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不同类型土壤对青蒿生长、生理生化 和青蒿素含量影响研究 摘要 本试验以赤红壤、黄壤、黑壤和白粘土四种不同类型的土壤为培养 基质，对青蒿( a r t e m i s i aa n n u al ) 生长、生理生化和青蒿素含量进行比 较研究，探讨最适宜青蒿生长的土壤。研究结果如下： 1 、在生长方面，出苗时间最早的是种植于黑壤的青蒿，其次是黄壤， 最后是白粘土；现蕾时间则以黑壤的最迟，赤红壤和白粘土的最早；生 长在黑壤上的青蒿株高、茎粗、分枝数、冠幅等生长指标均较优，现蕾 期较迟，生长期长，最终生物产量最高。生长在黄壤上的青蒿其生长特 性与黑壤相当，生物量也较高，仅次于黑壤。而生长在红壤和白粘土上 的青蒿生长较差，生物产量极显著低于前两种土壤的青蒿。产量与茎粗 和冠幅之间具有极显著正相关。 2 、在生理生化方面，种植于黑壤的青蒿，叶片叶绿素含量最稳定， 整个生长期变幅最小，表明种植于黑壤的青蒿衰老较慢：种植于黄壤的 青蒿，叶绿素含量下降较早，但在生长前期，其叶绿素含量是比较高的； 种植于各土壤上的青蒿，叶绿体上c a 2 + ( m 9 2 + ) a t p a s e 的活性及可溶性 蛋白的含量与叶绿素含量变化趋势一致；而可溶性总糖与多糖含量变化 一致，表现为种植于黄壤的较高，黑壤的较低，且其变化不同于蛋白质 和叶绿素，因其在后期还有相当高的含量；全氮含量以黑壤最高，全磷 和全钾含量最终以黄壤的最高。从衰老的相关指标来看，种植于黑壤的 青蒿，叶片p o d 活性较低，c a d 、s o d 活性高，m d a 含量低，衰老缓 慢，而种植于黄壤的青蒿叶片p o d 活性高、s o d 活性较低，衰老较快， 但m d a 含量以白粘土的最高。 本试验采用了紫外分光光度法测定了不同部位的青蒿素含量，结果表 明种植于白粘土的青蒿无论是叶片、花蕾还是种子，青蒿素含量都是最 高的，其次是黄壤，最低的是黑壤。 单位面积上的青蒿素总产量受两个因素影响，即总生物量和单位生 物量中的青蒿素含量。从上面的分析可知，种植于白粘土的青蒿，青蒿 素含量最高，但总生物量太低；而黑壤总生物量最高，但青蒿素含量却 是最低的；只有种植于黄壤的青蒿无论是总生物量还是青蒿素含量均较 高。因此，本试验研究结果认为，以青蒿素为收获目的青蒿种植，应选 择黄壤。同时，在整个生长期叶片青蒿素含量有两个高峰期，即7 月底 与9 月中旬，考虑到花蕾青蒿素含量与叶片含量相当，且9 月中旬生物 量大大超过7 月底的生物量，因此，本试验建议青蒿的最佳采收时期应 为9 月中旬，即植株刚现蕾之时。 关键词：青蒿不同类型土壤生长生理生化青蒿素 i i s t u d yo ne f f e c t so fd i f f e r e n ts o i lt y p e so ng r o w t h ， p h y s i o l o g y - b i o c h e m i s t r ya n d a r t e m i s i n i nc o n t e n t 柚j t 0 l 以r t e m 坶z 口口刀刀比口l h ez h i p e n g ( c o l l e g eo f a g r i c u l t u r e ，g u a n g x iu n i v e r s i t y ，n a n n i n g5 3 0 0 0 4 ，c h i n a ) a b s t r a c t e f f e c to ff o u rd i f f e r e n tt y p e so fs o i l ，r e ds o i l ，y e l l o ws a n d ys o i l ，b l a c k s o i la n dw h i t ec l a y , o ng r o w t h ，p h y s i o l o g ya n da r t e m i s i n i nc o n t e n to f a r t e m i s i aa n n u al w a ss t u d i e di no r d e rt of i n do u tt h eb e s ts u i t a b l es o i lf o r p l a n t i n ga r t e m i s i aa n n u a l t h em a i nr e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： f i r s t ，i ng r o w t h c h a r a c t e r a s p e c t ，t h ee m e r g e n c eo fs e e d l i n g s o f a r t e m 必i aa n n u al w h i c hp l a n t e do nt h eb l a c ks o i lw a st h ee a r l i e s t ，a n dt h e n e x tw a st h ey e l l o ws a n d ys o i l ，t h el a s tw a st h ew h i t es o i l t h ee m e r g e n c eo f b u d sw h i c hp l a n t e do nt h er e ds o i la n dw h i t ec l a yw a st h ee a r l i e s t ，a n dt h e l a t e s tw a sb l a c ks o i l t h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i co fa r t e m i s i aa n n u al s u c ha s h e i g h t ，s t a l kd i a m e t e r s ，r a m i f i c a t i o nn u m b e r ，w i d t hw a sb e a e rw h e np l a n t e d o nt h eb l a c ks o i l ，a n dt h es a m ea st h ey e l l o ws a n ds o i l t h er o o t s t a l kr a t i oo f a r t e m i s i aa n n u al p l a n t e do nt h ey e l l o ws a n d ys o i lw a ss i g n i f i c a n t l yl e s s t h a np l a n t i n go nt h eo t h e rt h r e es o i l s ，b u tt h eb i o m a s sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nr e ds o i la n dw h i t ec l a y , o n l yi n f e r i o rt ot h eb l a c ks o i l t h e r ew e r e s i g n i f i c a n ta n dp o s i t i v ec o r r e l a t i o n sb e t w e e ny i e l da n ds t a l kd i a m e t e r , w i d t h i i i s e c o n d ，t h ec h a n g eo fc h l o r o p h y l lc o n t e n to fl e a v e st h a tp l a n t e do nt h e b l a c ks o i lw a st h el e a s t ，a n dt h ec h a n g ee x t e n s i o no ft h ec h l o r o p h y l lc o n t e n t w a st h el e a s tt o o t h e s es h o w e dt h ea r t e m i s i aa n n u al p l a n t e do nt h eb l a c k s o i lh a das l o w e ra g i n gr a t ea n dc o u l dl i v el o n g t h ec h l o r o p h y l lc o n t e n to f l e a v e st h a tp l a n t e do nt h ey e l l o ws a n d ys o i lw a sh i g h e ri nt h ef o r w a r dp e r i o d b u td e c r e a s e dq u i c k l yi nt h el a t e rp e r i o d c a 2 + ( m 9 2 + ) a t p a s ea n ds o l u b l e p r o t e i nc o n t e n ti nl e a fh a dt h es a m et r e n dw i t ht h ec h l o r o p h y l lc o n t e n t t o t a l s o l u b l es u g a rh a dt h es a m et r e n dw i t ht h ep o l y s a c c h a r i d ec o n t e n ti nl e a f , w i t c hw e r eh i g h e rw h e np l a n t e do nt h ey e l l o ws a n d ys o i l ，a n dl o w e ro nt h e b l a c ks o i l ，a n dt h ec h a n g et r e n dw e r en o ta c c o r d a n tw i t hc h l o r o p h y l lc o n t e n t a n ds o l u b l ep r o t e i nc o n t e n t e v e ni nt h el a t ep e r i o d ，t h e r ew e r eh i g hs o l u b l e s u g a ra n dp o l y s a c c h a r i d ec o n t e n ti nt h el e a v e s t h et o t a ln c o n t e n to ft h e a r t e m i s i aa n n u al w a st h eh i g h e s tw h e np l a n t e do nt h eb l a c ks o i la n dt h e t o t a lpc o n t e n ta n dt o t a lkc o n t e n tw e r et h eh i g h e s tw h e np l a n t e do nt h e y e l l o ws a n ds o i l f o rt h es e n e s c e n c ec h a r a c t e r s ，c a t , s o da c t i v i t i e sw e r e h i g h e rb u tp o d a c t i v i t i e sa n dm d ac o n t e n tw a sl o w e rw h e na r t e m i s i aa n n u a l p l a n t e do nt h eb l a c ks o i lw i t c hs h o w e dt h es e n e s c e n ts p e e do fp l a n tw a s s l o w t h e r ew e r et h ec o n t r a r yt r e n da b o u tc a t , s o d ，a n dp o da c t i v i t i e s w h e np l a n t e do nt h ey e l l o ws a n d ys o i l ，b u tm d ac o n t e n tw a st h eh i g h e s t w h e np l a n t e do nt h ew h i t ec l a y t h i r d ，u l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r i cw a su s e dt od e t e r m i n ea r t e r r n i s i n i n c o n t e n to fd i f f e r e n tp a r to fp l a n ti nt h i se x p e r i m e n t t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e i v a r t e r m i s i n i nc o n t e n tw a sh i g h e s ti na l lp a r t so ft h ep l a n tw h e np l a n t e do nt h e w h i t ec l a y ，t h en e x tw a st h ey e l l o ws a n d ys o i l ，a n dp l a n t e do nt h eb l a c ks a n d y s o i lw a st h el o w e s t t h ey i e l do ft h ea r t e r m i s i n i nw a sd e t e r m i n e db o t hb yt h eb i o m a s sa n d t h ea r t e r m i s i n i nc o n t e n ti na r t e m i s 施a n n u al 。w ec o u l dk n o wf r o mt h e a n a l y s i sa b o v e ，a r t e m i s i aa n n u al t h a tp l a n t e do n t h eb l a c ks o i lh a dt h em o s t b i o m a s sb u th a dt h el e a s ta r t e r m i s i n i nc o n t e n t ，j u s tc o n t r a r yt ot h ew h i t ec l a y b u ta r t e m i s i aa n n u al 。p l a n t e do nt h ey e l l o ws a n d ys o i lh a db o t hh i g h b i o m a s sa n dh i g ha r t e r m i s i n i nc o n t e n t s oa r t e m i s i aa n n u al s h o u l db e p l a n t e do nt h ey e l l o ws a n d ys o i lw h e nt h ea r t e r m i s i n i nw a sw a n t e d t h e r ew e r et w of a s t i g i u mo ft h ea r t e r m i s i n i nc o n t e n ti nt h ea l lp e r i o d ， w h i c hw e r et h el a t ed a y so fj u l ya n dt h em i d d l et e nd a y so fn o v e m b e r c o n s i d e r i n gt h em i d d l et e nd a y so f n o v e m b e rh a dm u c hm o r eb i o m a s st h a n t h el a t ed a y so fj u l ya n dt h eb u dh a dt h es a m ea r t e r m i s i n i nc o n t e n tw i t ht h e l e a f , s ot h eb e s th a r v e s tt i m ew a st h em i d d l et e nd a y so fn o v e m b e r k e y w o r d s ：a r t e m i s i aa n n u al d i f f e r e n t t y p e s o fs o i l g r o w t h p h y s i o l o g y b i o c h e m i s t r y a r t e r m i s i n i n v 承诺书 广西大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下完成的，研究工作所取 得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已 经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究 工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。本人完全意识到 本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 饲厶鹏 日期： 2 0 甜年月7 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不 以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论 文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索 与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢 利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 本学位论文属于： 口保密，在年解密后适用本授权书。 回不保密。 学位论文全文电子版提交后： 留同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览。 作者签名： 导师签名： 日期： 日期： 不同类型土壤对青篙生长、生理生化和青蓠素含量影响研究 1 前言 1 1 文献综述 青蒿( a r t e m i s i aa n n u al ) ，学名黄花蒿，别名臭蒿、香蒿、苦蒿，为菊科艾属 的一年生短日照草本植物，是我国的传统中药，具有清热、凉血、化斑等功效。其地 上部分叶片、花蕾可提取生产青蒿素等一系列产品，其衍生物可生产出很多系列产品， 主要治疗疟疾、结核病、潮热，此外，还有治疗中暑、皮肤瘙痒、荨麻疹、脑溢性皮 炎和灭蚊等( 中国医学科学院药用植物资源开发研究所，1 9 9 0 ；路宏顺，2 0 0 2 ) 。 青蒿是世界的广布种，我国大部分省区、亚洲其它地区、欧洲东部及北美洲均有 野生分布。多生长于海拔5 0 - 4 0 0 m 的低丘陵地带，在6 0 0 m 以上地区仅有零星分布。我 国从海拔5 0 m 的沿海地带至海拔3 6 5 0 m 的青藏高原均有青蒿的分布，具有多种生态型， 主要分布在我国的广西、云南、四川、贵州、重庆等地。其适应性较强，在石山、土 坡、丘陵、平地、路边及房前屋后的红壤、红黄壤、石灰土等均有分布，且都能正常 生长发育。但不同地区不同生态条件下的黄花蒿中青蒿素含量不同，欧洲品系为 0 0 3 - - 0 2 2 ，美国品系为0 0 5 - 0 2 1 ，中国品系为0 0 1 , - 一0 5 。重庆酉阳的栽 培种中有青蒿素含量高达1 2 1 5 的单株系，广西产黄花蒿植物中青蒿素含量一 般为0 4 - - 0 8 ，福达乡的黄花蒿中青蒿素含量达1 2 ，靖西、德保、田阳一带为 0 3 ( 李国栋等，1 9 9 8 ；杨水平，2 0 0 4 ；韦美丽等，2 0 0 5 ；韦记青等，2 0 0 5 ) 。 在广西，青蒿分布地形为平原、丘陵及低山地带，基岩为砂页岩、砂岩或石灰岩， 土壤为红壤、红黄壤及棕色石灰土，p h 值4 5 , - , 8 0 。土层较薄，土层0 - 3 5 c m 深的 有机碳含量0 2 8 8 4 - - 1 7 8 5 6 ，有机质0 2 5 5 7 - - 3 0 7 8 4 ，全氮0 1 0 6 2 - - 0 4 2 2 6 ， 全磷0 0 7 4 1 一- , 0 4 1 0 5 ，全钾0 6 6 1 0 - 3 1 7 9 9 ，适宜青蒿的生长( 耿飒等，2 0 0 2 ) 。 1 1 1 青蒿的栽培研究 青蒿中所含的有效成分主要是青蒿素，青蒿素主要存在于叶片中，故进行青蒿生 产的目的就是获得较高生物产量和高青蒿素含量的叶片。但是青蒿多为野生种，其青 不同类型土壤对青蒿生长、生理生化和青蓠素含量影响研究 蒿素含量在不同的生长环境下含量有很大差异，因此，为获得含量稳定的青蒿植株， 就要进行人工驯化栽培，在这方面的研究上，取得较好效果的国家有澳大利亚、比利 时、印度、瑞士、美国和越南( 吴叶宽等，2 0 0 4 ) 。 目前，青蒿栽培研究的方向主要集中在繁殖、播种、施肥以及收获上。青蒿的无 性繁殖方法很简单，特别是在组织培养方面，但作为繁殖种质的青蒿植株必须生长在 长日照条件下，以免开花( 郑占虎，1 9 9 9 ) 。目前，在青蒿素原料的商品化过程中， 用种子播种是最实用和经济的方法。青蒿种子在低温条件下至少可保存3 年。在北温 带的种植研究表明，在晚春或早夏播种可以获得生物量的高产，使青蒿素含量达到最 高的关键时期是开花前期，这时的光周期约1 3 5h ；若种植较晚，整个植株会在很矮 时就会开花，这样产量就会降低，也可能试行秋播越冬种植，但关于这方面的资料不 多( 钟国跃等，1 9 9 8 ；李锋等，1 9 9 7 ) 。施用氮肥可以促进青蒿的生长，但很少有关 于施肥对青蒿素积累的报道。s f i v a s t a v a 等( 1 9 9 0 ) 报道微量元素如硼能提高青蒿素 的含量，但是使用的土壤是否含硼，青蒿植株对硼是否利用和怎么利用却不得而知。 温室实验表明，土壤的p h 值从5 5 到7 4 之间，叶片产量基本没有变化，并j | p h 值对青 蒿素的含量也没有大的影响；收获前水胁迫2 周会使叶片青蒿素的含量大大降低( 韦 霄等，1 9 9 7 ) 。s h u k l a 等( 1 9 9 2 ) 报道外施生长调节物质不仅能促进青蒿长高，而且 能提高青蒿素的含量，但是生长调节物质是否能有效的应用还需进一步的研究。 综合国内外研究的文献报导来看，对青蒿的栽培的研究还是比较少的。青蒿的人 工种植体系还远未形成。为了适应国际市场对青蒿素药品的需求，应加强对青蒿人工 种植的研究，如加强优良种源的研究、营养特点的研究、青蒿素积累规律的研究等。 1 1 2 青蒿的生长研究 青蒿是严格的短日照植物，当光周期约1 3 5 小时时，半月之内就会开花，因此， 适宜在长日照地区生长。若种植于热带，未能达到一定的生物量时就会开花结实，会 导致青蒿素含量降低。青蒿的生长期为2 4 0 - 2 5 0 天，虽然其适应种植区域广，但在不 同生长条件下的青蒿，青蒿素含量差异较大。青蒿对生态环境的适应能力强，性喜湿 润、忌干旱、怕积水，适应高温和光照充足的环境，对土壤要求不严，以p h 5 5 7 5 、 排水良好的壤质土为宜( 傅德明等，2 0 0 5 ) 。 青蒿在广西，盆播种子5 - 1l d 开始发芽，大田则要8 1 6 d ，发芽后8 1 5 d 第一对 2 r - 西大学硕士掌位论文不同类型土壤对青蓠生长、生理生玳，一青篙素含量影响研究 真叶出现，1 6 - - 2 2 d 第二对真叶出现；5 0 - 6 9 d 出现侧枝；整个生育期约2 4 0 d 。开花期 为8 月上旬9 月下旬。l o 月上旬果形成，1 0 月中旬种子成熟。1 1 月为枯萎期。青蒿从 发芽到侧枝出现前，生长较为缓慢，5 月下旬至7 月下旬为高速生长期，7 月下旬后高 增长逐渐缓慢，到9 月上旬停止长高。基部茎粗生长在生长前期即5 月下旬以前为快速 生长期，生长量占整个生长量的3 0 以上，在8 月上旬至中旬，出现第二次增长高峰， 9 月上旬停止增长。 关于青蒿的生长，还是有一定的研究的。钟国跃等( 1 9 9 8 ) 认为青蒿资源品质具 有显著的生态地域性，并从植物生态学角度对华中地区中亚热带长绿阔叶林北部亚地 区山峡武陵山地所属的渝东南、鄂西、湘西及黔东北各地进行了青蒿的生态环境调查 及青蒿素含量的测定，结果表明实验区域内青蒿的青蒿素含量普遍较高，这些区域的 生态环境对青蒿中青蒿素成分的生物合成与转化有利。李锋等( 1 9 9 7 ) 对广西青蒿资 源调查得出生长在石山上的青蒿类型植株长势比生长在平地、路边、山坡、房前屋后 的类型差，且产量也较低。同一分布区内，生长在石山的青蒿类型青蒿素含量明显高 于生长在平地、路边的类型，并推测微碱性富含钙质的石山土壤可能有利于青蒿的生 物合成与转化。通过研究，人们逐步认识只有南方和低海拔地区产青蒿才有利用价值。 1 1 3 青蒿的生理生化研究 青蒿最显著的生化特征是它含有青蒿素及其衍生物。蒿属植物种类繁多，但是并 不是所有种类中都含有青蒿素。胡世林等( 1 9 8 4 ) 选择全国各地使用的青蒿药材涉及 菊科蒿属5 种植物进行分析，它们都有相当长的药用历史和地区习性，因而是寻找青 蒿素的首选植物。一般认为，具抗疟作用的药物多能清热、抗菌，而能清热抗菌者未 必有抗疟效果，因此，他们把是否具有抗疟作用作为判断青蒿真伪的重要标志，且能 提供寻找其它抗疟成份的线索。他们的结果表明：5 种来源的青蒿药材及已筛选的近 2 0 种蒿属植物，只有青蒿似a n n u a ) 种植物含有青蒿素。k l a y m a n ( 1 9 8 5 ) 分析研究 a 1 u d o v i v i a n a ，a v u l g a r i s ，a s c h i d t i a n a ，a p o n t i c a ，a a r t u s c u l a 和a d r a c u n c u l u s 等几种蒿属植物，均未检测到青蒿素存在。到目前为止，至少已有4 0 种挥发的油类物 质从青蒿中分离出来，青蒿中还含有许多不挥发性的有使用价值的倍半萜类物质，其 中包括青蒿素、青蒿酸和青蒿素，青蒿植株中含有青蒿素的部位有叶片、幼茎、花蕾、 花和种子，其中花蕾中的含量最高。 不同类型土壤对青蓠生长、生理生化和青篙素含量影响研究 关于青蒿生理生化的研究，国内外有大量的报道。我国科学工作者研究青蒿发现， 青蒿开花期是青蒿叶中青蒿素含量达到最高的转折点，而开花期受地形、气温、土质 和施肥等的影响很大。所以在开花前叶盛期采收青蒿为宜，人工稍加施肥的青蒿，一 般植株高大，青蒿素含量较野生略高，嫩叶比老叶的青蒿素含量高。在人工控制的环 境中只要青蒿基本生长营养条件得到满足，生长环境中营养物质含量和生长基质对青 蒿素含量没有多大的影响。而高温( 3 0 ) 和强光照却使青蒿索的含量成百倍地增长。 f e r r e i r a 等( 1 9 9 7 ) 则在严格地研究了叶片和花序中的青蒿素含量后，发现花序中青 蒿素含量最高，接近盛花期花蕾中的青蒿素含量。这一研究结果进一步证实了许多温 室或田间的实验结果，即盛花期的青蒿中青蒿素含量最高( m o r a l e se ta l ，1 9 9 3 ) 。还 有些结果说明青蒿植株中青蒿素最高含量出现在开花前期( p r a se ta l ，1 9 9 1 ) 。 w o e r d e n b a g 等( 1 9 9 1 ) 的研究发现，在青蒿的生长周期中，5 个月生长时间的青蒿的叶 产量和青蒿素含量可以达到最高，青蒿素含量可达0 8 6 ( 干重) ，然后开始下降。s i n g h 等( 1 9 9 8 ) 也发现不同地区栽培的青蒿，当植株生长至花开一半到完全开放时，青蒿素 的含量和产量可达到最高。e l h a g 等( 1 9 9 2 ) 筛选高产的青蒿植株时，发现青蒿素含量高 的植株具有长的节间、茁壮的茎杆、伸展的枝条和茂密的叶。从不同的科学工作者的 研究结果中可见，青蒿的收获应该在青蒿营养生长末期开始转为生殖生长期时为宜。 法尼基焦磷酸合成酶、倍半萜环化酶以及内脂形成过程中的加氧酶或氧化酶是青 蒿素生物合成的关键酶( 刘春朝等，2 0 0 0 ；王红等，2 0 0 3 ) 。如倍半萜环化酶的活性受 至l j m 9 2 + 、m n 2 + 和真菌诱导子的调节，氧化酶和加氧酶活性也受到光照的促进，通过 对不同酶的活性进行有利的调节控制，可能最大限度地促进青蒿素的积累。也可通过 抑制其次生代谢物的合成途径，使代谢向合成青蒿素的方向移动，明显地提高青蒿素 的产量( 李弘剑等，1 9 9 9 ) 。 青蒿素的合成可能被多种刺激所诱导。在细胞培养中加入酵母菌提取液或果胶酶， 可使青蒿素产量得到提高。微生物刺激剂、酵母、细菌提取物和胞外酶刺激可促进青 蒿素的生物合成( 王三根等，2 0 0 3 ) 。 1 1 4 青蒿素的提取和分离研究 青蒿素是一种无色针状晶体，分子式为c 1 5 h 2 2 0 5 ，分子量为2 8 2 3 4 。1 9 7 6 年通过 化学反应、光谱数据和x 射线单晶衍射方法证明其为一种含有过氧基的新型倍半萜内 4 广西大掌硕士掌位论文不同类型土壤对青蒿生长、生理生化和青篙素含量影响研究 酯，具有过氧键和6 一内酯环，有一个包括氧化物在内的l ，2 ，4 三恶烷结构单元， 在自然界中是非常罕见的，它的分子中包括7 个手性中心。熔点为1 5 6 - - 1 5 7 、易溶 于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和苯，可溶于乙醇、乙醚，微溶于冷石油醚，几乎不溶于水。 因其具有特殊的过氧基团，对热不稳定，易受湿、热和还原性物质的影响而分解。青 蒿素结构独特，具有抗疟、抗菌、解热、增强免疫等药理活性，对恶性疟、脑型疟有 特效，已成为世界卫生组织推荐的治疗疟疾的首选药品。 青蒿中青蒿素的提取，国内外研究得比较多。目前，综合国内外的研究情况，青 蒿素的提取方法有：有机溶剂提取( 李子颖等，2 0 0 4 ) 、超声波提取( 梁成钦等，2 0 0 4 ； 杨祖荣，2 0 0 3 ；赵兵等，2 0 0 0 ) 、微波辅助提取( 郝金玉等，2 0 0 2 ；梁忠生，2 0 0 4 ： 韩伟等，2 0 0 2 ) 、超临界c 0 2 提取( 钱国平等，2 0 0 5 ；胡淼等，2 0 0 6 ；s o c r a t e se ta l ， 2 0 0 6 ：y o u n g l u n gl i ne ta l ，2 0 0 6 ) 等。提取所需的提取剂主要有乙醇、乙酸乙酯、 石油醚等，其中乙醇的提取效果最佳( 杜小英等，2 0 0 5 ) 。有机溶剂法提取青蒿素， 其工艺路线成熟，易于工业化，但是需要经过多次萃取，耗能大，周期长，成本高， 且部分溶剂逃逸会对环境造成污染。超声波提取方法是一种操作方便、提取流程简 单的提取方法，它可以以乙醇、乙酸乙酯、石油醚等有机溶剂为提取剂，是目前青蒿 素提取比较常用的方法。微波辅助提取是利用微波能来提高萃取效率的一种新技 术，它是在有机溶剂提取的基础上进行的改进，较有机溶剂萃取选择性增加，溶剂消 耗量大大减少，时间缩短数倍或数十倍，收率提高，成本降低。超临界c 0 2 方法 提取青蒿素，是一种新兴的萃取分离技术，处于临界区附近的流体可以像普通流体一 样作为萃取剂使用，以高压液化气为溶剂，加压逆流和减压蒸发为主导的工艺路线， 其萃取工艺简单，周期短，操作温度接受常温，青蒿素几乎不发生热裂解等化学反应。 青蒿素的测定，国内外也是研究得比较多的。这些方法包括高效液相色谱法( 王 宗德等，1 9 9 9 ：e l s o h l ye ta l ，1 9 9 0 ：c o n g y u ee ta l ，2 0 0 6 ：周翱翱等，2 0 0 6 ：c h u r l z h a o l i u ，e ta l ，2 0 0 6 ；f i l i pe ta l ，2 0 0 6 ) 、反相高效液相色谱法( 刘丽芳等，2 0 0 4 ；黄海滨等， 1 9 9 4 ；李锦檠等，2 0 0 5 ) 、薄层扫描法( 梁成钦等，2 0 0 4 ：陈强等，1 9 9 9 ) 、紫外分 光光度法( 李典鹏等，1 9 9 5 ) 、还原性电化学法( 李子颖等，2 0 0 4 ) 、气相色谱法等。 高效液相色谱法( h p l c u v ) 适用于植物材料青蒿素含量的测定，在生药学及其他 学科中也适用，是青蒿中青蒿测定的最早的也是最常用的方法。薄层扫描定量法适 用于多组分物质和微量组分的含量测定，较其他一些薄层层析定量法具有准确度好、 灵敏度高、方法简便、快速等优点。其做法是在硅胶g 板上点标准品氯仿溶液，展开 不同类型土壤对青蓠生长、生理生化和青l l t - l l ：含量影响研究 显色后扫描得浓度、积分值标准曲线这一线性关系，再通过标准品积分值回归方法计 算出样品含量。紫外分光光度法，此法的原理是青蒿素在紫外区在2 0 3a m 处有弱 吸收，将其碱反应后酸化为一吸收峰在2 9 0a m 处的化合物( q 2 9 0 ) ，则可在紫外区测 定。还原性电化学法采用薄层含金汞齐电极响应过氧桥，它灵敏度高，选择性好， 测定迅速，是测定植物提取液青蒿素含量的一种好方法，但需除氧等较高要求。气 相色谱法是基于色谱柱洗脱出来产物检测青蒿素的一种间接的方法。此外，还有其他 的提取方法，如高效毛细管电泳电导法( 黄宝美等，2 0 0 6 ) ，柱前衍生r p h p l c 法、 高效液相色谱蒸发光散射检测器法( h p l c e s d l ) 等。 1 1 5 青蒿素类药物的药理作用研究 青蒿素是世界公认的抗疟新药物，其作用主要有以下几个方面： 第一：抗疟作用。青蒿素作为抗疟疾药物，对各种疟疾均有很好的治疗效果。研 究表明，青蒿素对疟原虫配子体有杀灭作用，其强度和剂量与配子体成熟度相关。近 年来，先后采用间接和直接的实验方法逐步证明，青蒿素类药物的抗疟作用与铁介导 的药物分子内过氧桥裂解产生的自由基有关。机体内铁( 包括游离铁和血红蛋白结合 铁1 能催化青蒿素类药物过氧桥结构的分解，产生自由基活性代谢物，损伤虫体细胞 膜结构达到抗疟目的。另外，青蒿素类药物还通过影响营养物质转运、抑制血红蛋白 酶、破坏血红素解毒机制、烷化d n a 等多个环节发挥杀虫效果( 贺小青等，2 0 0 6 ； 翟自立等，2 0 0 1 ) 。 第二：抗寄生虫作用。青蒿素类药物是一类广谱抗寄生虫药物，具有吸收好、分 布广、排泄和代谢快及高效、低毒等优点，对血吸虫( 胡水银等，2 0 0 0 ) 、弓形虫( s a r c i r o n e ta l ，2 0 0 0 ；王崇功等，1 9 9 7 ) 、肺胞子虫( 叶彬等，2 0 0 1 ；倪小毅等，2 0 0 1 ) 、利 什曼原虫( y a n gd me ta l ，1 9 9 3 ；芦殿梅等，1 9 9 9 ) 、阴道毛滴虫( 许静渡等，2 0 0 4 ； 谭苹等，2 0 0 0 ) 等有一定的治疗效果。但其抗寄生虫作用机制复杂，且对不同种寄生 虫或同种寄生虫不同发育阶段的作用不尽相同( 茹炜炜等，2 0 0 6 ) 。 第三：抗肿瘤作用。近年来发现青蒿琥酯有体内外抗肿瘤作用( 娄小娥等，2 0 0 2 ) ， 用青蒿琥酯处理的h e p g 细胞可见梯状d n a 和凋亡小体。双氢青蒿素对白血病、黑色 素瘤、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌细胞株高度敏感，而对非小细胞肺癌、中枢神经系 统肿瘤、卵巢癌和。肾癌细胞株的活性较低( b e e k m a n e ta l ，1 9 9 8 ) 。其抗肿瘤作用可能 6 广西大学硕士掌位论文不同类型土壤对青蒿生长、生理生化和青蓠素含量影响研究 同青蒿素与f e 2 + 反应产生大量自由基以及烷基化作用有关。 第四：抗病毒作用。青蒿素对流感病毒a 3 型京科7 9 2 株有抗病毒作用，马培林等 f 2 0 0 3 ) 以c v b 3 感染h e l a 细胞为实验模型，采用微量细胞病变抑制法，观察与分析青 蒿素、蒿甲醚等药物对c v b 3 的直接灭活、阻断吸附和抑制复制的作用。 第五：抗孕作用。娄小娥等( 2 0 0 1 ) 研究了青蒿琥酯对大鼠孕酮、雌二醇和蜕膜组 织的影响，结果青蒿琥酯能使血清孕酮含量下降并损伤蜕膜和胎盘而使胚胎坏死，吸 收而终止妊娠。青蒿琥酯和双氢青蒿素对小鼠、金黄地鼠、大鼠及兔均有抗孕作用， 金黄地鼠和豚鼠表现为流产，小鼠、大鼠和兔表现为胚胎吸收。青蒿素对体外培养的 人蜕膜细胞亦有直接杀伤作用。青蒿素类药对胚胎有较高的选择性毒性，较低剂量即 可使胚胎死亡而导致流产，但对母体子宫、卵巢和一般健康状况无明显影响( 徐继红 等，1 9 9 6 ) 。此类药有可能被开发为人工流产药物。 第六：对心血管的作用。青蒿素有减慢心率、抗心律失常、抑制心肌收缩等作用。 李宝馨等( 1 9 9 9 ) 发现，青蒿素能明显对抗结扎冠状动脉引起的心律失常，可使氯化 钙、氯仿引起的心律失常发作时间明显推迟，室颤明显减少，其作用与其抑制内向整 流钾电流阻1 ) 和浦肯野纤维瞬间外向钾电流( ) 有关。杨宝峰等( 1 9 9 8 ) 发现，青蒿 素能使豚鼠心室肌细胞，五l 显著降低，这种抑制呈浓度依赖性并可逆，且不呈现频率 依赖性。青蒿素能降低整流钾电流，五的快组分( 砧) 和慢组分眠。) 均能被抑制。 第七：其它作用。青蒿素( 蒿甲醚) 对预防性治疗和已患矽肺的治疗均有效，能显 著降低肺重、肺胶原和肺组织矽( 徐德忻等，1 9 9 8 ) 。青蒿素、青蒿琥酯均能对超适剂 量免疫法诱导供体鼠t 细胞的产生有显著抑制作用，提高淋巴细胞转化率，促进机体 细胞免疫，促进红细胞、白细胞、血红蛋白增加( 林培英等，1 9 9 8 ) 。郑红艳( 2 0 0 3 ) 对青蒿素母液体外抗真菌效能进行了考察，发现青蒿素渣粉剂和煎剂对部分真菌有不 同程度的抑制作用。 1 2 研究目的和意义 1 2 1 研究目的 在现有的研究的基础上，用不同的土壤种植青蒿，研究不同类型土壤对青蒿的生 长、各种生理生化特性以及其青蒿素含量的影响，探讨青蒿对各种土壤类型的适应性， 7 广西大学硕士掌位论文不同类型土壤对青篙生长、生理生化和青篙素含量影响研究 以便为青蒿的高产栽培及今后的进一步研究提供依据。 1 2 2 研究意义 青蒿是世界的广布种，世界各地均有栽培。中国是青蒿的栽培国家之一。青蒿的 有效药用成分青蒿素，具有抗疟、抗菌、解热、增强免疫等药理活性，对恶性疟、脑 型疟有特效，己成为世界卫生组织推荐的治疗疟疾的首选药品。而广西的条件适合青 蒿的生长，是我国青蒿种植的主要省份之一，且青蒿资源分布广泛，8 个地区4 0 多 个县均有青蒿的分布，年产量在4 0 0 0 吨以上，因此青蒿在广西的药用植物栽培生产 中具有举足轻重的地位。发展青蒿的栽培，对于提高青蒿素的生产有促进作用。 青蒿素是青蒿最重要的指标，是种植青蒿的最终目的，因此，研究青蒿的栽培条 件，以提高青蒿中青蒿素的含量，是有重大的意义的。目前，国内外对青蒿栽培的条 件的研究成果是比较少的，本次研究，就是在已有的研究基础上，探讨用不同类型的 土壤种植青蒿后对青蒿素含量的影响，以此作为青蒿栽培研究的一个补充，为今后的 更深入的研究打下一定的基础。 8 广西大掌硕士掌位论文不同类裂- - k 壤对青篙生长、生理生化和青蒿素含量影响研究 2 试验材料与方法 2 1 试验材料与设计 2 1 1 试验材料 本次试验的青蒿( 酉青5 号) 种子采于广西横县：选择生长良好的植株，将其种 子摘下，去除枝梗，风干后装袋备用。 2 1 2 试验设计 采用赤红壤( 成土母质第四纪红色粘土r e ds o i l ，r s ) 、黄壤( 砂质黄红壤，成土 母质砂页岩y e l l o ws o i l ，y s ) 、黑壤( 黑色石灰土：成土母质碳酸盐岩b l a c ks o i l ，b s ) 及白粘土( 硅质白粉土：成土母质硅质岩类w h i t ec l a y , w c ) 四种不同类型的土壤进 行青蒿栽培试验。各土壤养分含量情况见表2 1 。采用盆栽，置于温室栽培，每类型 土壤种植2 4 盆，三个重复，采用随机区组设计排列。2 0 0 7 年3 月上旬播种，播后盖 上一层草木灰，于5 月初定苗，每盆三株，此时苗高5 - - 1 0e m 不等，1 0 月下旬采收。 表2 1 不同类型土壤养分含量 t a b l e2 - 1t h en u t r i e n t sc o n t e n to fd i f f e r e n tt y p e so fs o i l 9 广西大掌硕士学位论文 不同类型土壤对青篙生长、生理生化和青篙素含量影响研究 2 2 生长特性及产量的测定 从2 0 0 7 年5 月1 5e t ( 且i j 定植后1 5 d ) y f 始，每隔1 5 d 进行一次生长特性的调查， 主要调查不同土壤栽培的青蒿的出苗时间、株高、基茎粗、冠幅、分枝数等，以及收 获后分别测定植株地上部和地下部鲜重，测其根茎比、生物产量等。 2 3 生理生化指标的分析测定 2 3 1 叶片多糖的测定 参考文献( 张海容等，2 0 0 6 ) 的方法，并有所改动： 标准曲线的绘制：吸取1 0 0 1 , t g m l 的葡萄糖标准溶液0 2 ，o 4 ，0 6 ，0 8 ，1 0 ，1 2 ， 1 4 m l 于7 支1 0 m l 的比色管中，各补水至2 m l ，分别加入5 的苯酚溶液2 m l 及9 8 的浓 硫酸