（微生物学专业论文）壳聚糖纳米粒子抑菌效果及免疫效果评价.pdf

k ， l 黑龙江大学硕士学位论文 以上结果表明，可用离子交联法制备具有生物安全性和良好缓释效果的载 b c v - n 蛋白壳聚糖纳米粒子。这为将壳聚糖应用于新型免疫佐剂，将b c v - n 蛋白 制成缓释制剂应用于临床研究提供了试验支持。 关键词壳聚糖纳米粒子；缓释；牛冠状病毒核衣壳蛋白；抑菌；免疫佐剂 一i i l a b s t r a c t a b s t r a c t c h i t o s a n , a san a t u r a lp o s i t i v e l yc h a r g e dp o l y m e rw h i c hi sr i c hr e s o u r c e ，l o wc o s t , g o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n db i o d e g r a d a b l e ，n o n - t o x i c ，i ta l s oh a sm a n yf u n c t i o n ss u c ha s a n t i b a c t e r i a l ，s t e r i l i z a t i o n , a n t i - t u m o r , i m p r o v ei m m u n o c o m p e t e n c e ，p r o m o t et i s s u e r e p a i ra n dh e m o s t a s i s i th a sv e r yw i d ep r o s p e c ti nb i o m e d i c a lf i e l d c h i t o s a nw a sm a d e i n t os u s t a i n e dr e l e a s ep r e p a r a t i o nc o u l dr e d u c et h et i m e so f a d m i n i s t r a t i o n ；i ta l s oc o u l d i m p r o v et h ed r u gs a f e t y , e f f e c t i v e n e s sa n dr e l i a b i l i t y t h ei d e a la d j u v a n ts h o u l dp o s s e s s m a n yc h a r a c t e r s s u c ha s n o n t o x i c ，n o n - i m m t m o g e n i c ，g o o db i o c o m p a t i b i l i t y , b i o d e g r a d a b l e ，c a ne f f e c t i v e l yi n d u c e do re n h a n c e dc e l l u l a ri m m u n i t ya n dl o n g e f f e c t i v e n e s s ，t h e r e f o r e ，c h i t o s a nh a st h ep o t e n t i a lv a l u et od e v e l o pan e wi m m u n e a d j u v a n t c h i t o s a nn a n o p a r t i c l e s ( c n p ) w e r ep r e p a r e db yi o n i cc r o s s - l i n k i n gm e t h o d , t h e c r o s s - l i n k i n ga g e n ti st p p t h eb a c t e d o s t a t i ca b i l i t yw r i t ss t u d i e da tt h es a m et i m e t h e p a r t i c l es i z ea n a l y s i sa n da f m r e s u l t ss h o w e dt h a t , t h ec n pw a sg r a i n y ，咖s i z ew a s u n i f o r m , a n dh a dg o o dd i s p e r s i b i l i t y t h ep a r t i c l ed i a m e t e ro fc n pw h i c hw e r e p r e p a r e db yf o u rd i f f e r e n tt p pc o n c e n t r a t i o n sw a s14 12 8 + 0 0 2 6 n m 、2 9 13 2 a ：0 0 3 2 r i m 、 4 4 3 3 3 + 0 1 0 4 n ma n d7 0 2 8 4 + 0 0 6 3 n mr e s p e c t i v e l y t h es t u d yr e s u l t so fb a c t e r i o s t a t i c a b i l i t yw e r ef o u n dt h a tc n ps h o w si n h i b i t o r ye f f e c ta g a i n s te c o l ia n ds a u r e u s ，t h e e f f e c ti sb e t t e rt h a nc h i t o s a n ，a n dt h ei n h i b i t o r ye f f e c to fc n pa g a i n s ts a u r e u si s s u p e r i o rt oe c o l is l i g h t l y c n pw a sl o a d e dw i t hb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a sm o d e ld r u gb y a d s o r p t i o n t h ee f f e c to fa d s o r p t i o nc o n d i t i o n so na d s o r p t i o nr a t ew a sd i s c u s s e d ；i nv i t r or e l e a s e b e h a v i o ro fc n pl o a dw i t hb s aw a ss t u d i e ds u b s e q u e n t l y t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e a d s o r p t i o nm t ew a s2 1 8 2 a ：1 4 3 a f t e ro p t i m u ma d s o r p t i o nc o n d i t i o n s ，t h ec u m u l a t i v e r e l e a s ea m o u n to fb s af r o mc n pw a s3 2 9 8 + 2 3 5 ，a n di ti n d i c a t e d g o o d s u s t a i n e d - r e l e a s ep r o f i l eo fc n p 一i i i 黑龙江大学硕士学位论文 i nt h es t u d yo fi nv i v oi n l m u n e ，b o v i n ec o r o n a v i r u snp r o t e i na sm o d e ld r u g a d s o r p t i o no n t oc n p , t h ea d s o r p t i o nr a t ew a sr e a c h e dt o7 3 2 6 士1 3 2 t h eb c v - nl o a d c n pw a su s e dt oi m m u n i z eb a l b cm i c eb yi n j e c t i o n t h ed y n a m i ca n t i b o d yl e v e lo f i g gi g ma n di g ai ns e r u mw a sm o n i t o r e db yi n d i r e c te l i s a t h er e s u l ts h o w e d 也矾 t h es u s t a i n e dr e l e a s ee f f e c to fc n pw a ss i g n i f i c a n t l y ，a n di th a sn o n - i m m u n o g e n i c ，i t c o u l ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h ei g gl e v e lo fm i c ea f t e ri m m u n i z e d i nc o n c l u s i o n , c n pa d s o p t i o nw i t hb c v - nc a nb ep r e p a r e db yi o n i cc r o s s l i n k i n g m e t h o d t h ep r e p a r e dc n pi ss a f ea n dh a sg o o ds u s t a i n e dr e l e a s ee f f e c t s c n pi sa p o t e n t i a ln e w i m m u n ea d j u v a n tf o rt h et r a n s p o r to fb c v - n k e y w o r d s ：c h i t o s a nn a n o p a r t i c l e s ；s u s t a i n e dr e l e a s e ；b o v i n ec o r o n a v i r u snp r o t e i n ； b a c t e r i o s t a s i s ；i m m u n ea d j u v a n t i v + 目录 目录 中文摘要i a b s tr a c t i i i 第l 章绪论1 1 1 壳聚糖概述1 1 2 壳聚糖的抑菌活性研究1 1 3 壳聚糖在药物缓释系统中的研究概况。3 1 3 1 在缓释片剂中的应用3 1 3 2 在缓释微球中的应用4 1 3 3 在缓释纳米粒子中的应用5 1 3 4 在缓释膜中的应用6 1 4 牛冠状病毒7 1 5 壳聚糖在新型佐剂中的研究概况一8 1 6 本论文研究目的及意义。8 第2 章材料与方法1 0 2 1 实验材料与仪器1 0 2 1 1 实验材料及试剂1 0 2 1 2 实验仪器10 2 2 实验方法1 1 2 2 1 壳聚糖的纯化及脱乙酰度的测定1 1 2 2 2 壳聚糖分子量的测定1 2 2 。2 3 壳聚糖纳米粒子的制备1 2 2 2 4 壳聚糖纳米粒子的结构表征1 3 2 2 5 壳聚糖纳米粒子的抑菌效果评价13 2 2 6 壳聚糖纳米粒子对b s a 的吸附性能研究1 4 2 2 7 载b s a 壳聚糖纳米粒子的体外释放研究1 5 一v 一 1 i i 黑龙江大学硕士学位论文 2 2 8 载b c v - n 蛋白壳聚糖纳米粒子的体内免疫效果评价1 5 第3 章结果与讨论18 3 1 壳聚糖的纯化及脱乙酰度的测定1 8 3 2 壳聚糖分子量的测定。：1 8 3 3 壳聚糖纳米粒子的结构表征1 9 3 4 壳聚糖纳米粒子的抑菌效果评价。2 7 3 5 壳聚糖纳米粒子对b s a 的吸附性能研究2 8 3 5 1t p p 浓度对吸附率的影响。2 9 3 5 2b s a 浓度对吸附率的影响3 0 3 6 体外释放研究3 2 3 7 体内免疫效果评价3 3 3 7 1 载b c v - n 蛋白壳聚糖纳米粒子的吸附率测定3 3 3 7 2 体内免疫效果评价3 3 结论：4 0 参考文献4 l 致谢4 8 攻读学位期间发表的学术论文。4 9 独创性声明5 0 一v i 第1 苹绪论 第1 章绪论 1 1 壳聚糖概述 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素经不同程度脱乙酰化的产物，由n 乙酰氨基葡萄糖 以洳1 ，4 糖苷键缩合而成聚2 氨基一2 脱氧p 葡萄糖【1 瑚。外观呈白色或淡黄色， 略有珍珠光泽，约1 8 5 c 分解，可溶解于矿酸、有机酸及弱酸稀溶液 4 1 ，但是不溶 于稀硫酸和磷酸。目前常用脱乙酰度和平均相对分子量作为评价壳聚糖性能的重 要指标，如利用脱乙酰度来判断壳聚糖的溶解性，脱乙酰度越高，壳聚糖分子链 上的游离氨基就越多，在酸溶液中溶解性就越好；而壳聚糖平均相对分子量的大 小则影响着壳聚糖高分子絮凝剂的性能，平均相对分子量越大，分子间的缠绕程 度就越大，溶解度越小，但由于原料和制备工艺不同，壳聚糖的这两项指标也有 所不剐5 1 。 壳聚糖分子中的功能基团十分丰富，包括羟基、氨基、吡喃环、氧桥等功能 基，因此，在一定条件下；可以发生生物降解、水解、烷基化、磺化、酰基化、 缩合、络合、氧化还原等化学反应，由此制备出具有不同性能的衍生物 6 1 。将壳聚 糖通过改造、修饰其侧链基团而赋予新衍生物以新的生物活性也是目前研究的热 点之一。 壳聚糖溶于酸后，其分子中的氨基可以发生质子化而使自身带正电荷。壳聚 糖来源丰富，成本低，制备简单，具有良好的生物相容性、生物可降解性、无毒 性、成膜性和极强的可塑性，日益受到人们的重视【7 - - 9 ，同时，壳聚糖还具有抗菌、 杀菌、抗肿瘤、提高免疫能力、促进组织修复及止血作用 1 0 , 1 1 】，因此在生物医学领 域也有极广阔的前景。 1 2 壳聚糖的抑菌活性研究 壳聚糖可以有效的抑制多种细菌如a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ，b a c i l l u sc e r e u s ， c o r i n e b a c t e r i u mm i c h i g a n e n e c e ，e r w i n i as p ，e r w i n i ac a r o t o v o r as u b s p ，e s c h e r i c h i a c o l i k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e m i c r o c o c c u sl u t e u s p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s ，和真菌如b o t r y t i sc i n e r e a ， 一1 一 黑龙江大学硕士学位论文 d r e c h s t e r as o r o k i a n a ，f u s a r i u mo x y s p o r u m ，m i c r o n e c t r i e l l an i v a l i s 。p i r i c u l a r i a o r y z a e ，r h i z o c t o n i as o l a n i ，t r i c h o p h y t o ne q u i n u m 的生长繁殖，是一种广谱型抑菌 剂。与普通抑菌剂相比，它具有广谱性、高抑茵活性、高杀菌率以及毒性低等优 点【1 2 4 1 。其抑菌性能受到如壳聚糖的浓度、分子量、介质p h 值、脱乙酰度等诸多 因素的影响。 不同浓度壳聚糖的抑菌效果是不同的。w a n g ”1 研究了壳聚糖对大肠杆菌和金 黄色葡萄球菌抑菌效果。研究结果表明，用含有0 5 或1 壳聚糖的培养基在p h 5 5 条件下培养大肠杆菌2 天，可导致菌体完全失活；而当壳聚糖浓度超过1 ， 在p h5 5 下与大肠杆菌培养1 天便可导致菌体完全失活。壳聚糖浓度为1 1 5 时， 在p h5 5 或6 5 条件下培养金黄色葡萄球菌2 天，菌体全部失活。刘艳如等【1 6 】研 究了5 种不同浓度的壳聚糖的抑菌性能，谢勇等【1 7 】研究了在2 种不同p h 下，8 种 浓度的壳聚糖的抑菌性能。结果都表明，随着壳聚糖浓度增加，抑菌性能也得到 加强。t a h a 等【1 8 1 也认为一定条件下，随着壳聚糖浓度的升高，抗菌性能也增强。 大量研究结果表明，分子量是影响壳聚糖抑菌性能的重要因素。s h i n 等【1 9 】研 究发现，高分子量壳聚糖相对于低分子量壳聚糖以及水溶性壳寡糖的抑菌效果要 更加突出。j e o n 等口川的研究也证实这一结果，指出分子量是抑制微生物生长的最 重要的影响因素。o m u r a 等【2 1 】研究结果表明，分子量为1 1 ，0 0 0 3 0 ，0 0 0 的壳聚糖对 革兰氏阴性菌的抑菌性能最强；然而对革兰氏阳性菌，随着壳聚糖分子量的增大， 抑菌性能反而降低。由此可见，壳聚糖的抑菌性能受到分子量的影响，而且针对 不同的菌体特征影响的效果也不同。在一定条件下，壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑 菌性能是随着分子量的增大而增强的；而低分子量的壳聚糖对革兰氏阳性菌的抑 菌性能强于高分子量的壳聚糖。 p h 值对壳聚糖的抑菌性能也有重要影响。n o 等瞄1 报道，壳聚糖的抑菌性能 在p h4 5 5 9 的范围内，随p h 值的升高而降低。谢勇等【1 7 1 研究了3 种不同p h 值 对壳聚糖抑制幽门杆菌性能的影响，结果表明壳聚糖的抑菌性能随p h 值的降低而 增强，但是低p h 酸性溶液本身对菌体的抑制效果并未提及。这可能是因为在壳聚 糖的等电点以下的时候，p h 值越低越有利于壳聚糖解离出大量的质子化的氨基， 一2 一 第1 章绪论 它能够与细胞表面的阴离子基团相互作用，可以与细菌表面的化合物形成聚合电 解质络合物，藉此在细胞膜上产生一层不可渗透的膜，阻止细胞生长所需要的组 分进入细胞，扰乱细胞正常的生理功能，从而达到杀菌的目的。1 2 3 脱乙酰度也能影响壳聚糖抑菌性能。王鸿等【硐对3 种不同脱乙酰度壳聚糖的 抑菌性能进行研究，结果表明，脱乙酰度越高，抑菌性能越强。c h e n 等口5 1 的研究 也证实这一结果，认为脱乙酰度是影响壳聚糖抑菌性能的重要因素之一。由此可 见，壳聚糖c - 2 位上的氨基对壳聚糖的抑菌性能至关重要。 另外，改变壳聚糖的形态也有可能会对其抑菌性能有积极的影响。z h a o 等1 2 0 3 研究了聚乙烯醇羧甲基化壳聚糖共混水凝胶的制备及其抑菌性能，这种共混水凝 胶可以很好的抑制大肠杆菌的生长。i g n a t o v a 等【2 7 1 对制备出的壳聚糖季铵盐与聚乙 烯基吡咯烷酮混合纤维进行抑菌性能评价结果表明，该混合纤维对大肠杆菌和金 黄色葡萄球菌都显示出极好的抑菌性能。这些研究为壳聚糖在生物医学领域提供 了很好的应用前景。 1 3 壳聚糖在药物缓释系统中的研究概况 采用传统药物剂型进行给药，常导致血药浓度变化幅度大。大多数药物都是 在给药后便迅速释放，致使机体内药物浓度迅速增加，甚至达到中毒浓度，随后 又很快回落。这些剂型通常导致药物在体内有效作用时间短，并有可能在某一阶 段对机体产生副作用。 药物缓释系统( d r u gs u s t a i n e dr e l e a s es y s t e m ) 出现于2 0 世纪7 0 年代，是药 物传递系统( d r u gd e l i v e r ys y s t e m ) 中的一种。它可使药物以缓慢的速率释放， 使血液或组织中的药物浓度在较长时间内保持在有效治疗指数范围内，而延长了 药物在给药部位的滞留时间，藉此达到缓释的效果【2 8 - 3 。而利用壳聚糖制备的缓 释制剂可以提高药物安全性、有效性及可靠性，可以调整药物释放速率，减少给 药次数。 1 3 1 在缓释片剂中的应用 虽然壳聚糖不溶于水，但其分子结构中含有弱碱性的游离氨基，使得壳聚糖 一3 一 黑龙江大学硕士学位论文 分子表面带有正电荷，因此，壳聚糖在弱酸性环境下呈现出线性高分子电解质， 表现出凝胶能力。人们利用壳聚糖的这种性质，将壳聚糖作为辅料与药物混合压 片。给药后，片剂表面的药物首先释放，释放后在表面留下很多孔，同时壳聚糖 膨胀形成凝胶，使介质不能很快进入片剂内部溶解药物，药物从留下的孔隙中缓 慢释放出来，从而达到缓释效果【3 2 】。 p a r k 等【3 3 】利用壳聚糖的氨基与聚羧乙烯的羧基的静电作用结合而成的共聚 物，制备了缓释片剂，很好的解决了单独使用聚羧乙烯制备片剂存在的p h 依赖性 的问题。通过使用不同辅料作为对照，进行了体内体外药物释放的考察，证明了 使用壳聚糖与聚羧乙烯的共聚物作为骨架片材可以有效地提高药物的缓释效果。 n u n t h a n i d 等瞰】使用喷雾干燥技术，将壳聚糖制备成微粒，然后用作缓释片剂 的粘合剂而制备片剂。药物与壳聚糖微粒以l ：1 的质量比物理混合，模型药物分 别选用酸性药物( 水杨酸) 和碱性药物( 无水茶碱) ，对照辅料为聚乙烯吡咯烷酮， 压片时加入质量百分比为1 的硬脂酸镁作为润滑剂。分别考察了使用1 、2 和 3 的壳聚糖微粒及聚乙烯吡咯烷酮作为辅料对片剂硬度、易碎性、崩解时间的影 响，结果表明，使用3 的壳聚糖微粒作为粘合剂与常用粘合剂聚乙烯吡咯烷酮所 制片剂的参数最为贴近。体外释放试验首先选用蒸馏水作为介质，使用聚乙烯吡 咯烷酮所得片剂药物在1h 内迅速释放完全，而使用质量百分比浓度分别为1 、 2 、3 的壳聚糖微粒所得片剂中，药物分别于第3 、1 0 和2 4 小时释放完全。可 见随着壳聚糖使用量的增加，药物释放速度逐渐缓慢，缓释效果逐渐明显。随后 选定3 的壳聚糖微粒作为粘合剂，考察片剂在蒸馏水、0 1m o l l 盐酸和p h6 8 的磷酸缓冲液3 种介质中的释药情况，药物累积释放量分别于第6 、1 6 和2 4 小时 接近1 0 0 。可见，使用喷雾干燥所得壳聚糖微粒作为粘合剂而制备片剂，可明显 提高对药物释放的控制，具有良好的缓释效果。 1 3 2 在缓释微球中的应用 壳聚糖分子中的带有正电荷的氨基可与带有负电荷的抗衡离子通过复合凝聚 法或离子凝胶法交联成微球，这些抗衡离子包括藻酸盐、羧甲基纤维素及三聚磷 一4 一 一 _ 第1 苹绪论 酸盐【3 5 1 。目前制备壳聚糖微球的方法主要有乳化交联法、液中干燥法、复乳法、 沉淀凝聚法、复乙酰法、喷雾干燥法和壳聚糖包衣法【3 6 】。由于壳聚糖微球具有药 物缓释效果、组织靶向性、和提高药物稳定性的能力，近年来国内外都围绕着壳 聚糖微球展开大量研究。 s h a n m u g a n a t h a n 等1 3 7 采用新型油包水乳剂技术和离子凝胶技术研$ t j t 载多西 霉素的壳聚糖微球。水相是壳聚糖的醋酸溶液，油相使用的豆油与正辛醇体积比 为1 ：2 ，乳化剂是5 的s p a n 8 0 ，使用平衡溶胀法来包埋多西霉素。在扫描电镜 下观察，所得空白微球表面光滑，并呈现多孔性质，微球平均粒径为2 0 8 岫，粒 度分布均匀。采用m t t 法对生物相容性进行考察，结果表明，对照组中使用的未 经壳聚糖微球包载的多西环素浓度超过2 0 0p , g ，即对成纤维细胞显示出了毒性； 而包载过的多西环素浓度达到4 0 01 t g ，也未显现毒性；结果还表明，使用载药微 球可有效提高细胞存活率。体外释放结果表明，药物6h 突释了4 2 以后，即达到 了平衡浓度，2 4h 内累计释放量维持在7 2 左右；而未经壳聚糖微球包载的多西 环素2 4h 内累计释放量达到了9 7 ，由此可见，利用壳聚糖微球包载多西环素， 缓释效果比较明显。 g e 等1 3 8 1 使用乳化化学交联法制备载大豆黄素的壳聚糖微球，液体石蜡和 s p a n 8 0 作为油相。所得空白微球表面光滑，载药微球平均粒径为7 2 9 1 岬，分散 系数为0 5 5 3 。使用高效液相色谱法测定微球的载药量为3 1 0 4 。体外释放结果表 明，2 4h 药物累计释放4 9 5 9 ，第3 5 天累计释放量才达到9 3 1 3 。该研究又对 雄性i c r 大鼠肌肉注射进行体内释放考察，结果第3 天药物释放9 5 4 后，药物 便保持均一释放，直到第3 5 天释放完全，体外和体内释放结果均表明，用壳聚糖 微球包载大豆黄素可以达到缓释目的。 目前以壳聚糖为载体包封的药物类型广泛，包括蛋白质【3 9 , 4 0 、疏水性药物【4 、 抗癌药物【4 2 】、疫苗【4 3 蛔、酶类等 4 7 1 。 1 3 3 在缓释纳米粒子中的应用 纳米粒子是指直径在1 0 1 0 0 0 n m 之间的固态粒子。药物分子通过溶解、包裹 一5 一 黑龙江大学硕士学位论文 于壳聚糖纳米粒子内部，或者通过正负电荷吸附作用附着于粒子表面。壳聚糖纳 米粒子的优势是其微小的体积，这可以使它们直接作用于细胞，可以增加蛋白质 及多肽类药物的稳定性，降低药物在机体内的副作用，延长药物疗效。使用壳聚 糖纳米粒子作为药物缓释系统的载体是近年来国内外学者研究的热点之一。 a k t a s 等【4 8 】选用三聚磷酸钠作为交联剂，用离子交联法制备壳聚糖纳米粒子， 粒径约为3 1 3 - 4 1 2 n m ，正电位为2 0 2 8 m v 。纳米粒子对z - d e v d f m k 肽的最大载 药能力为0 4 6 ，并且在2 4 小时释放6 5 ，表现出较好的缓释能力。郭英等 4 9 1 采 用乳化化学交联法制备载阿司匹林壳聚糖纳米粒子，平均粒径控制在2 0 3 0 n m ， 药物包封率最高可达7 9 。体外释放研究表明，6 小时内药物突释比较明显，释放 率达6 0 ，6 1 6 小时累计释放率上升至8 0 左右，释放速度较为平缓，2 5 小时以 内，药物仍持续释放，缓释效果明显。 1 3 4 在缓释膜中的应用 壳聚糖具有良好的成膜性，将其制备成缓释膜植入生物体内或者覆盖在创伤 表面时，药物可持续作用，同时壳聚糖引起的生物组织反应小，且可被组织中的 酶降解。 季娟娟等【5 0 】利用壳聚糖作为高分子载体材料负载生长因子，然后定植于钛种 植体表面，从而促进牙种植体植入后与周骨的结合，这样可以利用壳聚糖保护生 长因子的生物活性，又能够帮助生长因子缓释来促进新骨的形成。使用脱乙酰度 为9 0 5 6 的壳聚糖，采取溶剂蒸发法，选用无生物毒性的三聚磷酸钠作为物理交 联剂。得到的壳聚糖缓释膜表面呈现多孔结构，最大孔径1 1 5 8 p r o ，最小孔径 3 9 2 1 m a ，平均孔径7 5 4 1 a m 。降解实验结果：该壳聚糖膜在第1 、2 、3 、4 周的降解 率分别为1 3 6 7 、1 8 9 2 、2 2 3 5 、3 6 7 3 ，可见该壳聚糖膜随着时间的增长， 重量不断减少，表现出较为良好的可降解性。释放率结果：模板药物牛血清白蛋 白在壳聚糖膜中第1 、2 、4 、6 、8 天的释放率分别为：2 0 1 、2 3 7 7 、2 6 4 4 、 3 0 9 7 、3 3 1 3 ，可见b s a 的释放量随着时间的增加而恒定增加，表明该壳聚糖 膜的确有缓释作用。另外，该研究又选取原代培养的胎鼠颅骨成骨细胞，采用改 一6 一 - 第1 章绪论 良m t t 法检测壳聚糖膜对成骨细胞的毒性。结果与壳聚糖膜直接接触的原代培养 的成骨细胞第o 5 、2 、3 、5 天的相对增值率均在1 0 0 以上，毒性分级为0 级；第 1 天的相对增值率在9 0 以上，毒性分级为1 级，表明该壳聚糖缓释膜无细胞毒性。 在众多药物缓释系统中，利用壳聚糖微球、纳米粒子作为缓释药物的载体是 一种很有前景的应用方式，一方面它不但可以防止载入缓释系统的药物被蛋白酶 水解，而且可以延长药物的半衰期；另一方面，壳聚糖微球、纳米粒子还可提高 药物的生物利用度5 1 , 5 2 。此外，还可用药物和适当的磁活性成分( 如f e 3 0 4 ) 共同分 散于壳聚糖中，然后制成壳聚糖磁性纳米粒子。将其应用于机体后，在外部介入 足够强的磁场，便可以渐渐地把药物定向于靶点，使药物可以定位释放。近年来， 壳聚糖磁性纳米制剂已经成为国内外学者研究的新方向【5 3 彤】。 1 4 牛冠状病毒 牛冠状病毒( b o v i n ec o r o n a v i r u s ，b c v ) 是牛的- - 种致病性病毒【5 6 1 ，分类学上属 于冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子大小约为1 0 7 1 6 0 r i m ，并具有囊膜，是所有 r n a 病毒中最大的【5 7 1 。牛冠状病毒是引起牛腹泻的主要病原之一，感染牛以出血 性腹泻为特征，因为对犊牛具有较高的致死率，因此又称新生犊牛腹泻冠状病毒， 牛冠状病毒也是成年牛患冬季痢疾的主要病原，而冬季痢疾是一种季节性爆发性 强的疾病，临床以发病率高、传播快、严重腹泻和产奶量明显下降为特征，奶牛 和黄牛均可发生【5 8 1 。 预防牛冠状病毒腹泻的关键在于体内产生特异性抗体。初生犊牛可以通过吸 吮初乳和常乳达到被动免疫的目的，母牛分娩时乳汁中的牛冠状病毒抗体含量很 高，之后迅速下降，犊牛可以将吸收后的免疫球蛋白分泌到肠腔，并吸附至小肠 粘膜上，以此延长被动免疫时间。犊牛自然感染牛冠状病毒时可以对病毒产生主 动免疫，但是腹泻最可能发生在被动免疫下降而主动免疫尚未形成之前【5 9 1 。因此， 如何延长抗体在体内存活的时间是近年来动物医学者讨论的难点。 牛冠状病毒核衣壳蛋白( n u c l e o c a p s i d ) 是指牛冠状病毒的蛋白核酸复合体。 牛冠状病毒n 蛋白比较保守，其羧基端更加保守，既可以作为冠状病毒的诊断抗 一7 一 黑龙江大学硕士学位论文 原，又具有很强的免疫原性 6 0 l 。 1 5 壳聚糖在新型佐剂中的研究概况 理想的佐剂应具备以下几个特点：无毒性、无免疫原性、较好的生物相容性、 可生物降解、能有效诱导或增强细胞免疫及长效性。壳聚糖来源丰富，具有良好 的生物相容性、无毒性、生物可降解性。壳聚糖能增强细胞免疫和免疫调节的特 点已广见报道，k a n g 等【6 l 】用壳聚糖微球作为佐剂包埋支气管炎博德特菌，通过鼻 腔对小鼠进行免疫，然后测定小鼠的血清、洗鼻液及唾液中的i g a 、i g g 抗体水平， 结果发现，在血清和洗鼻液中，壳聚糖微球都能显著提高l e a 、i g g 的抗体水平， 但是在唾液中未能检测出抗体。z a h a r o f f 等【6 2 1 利用壳聚糖作为佐剂包埋1 3 半乳 糖苷，通过皮下注射免疫小鼠，结果证实壳聚糖佐剂既可以增强体液免疫作用， 又可以增强细胞免疫作用，并且特异性抗体的水平高于对照组的5 倍，细胞免疫 效果高于对照组的6 倍。另外，该研究还指出，载p 半乳糖苷的壳聚糖注射入体 内后，会首先形成一个抗原储存库，然后再将抗原缓慢释放，另外壳聚糖还可以 促进淋巴细胞的增殖，证实了壳聚糖作为佐剂的长效性。y a n g 等【6 3 】以壳聚糖纳米 粒子为佐剂包载猪白细胞介素2 因子，通过肌肉注射对小鼠免疫，通过e l i s a 操 作检测血清中i g g 、i g a 、i g m 、i l 一2 、i l - 4 、i l - 6 和特异性抗体效价均达到一定水 平，结果显示壳聚糖纳米粒子与对照组相比，可显著提高免疫球蛋白、细胞因子、 特异性抗体和淋巴细胞的水平。由此可见，壳聚糖作为新型佐剂具有广阔的应用 前景，将壳聚糖赋予更多的形式作为新型佐剂有待于进一步研究和开发。 1 6 本论文研究目的及意义 药物剂型的发展已经从最初的丸散膏丹发展到片剂、注射剂、浇泼剂、散剂 直至目前的缓释制剂。为了达到缓释的目的，自2 0 世纪7 0 年代以来，许多高分 子材料都被用作药物载体材料，通过形成微球、纳米粒子的形式达到药物缓释的 目的。但是至今为止，选择一种来源广泛，生物相容性好，可以通过不同的方式 对其进行修饰以达到不同的应用目的的材料仍然是研究人员寻求的目标。而壳聚 糖不仅来源广泛，生物相容性好，无毒性，而且具有特殊的可塑的结构。 一8 一 第1 章绪论 有关壳聚糖及其聚合物抗菌性能的研究表明，壳聚糖不仅具有天然抗菌性能， 而且具有广谱抗菌性。但是在改变形态后，其抑菌性能可能会改变。而本课题中 利用离子交联法制备的壳聚糖纳米粒子都是通过利用壳聚糖的氨基，改变壳聚糖 的形态，因此，需要对制备成的壳聚糖纳米粒子进行抑菌效果评价。 本研究以壳聚糖为材料，利用离子交联法，制备出粒度均一，分散性好的壳 聚糖纳米粒子，并考察其抑菌效果。以b s a 为药物模板，进行与壳聚糖纳米粒子 的吸附性能研究，并进行体外试验考察缓释效果。最后采用最优吸附条件对壳聚 糖纳米粒子吸附牛冠状病毒n 蛋白后免疫b a l b c 小鼠，利用间接e l i s a 方法对 壳聚糖纳米粒子的缓释作用进行免疫学效果的评价，为应用于动物疫苗研究及临 床应用提供实验基础。 一9 一 黑龙江大学硕士学位论文 第2 章材料与方法 2 1 实验材料与仪器 2 1 1 实验材料及试剂 b c v - n 蛋白：哈尔滨兽医研究所制备提供； 壳聚糖( 脱乙酰度9 0 ) ：国药集团化学试剂有限公司； b r a d f o r d 蛋白质定量试剂盒：p 1 5 1 0 ，普利莱基因技术有限公司； 三聚磷酸钠：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂； 大肠杆菌；黑龙江大学微生物重点实验室提供； 金黄色葡萄球菌：黑龙江大学微生物重点实验室提供； h r p 山羊抗小鼠i g g 、i g a 、i g m ：s i g m a 公司； 四甲基联苯胺( n 但) 显色液：天根生化科技有限公司； 实验使用其它试剂均为分析纯。 l b 培养基配方： 取1 0 9 蛋白胨，5 9 酵母膏及1 0 9 氯化钠用蒸馏水定容至1 0 0 0 m l ( 固体培养基 另外加入2 0 9 琼脂) ，调p h 至7 0 ，最后于1 2 1 灭菌2 0 分钟。 2 1 2 实验仪器 粒度分析仪：z e t ap a l s 9 0 ，b r o o k h a v e n ，l t d ，美国； 傅里叶变换红外分光光度仪：s p e c t r u mo n e ，p e r k i ne l m e r , l t d ，美国； 原子力学显微镜：n a n o s c o p ee i a ，d i g i t a li n s t r u m e n t s ，l t d ，美国； 高速台式离心机：h 1 6 5 0 ，长沙湘仪离心机仪器有限公司，中国； 多管架自动平衡离心机：t d z 5 w s ，长沙湘仪离心机仪器有限公司，中国； 酸度计：p h s 3 c ，上海精密科学有限公司，中国； 数显恒温多头磁力搅拌器：i l l 2 a ，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司，中 国： 电子天平：a u y 2 2 0 ，s h i m a d z u ，l t d ，日本； 一1 0 一 i 第2 章材料与方法 恒温水浴锅：w 2 0 1 ，上海申胜生物技术有限公司，中国； 循环水真空泵：s h b c ，郑州杜甫仪器厂，中国； 乌式粘度计：毛细管内径0 5 7 m m ，上海硕光电子科技有限公司，中国； 旋涡混合器：m v s 1 ，北京全北德工贸有限公司，中国； 紫外分光光度仪：u v - 2 5 5 0 ，s h i m a d z u ，l t d ，日本； 酶标仪：v e r s am a xp l u s3 8 4 ，m o l e c u l a rd e v i c e s ，l t d ，美国； 多功能酶标仪：z e n y t h3 1 0 0 ，a n t l l o s ，l t d ，奥地利； 脱色摇床：t s 2 0 0 0 a ，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，中国； 高压蒸汽灭菌锅：l d z x - 4 0 bi ，上海申安医疗器械厂，中国； 移液器：各种规格，e p p e n d o r f , l t d ，德国。 2 2 实验方法 2 2 1 壳聚糖的纯化及脱乙酰度的测定 取1 9 壳聚糖溶于1 l o m l 氢氧化钠溶液( 1 m 0 1 l ) 中，7 0 c 水浴条件下用磁力 搅拌器分别搅拌2 小时和1 2 小时，然后用布氏漏斗过滤，回收并用蒸馏水彻底清 洗，置烘箱中4 0 干燥1 2 小时。将干燥后的样品溶解于2 ( v v ) 醋酸中，再 用氢氧化钠溶液( 1 m o l l ) 调整p h 至8 0 ，溶液中有白色沉淀产生，用布氏漏斗 过滤，并用蒸馏水反复清洗，冷冻干燥过夜。 使用酸碱滴定法测定纯化后壳聚糖的脱乙酰度。将纯化后的壳聚糖于1 0 0 。c 下 烘干至恒重，然后准确称取0 5 9 纯化后的壳聚糖，置于2 5 0 m l 锥形瓶中，加入 0 1 m o l l 盐酸标准溶液3 0 m l ，并在2 5 c 水浴下搅拌至溶解完全，向溶液中滴加 2 3 滴甲基橙指示剂，用0 1 m o l l 氢氧化钠标准溶液滴定游离的盐酸，当反应液由 红色变为黄色即为滴定终点。按照文献【删的方法计算纯化后壳聚糖的脱乙酰度， 公式如下： 自由氨基含量( ) ：( c 1 - v i - c _ 2 - - v 2 ) x 0 一0 1 6 1 0 0 脱乙酰度( ) = 型铲1 0 。 一1 1 黑龙江大学硕士学位论文 式中c l 盐酸标准溶液的浓度( m o f l ) ； c 广氢氧化钠标准溶液的浓度( m o l l ) ； v 1 所加入盐酸标准溶液的体积( m l ) ； v 2 _ 谪定消耗的氢氧化钠标准溶液体积( 1 1 1 l ) ； g 群品重量( g ) ； 0 0 1 6 与l m l 的l m o l l 盐酸溶液相当的氨基量( g ) ； 9 9 4 一理论氨基含量。 2 2 2 壳聚糖分子量的测定 取适量壳聚糖，用2 ( v v ) 醋酸配成5 m g m l 的壳聚糖一醋酸溶液。分别将配 好的壳聚糖醋酸溶液和2 醋酸溶液置于乌式粘度计中，在2 5 + 0 0 5 恒温水浴中 恒温l o m i n 后，分别测定壳聚糖醋酸溶液和2 醋酸溶液的流出时间( t ，t 0 ) ，每 组测3 次，测量结果的误差不超过0 2 秒，取测量结果的平均值，根据文献嘲的方 法公式计算特性粘度h 】，再根据公式计算分子量大小，公式如下： 1 1 1 ( 习 h 】。半 r 1 = k x m v 口 式中h 】特性粘度； t 被测样品流出时间( s ) ； 卜溶剂流出时间( s ) ； c 被测样品浓度( g m l ) ； k - 1 8 1x l o 3 ： m v 一相对分子量； 1 1 _ 0 9 3 。 2 2 3 壳聚糖纳米粒子的制备 采用三聚磷酸钠( t p p ) 离子交联法制备壳聚糖纳米粒子：称取一定量的纯化 后的壳聚糖，溶于2 ( v v ) 的醋酸溶液中，制得2 m g m l 的壳聚糖醋酸溶液，用 一12 一 - 第2 章材料与方法 2 m 的氢氧化钠调节p h 至4 8 ；然后用低速离心机离心( 4 0 0 0 r p m ，5 m i n ) 除去未 溶解的壳聚糖及杂质。