（微生物学专业论文）鼠李糖乳杆菌（lactobacillus+rhamnosus）高效生产l乳酸工艺研究.pdf

原刨性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 糍：啤攀抖 山东大学硕十学位论文 摘要 乳酸是三大有机酸之一，用途广泛，且其需求量在逐年增加。乳酸分子中具有不对称 碳原子。因此有l 一、d - 乳酸两种旋光异构体及d l 一乳酸外消旋体。由于人体只能代谢l 一乳酸， 因此在用于食品及医药工业时必然要用l 一乳酸代替d 卜乳酸。而l 一乳酸最具应用潜力的是 生产聚乳酸( p l a ) ，制造生物可降解性塑料，其市场潜力巨大，发展前景十分诱人。本论文 以一株产生l 一乳酸的鼠李糖乳杆菌( l a c t o b a c i l u s r h a m n o s u s ) 为研究对象，进行了高效 高产l 一乳酸发酵的工艺优化和动力学模型的研究工作，为实现l - t l 酸的工业化生产奠定了 基础。 本文探讨了影响鼠李糖乳杆菌高效高产l - 乳酸的因素。以不同浓度葡萄糖为碳源发酵 产l 一乳酸时，糖浓度为1 2 0 、1 4 6 9 l 时，l 一乳酸产量分别为1 0 4 、1 1 7 5 9 l ，产酸水平已 接近国内外该菌株的最高水平；加大接种量不能有效克服菌体生长延迟：高乳酸浓度对菌 体生长和产酸有显著抑制作用，初始乳酸浓度到达7 0 9 l 以上时，菌体基本停止生长和产 酸。三种常见的调节p h 的中和剂n a o h 、浓氨水、c a c o ，对于鼠李糖乳杆菌在5 l 发酵罐上发 酵产l 一乳酸和生长有明显不同的影响。 酵母粉是鼠李糖乳杆菌最佳的复合氮源，然而酵母粉成本较高，因此，减少酵母粉用 量或寻找廉价的复合氮源替代酵母粉具有重要的经济价值。用廉价的黄豆粉补充微量维生 素液，可替代培养基中昂贵的酵母粉。氮源经优化后，使用3 5 4 5 的黄豆粉并添加最优 剂量的八种维生素混合液，摇瓶和5 l 发酵罐上l 一乳酸产量和得率基本达到了以酵母粉做氮 源和生长因子的发酵指标。 为了能够进一步高效高产l 一乳酸，进行了各种补料和连续培养生产l 一乳酸。由摇瓶 分批补料和5 l 发酵罐鼠李糖乳杆菌三种分批补料方式的实验得知，与分批发酵相比，发酵 动态变化过程没有显著的差别，补料并没有有效地促进鼠李糖乳杆菌的生长和代谢而高效 高产l 一乳酸。分批补料的条件和方式还有待进一步研究。 鼠李糖乳杆菌5l 发酵罐中限氮条件下恒化连续培养生产l 一乳酸，0 = 0 1 5l h 的稀 释率已经到达了氮源限制培养条件下的临界稀释率，随着稀释率从0 0 5l h 到0 1 5l h 的变化的过程中，菌浓、l 一乳酸的产量、l 一乳酸的得率是逐渐降低，残糖的含量逐渐上升， 山东大学硕十学位论文 比容积产率在d = o 1 2 5l h 时有最大值。限氮条件下，因为菌的生长被限制，仅只能以较 低的稀释率进行恒化连续生产l 一乳酸。 发酵罐反复分批发酵生产l 一乳酸，第一次发酵过程l - $ l 酸浓度为9 3 9 l ，得率为9 3 ， 残糖为5 9 l ，第二次l 一乳酸浓度为1 0 8g l ，得率为8 3 8 ，残糖约3 0 9 l ，延长发酵时日j ， 有可能得到更高的乳酸浓度。 淀粉质原料是工业化生产乳酸的常见原料，实验研究了双酶同时糖化发酵产l 一乳酸的 工艺。通过淀粉质原料糖化实验，考虑到原料的来源和价格，选用红薯粗淀粉和玉米粉作 为发酵产l 一乳酸的淀粉质原料。正交实验得知，影响双酶糖化效率的因素的最佳条件为： 湿热灭菌处理原料，4 2 糖化温度、l o i j g 干物质的a 一淀粉酶和2 5 0 u g 干物质的糖化酶用 量。 比较不同浓度淀粉质原料双酶糖化的糖化效果，得知，玉米生粉双酶糖化的淀粉质塘 化效率随着淀粉质浓度的升高而升高，因而可以用高浓度玉米生粉双酶糖化后进行鼠李糖 乳杆菌的l 一乳酸发酵。2 5 0 9 l 的红薯粗淀粉湿热灭菌、玉米粉湿热灭菌、玉米粉干热灭菌 三者摇瓶培养同时糖化发酵产生l 一乳酸浓度分别是1 2 9 、1 1 8 、“i g l ，l - 乳酸对淀粉质原 料的转化率分别是5 4 9 、6 1 5 、5 7 9 ；2 0 0 9 l 可溶性淀粉和玉米生粉同时糖化 发酵产生的l 一乳酸浓度分别为1 2 0 和1 1 5 9 l ，l - 乳酸对淀粉的的转化率为6 3 8 和7 4 9 ；由此可见，玉米生粉的l 一乳酸转化率要高于可溶性淀粉、红薯粗淀粉，原料的利用程 度较高因而以玉米生粉为原料进行同时糖化发酵产l 一乳酸为经济可行的方法，能得到较 高的l 一乳酸产量和得率。玉米生粉5 l 发酵罐同时糖化发酵得到了优于摇瓶的结果，l 一乳酸 产量为1 3 1 9 l ，对淀粉的转化率为8 5 3 。玉米生粉分批反复补料同时糖化发酵生产l 一 乳酸，第二批发酵结束时l 一乳酸浓度为1 2 1 9 l ，得率为8 7 6 。 最后，为了模拟l 一乳酸发酵的动态过程和指导生产，为鼠李糖乳杆菌l 一乳酸发酵的 建立了动力学模型。 关键词：鼠李糖乳杆菌，l 一乳酸发酵，- r e c g t f g ，同时糖化发酵，动力学模型 山东大学硕十学位论文 p r o c e s so p t i m i z a t i o nf o re f f i c i e n tp r o d u c t i o no fl l a c t i c a c i du s i n gl a c t o b a c i l l u sr h a m n o s u s a b s t r a c t l a c t i ca c i di so n eo ft h et h r e eo r g a n i ca c i d st h a th a st h eb i g g e s tm a r k e t a n dh a sb e e nu s e di n m a n yf i e l d s t h em o l e c u l a l s t r u c t u r eo fl a c t i ca c i dh a sa s y m m e t r yc a r b o na t o m s oi th a st h r e e k i n d so fo p t i c a li s o m e r ：l 1 a c t i ca c i d d 1 a c t i ca c i da n dd l 1 a c t i ca c i dr a c e m i z e d i nt h ef o o d s t u f f a n dm e d i c i n ei n d u s t r yda n dd l - l a c t i ca c i ds h o u l db er e p l a c e db yl l a c t i ca c i db e c a u s et h e h u m a nb o d yc a no n l ym e t a b o l i z el - l a c t i ca c i d m o r e o v e r , t h ep o t e n t i a lu s eo fl - l a c t i ca c i dt o p r o d u c ep o l y l a c t i ca c i df o rs y n t h e s i so fb i o d e g r a d e i n gp l a s t i c ，m a k e si tt oh a v ee v e ng r e a t e r p o t e n t i a lm a r k e t i nt h i sp a p e ras t r a i no fl a c t o b a c i l l u sr h a m n o s u st h a tc a np r o d u c el 1 a c t i ca c i d w a ss t u d i e d a n df e r m e n t a t i o np r o c e s sf o rp r o d u c t i o no fl 1 a c t i ca c i dw i t hh i g hp r o d u c t i v i t ya n d e m c i e n c yw a so p t i m i z e d a n dt h ef e r m e n t a t i o nd y n a m i cw a ss t u d i e da n ds i m u l a t e d s o m eo ft h ef a c t o r st h a te n h a n c el r h a m n o s u si np r o d u c i n gl 1 a c t i ca c i dw i t hh i g h e f f i c i e n t l yw e r ei n v e s t i g a t e d m e ng l u c o s ew a su s e da st h ec a r b o ns o u i c ：e 1 2 0a n d1 4 6 9 lo f a c o s ew e r ec o n v e r t e dt o1 0 4a n d1 1 7 5 e e lo f l l a c t i ca c i d ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l tw a sc l o s e t ot h eh i g h e s tl e v e lr e p o r t e d h o w e v e ri n c r e a s i n gt h ei n o c u l a t i o nv o l u m ec o u l dn o to v e r c o m et h e g r o w t hd e l a yr e s u l t e df r o mt h es u b s t r a t ei n h i b i f i o n h i g hc o n c e n t r a t i o no fi n i t i a ll 1 a c t i c a c i d s e v e r e l yi n h i b i t e dt h eg r o w t ha n dp r o d u c t i o no fl 1 a c t i ca c i d w h e ni n i t i a l l l a c t i ca c i d c o n c e n t r a t i o nw a sb e y o n d7 0 9 ，l ，t h eg r o w t ha n dl l a c t i ca c i dp r o d u c t i o ns t o p p e d t h r e ek i n d so f n e u t r a l i z a t i o nr e a g e n t su s e df o rp he o n t r o lh a dd i f f e r e n te f f e c t so nt h eg r o w t ho fl r h a m n o s u s a n dp r o d u c t i o no fl 1 a c t i ca c i d y e a s te x t r a c te n h a n c e dl a c t i ca c i dp r o d u c t i o ng r e a t l y , a l t h o u g hi ti se x p e n s i v e t h ec h e a p e r s o y b c a nf l o u rs u p p l e m e n t e dw i t l lam i x t u r eo fv i t a m i n sc a nr e p l a c et h ee x p e n s i v ey e a s te x t r a c t a f t e rt h eo p t i m i z a t i o n 3 5 - - 4 5 o fs o y b e a nf l o u rs u p p l e m e n t e dw i t ho p t i m a la m o u n to ft h e m i x t u r eo f e i g h tk i n d so f v i t a m i n sp r o d u c e dl - l a c t i ca c i do f1 0 4 9 lf r o m1 2 0g lg l u c o s ew i t l i t h ey i e l do f8 6 7 u s i n gf l a s kc u l t i v a t i o n a n dl l a c t i ca c i do f1 2 8g lf r o m1 5 0g lo fg l u c o s e w i t ht h ey i e l do f8 5 3 u s i n g5lf e r m e n t o rc u l t i v a t i o n , r e s p e c t i v e l y 。w h i c hr e s u l t sw e r e c o m p a r a b l et ot h ef e r m e n t a t i o nr e s u l t su s i n gy e a s te x t r a c ta st h en i t r o g e ns o u r c ea n dg r o w t h f a c t o r s i no r d e rt op r o d u c em u c hl 1 a c t i ca c i de f f i c i e n t l y ，t h ep r o c e s s e so ff e d b a c t hc u l t u r ea n d c o n t i n u o u sc u l t u r ew e r ei n v e s t i g a t e d f r o mt h ef e d - b a t c he x p e r i m e n t a lr e s u l t so f r h a m n o s u s f e r m e n t a t i o ni nf l a s k sa n d5 lf e r m e n t o r , t h ed y n a m i cp r o c e s so ff e r m e n t a t i o nh a dn oo b v i o u s d i f f e r e n c eb e t w e e nb a t c ha n df e d - b a t c hf e r m e n t a t i o n ；f e d b a t c hc u l t u r ed i dn o te f f e c t i v e l y p r o m o t et h eg r o w t ha n dl a c t i ca c i dp r o d u c t i o n t h ec o n d i t i o n sa n dm e a n so ff e d b a t c hc u l t u r e n e e dt ob ef u r t h e rs t u d i e d 6 山东大学硕t 学位论文 u s i n gc o n t i n u o u sc u l t u r e ，t h ep r o c e s so ft h eg r o w t ha n dp r o d u c t i o no fl l a c t i ca c i do fl r h a m n o s u sw a si n v e s t i g a t e di n5 lf e r m e n t o ru n d e rl i m i m t i o no fn i t r o g e ns o u r c e t h er e s u l t sw e r e a sf o i l o w s ：t h ed i l u t i o nr a t ew i t h1 3 = 0 1 5l hh a da l r e a d ya r r i v e da tc r i t i c a ld i l u t i o nr a t eu n d e rt h e c o n d i t i o n o f r e s t r i c t e d n i t r o g e ns o u r c e w h i l e t h e d i l u t i o nr a t e i n c r e a s e df r o m 0 0 5l h t o0 1 51 1 1 t h eb i o m a s s ，t h eo u t p u to fl l a c t i ca c i d ，a n dt h ep r o d u c t i v i t yg r a d u a l l yr e d u c e d ，h o w e v e r , r e s i d u a l g l u c o s ew a si n c r e a s i n gg r a d u a l l ya n dt h es p e c i f i cv o l u m ep r o d u c t i v i t yw a st h em a x i m u mw i t h d ：o 1 2 5l 1 1 b e c a u s et h eg r o w t hw a sl i r n i n e du n d e rr e s t r i c t e dn i t r o g e n8 0 u r c e c o n t i n u o u s c u l t u r eo f l r h a m n o s u sc a l lo n l yp r o d u c el l a c t i ca c i dw i t hl o w e rd i l u t i o nr a t e i nr e p e a t e df e d b a t c hf e r m e n t a t i o n , t h ef i n a lc o n c e n t r a t i o no fl 1 a c t i ca c i dw a s9 3 叠，l ，t h e p r o d u c ty i e l dw a s9 3 a n dt h er e s i d u a l 羽u c o s ew a s5 9 li nt h ef i r s tf e r m e n t a t i o np r o c e s s ；w h i l e t h ef i n a lc o n c e n t r a t i o no fl l a c t i ca c i da r r i v e dl o s g l t h ep r o d u c ty i e l dw a s8 3 8 a n dt h e r e s i d u a lg l u c o s ew a s3 0 9 li nt h es e c o n df e r m e n t a t i o np r o c e s s s t a r c hi sau s u a lm a t e r i a li ni n d u s t r i a l i z e dl 1 a c t i ca c i df e r m e n t a t i o n 1 1 1 ec r u d e p a c h y r h i z u ss t a r c ha n dr a wc o r nf l o u rw e r es e l e c t e da sm a t e r i a l sf o rl l a c t i ca c i dp r o d u c t i o n u s i n gs i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o d t h eo p t i m a lr e s u l tf o rd i e n z y m a t i c s a c c h a r i f i c a t i o no fs t a r c h i n e s sm a t e r i a lw a s ：w e ts t e r i l i z e dm a t e r i a la d d i n ga - - a m y l a s eo f1 0 u g d r ym a t e r i a l ，g l u c o a m y l a s eo f2 5 0u g - d r ym a t e r i a l ，a n ds a c c h a r i f i c a t i o nt e m p e r a t u r eo f4 2 t h es a c c h a r i f i c a t i o ne f f i c i e n c yo fr a we o mf l o u rw a si n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n go ft h e s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n h i g l ll l a c t i ca c i dc o n c e n t r a t i o nw a so b t a i n e db ylr h a m n o s u s f e r m e n t a t i o nu n d e rh i 曲r a wc o l af l o u rc o n c e n t r a t i o n 2 5 0g lo fw e ts t e r i l i z e dc r u d ep a c h y r h i z u s s t a r c h ，w e ts t e r i l i z e dc o r nf l o u ra n dd r ys t e r i l i z e dc o mf l o u rp r o d u c e dl2 9 、1 18 、1 llg ll l a c t i c a c i d ，w i t ht h ey i e l do f5 4 9 ，6 1 5 ，5 7 9 ，r e s p e c t i v e l y 2 0 0 以o fs o l u b l es t a r c ha n dr a wc o r n f l o u rp r o d u c e d1 2 0a n d1 1 5g ll l a c t i ca c i dw i t hy i e l do f 6 3 8 a n d7 4 ，9 ，r e s p e c t i v e l y , u s i n g s s f t h ee 衔c i e n c yo fr a wc o r nf l o u rc o n v e r t i n gt ol l a c t i ca c i dw a sh i 【g h e rt h a ns o l u b l es t a r c h a n dc r u d ep a c h y r h i z u ss t a r c h t h e r e f o r e i ti se c o n o m i c a lt op r o d u c el l a c t i ca c i du s i n gr a wc o r n f l o u ru s i n gs s fm e t h o d r a wc o r nf l o u ro f2 0 0 9 & u s i n gs s fi n5 lf e r m e n t o rc o u l dp r o d u c e 13l 乩o fl 1 a c t i ca c i dw i t ht h ey i e l do f8 5 3 t h er a wc o r nf l o u ru s i n gr e p e a t e df e d b a t c h c u l t u r ec o u l dp r o d u c eh i g hc o n c e n t r a t i o no fl 1 a c t i ca c i di n5 lf e r m e n t o ru s i n gs s f ，w i t ht h e f i n a lc o n c e n t r a t i o no f l 1 a c t i ca c i do f1 2 1 e d la n dt h ey i e l do f8 7 6 o f t h es e c o n df e r m e n t a t i o n s t a g e i no r d e rt os i m u l a t ed y n a m i cp r o c e s so fl 1 a c t i ca c i df e r m e n t a t i o n , t h em a t h e m a t i cm o d e l s o f l l a c t i ca c i df e r m e n t a t i o nw e r ec o n s t r u c t e d k e y w o r d s ：l a c t o b a c i l l u sr h a m n o s u s ，l - l a c t i c a c i df e r m e n t a t i o n ，k i n e t i c sm o d e l ， t e c h n i c so p t i m i z a t i o n 。 s i m u l t a n e o u ss a e e h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n ( s s f ) 7 山东大学硕十学位论文 1 绪论 1 1 乳酸的结构、性质及其应用 1 1 1 乳酸的结构和性质 乳酸( l a c t i ca c i d ) ，乳酸是一种天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物 中，分子式为c h ，c h ( o h ) c 0 0 f j ，即2 一羟基丙酸( 2 - - h y d r o x y p r o p i o n i ca c i d ) ，分子量为9 0 0 8 。 纯净的无水乳酸是白色的晶状固体，熔点是1 6 8 ，沸点1 2 2 ( 2 k p a ) ，相对密度1 2 4 9 。 乳酸与水可以完全互溶，不易结晶出来。浓度在6 0 以上的乳酸溶液有很强的吸湿性。在 6 7 1 3 3 p a 的真空条件下反复分馏，可以得到纯品的乳酸结晶。乳酸通常是乳酸( c h “0 0 和乳酰乳酸( c 。h 积) 的混合物，为无色透明或浅黄色糖浆状的粘性液，几乎无臭或带有脂 肪臭味，味酸，与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙酮混溶，但几乎不溶于氯仿，石油 醚、二硫化碳和苯f 1 埘。 乳酸可分为工业级、食品级和药典级。工业级乳酸是含量为5 0 9 0 的乳酸溶液，具 有吸湿性，煮沸浓缩时，可缩合为乳酰乳酸和2 一乳酰羟基一丙酸，加热稀释后又转化为乳酸： 食品级的乳酸含量为8 0 以上，药典级的乳酸含量在8 5 5 9 0 o f 3 ，4 j 。 据旋光性乳酸可分为d - - 孚l 酸、l 一乳酸和两者的混合物d l 一乳酸3 种，l 一乳酸、d 一乳酸分 子结构式如下图所示【2 1 。 h 3 c “ d ( 一) 一孥l 酸 o h h 吃c l ( + ) 一孥l 酸 由于人体和动物体内只含有l 乳酸脱氢酶，因而只能利用自体产生或摄入的l 一乳酸。 l 。乳酸是哺乳动物体内正常代谢产物，在体内可被分解为氨基酸和二羧基产物，( 经) 机体 实验证明：d l 乳酸可以使肝中肝糖增高，d 乳酸使血中乳酸盐增高，( 由尿中排出体外， 因而，) 过量食用d 或d l 乳酸，会导致血液中富含d 乳酸，尿中会出现高浓度d 一乳酸现 象，引起代谢紊乱，因此世界卫生组织( w h o ) 限制人体每天摄入d 乳酸量应该在1 0 0 m g k g 3 山东大学颅士学位论文 以下，d 型、d l 型乳酸不应加入到三个月以下婴儿的食品中，对l - ? l 酸却不限制【3 】。所以 在食品、酿造以及医药行业中应使用l 广乳酸，而在其他行业中对乳酸的构型不加限制。 由于乳酸含有一个羟基和一个羧基，因此它可以参与许多反应。如氧化反应、还原反应、 缩合反应和酯化反应等1 5 1 a 充分脱水而形成的聚合物中，聚合体的一般形式可以表示为鸭 nc h 3 c h o h c o o h _ h o - ec h c o o h n + ( n 一jh 2 0 c h 3 另外，加热乳酸时发生自动酯化，可形成乳交酯： 毗一c h c 一0 l1 00 i 1 0 一c c h c h 3 1 1 2 乳酸的应用 乳酸及其衍生物应用广泛，应用的范围涉及到以下的行业 】。 1 1 2 1 食品业 乳酸是世界普遍使用的酸味剂，主要用于饮料、糕点、酒类等隅i 。它的酸味柔和爽口， 既能使食品具有微酸性，又不掩盖水果和蔬菜的天然风味与芳香。在国内，乳酸是除柠檬 酸以外的第二大酸味剂。在食用香料中，乳酸多用作黄油、乳酪、牛奶等乳制品香精的组 分【卯。另外，l 乳酸和d 乳酸在机体内的代谢途径不同，特别是婴幼儿，由于部分脏器发 育不全，不能够代谢d 乳酸，d 乳酸在体内的积累可能引起急性尿酸值升高。在欧共体的 允许使用食品添加剂名单中。乳婴强化牛奶和婴幼儿断奶食品中只允许使用l 乳酸和l 一乳 酸盐川。 在酿造工业中，1 0 0 0 l 糖化醪中加入l l 食品级乳酸，能促进糖化完全，提高啤酒品级， 并延长保质期【9 1 0 l ：乳酸作为灭菌剂能防止杂菌繁殖，促进酵母菌发育，防止酒混浊；乳 酸作为风味剂能改善酒的品味、提高酒的收率。 1 1 2 2 医药工业 乳酸可直接配制成药，乳酸盐可作为消毒剂u 。乳酸具有亲水性，能溶解蛋白质、角 质及许多难溶药物，且对病变组织腐蚀作用相当敏感，可以增加药物吸收量，减少副作用。 9 山东人学颂t 学位论史 此外，乳酸可用来制取红霉素糖衣，在收敛性杀菌方面可作含漱剂、注入剂、洗净剂等。 另外，高度光学异构的聚l 一乳酸( l ( l + d ) 9 2 ) 在骨外科、人造手术缝合线、血管外科 及药物缓释材料方面有良好的应用前景。而且乳酸及其酯类是常用且价格便宜的手性起始 物，目前已用于合成有光学活性的医药和农药1 1 2 】，其中乳酸乙酯可作压制药片的润滑剂。 1 1 2 3 生产生物降解材料 塑料废弃物己成为威胁全球环境的主要因素之一，为解决塑料废弃物对环境造成的污 染问题，许多国家已开始研究、生产和使用可降解塑料1 1 3 】。经多年研究发现，以乳酸为原 料合成的乳酸聚合物具有很好的生物降解性【1 4 】，这种高分子材料不仅具有良好的化学惰性 和易加工性，还有良好的生物相容性，而且它的分子链经生物或化学作用破坏后，失去物 理强度并脆化，经自然界的风化作用变成粉末进入土壤，然后在微生物的作用下重新进入 生物循环。用乳酸生产生物降解塑料，在世界上具有极大的市场发展潜力，目前己成为国 内外开发的热点项目。 以乳酸为原料生产的乳酸酯类，具有溶解性好、无毒，易回收等优良特点，是可降解 的绿色环保型有机溶剂1 1 5 1 。例如，乳酸乙酯在- r 业a e 被用作增塑剂和溶剂，是人造珍珠的 高级溶剂；乳酸酯可用于香料、合成树脂涂料、胶粘剂、印刷油墨等生产中，还可应用于 石油管道的清洗和电子工业清洗1 6 1 。 1 1 2 4 日化行业 乳酸可用于配制清洁用品、护肤露或沐浴液。乳酸及其钠盐和钙盐可用做化妆品的保 湿剂，而且对改善皮肤组织结构，消除皱纹、色斑，治疗皮肤粗糙、痤疮等具有明显效果【6 1 。 1 1 2 5 其他应用“” 在制革业中，用4 0 的乳酸能除去革鞣皮中的石灰，俗称脱灰，脱灰后的皮革较用其 他酸脱灰质量好，因此，高级皮革均用乳酸处理。在卷烟业中，用乳酸除去烟草中的杂质， 清除苦辣味以提高烟草档次。此外乳酸在工业生产中作为p h 值调节剂；在毛纺业中用于预 铬媒染，以降低羊毛的铬酸盐含量并防止纤维氧化：在丝绸和人造丝中起增艳作用。 1 2 乳酸的生产方法 1 2 1 发酵法 发酵法制备乳酸是以淀粉、葡萄糖等糖类或牛乳为原料，接种微生物( 乳酸菌或霉菌) 经发酵生产而得。 1 0 山东大学硕十学位论文 按乳酸菌发酵糖类经过的过程和生成产物不同，可将乳酸发酵分为同型乳酸发酵 ( h o m o f e r m e n t a t i o n ) 、异型乳酸发酵( h e t e r o f e r m e n t a t i o n ) 、双歧( b i f i d u s ) 发酵途径和混合 酸型乳酸发酵( m i x e da c i df e r m e n t a t i o n ) 1 2 , 1 7 1 。 1 2 1 1 同型乳酸发酵 乳酸是葡萄糖代谢的唯一产物，采用的是e m p 途径，由丙酮酸经乳酸脱氢酶还原成乳 酸，经过此途径，l m o l 葡萄糖可生产2 t o o l 乳酸，理论转化率为i 0 0 ，但由于发酵过程中 微生物有其他的生理活动存在，实际理论转化率不可能达1 0 0 ，一般认为转化率在8 0 以 上者，即视为同型乳酸发酵田。 1 2 1 2 异型乳酸发酵 异型乳酸发酵是某些乳酸菌利用h m p 途径，分解葡萄糖为5 磷酸核酮糖，再经差向 异构酶作用变成5 磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶的作用下发生裂解反应，生成乙酰磷酸 和3 磷酸甘油醛，3 磷酸甘油醛进一步还原为乳酸。异型乳酸发酵的菌种除生成乳酸外， 还生成乙醇、c 0 2 和乙酸。此过程l m o l 己糖生成l m o l 乙酸、i t o o lc 0 2 和i m o l 乳酸。乳酸 对糖的转化率最大只有5 0 i “。 1 2 1 3 双歧( b i f i d u s ) 发酵途径 双歧发酵是两歧双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u mb i f i d u m ) 发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。此 途径中有两种酮解酶参与反应，即6 磷酸果糖磷酸酮解酶和5 磷酸木酮糖磷酸酮解酶分 别催化6 一磷酸果糖和5 一磷酸木酮糖的裂解反应，产生乙酰磷酸、4 磷酸赤藓糖和3 一磷 酸甘油醛、乙酰磷酸1 2 1 。其发酵途径如下： ，乙酰磷酸乙酸 磷酸果糖礴酸齐肆糖 i 葡萄蓿 + 乙酰磷酸乙酸 礴酸果靖礴酸虎糖亘至二3 礴酿甘油睦_ 丙酮醯一5 磊习 6 磷酸果糖礴酸酮辟醇 5 磷酸木舅糖奔酸酮解蠢 其发酵总反应式为： 0 g h l l q 一躲b ( - k ) i - k x x ) h + a c t - h 0 2 0 h 此发酵过程中，2 t o o l 的葡萄糖可生成2 m o l 乳酸和3 m o l 的乙酸，乳酸的转化率理论上 只有5 0 。 1 2 1 4 混合酸发酵 山东大学硕士学位论文 它是同型乳酸发酵菌在特殊情况下，如葡萄糖浓度受到了限制、p h 提高或温度降低， 而采用的种乳酸发酵机制，它经由与同型乳酸发酵相同的途径即e m p 途径，但丙酮酸的 代谢途径发生了改变，除了生产乳酸外，还生产了甲酸、乙醇等副产物。传统意义上的同 型乳酸发酵或异型乳酸发酵是针对乳酸细菌而言，米根霉作为好氧真菌，靠呼吸产能并提 供合成菌体的中间体，就发酵产物而言，其发酵类型属混合酸发酵，它经由e m p 途径生成 丙酮酸，然后再进入t c a ( 三羧酸) 循环，副产物有机酸是乳酸的前提物质一丙酮酸在一 些酶的作用下生成的【2 1 。 1 2 2 化学合成法 直到1 9 6 3 年，美国m o n s a n t o 公司才开始采用化学合成法来生成乳酸f 增j ，在以前，都 是通过发酵法来生产。由化学合成法生产乳酸可通过多种途径，其中最具有现实意义的是 乳腈法1 8 1 ，该法是乙醛与氢氰酸经催化作用生成粗乳腈，粗乳腈通过蒸馏回收纯化并用浓虢 酸或浓硫酸水解为粗乳酸，租乳酸用甲醇酯化得到乳酸甲脂，精馏后再行水解生成乳酸， 浓缩纯化后分不同产品等级装运，甲醇可再循环使用。 乳酸的其他一些可行的化学合成途径包括糖的碱性催化水解、丙烯7 , - - 醇氧化、乙醛、 一氧化碳和水在高温高压下反应和乙二醇的硝酸氧化等，但这些途径都无法形成技术上或 经济上可持续发展的过程脚。 1 2 3 酶转化法 1 2 3 1 2 一氯丙酸酶转化法“ ， 日本东京大学的本崎等人研究了用酶法生产乳酸，他分别从恶臭假单孢菌和假单孢菌 1 1 3 细胞中抽提纯化出l 2 卤代酸脱卤酶( 简称为l 酶) 和d l 卤代酸脱卤酶( 简称为d l 一 酶) ，使之作用于底物d l 2 氯丙酸，即可制得l 碍l 酸或d - 乳酸。l 一酶催化l 2 一卤代酸脱卤 得到d 乳酸，而d l ，酶既可催化l 2 卤代酸脱卤得到d 乳酸，又可催化d 一2 一卤代酸脱卤得 到l 。乳酸。催化是发生如下的构型转化： 。一型c 旷r 一+ 邺蠕一型盱r c 。o 一+ 岫l - 型c 旷r 洲坤枷叫盱r 洲悯 a o h d l 酶 d 一型时掣一c o o h + 呐。一型c 伊? 卜。0 0 叶帕 或卜型 占i 或d 型 ：h 山东大学硕士学位论文 1 2 3 2 丙酮酸酶转化法 h u n n d 等1 4 l 从乳杆菌d s m 2 0 1 9 6 中得到了酶活最高的d 一乳酸脱氢酶，以无旋光性的丙 酮酸为底物得到d 乳酸。 1 2 4 乳酸生产方法的比较 化学合成法的缺点是产品为外消旋乳酸即d l 乳酸，另外，由于合成法所用的原料是 乙醛和剧毒物氢氰酸，尽管美国食品和药物管理局( f d a ) 己将合成的乳酸列为安全食品， 但发达国家人民还是不能放心食用合成法制得的乳酸2 叭，因而，合成法生产乳酸大大受到 了限制，此外其生产成本也较高。 酶法生产乳酸虽可以专一性的得到旋光乳酸，但工艺比较复杂，应用到工业上还有待 于研究。 微生物发酵法生产乳酸，可以通过菌种和培养条件的选择而得到具有立体专一性的d 一 乳酸或l 乳酸或者是两异构体以一定比例混合的消旋体，可以满足生产聚乳酸的需要。另 外发酵法生产乳酸除能以葡萄糖、乳糖等单糖外，还能以淀粉、纤维素为原料发酵生产乳 酸，利用这些可再生资源不会导致环境污染。因此，微生物发酵法生成乳酸因其原料来源 广泛、生产成本低、产品光学纯度高等优点而成为生产乳酸的重要方法。 1 3 乳酸发酵技术进展 1 3 1 乳酸发酵菌种的选择和改良 用于发酵生产乳酸的菌种有乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、链球菌属( s t r e p t o c c o c c u s ) 、乳 球菌属( l a c t o c o c c u s ) 、芽孢杆菌属以及米根霉( r h i z o p u s o r y z a e ) 等| 1 7 , 1 9 2 1 】。 优良的生产菌种是保障工业乳酸发酵良好经济效益的关键，国内外很多研究者在菌种 的选择和改良上作了很多有成效的工作【翻。 t a s i l z 3 1 等设计了一套慎密的工业乳酸发酵菌种筛选和育种方案。通过2 轮8 套筛子， 筛选出耐高温、耐乳酸的合格菌种。 c a r l s o n & p e t e r s 报告了耐乳酸同型发酵乳酸菌的筛选1 2 4 1 ，从玉米浸渍浆水( c o r ds t e e p w a t e r ) 中分离i 株在葡萄糖和玉米浆水的培养基d p 4 7 。c 发酵产乳酸接近l o o g l 。 一般的乳酸菌不产淀粉酶，但淀粉分解乳酸菌( a m y l o l y t i cl a c t i ca c i db a c t e r i a ， a l a b ) 则能产淀粉酶。z h a n g & c h e r y a n 研究了食淀粉乳杆菌n r r lb 4 5 4 2 直接从淀粉发酵生产l 一乳酸的条件1 2 5 1 。淀粉的起始浓度为1 2 0 9 l ，从液化淀粉出发，可在2 0 h 生产出浓度为 9 6 2 9 l 的乳酸。 山东大学硕十学位论文 近年来芽孢杆菌发酵产生乳酸受到关注。d a r m e r 等f 2 纠用嗜热脂肪芽孢杆菌菌株i f a 6 和 i f a 9 ，以葡萄糖为碳源，6 5 分批培养发酵生产l 一乳酸，转化率分别为6 0 5 8 4 o 和9 8 7 。p a y o t 等报导【2 7 1 ，筛选得到能在5 2 。c 生长的一株凝结芽孢杆菌t b 0