬( v i ) 废水 这方面研究得还是很少，报道过固定化铬还原细菌的有：微杆菌( p a t t a n a p i p i t p a i s a l e ta 1 ，2 0 0 1 ) ； 假单胞菌( k o n o v a l o v ae ta 1 ，2 0 0 3 ) ；芽胞杆菌( c a m a r g oe ta 1 ，2 0 0 3 a ) ； 链霉菌( p o o p a la n dl a x m a n ，2 0 0 8 ) 。 1 7 研究目的与技术路线 1 7 1 研究目的 目前对铬还原细菌的研究主要集中在假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) 和芽胞杆菌 ( b a c i l l u s ) ；并且许多微生物虽然具有铬( v i ) 还原能力，但其生长速度慢，导致铬( v i ) 的还原速率慢，处理周期较长；另外，微生物易受铬( v i ) 毒性的影响，很多菌种只 能处理低浓度铬( v i ) ，而实际铬污染环境中铬( v i ) 的浓度往往超出了这些菌种所能 承受的最大铬( v i ) 处理浓度，这就限制了还原菌种在实际铬污染治理中的应用。所 以，本研究的目的：( 1 ) 筛选铬高抗性的菌株，并从高抗性菌株中筛选出高效铬还 原菌，并且结合菌株的生长特性，优化菌株的铬还原条件，以取得较好的铬还原 效率；( 2 ) 把筛选出来的铬还原菌进行固定化包埋处理模拟含铬污水，为工业含铬 ( v i ) 废水的处理提供实验基础。 1 7 2 技术路线 本实验技术路线如下( 图1 2 ) ： 本实验以从湖南锰矿土样中筛选出来的一株高效铬还原菌为研究菌株，首先 对其进行细菌的分类鉴定；然后在实验室条件下，对该菌株的铬( v i ) 还原特性进行 研究，对其在还原过程中的生长特性，最适p h 进行了检测，并且对该菌株在不同 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 浓度的铬溶液中，以及在连续添加相同浓度的铬( v d 溶液中的还原情况进行了检 测；然后收集该菌株的静止细胞，检测不同的碳源对其还原的影响；最后通过固 定化细胞包埋技术，检测固定化细胞的铬( v i ) 还原能力。 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 细菌菌株 图1 2 本课题技术路线 f i g 1 2f l o wc h a r ti nt h i ss t u d y 重点研究的实验菌株q 5 - 1 分离自湖南锰矿土壤，还有两株菌株t 1 0 1 ，t 1 5 6 1 2 利用游离和固定化铬( v 1 ) i 五i 原菌除铬的研究 分离自天津一钢厂土壤。 2 1 2 实验培养基及组分 l b 培养基配方如下：胰蛋白胨( t r y p t o n e ) 1 0g ，酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 5g ， 氯化钠( n a c l ) 5g ，p h7 2 ，用蒸馏水定容至1l 。以上为液体培养基的配方，如要 配制固体培养基，则向液体培养基中加入1 5 琼脂粉即可。配好后在1 2 1 高压 灭菌3 0 m i n 。 2 1 3 试剂 常规试剂若非特别指出，均为国产分析纯。 铬标准贮备溶液： 1 0 0r t g m l0 2 8 2 9g 重铬酸钾( 优级纯) 溶于1 0 0 0m l 去离子水中。 铬标准使用溶液： 量取5m 1 铬标准贮备溶液于2 5 0 m l 去离子水中。 二苯碳酰二肼溶液：称取二苯碳酰二肼0 2g ，溶于5 0m l 丙酮中，溶解后 加水稀释至1 0 0 m l ，摇匀。贮于棕色瓶，置冰箱中。色变深后，不能使用。 1m o l l t r i s 缓冲液：将1 2 1 1gt r i s ( = 羟甲基氨基甲烷，生化试剂，分子量 1 2 1 1 ) 溶于8 0 0m l 重蒸馏水中，并加浓h c i ( 分析纯，分子量3 6 4 6 ) 调p h 至所 需值。将溶液冷却至室温，对p h 作最后的调节。将溶液体积调整为1l 。分 装成小份，进行高压灭菌。 5 0 x t a eb u f f e r 先用3 0 0m l 蒸馏水溶解t r i s 2 4 2 2g ，加入5 71 1 1 1 冰乙酸， 1 0 0m l5 0 0m m o l le d t a0 h 8 o ) ，用冰乙酸调节p h 8 0 ，然后加蒸馏水定容至 1l ，使用时稀释5 0 倍。 t eb u f f e r ：10m m o l lt r i s c 1 ( p h 8 o ) ，1m m o l le d t a ( p h 8 o ) 。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 2 1 4 主要仪器设备 表2 1 仪器和设备 t a b l e2 1t h ei n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t s 2 2 实验方法 2 2 1 铬( v i ) 还原菌的筛选 实验样品取自湖南一锰矿土壤，具体操作步骤如下： ( 1 ) 样品富集：精确称取新鲜土壤1 0 0g 于一2 5 0m l 灭菌三角瓶中，添加5i i l l o 1m o l l k e c r 0 4 母液混匀，使土壤中铬( v i ) 浓度为5m m o l l 。三角瓶加盖封好， 放置3 7 培养箱中富集7d ，富集过程中注意补加无菌水，确保样品不干。 ( 2 ) 铬( v i ) 抗性菌的分离：精确称取铬( v i ) 富集土壤样品1 0g 于装有9 0 面无 菌生理盐水( o 8 5 n a c l ) 的三角瓶中，置3 7 摇床中振荡半小时，取1 “土壤悬 液加入到9m l 无菌生理盐水中逐步稀释至l o ，1 0 。，1 0 。4 ，1 0 一，在1 0 一，1 0 4 ， 1 0 巧三个稀释度分别取0 1m 1 涂布在铬( v i ) 浓度为2m m o l l 的l u r i ab r o t h ( l b ) 培 养基平板上，每个稀释度涂布3 个平板，置3 7 c 培养箱中培养7d 。待菌落长出后 将平板置40 c 冰箱中待用。将平板挑取不同的菌落划线，确保得到单克隆，待菌落 长出后放4 0 c 冰箱中待用并用甘油冷冻管保存一份于8 0 。c 冰箱。 ( 3 ) 菌株的铬( v i ) 抗性测定：菌株的铬( v 0 抗性用最小抑制浓度( m i n i m a l 1 4 利用游离和同定化铬( v i ) 还原菌除铬的研究 i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ，m i c ) 来评价。在含铬( v i ) 浓度5m m o v l 一10m m o l l 的液 体l b 培养基中分别接种1 的新鲜菌液( o d 6 0 0 = 0 3 ) ，于3 7 c ，1 6 0r m i n 摇床中培 养3d 。所有重金属的抗性检测实验都做3 个平行重复，在1 0m m o l l 铬( v i ) 中可 以生长的菌株继续往更高铬( v i ) 浓度培养，以菌株不能生长的最低铬( v i ) 浓度为该 菌株的最小抑制浓度。 ( 4 ) 铬( v d 还原菌的筛选：虽然有些微生物对铬( v i ) 具有较强的抗性，但并不 说明其对铬( v i ) 有较好的还原作用。为了筛选到高效的铬( v d 还原菌，还必须对分 离出的菌种进行铬( v i ) 还原能力的初步检测。在2 5 0m l 三角瓶中装入5 0 1 1 1 1 铬( v d 浓度为1m m o l l 的液体l b 培养基，接种1 的新鲜菌液( o d 6 0 0 - o 3 ) ，于3 7 c ， 1 6 0r m i n 摇床中培养3d 。每2 4h 取样一次，每次取菌液2m l ，以6 0 0 0r m i n 离 心1 0m i n ， 取上清液，测定其剩余铬i ) 浓度。同时用无菌培养基做空白对照实 验。以此确定各菌种对铬( v i ) 的还原情况，挑选出还原效果最好的菌种，用于鉴定。 ( 5 ) 铬( v i ) 含量的测定( g b 7 4 6 6 8 7 ，1 9 8 7 ) ：铬( v i ) 的测定采用二苯碳酰二肼分光 光度法( g b t7 4 6 7 8 7 ) 。 标准曲线：分别量取0 ，0 5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0m l 铬标准使用溶液于加入到 5 0m 1 比色管中，用水稀释至刻度，加入5 0 硫酸o 5m l 和5 0 磷酸0 5m l ，摇 匀。加入二苯碳酰二肼溶液2m l ，摇匀。显色5 1 0m i n 后，于5 4 0n l t l 波长处比 色测定，根据得到的数据做标准曲线。 铬( v i ) 含量测定：取1m l ( 4 ) 中离心后上清液加入到5 0m 1 比色管中，用水稀释 至刻度，加入5 0 硫酸o 5m l 和5 0 磷酸o 5m l ，摇匀。加入二苯碳酰二肼溶液2 m l ，摇匀。显色5 1 0m i n 后，于5 4 0n l i l 波长处比色测定，在对照标准曲线可得 出铬( v i ) 含量。 2 2 2 铬( ) 还原菌的鉴定 2 2 2 1 形态学和生理生化分析 ( 1 ) 平板菌落形态观察：将新鲜菌液在l b 平板上接种划线，放置3 7 培养箱 中培养3d ，长出单菌落后观察菌落特征。 ( 2 ) 对其在光学显微镜和扫描电镜观察下细胞形态，扫描电镜观察具体准备步 骤如下： 1 5 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 菌体培养：在1 0 0m ll b 培养基中接种1 的新鲜种子菌液( 0 0 6 0 0 = o 3 ) ，3 7 。c ， 1 6 0r m i n 摇床中培养2 0h ，取3 0m 1 培养液在4 ，3 0 0 0r r a i n 低速离心1 0 m i n ，弃除上清，收集菌体于2m l 离心管中； 固定：加入2 5 戊二醛1 5m l ，固定5h ，3 0 0 0r m i n 低速离心5m i n 收集菌 体； 洗涤脱水：依次用3 0 ，5 0 ，7 0 ，8 5 ，9 5 的乙醇洗涤，每次加入乙醇 后，静置1 0m i n ，再3 0 0 0r m i n 低速离心3m i n ，弃上清，再加入高浓度乙醇； 冻干处理：乙醇处理完后，立刻把菌体冷冻真空干燥10h ； 上样观察：将冻干菌体用无菌牙签挑取适量，镀膜后进行扫描电镜观察。 ( 3 ) 对分离菌的部分生理生化特征进行检测，对菌株的碳源和氮源的利用，淀 粉水解，明胶液化，v p ，m r ，吲哚实验，产h 2 s 实验，氧化酶和过氧化氢酶 实验等，依据常见细菌系统鉴定手册进行检测( 赵斌和何绍江，2 0 0 2 ) 。 2 2 2 21 6 sr r n a 基因同源性比较 做菌落p c r ：用无菌牙签从平板中直接挑取菌体，加到5 0p l 的d d h ：2 0 中混 匀。1 0 0 水浴5 7m i n ，立即冰浴5 7m i n ， 1 2 0 0 0r m i n 离心3m i n ，上清液直 接用于p c r 扩增模板。 p c r 扩增引物采用细菌1 6 sr r n a 通用引物，为 2 7 f - 5 - a g a g t t t g a t c c t g g c t c a g 一3 14 9 2 r ：5 一g g t t a c c t t g t i 、a c g a c r r - 3 。 5 0 “lp c r 反应体系为：引物、d n t p 各lm ，t a q 酶0 5 山，1 0 x p c r 缓冲液 和m 9 2 + 各5p l ，和模板d n a 2l x l ，d d h 2 03 4 5m 。 p c r 反应扩增条件为：9 4 预变性5m i n ；9 4 变性，1m i n ；4 9 退火，1m i n ； 7 2 延伸，3m i n ，进行3 5 个循环；最后7 2 延伸1 0m i n 。p c r 产物经1 琼脂糖 凝胶电泳检测。纯化p c r 产物以后，送交北京三博远志公司的a b i3 7 3 0 x ld n a 测序仪测序，测序结果提交g e n b a n k 进行b l a s t 分析。 2 2 3 铬( v i ) 对茵体细胞形态的影响 准备两瓶l b 培养基各1 0 0m l ，其中一瓶加入o 5m 1o 1m o l lk 2 c r 0 4 母液使 铬( v i ) 终浓度为o 5m m o l l ，另外一瓶不添加铬( v i ) 。分别接种1 的新鲜种子菌 1 6 利用游离和固定化铬( v i ) 还原菌除铬的研究 液( o d 6 0 0 = 0 3 ) ，3 7 。c ，1 6 0 r m i n 摇床中培养2 0h 。然后将菌体进行扫描电镜观 察比较，具体步骤同2 2 2 1 ( 2 ) 中所描述。 2 2 4q 5 1 菌株对铬( v d 的还原效果 挑取q 5 1 单克隆接种到1 0 0m ll b 液体培养基中，置3 7 。c 摇床中振荡培养 2 4h ，此时细胞密度o d 6 0 0 为o 3 左右，保存在4 。c 冰箱，作为种子菌液用于接种。 以1 的接种量吸取1m l 到铬( v i ) 浓度为lm m o l l 的液体l b 培养基中，3 7 ， 1 6 0r m i n 摇床中培养，培养8h 后开始取样，每隔2h 取一次样，直至铬( v i ) 完 全还原为止，每次取2m l ，再用分光光度法分别测细胞密度( o d 6 0 0 ) 和铬( v i ) 浓度 ( o d 5 4 0 ) 。具体做法如下：一是测细胞密度( o d 6 0 0 ) ，以去离子水为参照，直接用1 5 1 1 1 1 的样测定其在波长6 0 0n l t l 处的吸光值；铬( v i ) 浓度( o d s 4 0 ) i 9 1 , j 定见以上2 2 1 ( 5 ) 中所述。实验同时设置不接种菌液的培养基作为对照，每个处理设置三个重复。 铬( v d 的去除率用以下公式计算： c i c f r = 三一j 1 0 0 g 其中，r ：铬( v i ) 去除率； c i ：铬( v i ) 初始浓度； c f ：处理一定时间后所测得的铬( v d 浓度。 2 2 5q 5 1 菌株边培养边还原下的铬( v i ) 还原效果 以1 的接种量接种li i l l 种子液到含铬( v i ) 的1 0 0m l 液体l b 培养基中，3 7 。c ， 1 6 0r m i n 摇床中培养，细菌在生长的过程中逐渐还原铬( v i ) ，每隔一定时间取一 次样测定其剩余铬( v i ) 含量，具体方法见2 2 1 ( 5 ) ，直至铬( v i ) 接近完全还原为止。 每个处理设置三个重复。 ( 1 ) p h 值对q 5 1 还原铬( v i ) 的影响 考察p h 值对q 5 1 菌株还原铬( v i ) 的影响，培养基的初始铬( v i ) 浓度为l m m o l l ，调节培养基的不同初始p h 值，分别为6 ，7 ，8 ，9 ，1 0 ，培养2 4h 后取 样检测，从而得知该菌株还原铬( v i ) 的最适p h 值。 ( 2 ) 不同初始铬( v i ) 浓度对q 5 1 还原铬( ) 的影响 1 7 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 通过加入不同量的铬( v i ) 母液，使培养基的初始铬( v d 浓度分别为2m m o l l ， 3m m o l l ，4m m o l l ，5m m o l l ，从培养2 4h 开始，每间隔1 2h 取样，测定剩余 铬( v d 浓度，从而得知q 5 1 在不同的铬( v i ) 浓度下的还原能力。 ( 3 ) 连续添加同一浓度的铬( v d 对q 5 1 还原铬( v i ) 的影响 为了考察q 5 1 对铬( v i ) 的连续还原能力，通过连续添加4 次1m lo 1 mk 2 c r 0 4 母液，使添加进去的铬( v i ) 浓度为1m m o l l ，后一次的添加在前一次的铬( v i ) 接近 完全还原的时候。从培养8h 开始，每间隔8h 取样检测。 2 2 6q 5 - 1 菌株先培养后还原下不同碳源对铬( v i ) 还原的影响 以1 的接种量分别接种1m 1 种子液到不含铬( v i ) 的4 瓶1 0 0m l 液体l b 培养基 中，3 7 ，1 6 0r m i n 摇床中培养，培养1 8h 后，4 ，6 0 0 0r m i n t 氐速离心1 0m i n ， 收集菌体；再把菌体用无菌的1 0m m o l l t r i s - h c l 缓冲液( p h 8 o ) 洗涤两次；最后用 2 0 0 m l 的该缓冲液悬浮菌体，使细菌处于静止状态。为了考察不同碳源对q 5 1 还原 铬( v i ) 的影响，在这2 0 0m l 的处于静止状态的悬浮菌体中加入铬( v i ) ，使其浓度为 0 2m m o l l ，然后每份取2 0m l ，一共取9 份，分别加入不同的碳源：葡萄糖( o 5 m m o l l ) ，乳糖( 0 5m m o l l ) ，蔗糖( o 5m m o y l ) ，醋酸钠( 0 5m m o l l ) ，n a d h ( 0 4 m m o l l ) ，甲醇( 1 o ，v v ) ，乙醇( 1 o ，v v ) ，同时设置两个对照，一个为不添加 任何碳源的c k + ，另一为热杀死细胞( 1 0 0 。c 下，加热1 0m i m ，考察细胞非生物活性 物质是否对还原有作用。将以上样品放置3 7 。c ，1 6 0r m i n 摇床中培养，6h 后取样 检测。每个处理设置3 个重复。 2 2 7 固定化菌株q 5 1 还原铬( v i ) 的效果 ( 1 ) 菌体培养 以1 的接种量分别接种种子液到液体l b 培养基中，3 7 ，1 6 0r m i n 摇床中 培养，培养1 8h 后，4 。c ，6 0 0 0r m i n 低速离心1 0m i n ，收集菌体； ( 2 ) 固定化小球的制备 将载体材料 p v a ，海藻酸钠( s a ) ，活性炭，硅藻土】按照不同的配比用恒温水 浴锅在9 0 。c 左右完全溶解后，冷却到4 0 。c 左右，将载体材料和收集的菌体混合， 然后用1 5i m 直径针头的注射器加压将混合液均匀的注射到含2 c a c l 2 的饱和 利用游离和同定化铬( v i ) 还原菌除铬的研究 硼酸溶液中，交联成球，静置过夜，用无菌水冲洗3 次后置于4 c 的冰箱中保存备 用。 ( 3 ) 固定化菌株q 5 1 还原铬( v i ) 效果 将( 2 ) 中