（微生物学专业论文）益生菌清除脱氧雪腐镰刀菌烯醇的作用研究.pdf

摘要脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d v o x y n i v a l e n o l ，d o n ) 是由镰刀菌产生的有毒次级代谢产物，具有导致厌食、呕吐的急性毒性和免疫、细胞、生殖毒性以及致癌性，主要污染小麦、玉米等谷物及其制品。常规的物理或化学方法脱毒方法会破坏谷物的营养成分，导致脱毒不完全或残留化学成分。利用益生菌去除真菌毒素避免了上述的缺点，其条件温和，不会对环境造成污染，是一种理想的去毒方法。本研究旨在筛选高效清除真菌毒索d o n 的益生菌菌株，研究其清除毒素的机制、特性，目的是为应用于传统发酵食品的生产，降低真菌毒素污染，确保食品安全打下基础。研究内容分述如下：1 通过稀释以及调节p h 的方式，避免了基质对间接竞争e l i s a 测定d o n 含量方法的干扰，从5 9 株益生菌中筛选出2 株具有清除d o n 能力的芽孢杆菌菌株：枯草芽孢杆菌z z ，地衣芽孢杆菌d y 。2 从芽孢杆菌与d o n 共培养温度、时间、振荡转速三个条件对芽孢杆菌清除d o n 的条件进行了优化，其最佳条件：3 7 ( 2 ，1 8 0r p m 振荡共培养1 2 h 。3 对枯草芽孢杆菌z z 和地衣芽孢杆菌d y 清除d o n 的机理进行了初步分析，发现两株芽孢杆菌发酵上清液具有清除d o n 的作用，推断其清除d o n 的物质为次生代谢产物并且在7 5 以上具有热敏性。关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇；解毒；益生菌；乳酸菌：芽孢杆菌；e l i s aa b s t r a c td e o x y n i v a l c o o l ( d o n ) w 8 3ak i n do f m y c o t o x i na n db e l o n g st o 仃i c h o t h e c a n e sp r o d u c e db yf u s a r i u m 。l e a d i n gt oa n o r e x i a , e m e s i s ，i m m u n o s u p p r c s s i o no ri m m u n o s t i m u l a t i o n ，t c r a t o g c n y , c y t o t o x i c i t y , 陀p r o d u c t i v et o x i c i t ya n dh u m a nc a n e 足r s d o nw a sm a i n l yac o m m o nc o n t a m i n a n to f w h e a t ，c o ma n dr e l e v a n tp r o d u c t s p h y s i c a lo rc h e m i c a lm e t h o d sf o rd e t o x i f i c a t i o no f d o nr e s u l t e di ni o s s c so f n u t r i e n t s 。i n c o m p l e t ed e t o x i f i c a t i o no f m y c o t o x i na n dt h er e s i d u eo f c h e m i c a lc o m p o n e n t s m i c r o b i o l o g i c a la p p r o a c h ，e s p e c i a l l yt r e a t m e n tw i t hp r o b i o t i cb a c t e r i a , d i dn o th a v es u c hd i s a d v a n t a g e sa n dw a f ta ni d e a lm e t h o df o rd e t o x i f l c a t i o nd u et oi t sg e n t l er e a c t i o n , e f f i c i e n c ya n dn oc o n t a m i n 砒i o nt oe n v i r o n m e n t n ea i mo f t h i ss t u d yw a st os g r e c f lo u ts t r a i n st h a tc a ne f f i c i e n t l yd e t o x i f yd o nf r o mo u rc o l l e c t i o n so f p m b i o t i cb a c t e r i a , s t u d yt h ed e t o x i f i c a t i o nm e c h a n i s ma n dc h a r a c t e r i z et h ep r o p e r t i e so f t h o s ed e t o x i f i e ds t r a i n s a l lo f o u ra p p r o a c hw a st os e tu pab a s i sf o ra p p l y i n gt h ed e t o x i f i c a t i o nm e t h o di nt r a d i t i o n a lf o o df e r m e n t a t i o n ，r e d u c i n gt h ec o n t a m i n a n to f m y c o t o x i ni nf o o dc h a i n sa n de n s u r i n gt h e 向o ds a f e t y t h ew h o l er e s e a r c hw o r kw a sd e s c r i b e da sf o l l o w s ：1 t h e i n t e f f e r e n c ee f f e c t o f m r s o r b a o i l t h e d e t e r m i n a t i o n o f d o n b yc o m p e t i t i v ei n d i r e c te l i s aw a se l i m i n a t e dm a x i m a l l y b yd i l u t i o na n dr e g u l a t i n gp hv a l u eo f t h eb r o t h b a c i l l u ss u b t i t i sz za n db a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sd yw g q 1 9s c r e e n e do u tf o rd c t o x i f i c a t i o no f d o nf r o m5 9p r o b i o t i cb a c t e r i a 2 t h ei m p a c to f t e m p e r a t u r e i n c u b a t i o nt i m ea n dr o t a t i o ns p e e do f r e v o l u t i o no nt h ed e t o x i f i c a t i o ne f f i c i e n c yw a sd e t e r m i n e d 1 1 他o p t i m a lc o n d i t i o nf o rd e t o x i f i c a t i o no fd o nb yb a c i l l u ss u b t i l i sz za n db a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sd yw a si n c u b a t i o na t3 7 1 8 0r p m f o r l 2 h 3 t h ed e t o x i f i c a t i o nm e c h a n i s mo f b a c i l l u ss u b t i l i sz za n db a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sd yw a sa n a l y z e dp r e l i m i n a r i l y i tw a sf o u n dt h a tt h es p e n tc u l t u r es u p e m a t a n t ( s c s ) o ft w os t r a i n sw a si n v o l v e di n t ot h ed e t o x i f i c a t i o no f d o n t h ed e m x i f i c a t i o nc o m p o n e n t sms c sw a sd e d u c e dt ob et h es e c o n dm e t a b o l i cs u b s t a n c e sa n ds e n s i t i v et ot h eh e a t i n gt r e a t m e n ta b o v e7 5 k e yw o r d s ：d c o x y n i v a l e n o l ；d e t o x i f i c a t i o n ；p r o b i o t i c s ；l a c t i ca c i db a c t e r i a ；b a c i l l u s ；e l i s a缩略语英文缩写英文全名中文名称a sb ac m c ci n s t i t u t eo fm i c r o b i o l o g y , c h i n e s ea c a d e m yo fs c i e n c e s ，c h i n ab r o t ha g a rm e d i u mn a t i o f l a lc e n t e rf o rm e d i c a lc u l t u r ec o l l e c t i o nc f uc o l o n yf o r m i n gu n i td o nd e o x y n i v a l e n o i中国普通微生物菌种保藏管理中心b a 培莠基中国医学菌种保藏中心菌落形成单位脱氧雪腐镰刀菌烯醇e l i s ae n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r t m n ta s s a y酶联免疫吸附法h r pi c 5 dm t n岱n l c p b po dp b sp b s tr p ms c s5 0 i n h i b i t i o nb i n d i n gm i n u t en a 矗o n a li n s t i t u t ef o rt h ec o n 订o lo f p h a t m a c e u t i c a la n db i o l o g i c a lp r o d u c t so p t i c a ld e n s i t yp h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e0 0 5 t w e 锄- 2 0i np b s辣根过氧化物酶5 0 抑制率分钟m r s 培养基中国药品生物制品检定所光密度磷酸盐缓冲液磷酸缓冲液+ o 0 5 吐温- 2 0r e v o l u t i o np e rm i n u t e每分钟转数u i发酵上清液3 , 3 ，5 ，57 - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e3 3 ，5 ，5 - 四甲基联苯胺二盐酸j i a n g x i - o a lj o i n tr e s e a r c hi n s t i t u t e ( z h o n gd ey u a n )中德联合研究院a f l a t o x i n s0 c h r a t o x i nap a t u l i nz e a 甩l e n o n ef u m o n i s i n s黄曲酶毒素赭曲霉毒素a展青霉素玉米赤霉烯酮伏马菌素i v舳研灯叭附硎阳学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌文学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名( 手写) ：物走k 签字日期：例7年阻月增日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解壶墨叁鲎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名( 手写) ：杨史良导师签名( 手写) ：签字日期：训7 年胁月诏日签字日期：分咛年队月掰第l 章微生物拮抗真菌和清除毒索的研究进展第1 章微生物拮抗真菌和清除毒素的研究进展摘要真菌毒素是影响食品安全的一大隐患，物理、化学去除毒素方法不能完全有效地控制毒素或会对营养成分造成极大的破坏，近年来微生物降解毒素已成为一大热点。本章对真菌毒素在食物链中的污染、微生物拮抗真菌和清除毒素的作用及其机制进行了综述。关键词真菌；毒素；拮抗；清除；微生物1 1 真菌毒素的污染真菌毒素( m y c o t o x i n ) 是真菌产生的次级代谢产物，目前已知的有2 0 0 多种，主要包括黄曲霉毒素b l 和m l ( a f l a t o x i n s ，a f b l 、a f m l ) 、赭曲霉毒素a ( o c h r a t o x i na ，0 1 r a ) 、展青霉素( p a t u l i n ，p a t ) 、玉米赤霉烯酮( z e a r a l e n o n e ，z e n ) 、伏马菌素( f u m o n i s i n s , f b ) 、脱氧雪腐镰刀菌烯醇( 呕吐毒素) ( d e o x y n i v a l e n o l ，d o n ) 等。全球每年约有2 5 的农作物受到真菌毒素的污染，约有2 的农作物因污染严重而失去营养和经济价值。真菌或真菌毒素的存在，不仅严重影响农作物的产量，而且降低了农产品、饲料以及畜产品的品质，造成全球每年数百亿美元的经济损失【i 捌。常见真菌毒素的概况如表1 1 所述。1 1 1 黄曲霉毒素在食物链中的污染王君等报导玉米和花生中a f 的检出率分别为7 0 2 7 和2 4 2 4 ：平均含量为3 6 5 l 和0 2 7g ，l 【g ：最高含量为1 0 9 8 3 6g k g f b 4 3 7 0 9g k g ；超出国家限量标准1 4 8 6 和3 0 3 。大米、核桃、松子a f 全部符合国家限量标准p 1 。王若军等报导玉米样品、全价饲料、蛋白质饲料中a f 的检出率分别为8 3 9 ，1 0 0 和1 0 0 【4 】。研究表明饲料中每6 5 个单位的黄曲霉毒素会有0 1 个单位转移到猪和禽肉中，1 个单位转移到牛奶中【5 1 。当动物摄入了a f b l 污染的食物后，l 3 的a f b l 转化为a f m i ，出现在泌乳中州。1 1 2 赭曲霉毒素a ( o t a ) 在食物链中的污染1 9 9 1 年波兰小麦粉中o t a 的平均含量为3 7 0 0 p e , k g ，污染率为1 9 7 ；黑麦和小麦中污染率分别为2 7 3 和1 1 7 ，含量范围为5 2 4 0 0t t g k g ，远超w h o5p g k g 的限量标准。1 9 9 0 - 1 9 9 1 年丹麦和德国小麦麸的o t a 的污染率也高达1 0 5 6 8 ，污染范围为0 5 1 2t t g k g | 7 j 。1 9 9 6 1 9 9 7 年英国咖啡、可可粉和葡萄干中o t a 的污染率t 本文主要内容发表于中国粮油擘报精_*弹峰藩赫洋*醇智尊郭抽*暑奄播群两潍_1辞净耗霹姗漪莆甾兰。一一1110旨量ryof-露j乌一暑ycotoxin丹漪莳群1 脯_ 茁薷1 舟龄毒蔼障莉蒜时蠼饰精茸静脯i 生，它8eq矗，_od再ngsp8&pif8fidi104尸宇夏誉fdz 岂0 18。t苣董ed098一fxic茸肆导辩聃游nbt曼；s)州*势稿霉强(z口星gonel量精，棚_4n一，、霉多93-o，饕一*啦尊丑黯，茹譬7丁鹭，*辞落丑群，崎蘑箍7丁匿，薄觜尊了)硅嚣昏尊精蒲0c彳巨晏暑饕嚣雌撼，雄蛋智鞋稿量常_马辟潍(f置暑，量js)哥辨落丑瞬蛊筚【嶂爵黛7了畦甄蜀矩啦蕞丑睡口eoivakg一)|藕砖辩肆，；unv一6_d盏鼍陆湃x寻匦，*拳曩薯彗斗誊_l舌誊爵黼冲a。*博礴滔苜*串* 1 8 ，2 3 鬟寻_5ndaw-o5_o99舜瞄。哥。妨蚌。勺b1ii神，l(孵q掣120吾藩汁苍随50吾，g七圈。s是d e z o 一啦藩s5忑，k_li田射。一和唑厶。忑弃目磐宣篁_oo二口g畏kg可口罩措斗血卅*亭g，icg錾营盛ji斗。_：50鲁啦，k汁精群阻精。磐誊盛聋暑畦，ic啐和一日饕恃，辩雾，汁，嚣壁和，跨趣尊啦垂和州*。骑榷，手精啦璐辩寄藩昔洁措酗寻亏精j|呈阕斗ol-681i电l【g汁，嚣娅，虢署暑善硝，酶蟛茸，墨需和，僻*莓婷。齑葺艟斟*滔辩量和哥畸一i瘁砖i生一日g，kg。阱汁*，刮带。宣罢事，斟粹，署酋母击耐汁跚，夸湃，州*，罄辨蔫曩rpo。，ww蚺暑导g婵爵，摆誊，斟坍崭降海矽浔，阜南糟1生营搏屋千乍丑汁噩生臣口r口旨o暑g，kg一聋南昔且=f爵冉霹博藩，样亘，搏灌嫩汁爵口濞搏高瞎，龉雾*毒，j、嚣j阡爵，擗本鹾蔷争霈龄口卜f乱蕾譬窖，lcg_挣海。鉴高，阡屠脯霹肆祟礴糖，潮璋脯。凰嚣碍辩，飞斗+，l圃抖。*湘。潍捧，群料，曰回曾，j、蜀薹臣口r口苗uu暑幢，k91婵砖雄辩，燃藩珊霸，蔫罄，研汁*油翱料垂审饥ot电icg丑登和蠛潜，姆蚕，姆滑爝。彗葛艚第1 章微生物拮抗真菌和清除毒素的研究进展分别为3 8 、8 5 和8 8 ，污染浓度范围为0 2 2 7 3 、0 i 1 1 和o 2 5 3 6 峙l ( g 。1 9 9 6 年，德国酒类中o t a 的污染率为4 2 ，范围为0 o l 7 0 岭，k 【剐：1 9 9 6 1 9 9 9年德国猪肾中o t a 的含量为5 5 0 n g g ，香肠中污染率为7 7 2 ，平均含量为3 6蛾，猪肝型香肠中污染率为6 7 9 ，平均含量为4 6t c d k g 咿l 。在人类的肾脏组织、血清和乳汁中也有o t a 的存在，检出率分别为6 6 ，6 0 1 0 0 0 , 4 和1 5 3 【1 0 j1 1 】。1 1 3 玉米赤霉烯酮( z e n ) 在食物、饲料中的污染王若军等报导1 0 9 份样品中，玉米饲料、全价饲料和蛋白质饲料中z e n 的检出率分别为1 0 0 ，1 0 0 1 1 4 脱氧看腐镰刀菌燔醇( d o n ) 在食品、饲料中的污染郭红卫等检测了我国上海及河南地区赤霉病流行年份与非流行年份小麦中的镰刀菌的污染情况，发现d o n 含量的中位数分别为9 3 3 0 和1 4 2m g k g ，远超出我国的限量标准【l 。1 9 9 9 年s c h o l l e n b e r g e r 等报导德国1 0 1 份样品中d o n 检出率为9 2 ，含量为1 5 6 9 0u e j k g ，平均为1 3 4u g k gu 4 1 01 1 5 展青霉素( p a t ) 在食品中的污染宋家玉等对山东省苹果及其制品进行只a t 检测，烂苹果、苹果制品的污染率分别为4 0 和7 0 。阳性样品平均含量为8 0 6 岭，l ( g 旧。y u r d u n 发现，6 0 的苹果汁中p a t 含量为1 9 1 7 3 2 8 陷刖1 1 6 伏马毒素( f b ) 在食品、饲料中的污染1 9 9 7 年中国、德国玉米中伏马毒素检出率分别为5 6 f f 铂2 7 ，含量范围为5 0 3 4 8 6 8 腭瑰g 和6 7 1 3 4 腭。曙。1 9 9 8 年英国、中国台湾玉米饲料中伏马毒素检出率分别为9 7 和3 4 ，含量范围为2 5 2 7 0 0 0 和7 3 2 3 9 5p g k g l l 7 11 2 微生物的抗真菌活性1 2 1 微生物对真菌的拮抗作用许多微生物对真菌具有拮抗作用，包括食品级的乳酸菌、枯草芽孢杆菌、无色菌( a c h r o m o b a c t e r ) 、漆斑菌( m y r o t h e c i u m ) 等，其对真菌的拈抗作用如表1 2 所述。主要作用机制有：( 1 ) 代谢产生有机酸抑制真菌生长。体外较低的p h 值环境能使细胞壁、细胞膜上的酶丧失部分活性，增加细胞膜的渗透性( 如3 - o h f a s 【l 町) ，从而抑制真菌生长。另外亲脂性的乙酸、丙酸、乳酸、己酸【1 9 l 、苯乳酸i 训等有机弱酸透过脂质双层膜扩散到细胞质中，再解离成一和阴离子，使细胞内p h 值降低，导致蛋白变性，使细胞的其他结构和功能组分失衡，干扰细胞生长和存活。( 2 ) 代谢产生一些蛋白质类似物如环肽口“乜2 引、几丁质酶 2 4 j 等抑制真菌的生长。1 2 2 微生物对真菌毒素的清除作用乳酸菌、酵母菌等多种微生物对真菌毒素的清除作用如表1 3 所述，其作用机制第1 章锾生物拮抗真苗和清除毒素的研究进展主要有：( 1 ) 细胞壁的物理吸附作用。加热和酸处理会增加细胞对毒素的吸附作用( 加热或酸处理使得细胞壁的多聚糖和肽聚糖的糖苷键或肽键断裂，释放出单体，细胞壁变薄，孔径增大，毒素能同时被细胞壁表面和原生质膜组分吸附) ：毒素的吸附是非共价键的疏水作用，是可逆的( 水洗和有机溶剂浸提都能重新释放毒素) ，吸附效果与菌体浓度有关 2 5 , 2 6 1 。( 2 ) 一些蛋白质类似物或胞外多糖阻断或延缓毒素的生物合成。如环肽能抑制毒素相关基因的转录，从而抑制毒素的产生：环肽的这种作用与其环状结构有关，且环肽中必须含有脯氨酸和疏水氨基酸才显示抗菌活性 2 1 1 。( 3 ) 胞内和胞外酶把毒素降解成毒性更小或无毒性物质。4牛斗井喜雕喜i ；i 莹i潞_*藩忤排嵩将醇曾蕃醪藤瓣。单坍群潮潍一薛忤耳抖雕吕吉崮斋月j学一。一2tho害t；晶o；isfjcsof_banleria荷ai既葚目a i 暑斋片j 翌齄蹲粒芦e s u l 苗赫墅彗垂p r e 2 日0 4ann，sis移冲h 嚣刃ofe_98工c誉日”cfsp分2茸n百2u窑量d毫哥80bl拳，b奇逛6)毫计量芦n lk肇扁，i岛导e莓一h名、zn争盎战塑蹯薛。冲耸曷卜旃薄白勺等酷蜃斗_协-l口bkbf菩zn一互98k，a黑二0547，菩善il_cr蔫q暮62u寄h暑斗6毒誊cb_1斟爿哥蔺河h喜垂壮*西=哥ffiiiq n，奇曼一群28lll口卅缨elroti羞。嚣cilic罩野盈。聋磊”pergi吾寺兰io嘲#器ri#罩trlc_5量苔4，c叠罩昏日no哥_i蟹一o薹菇，口晕鼍蛊kc、aio胃写u一82idoizq置一拿n2e畸ou o 喜砉_皂；js p n 1 6磬loooil，6l i s 童#一u o 西_嚣03c季髻8ic，oiid摹，苦盘吧l|磊鼻l詈i|曙蓐功一誊g一2晶f旨巴u幕精箍呻引雷，目薄曾妨蔷墨臣辩匿，碚搠酵曾譬过醇j口q己，lc葛4、i苦善基昏q且可口基f譬窖_宇_c皂争c鐾二nncc互80014)k3田4一nonn呈nnnuogu)叶hco忌i呈毒薯墨一ccnn墨_i口量01)c口一晕口6fc雪警善皂暑呈童争己暑_掣m薹。#3。孽琶嚼d罩ir擎ion萝茸嚣，glls_它r置ihlhor口口，i#=口lz毛_8ri_im，口j_?gr乏摊饕碍4通礴*醇蠹勺，眚。冲鲁苦扫，mj第了4量毫一66目，mv掣嚣磷沸饕懈琳1磐3，宣。洳uu暑警一u摊掣碍，足0昏-p彳工g等，自。串遑蚌75o亭鼍亨一筇醇串落吕步卜釜游u6h善目臼王ic泞一o-一8il电巴*鍪辱白勺置p。苷7h暑警一cyclo(r-l口乍l-，m)磐cyclo(9善，邑8苫n斗乱0暑毪搴一q浔鬻喜垂轴醇忤术。辫屠苷目詈一i翅+漆脚咐露jc寸*霹奇勺mrnil昔1)卓堂冲u_2u。625昔12z昔|；卡于崮盛蒲12苦一n年口u一25一薄藩藕沸a、甲h蹲卡于于包匿潞h=_25夺n哳考12工-10l一署rali_昂掣嗣谇v兽7自n；m1)一_no-uoh-40_uw8-48_i*noou50_5 1w口o-48_6u蚺og彗醛海冲i曝硝渖擗宜藩斟霉鼹菌昨藩抖碍，叫嚣，刮赠，叫碌，疑曝妇蓐群v冲越净叫殍吝壁丁牲醛嚣旰亦珊彗黟酬碍，z醒，*翦碍，潮磐璐v昔l悔，j、呻u08口嚣洋磷舜薯垂擗泔叫栅鞋uohi勺as薛彗訾蔷薪3藩醑生赢书苦河享藩椰埤瞥哥迎汁*掣鼹曩*赣爵礤*薄誊曷j舌嚣蘑爵h+平口温酣叫口王幕者硝海褂霹二f茹磐离阡亦誊甜茚c t d 巴乌巴_99西一一b】n s o 曼g 巴一998)【-9】lavnhn口ct呈g。一【291，itiukcg巴n8一【30一才a 詈霉巴n8一一22一_i盘_镩，霉ai一量一一；一rcn目一oon盆霉巴noou一【201吒鲁卫巴0i)4v【2 1 1c h 觚gc ta 18uv【2一riu盘巴8av【3 1 】q g n 盘巴002)【2u一l 瑶* 净措算蔷_甘毒苎e!l古鲁*霹曾簟界辅嚣暑卓坍j捆姗_3鼙恃彗鼍料畦糖精白勺_漪醪千乍月j_一blo一_3一丁o4etoxi盛oatooo f - 口o zf吒口aibio|cicf簧藩ri露聋t 乍丑置寸臀酢油高簦彗墅謦h 蚕耳，rf每ct_彳ui劈，_口c吕ed暑ootini暑州gfca譬口j鼍o_ncc5l喜一号 f b ，串墼矗潭毒嬉i等钾葶昔譬罄fb-菖暑摩岛#篮串暑塌罩斋月ip e 芎r j 盘巴h、i8sh一，3n菩1)【3一享；ioo一_rnn53lo邕。备一譬甚直罐jl|薛曲首碍净暗_|舌鲁苗罄。昂胃|76-嚣x暮訾墨瞎尊温潭罩鼍ne皂i盘巴雪一v6】h争、qsesl_h70=a互qo璺_f日：*牛h并j舌宣婚罩譬7一鬟上6，王egoo几c70u曼营pno广昔置露罩藩丰薛等晰哥昌冀叶斟暑瞢膏茸誊营牟瞄彗量瘁尊衄昏葺尊乒znlt砒巴譬，28e-hlb、p富譬llc一2；m一0 窘浔罩肆芦嚣譬卅醇一置“装耳辟砷牛e目；一卜争口f苦ilbq、罨孽电宕lx、3日1阡兽-*辱笛氏揖蛋莓暑一饕姗南一a暑导nlho，=t阜琶fg-l3 7 _ktfo，2rn-五冬e6基彗z嘲_巴一_ v b ，e et3i曹b呈謦g亭aj_歪2ii群排y叫莹岛o斟醢) |理g牟snsrq萝，已#_r霄拿8#j蓄，n15ja苦口o口7盂uo一守2可翟，e暑nen l 冒r9991旰薯；k口n，rj，星ys1恃窖 k毫，b辜叠h1忡甚；跹n筒#酵旰蓝，g哥r_sg旨口印互015l，_譬葺螫，崎bl串搿廿12niri40a毒sr弓9睾qnsgs，ic口一is，昌isi，口_l霉暑g寸j了知，0q。l为毫q毫qe扣qu90知g殳鼋，嘎可k4h翟、n石oa口k鲁嚣，e-口荤专、硝莲eo 叫譬q i _ 孚l罨斟钟霹h鼍蔼丹fbl喇o_疆茸墨篮串遑守曾晕r曾9 2 霉兰o(r譬l著域cydooyffp要s苫n#uu| 嘎一hvqi吾t-曼q鲁旦署享蚺爵)|粤港、，、eg善鐾叫阜詈鬟5名s，僻一悱研i即喜措盼幂幕尊肆3日寸直串酱冲-争一t捌善爵3冲瞥署船妇签茸尹幂薯一h：vqo_4hv8鬟hl蓐整刊理叫ds墨12a甚奇。15一墨冲彗离茄昔蔷24，pj毕翌暑i丁8x一窨#暑毛粤_壳：盅*降幂暑廿膏等耳菖苷譬f豪童琶；“哥嚣鬲看器嚣导01a_有_知甚f瞢，罱哥藿，j、灌哥芸”鬟暑乌；謦爵，目蓐誓辫j毕塑僻p04营蚺a群葛薯姆蕾蔷墨孵墨藩诅昂墨精细f喜鐾_暮苎e尊玲碍馨幂藿喝bil露弃壤1誊七暑翻廿耳昔霉辟鼍暑曹年nyda(rf旱广予)或童。一争导要奢童af益排啭圜皂4如蚤争主善薄湖ep赢既热薯篮叫啊_目琳斜圈釜昔i王白勺鬻辞#哥陡i童呻吕恃藩跨爵一基。口拿芑。一。辱。一羞苦蕾硝*醉v音巴nhin簿培爵叫m蒲阵1营蕾鲁暑墨辩啦墨幂嚣叫fb譬爵暑薯攀瞻蛋幂藿丁-一14口缸斟晰冀惜嚣蓦j舌离描辟霉惜岛+士疑薯，瓠斗，l黠蒜8鼻芽g+ 瘫辅潞譬器港ot幂鞋_|赴01蔷群i嫩*鹭擘罨端泞h舞牟渖潞犀蟊巴ot幂墨j莲j舌衅i啦*曹幂曩苷m尊奔彗卑一8)|一5】导一季2巴(2005)一33一n o 1 手_ 昔鹱麓重bue1日吾b(苗田望发一rs皇巴f时口2吾一一n苣c曼ef283_u2孑孑4兰2_一lx3一vl蚕-盘巴(2署苦芝气冒2巴(20弓o】。d菩嘎_善lsllp 砒i l l i n打鼍葛蓝盏藩10a矾_8誊菪矗亨一蓦l晕罄露声摧矗弃嚣了茼_|生栩汁墨誉津nb量霉1一鼍一一瞢告q嚣芸，竺美鬟k穹寸曼曼；h譬-莹鹭莹e3-3肾d 0 z8喜ll兽吕z阱id导薄*肛雄匕爵u酬料gz簪甚津罐o-嚣t幂薯丁-o霉_协lli目n三一一嚣7)一42一蕾osjf0几j牛瑚1聋口争s)的，g_t亭矛口onl离n、，哪幂藿篓-d0z_4q_7签zen，f8z16兰n目幂蔷斋丑tisn巨一量善一翟3j口，p导至；每ij日t，逛、i￥啦u鬟-|zen协认兰gz62_n螂z450芸，_，g 自h kg4 4 笋 f 。阱i奢誓晰哞|*每馥第1 章微生物拈抗真菌和清除毒素的研究进展1 3 展望随着全球经济社会的持续发展，人们对食品安全极为重视，采取了多种生产质量管理规范，如g a p 、g m p 和h a c c p 等，保障从“田园到餐桌”的食品安全供应链体系。科技部分别于2 0 0 2 年和2 0 0 6 年启动了“十五”和“十一五”国家科技重大专项“食品安全关键技术”，强调建设和加强我国食品安全的支撑体系。真菌毒素作为影响食品安全的一大隐患，成为科技攻关的重要问题之一。控制食物链真菌毒素水平的方式有物理、化学的方法和生物的方法。加热、紫外照射和离子辐射等物理方法虽能破坏霉菌孢子活性，但不能完全有效地控制毒素的水平，而化学方法虽然能破坏毒素，但也会对营养成分造成极大的破坏，并导致处理后对健康危害的不确定性。因此，寻找生物技术的方法和手段替代上述物理化学方法成为目前国外研究的热点。近年来，采用微生物的方法控制食物链中的真菌毒素己被科学界所关注，但有关微生物清除毒素机制方面的研究较少。未来的研究工作将致力于用分子生物学方法寻找真菌毒素产生的相关基因，实行基因敲除获得不产毒菌株；或寻找降解毒素的酶等物质的表达基因，将其导入工程菌获得解毒菌株 2 7 1 ，并将其运用到食品生产中，有效地控制食物链中真菌毒素的水平。7第2 章清除脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d o n ) 菌株的初筛第2 章清除脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d o n ) 菌株的初筛摘要采用间接竞争e l i s a 对5 9 株益生菌清除d o n 的能力进行了初筛，获得了1 5株具有潜在清除能力的菌株，发现了培养基对检测d o n 的方法有一定的干扰作用。关键词脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d o n ) ：益生菌；e l i s a ；初筛2 1 前言脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d e o x y n i v a l e n o l ，d o n ) 是由镰刀菌产生的有毒次级代谢产物_ b 型单端孢霉烯族化合物，一种倍半烯衍生物，不仅具有急性毒性( 导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡) ，而且还具有免疫、细胞、生殖毒性以及致癌性，严重影响机体的身心健康。d o n 的污染广泛存在于全球，中国、日本、美国、德国、前苏联、南非、挪威等均有报道。d o n 主要污染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，如面包、饼干、麦制点心等。另外，在动物的奶、蛋中均发现有d o n 残留。我国地处于潮湿的温带、亚热带( 小麦赤霉病主要分布地区) ，是d o n 污染较严重的国家之一，赤霉病麦中毒也成为我国最主要的真菌性食物中毒之一，越来越引起了人们的重视。常规的物理或化学方法脱毒方法会破坏谷物的营养成分，导致脱毒不完全或残留化学试剂近年来，许多学者试图通过生物方法特别是微生物发酵的方法减少或消除谷物中d o n 的污染。s h i m a 等( 1 9 9 7 ) 分离的菌株e 3 3 9 ( a g r o b a c t e r i u m- r h i z o b i u mg r o u p ，土壤杆菌根瘤菌类) 在3 0 ( 2 培养2 4h 后能分解培养液中2 0 0p g m l的d o n 4 2 。b a k u t i s 等( 2 0 0 5 ) 发现深红酵母、粘红酵母、美极梅奇酵母、发酵地丝菌酵母、马克斯克鲁维酵母分别能减少4 7 7 、8 4 6 、5 5 、6 2 7 和4 4 的d o n l 4 3 。益生菌是一种或多种微生物组成的活菌培养物，可促进动物或人体原生微生物菌群生长而对宿主产生有益的影响，主要包括乳酸菌，职歧杆菌，部分链球菌等。益生菌具有抑制有害菌的生长、提高机体免疫力、降低胆固醇等重要生理功效。目前，有关益生菌降解或清除真菌毒素的研究鲜有报道。e i - n c z a m i 等( 2 0 0 2 ) 发现乳杆菌和费氏丙酸杆菌在3 7 作用lh 后能将2 0p g m l d o n 清除至1 9 2 6l l g m l 4 4 1 。本研究旨在从本院的益生菌资源库中筛选能高效清除真菌毒素d o n 的菌株，研究其解毒机制、特性，为其应用于传统发酵食品的生产降低真菌毒素污染，确保8第2 章清除脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d o n 菌株的初筛食品安全打下基础。中德院在功能性益生菌的研究方向上进行了长达1 4 年的研究，积累了大量的菌种信息资源。考虑到用于筛选的出发菌株数量众多，本章拟采用粗放的实验条件对菌株进行初筛，其目的是优选出具有潜在清除d o n 能力的菌株，至于菌株清除d o n 能力的强弱，以及其与菌量、菌龄和培养条件等因素的相关性等，则纳入复筛等章节的范畴。免疫学检测方法具有高选择性、灵敏、快速、一次可检测多个样品、对样品的纯度要求不高、操作简单等特点，特别适合于大批量样本的检测。因此本研究初筛的策略是将菌株与 1 0 n 共培养以后，离心取上清，应用间接竞争e l i s a 方法检测上清中残留的毒素含量，从而达到清除d o n 菌株初筛的目的。2 2 材料与方法2 2 1 菌株本实验所用菌株见表2 1 。表2 1 实验所用菌株! 生坦! ：! ! 塑些! ! ! 鲤堕坐堕塾唑序号菌种菌株代号来源坚垒墨p 塑! 箜苎! 堕翌攀堡堇堡型l唾液乳杆菌( l a c t o b a c i l l u ss a l i v a r i u ss s p a a l i v a r i u )a s i 1 8 8 1 a s2植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m )a s i 1 8 5 61a s3嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s )a s i 1 8 7 8 a s4德氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u d e l b r u w c l a i )a s i 2 6 2 4 1a s5鼠李糖乳杆菌( l a c t o b o c i l l ur h a m n o s u s )a s i 2 1 3 41a s6保加利亚乳杆菌( l a c t o b a c i l l u b u l g a r i c u 5 )a s i 1 4 8 0 1a s7嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l m )a s i 1 8 5 4 。a s8乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c k s )a s i 1 8 a s9嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m a p h i l )a s i 1 8 5 5 a s1 0纤维二糖乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc e l l o b i o s u s )z d y 2 a试验分离1 1嗜酸乳杆菌l ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )z d y 2 c试验分离1 2发酵乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s f e r m e n t n m )z d y 4 a试验分离1 3嗜酸乳杆菌j ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h f f u s )z d y 7 b试验分离1 4未鉴定z d y 9试验分离1 5未鉴定z d y l 0试验分离1 6卷曲乳杆菌( l o c t o b o c i l l u sc r i s p a t u ，)z d y 2 9 c试验分离1 7植物乳杆菌2 ( l a c t o b o c i l l u s p l a n t a r t a n ) z d y 4 6 a试验分离1 8植物乳杆菌l ( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a m a n )z d y 7 8试验分离1 9嗜酸乳杆菌l ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )z d y l 0 0 a试验分离2 0嗜酸乳杆菌l ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )z d y l 0 0 b试验分离2 l未鉴定z d y i o o c试验分离2 2未鉴定z d y l 0 2试验分离2 3发酵乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s f e r m e n t a )z d y l 0 3 a试验分离2 4卷曲乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s c r i s p a t u s )z d y1 1 3 b试验分离2 5嗜酸乳杆菌l ( l a c t o b a c i u u sa c i d o p h i l u s )z d y i1 9 b试验分离2 6未鉴定z d y l 2 0 b试验分离2 7卷曲乳杆菌( l a c t o b a c t l l u sc r i s p a t u s )z d y l 2 0 a试验分离兰!堕墼塾壁堕! ! 丝坚! 丝型堂竺型2 坐些竺!垫! ! ! 塑蔓墼坌塞9第2 章清除脱氧雪腐镰刀苗烯醇( d o n ) 菌株的初筛序号菌种菌株代号来源些! ：! e 型箜! 塑| ! 盟璺! ! ! 塑2 9嗜酸乳杆菌l ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )z d y l 2 5 a试验分离3 0植物乳杆菌l ( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r w n )z d y l 2 8试验分离3 l卷曲乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc r i s p a n a )z d y l 5 4 a试验分离3 2唾液乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s s a l i v a r i u s 娜s a l i v a h u )z d y i s 9 a试验分离3 3植物乳杆菌2 ( l a c t o b a c i l l u s p l a m a r u m )z d y l 6 1 a试验分离3 4唾液乳杆菌( l a c t o b a c i l l u ss a l i v a r i u as s p s a l i v a r l u )z d y l 6 2 a试验分离3 5嗜酸乳杆菌1 ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )z d y l 6 2 b试验分离3 6嗜酸乳杆菌1 ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )z d y s a试验分离3 7未鉴定z d y l 2 a试验分离嗜酸乳杆菌l ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )嗜酸乳杆菌2 ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )乳酸乳球菌乳酸亚种( l a c l o c o c c u sl a c t i ss s pl a c t i sj )嗜酸乳杆菌l ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )嗜酸乳杆菌i ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )嗜酸乳杆菌t ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )卷曲乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s c r i s p a t u a )卷曲乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc r i s p a t u s )嗜酸乳杆菌l ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )。纤维二糖乳杆菌( l a c t o b a e i l l u sc e l l o b i o s u s )未鉴定德氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l ud e l b r u w c k i i )未鉴定嗜酸乳杆菌l ( l a c t o b a c i l l u fa c i d o p h i l u s )末鉴定嗜酸乳杆菌3 ( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s )嗜酸乳杆菌l ( l