（作物遗传育种专业论文）拟南芥cbf3基因转化巴西橡胶树的研究.pdf

海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体。均已在文中以明确方式标明本声明的法律结果由本人 承担 论文作者签名：誓孙 日期：2 0 1 0 年6 月2 日 ； 。 ! 。 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅本人授权海南大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学、中国热带农业科学 院热带生物技术研究所 保密论文在解密后遵守此规定 论文作者签名： 誓劾 日期：2 0 1 0 年6 月2 日 导师躲西柱 日期：2 0 1 0 年6 月4 日 本人已经认真阅读“c a m s 高校学位论文全文数据库发布章程，同意将本人的学位论文提交 “c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益回盛途銮 握变匿溢唇! 旦坐生；旦= 生i 曼三生苤盔。 论文作者签名：誓劾 日期：2 0 1 0 年6 月2 日 导师躲薄板 日期：2 0 1 0 年6 月。4 日 l 摘要 本研究以巴西橡胶热研7 3 3 9 7 为实验材料，以调控植物抗寒性的c b f 3 基因为目的 基因，通过农杆菌介导法和基因枪法分别转化热研7 3 3 9 7 花药愈伤组织进行巴西橡胶树 的转基因研究 通过农杆菌介导转化法，研究选择转化材料、侵染后共培养时间、共培养温度、抑 菌抗生素浓度等对遗传转化的影响。结果表明：选择培养3 0 天的花药愈伤组织，侵染3 r a i n 后，在2 0 ( 2 共培养2 d ，再转至添力1 2 0 0 m g lc e f 的培养基上，可有效的控制农杆菌污染， 并且愈伤组织在侵染后可继续生长但是由于橡胶花药愈伤组织本身的成胚率十分低， 加之农杆菌的侵染以及添力1 c e f , 对愈伤组织的损伤较大，愈伤组织很难形成正常的胚 状体 研究了基因枪法转化热研7 - 3 3 9 7 花药愈伤组织，并通过2 5 m g lh y g 的筛选，最终获 得3 株抗性苗。经过提取其叶片d n a 进行p c r 检测，其中一株呈阳性。该株转化苗经过 扩繁4 代后得至- i j 2 9 株苗，再次提取叶片d n a 进 ? p c r 检测，结果仍然呈阳性，初步证明 c b f 3 基因已整合到橡胶基因组中。最后用b a m h i 和h i n d l l l 分别对其d n a 进行单酶切， 然后进, 行s o u t h e m 印迹杂交，结果有明显的杂交信号，而非转化的再生植株无s o u t h e m 杂交信号，说明目的基因c b f 3 已成功整合到橡胶树的基因组中，并可稳定遗传 关键词：巴西橡胶，c b f 3 基因，农杆菌，基因枪 l 一 a b s t r a c t - 一 n l ec b f 3g e n ew h i c hc o n t r o l st h ep l a n t sc o l dr e s i s t a n c ew a s t r a n s f e r r e d t l l ec a l l u s o f h e v e ab r a s i l i e n s t sr e y a n7 3 3 7 - 9 7b yp a r t i c l eb o m b a r d m e n t a n da g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d m e t h o ds e p a r a t e l y ： i nt h ea a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dg e n et r a n s f o r m a t i o nm e t h o d ，s o m e f a c t o r sw h i c hc o u l d i m p a c tt h et r a n s g e n i cr a t es u c ha s t h ea e c e p t o rm a t e r i a l s ，t h ec o c u l t u r et i m ea f t e ri n f e e t i o n 。 t h ec o - c u l t u r et e m p e r a t u r ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no f a n t i b a c t e r i a la n t i b i o t i c sw e f 占s t u d i e d h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h ec a l l u sc o u l de f f e c t i v e l yr e s i s tt h ea g r o b a c t e r i u mc o n t a 玎凼n a t i o n 觚d t h e yc o u l dc o n t i n u et og r o wu n d e rt h ec o n d i t i o n st h a t ：t h ea n t h e rc a l l u sw a s e u l t u r e df o r3 0 d a y sb e f o r eb e i n gi n f e c t e d ，b e i n gi n f e c t e df o r3 m i n ，c o c u l t u r e df o r2 d a y sa f t e rt h ei n f e c t i o n i n2 0 co nt h em e d i u mw i t hc e f 2 0 0 m g l t h er a t eo fe m b r y od i f i i e r e n t i a t i o n 五的ma n t h e r c a l l u si sv e r yl o wa n dt h ec e ff o rb a c t e r i u mi n h i b i t i o ni s h a r m f u lt ot h ec a l l u s s oi tw a s d i f f i c u l tt og e n e r a t en o r m a le m b r y of r o mt h eb e i n gi n f e c t e d c a l l u s 、 i nt h e p a r t i c l eb o m b a r d m e n tm e t h o dt h r e er e s i s t a n ts e e d l i n g sw e r e o b t a i n e dt h r o u 曲t h e 2 5 m g lh y gr e s i s t a n c es e l e c t i o n i nt h er e s i s t a n ts e e d l i n g s l e a f d n ap c r d e t e c t i o n o n ew a s p o s i t i v e t h i st r a n s g e n i ep l a n t l e tw a sp r o p a g a t e df o r4g e n e r a t i o n sa n d2 9n e w s e e d l i n 叠sw e r e o b t a i n e d p c ro fa l lt h ee x t r a c t e dl e a fd n a w e r ep o s i t i v e t h i sr e s u l ts h o w e dt l l a tt h ec b f 3 g e n ep o b a b l yh a db e e ni n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m eo f r u b b e r p r e l i m i n a r y b a m h ia n dh i n d l l l w e r eu s e dt o d i g e s tt h ed n as e p a r a t e l y t h e nt h er e s u l to fs o u t h e r nb l o ti d e n t i f i c a t i o n s h o w e dac l e a rs i g n a li nt h et r a n s f o r m e d p l a n t l e t sw h i l et h e r ew a sn os i g n a li n t h e n o n t r a n s f o r m e dp l a n t l e t s g e n o m i cd n a i td e m o n s t r a t e dt h a tt h ec b f 3g e n eh a db e e n i n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m eo fh e v e ab r a s i l i e n s i sr e y a n7 - 3 3 7 9 7s u c c e s s f u l l ya n di t sg e n e t i c s t a b i l i t y s o m eo ft h ep r o p a g a t e dt r a n s g e n i cp l a n t l e t sw o u l db e t r a n s p l a n t e di n t of i e l ds o o n k e y w o r d s ：h e v e ab r a s i l i e n s i s ，c b f 3g e n e ，a g r o b a c t e r i u m ，p a r t i c l eb o m b a r d m e n t h 、- ：。 目录： _ ! 摘要i a b s t r a c t 。j ：j 2 i j 1 前言1f j i j 罱 1 1 巴西橡胶的发展简介1 1 2 巴西橡胶树组织培养的研究进展2 1 3 巴西橡胶树基因工程研究进展3 1 3 1 报告基因和选择标记基因5 1 4 转化方法6 1 4 1 农杆菌介导法：7 1 4 1 1 农杆菌的转化特点以及转化机理8 1 4 1 2 农杆菌介导的转化方法。1 1 1 4 1 3 受体植物材料对转化的影响山1 2 1 4 1 4 培养及操作方法对转化的影响。1 2 1 4 2 基因枪法1 2 1 5c b f 基因的研究进展。1 4 1 5 1c o r l 5 a 冷诱导基因：1 4 1 5 2 转录激活因子c b f 基因15 1 5 2 1c b f 的结构和功能1 5 1 5 2 2c b f 基因的作用及特点。j 。1 6 1 5 2 3c b f 调节c o r 基因表达的机理二1 6 1 5 2 4 调控c b f 基因的表达：1 7 1 6 本研究的技术路线。l 1 7 1 7 本研究的目的和意义- 18 ： j 2 材料与方法1 9 2 1 巴西橡胶树的组织培养：“1 9 2 1 1 植物材料1 9 2 1 2 研究方法：_ 1 9 2 1 2 1 组织培养过程19 2 1 2 2 培养基：19 2 2 农杆菌法和基因枪法遗传转化巴西橡胶2 0 2 2 1 材料2 0 2 2 1 1 质粒及农杆菌菌株o 。2 0 2 2 1 2 受体材料2 l 2 2 1 3 农杆菌培养基“厶。2 l 2 2 1 4 重要试剂，酶和试剂盒2 1 2 2 2 农杆菌法遗传转化巴西橡胶树。2 2 m 2 2 2 1 潮霉素( h y g r o m y c i nb ) 筛选压力的确定2 2 2 2 2 2 头孢霉素( c e f a l e x i n ) 对愈伤组织再生的影响2 2 2 2 2 3 农杆菌侵染液的制备。2 2 2 2 2 a 农杆菌转化步骤2 3 2 2 2 5 转化材料的选择2 3 2 2 2 6 农杆菌侵染的时间对材料的影响。2 3 2 2 2 7 不同的共培养时间对抑菌影响2 3 2 2 2 8 不同的共培养温度对抑菌影响2 3 2 2 2 9 不同抑菌抗生素浓度对愈伤组织的影响2 4 2 2 3 基因枪法遗传转化巴西橡胶树。2 4 2 2 3 1 重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞：2 4 2 2 3 2 基因枪法转化步骤2 5 2 2 4 转化植株的检测山j _ 。2 6 2 2 4 1c t a b 法提取植物的总d n a 小2 6 2 2 4 2p c r 扩增2 6 2 2 4 3 转基因文心兰植株的s o u t h e r nb l o t 检测2 7 3 结果与分析3 2 3 1 农杆菌介导法转化巴西橡胶3 2 3 1 1 转化材料的选择。3 2 3 1 2 农杆菌侵染时间对材料的影响。3 2 3 1 3 共培养时间不同对抑菌影响3 4 3 1 4 侵染后共培养温度不同对抑菌影响3 4 3 1 5 不同c e f 浓度和培养方式的抑菌效果3 5 3 1 6 侵染后诱导出胚情况：一3 5 3 2 基因枪法遗传转化巴西橡胶3 6 3 2 1 潮霉素( h y g ) 对橡胶愈伤组织筛选压力浓度的确定3 6 3 2 2 基因枪轰击花药愈伤组织3 6 3 2 3 胚状体诱导出苗3 6 3 2 4 转基因橡胶p c r 检测及扩繁3 7 3 2 5 转基因橡胶的s o u t h ( g mb l o t 检测。3 8 4 讨论3 9 4 1 实验材料的制约3 9 4 2 试验新的受体材料。4 0 4 3c b f 3 基因转入巴西橡胶树尚4 0 4 4 后续工作展望4 0 4 5 橡胶树遗传转化体系研究的重要意义4 l 4 6 将抗寒基因导入橡胶树的意义4 l 5 结论4 2 i v ： 附图e o o eoe o eo e o j 4 缩写词及其英汉对照= 5 1 参考文献_ ：4 6 v 1 前言 1 1 巴西橡胶的发展简介 巴西橡胶树( h e v e a b r a s i l i e n s i sm u e u a r g ) 是多年生异花授粉乔木，属于橡胶树属 大戟科植物，原产地为南美亚马逊河流域。一百多年以前( 1 8 7 6 年) ，h a 威克汉在 巴西的塔帕诺斯( t a p a j o z ) 河岸的一个地方采集了一些巴西橡胶树的种子，然后运送到 了英国皇家植物园，种植后获得了两千七百多株巴西橡胶苗，然后他们选出了其中最好 的两千多株橡胶苗运送到了锡兰、爪哇和马来西亚。据一些报道说，运送到马来西亚的 仅2 2 棵，大部分运送到了锡兰种植。运到马来西亚的这2 2 株巴西橡胶苗则发展成为现 今东南亚的巴西橡胶树。而当初h a 威克汉采集的橡胶树的种子仅仅是当地土生的橡 胶树属中的一个种( e p 阿姆利1 9 7 8 ) ，因此除南美外，世界其他地区我们所称的巴 西橡胶树都是当时h a 威克汉所采摘的有限的几棵橡胶树的血统后代，这就说明其遗 传基础比较狭窄。巴西橡胶树的抗病性、抗寒性、抗风性、胶乳产量等性状都亟待提高。 而随后的好几十年巴西橡胶树主要是采用常规的育种方法，其费用高，且育种周期般 为1 0 , - 3 0 年，因此很难用常规育种对其进行品种改良，直到2 0 世纪5 0 年代，育种学家 们开始研究橡胶树的组织培养技术，尤其是6 0 年代以后，中国、马来西亚、斯里兰卡、 印度尼西亚等国家对此进行了比较深入的研究，并取得了一定的进展 ( s a t c h u t h a n a n t h a v a l er ，e ta 1 ，1 9 7 2 ) ，这就拓宽了巴西橡胶树的育种途径，大大的缩短 了育种年限。到9 0 年代初期a r o k i a r a j ( 1 9 9 1 ) 等开始了橡胶树基因工程的研究，为改 良橡胶树的性状提供了新的思路，随后，国际上对此开始了广泛的研究。 天然橡胶因其性质优良早已成为非常重要且不可替代的工业原料，被列为四大工业 原料之一。国际上，天然橡胶一直都是供不应求，尤其是第二次世界大战期间发生了很 严重的天然橡胶危机( e p 阿姆利，1 9 7 8 ) ，近几十年来我国经济迅速发展，对天然橡 胶的需求量也是逐年增大，而巴西橡胶树只能种植于热带地区，我国目前的种植面积只 有6 6 6 6 6 7 h m 2 ，天然橡胶的供应量仅为国内需求量的三分之一，远远不能满足本国的需 求。天然橡胶产业要更好的发展，就需进一步改良巴西橡胶树的育种方法以及更深入的 分子生物学研究。 1 2 巴西橡胶树组织培养的研究进展 天然橡胶是不可替代的工业原料，长期以来都是供不应求，研究人员一直都致力于 提高天然橡胶的生产效率，改善其生产技术的研究，尤其是对巴西橡胶树育种方法的改 善和对巴西橡胶树品质的改良研究，包括橡胶产量的提高以及抗逆性、抗病性的增强等。 自从h a 威克汉从巴西热带雨林将巴西橡胶树引种到世界其它地区开始到2 0 世 纪5 0 年代，巴西橡胶树主要是通过常规育种来选育品种，这种方法的周期长。因此， 巴西橡胶树的组织培养技术开始受到育种学家的关注，并开始试验研究。到7 0 年代以 后，植物组织培养技术发展迅猛，中国、马来西亚、斯里兰卡、印度尼西亚等国家对此 进行较深入的研究，并取得了一些进展( s a t c h u t h a n a n t h a v a l er e ta 1 ，1 9 7 2 ) 。1 9 7 7 年， 王泽云等利用离体花药培养首次获得了完整植株，并在1 9 7 8 年成功的移栽成活了世界 上第一批橡胶花药体细胞植株。目前已可从花药、内珠被、子叶诱导培养出胚性愈伤组 织( 陈正华等，1 9 8 6 ) ，经过体细胞胚发生得到再生植株，应用于实际生产，当前已取 得了很好的经济效益。目前，中国、印度、印度尼西亚、马来西亚、法国、巴西等国都 能利用花药或种子内珠被诱导出完整的植株，并应用于生产。 至今，巴西橡胶树的组织培养技术的发展主要包括以下几个方面： ( 1 ) 花药离体培养：1 9 7 2 和1 9 7 3 年，s a t c h u t h a n a n t h a v a l er 等获得了来自巴西橡 胶树花药壁的二倍体组织。随后，p a r a n j o t h yk 和g h a d i m a t h ih ( 1 9 7 5 年) 在花药培养 试验中获得胚状体，但没有获得再生植株。1 9 7 7 年，中国科学院遗传研究所和广东省农 垦总局保亭热带作物研究所获得了巴西橡胶树花药植株。1 9 7 8 年，王泽云等也获得花药 离体培养再生植株，并且移栽成活。 ( 2 ) 未授粉胚珠的培养：在2 0 世纪8 0 、9 0 年代郭发高等以及陈正华和肖三元等 对多个橡胶品系的未授粉胚珠进行诱导，并从几个品系的胚珠获得了完整的植株。但是 此方法的植株再生频率极低，培养难度较大，品系间差别较大，只有极少数的橡胶品系 能够获得再生植株，因此这项技术也就没有得到发展应用。 2 ( 3 ) 子房培养，肖三元和陈正华进行橡胶子房培养，获得了几个品系的子房苗完 整植株。但不同品系间，愈伤组织诱导率以及胚状体的发生率存在明显差异，而且诱导 出苗率和植株移栽成活率都较低。 ( 4 ) 体细胞植株克隆增殖：陈雄庭等( 2 0 0 6 年) 对体细胞植株克隆增殖成功，增 殖系数为2 3 ，解决了花药培养中，再生频率较低、生产成本高以及无法满足生产中的 大量需求等问题。 ( 5 ) 茎尖和嫩茎培养：1 9 7 5 年，p a r a n j o t h y 和g h a n d i m a t h i 以2 - - 3 周的种子实生 无菌苗的茎尖作外植体培养，仅获得一些愈伤组织，c a r r o nmp 、e n j a l r i e 等( 1 9 8 2 年) 、 m a s c a r e n h a s ( 1 9 8 2 年) 和m e n d a n h a 等( 1 9 9 8 年) 也做了大量工作，并获得了再生植 株。其能保持母本的优良性状，在生产中可能有很大的应用价值，但后来却没有继续发 展。 ( 6 ) 悬浮细胞培养：在早期，w i l s o n 等( 1 9 7 6 年) 和v e i s s e i r e 等( 1 9 9 4 年) 的 工作只诱导得到了胚状体。后来，陈正华和刘桂珍研究不仅得到了胚状体，还获得了再 生植株。目前，法国国际农业研究发展中心( 简称c i r a d ) 在橡胶树的悬浮培养方面 取得了重大进展，利用发酵罐培养愈伤的成胚率高达4 5 。 ( 7 ) 原生质体培养：原生质体是很好的受体材料，许多工作者对此方法进行了研 究，但只有s u s h a m a k u m a r 等( 2 0 0 0 年) 成功利用橡胶树原生质体培养获得了再生植株。 目前，巴西橡胶树组织培养的主要技术途径是花药离体培养。但是有些其他方法也 很有潜力或具有某方面的优势，这有待进一步的研究。橡胶组织培养技术是橡胶基因工 程的基础，在理论和实践中都具有十分重要的意义。 1 3 巴西橡胶树基因工程研究进展 天然橡胶的主要来源是巴西橡胶树，是十分重要的工业原料，而且天然橡胶的化学 成分橡胶烃经过生物改良，可作为化石能源的替代品。国际上对天然橡胶的需求逐年增 加。橡胶树只适应热带气候，而我国热带地区面积有限，可栽培区域已近饱和。国内天 然橡胶的产量只能达到消费量的三分之一，我国的天然橡胶产量亟待提高。然而橡胶树 的生活周期长，一个育种周期一般需要1 0 - - 3 0 年，而且橡胶树遗传背景很复杂，因此应 用常规的育种方法对橡胶树的产胶量、抗逆性、抗病性等品质进行改良很困难。 橡胶树的遗传转化具有重要的意义：一是橡胶树作为天然橡胶的商业来源，通过基 因工程可对其多种性状进行改良，而且可大大缩短育种周期。二是橡胶树具有特殊的乳 管系统，割胶可获得大量的胶乳，因此橡胶树可作为一种天然反应器，通过基因工程改 造使其高效表达外源蛋白质( 赵辉等，2 0 0 8 ) 。 近二十年来，基因工程发展迅速，获得了许多转基因植物，可以不影响其他性状而 有目的地改变植物的某一性状，并可缩短育种周期。转基因技术逐渐完善，但是，橡胶 树的基因转化仍存在很大困难。 1 9 9 1 年，马来西亚橡胶研究所的a r o k i a r a j 等在2 周龄的离体橡胶苗的茎部皮下注 入致癌农杆菌5 4 1 7 1 进行接种，3 周后开始形成肿瘤，8 周后肿瘤直径达到2 c m ，将该 肿瘤切下，放在不含激素的m s 基本培养基上，其能自主生长，用t l c 检测，确定肿 瘤组织中已含有由农杆菌诱导形成的章鱼碱( a r o k i a r a j ，1 9 9 1 ) 。肿瘤的形成需要质粒 的转移，并表明质粒包含的控制某些代谢物( 如冠瘿碱、植物激素等) 的基因在肿瘤中 得到了表达，这是最早关于橡胶树基因工程方面的报道。1 9 9 4 , - , 1 9 9 8 年a r o k i a r a j 等分别 应用农杆菌介导法和基因枪法，都成功的将新霉素磷酸转移酶和b 葡糖苷酸酶( g u s ) 基因转入橡胶中，在扩繁3 代后的无性系中仍能正常表达，表现出了较高的稳定性( 而 这个重要特征正是转基因动植物所需要具备的) ，初步建立了橡胶树的遗传转化体系， 从此，形成了以脱分化的愈伤组织为受体进行巴西橡胶转化的基本技术路线，但转化效 率很低( a r o k i a r a je t 口l ，1 9 9 4 ，1 9 9 6 ，1 9 9 8 ) 。2 0 0 0 年，m o n t o r o 等人研究了农杆菌介导 转化橡胶中钙的作用，但没有得到转基因植株( m o n t o r oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 2 0 0 3 年，印度 橡胶研究所的r j a y a s h r e e 等通过农杆菌介导将g u s 基因和s o d 基因成功转入橡胶中， 并且目的基因在转基因后代中能够稳定表达( j a y a s h r e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。2 0 0 5 年m o n t o r o 等在橡胶树的内珠被愈伤继代以及相关的悬浮培养技术的基础上，通过农杆菌介导成功 得到转基因植株，但转化过程产生了大量玻璃化苗，相关的组织培养技术还需完善 ( b l a n ce ta 1 ，2 0 0 6 ) 2 0 0 6 年中国热带农业科学院生物技术研究所的陈雄庭等对基因 枪转化橡胶愈伤的方法进行了探索，以g u s 基因为报告基因，m 玎基因为筛选标记 4 基因枪法对橡胶脱分化愈伤组织进行转化实验，将g a i 基因导入巴西橡胶， g a i 基因已经整合到橡胶基因组中，但经过基因枪轰击后，橡胶愈伤组织褐 重，胚状体再生率和出苗率都较低，最终没有获得转基因植株。 目前，法国国际农业研究发展中心( 简称c i 鼬) 在橡胶树生物技术的研究方面 处于世界领先水平。他们利用发酵罐培养愈伤的成胚率高达4 5 ，掌握了从橡胶树的内 珠被脱分化培养从而得到易碎胚性愈伤组织的技术，这种易碎的胚性愈伤组织长期继代 5 年以上，仍能诱导出再生植株。在此基础上，研究人员利用易碎的胚性愈伤组织进行 遗传转化研究，从6 个愈伤组织系的遗传转化中得到了数百株转基因植株( b l a n ce ta 1 ， 2 0 0 6 ) ，但用这种易碎的胚性愈伤组织进行悬浮培养所得到的植株大部分玻璃化，不能 正常生长，因此，最后未能成功地进行胚性细胞悬浮培养。自上世纪7 0 年代后期以来， 我国已可对花药、内珠被、子叶培养诱导出胚性愈伤组织，再经过体细胞胚发生得到再 生植株，但难以建立胚性细胞悬浮系和转化体系。至今，遗传转化成功的，都是在橡胶 花药离体培养和内珠被培养的基础上进行的( 王亚丽等，2 0 0 4 ) 目前国内胚状体诱导 率高、质量好的橡胶品种有：p b 2 6 0 ，p r i l l 0 5 ，云研7 3 4 7 7 ，热研7 3 3 9 7 ，热研8 8 1 3 ，海垦2 等，可以作为较好的橡胶树转化受体材料( 谭德冠等，2 0 0 5 ) 我国科研人 员进行橡胶树遗传转化主要采用以下品种：海垦2 ，热研7 3 3 9 7 ，热研8 8 1 3 ，p b 2 6 0 ， p r l 0 7 ，p r i i1 0 5 ，并取得一些研究进展( 赵辉等，2 0 0 8 ) 。橡胶树的组织培养对基因 型的依赖性较强，某些品种很难诱导植株，从而限制了橡胶树遗传转化的研究进展。 橡胶树是多年生的木本植物，在进行分子生物学和生物技术方面的研究存在一定的 困难，但也取得了一些成就，如橡胶树基因文库和c d n a 文库的建立、天然橡胶合成 途径中的一些关键性酶的基因克隆、转基因植株的获得等( 彭世清等，2 0 0 1 ) 。总之， 橡胶树分子生物学和生物技术研究还处于初始阶段，有待进一步的研究。目前，基因工 程育种是橡胶树生物技术研究的核心内容。 1 3 1 报告基因和选择标记基因 建立高效、可靠、稳定的选择报告系统是遗传转化成功的关键因素之一。报告基因 ( r e p o r t e rg o n e ) 是一种编码其表达产物容易被鉴定( 可被检测的蛋白质或酶) 的基因。 5 把报告基因和调节报告基因表达的序列接合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合， 在调控序列的控制下表达，利用其表达产物来标定目的基因的表达调控，进行筛选，从 而得到转化植株。报告基因在遗传选择和筛选检测方面须满足以下几个条件： ( 1 ) 已被克隆以及已测定其全序列； ( 2 ) 在受体细胞或被转染的细胞中本不存在其表达产物和相似的内源性表达产物， 即无背景； ( 3 ) 其表达产物能被定量测定。 在植物基因工程研究过程中，已经使用的报告基因有下列几种：胭脂碱合成酶基因 ( n o s ) 、章鱼碱合成酶基因( o c s ) 、新霉素磷酸转移酶基因( n p t i i ) 、氯霉素乙酰转 移酶基因( e a t ) 、庆大霉素转移酶基因、荧光酶基因、葡萄糖苷酶基因等。n o s 、o c s 这两个基因是致瘤农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m f a c i e n s ) 的t i 质粒自身所特有的，这两个 报告基因在植物的根、茎、叶中均能表达，不受发育调控，将外源目的基因导入t i 质 粒，再用相应的致瘤农杆菌转化植物体，如果检测时用转化体的提取液进行纸电泳，染 色后在紫外光下观察发荧光，则说明外源基因已转入植物体中。n p ti i 、c a t 及庆大霉素 转移酶基因，都是抗生素筛选基因，这些基因表达的酶可以对底物( 其对应的抗生素) 进行修饰( 磷酸化、乙酰化) 等，从而接触了这些抗生素对植物生长的抑制作用，因此， 含有这些抗性基因的转化体就能在含有这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用 转化体提取液，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。目前常用的一种报告基因是 d d 葡萄糖苷酶基因，此酶催化底物形成p d 葡萄糖苷酸，其在植物体中几乎没有背景， 组织化学检测十分稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。荧光酶基因( 1 u e ) 是在1 9 8 5 年从北美荧火虫和叩头虫的e d n a 文库中克隆得来的，此酶在有a 卯、m 孑+ 、0 2 和荧 光素存在下会发出荧光，这样就可用整株转基因植物或部分材料直接用x - 光片或专门 仪器进行检测得到结果，操作方便、简单。 。 1 4 转化方法 巴西橡胶树转化技术应用最普遍的方法是农杆菌介导法和基因枪法，而且这两种方 6 法都有转化成功的报道。以花药或内珠被脱分化诱导愈伤组织为转化受体材料，农杆菌 介导法与基因枪法相比，后者更容易转化成功。原因主要是脱分化愈伤组织随着继代次 数的增加，成胚率大大降低，一般经过4 - 5 次继代后就几乎不能形成胚状体( 吴蝴蝶等， 1 9 9 7 ) 。脱分化愈伤组织经基因枪轰击后约1 5 d 就可转接到胚状体诱导培养基，转化过 程对愈伤成胚影响不大，这是基因枪转化法的优势。但使用基因枪转化法，转化效率受 许多因素的影响，如受体生长状态、微弹射程、微弹质量、轰击次数以及筛选过程等。 。 ： 而农杆菌介导法由于其操作简单、转化效率较高、拷贝数少等优点，成为了目前最受关 注的橡胶树转化方法。 1 4 1 农杆菌介导法 1 9 世纪末期，s m i t h 发现了根癌农杆菌，由于其在改良品种的基因转化等方面的特 殊作用，受到了相关科研工作者的重视( b e r t h o m i e up , j o u a n i nl ，1 9 9 2 ；g i d d i n g sl 、 v ，1 9 9 6 ；l o w ejm ，d a v e ymr ，p o w e rjb ，b l u n d yks ，1 9 9 3 ) ，进行了很多方面的研究。 利用农杆菌进行作物遗传转化的研究是在19 8 3 年z a m b r y s k e 等以根癌农杆菌t i 质粒为 载体，将目的基因转入烟草细胞，获得第一株转基因烟草后，开始迅速发展。1 9 8 7 年， g r i m s l e y 等通过农杆菌介导将玉米条纹病毒的c d n a 转入玉米，转化后植株表现出了感 染症状。1 9 9 0 年和1 9 9 1 年通过根癌农杆菌介导分别将水稻和小麦转化也获得了成功。 在随后的植物基因工程发展中，农杆菌介导的基因转化系统( w e i s i n ge ta 1 ，1 9 8 8 ) 逐渐 成为有效且比较完善的基因转移方法，其中根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 介 导的遗传转化研究最为清楚，应用也最为成功。起初，研究者认为农杆菌只能转化双子 叶植物、裸子植物及少数几种单子叶植物，到2 0 世纪9 0 年代，农杆菌介导成功的转化 了一些单子叶植物和真菌( b u n d o c kp , d e ndr ，b e i j e r sb e r g e na e ta 1 ，1 9 9 5 ；c h a r tm t ，c h a n g hh ，h osl e t a l ，1 9 9 3 ) ，该方法有转基因拷贝、遗传稳定及可以转化大片段 的d n a 等优点( h a m i l t o ncm ，f r a r ya ，l e w i sc e ta 1 ，19 9 6 ；l i uyg ，s h i r a n oy ，f u k m l c i h 甜a 1 ，1 9 9 9 ) ，因此，引起研究者的更多关注。到2 0 0 0 年，已获得的近2 0 0 种转基因 植物中有8 0 都是由根癌农杆菌介导完成的( 王关林，方宏筠，2 0 0 2 ) 7 1 4 1 1 农杆菌的转化特点以及转化机理 一 。 1 4 1 1 1 农杆菌的基本特征。 农杆菌( a g r o b a c t e r i u m ) 是一种普遍存在于土壤中的革兰氏阴性菌，发现与转化植 物基因有关的有两种类型：一种为根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr u m 咖c i e n s ) ，含t i 质 粒，能侵染的植物细胞并诱导植物形成肿瘤( 冠瘿瘤) ；另一种为发根农杆菌 ( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) ，含有黜质粒，能够诱导侵染的植物细胞产生毛发状根。 - 2 0 世纪。7 0 年代末，研究者发现根癌农杆菌侵染植物后将其t i 质粒( t u t o r i n gd i c i n g p l a s m i d ) 上的一段t d n a 插入到被侵染的细胞基因组中，并且能在其后代中稳定地遗 传( 朱玉贤等，1 9 9 7 ) 。1 9 7 4 年，z e a n e n 等从根癌农杆菌中获得一个巨大质粒，称之 为致瘤质粒( t u m o r - i n d u c i n gp l a s m i d ) ，即t i 质粒。根癌农杆菌感染植物主要是通过 t i 质粒产生的冠瘿碱，根据产生的冠瘿碱种类不同，将根癌农杆菌分为四种：胭脂碱型 ( n o p a l i n e ) 、章鱼碱型( o c t o p i n e ) 、农杆碱型( a g r o p i n e ) 和琥珀碱型( s u c c i n a m o p i n e ) 。 后来研究发现t i 质粒上主要有四个重要区域：( 1 ) 复制起始区域( o r i g i no f r e p l i c a t i o n ，o r i 区) ，该区对t i 质粒的自我复制进行调控。( 2 ) 毒性区域( v i r u l e n c er e g i o n ，v i r 区) ， 位于t d n a 以外的一个3 0 - 4 0 k b 的区域内，该区段的基因并不整合到植物基因组中， 但对t d n a 的转移和整合十分重要。植物细胞释放水溶性酚类化合物的信号分子刺激 v i r 区，才能使其表达。根癌农杆菌毒性区有两个独立的转录单位( c h v a 和c h v b ) ， 其中c h v b 可能与菌表面2 环1 3 葡聚糖( 根癌农杆菌吸附于植物细胞壁所必需的) 的 合成有关，c h v a 则可能与吸附的过程有关。( 3 ) t - d n a 区域( t r a n s f e r d n a r e g i o n 区) ， 该区域有左右2 个边界( l b 和l u ) 是t - d n a 转移时所必需的，在两端序列中间插入 任何一段d n a 片段且保证两端序列存在且方向正确，外源d n a 就能被转移到植物基 因组中。t d n a 的转移方向是从右至左，右边界在t d n a 的转移过程中对识别靶d n a 的位点有重要作用( m a y e r h o f e re t 以，1 9 9 1 ) ，因此，右边界尤为重要。( 4 ) 接合转移 区域( r e g i o ne n c o d i n gc o n j u e a t i o n s , c o n 区) ，该区段基因与细菌间接合转移有关，调控 t i 质粒的转移。发根农杆菌感染植物利用的是砒质粒( r o o ti n d u c i n gp h s m i d ) 转移机 制与t i 质粒类似，只是v i r 区域和t - d n a 区域所含基因及其同源性有所不同( 郭春沅， 8 1 9 9 7 ) 研究者先将目的基因分离、鉴定，然后构建植物表达载体，再将目的基因插入 t - d n a 区，最后通过农杆菌t i 或融质粒介导将外源目的基因整合到植物基因组中，从 而获得转基因植株( 张成合等，2 0 0 1 ；m a r i a n ne ta l ，2 0 0 1 ) 。 1 4 1 1 2 农杆菌介导转化的机理 植物基因转化是指利用分子生物学及基因工程技术将外源目的基因导入受体材料 的基因组中，并使外源基因在后代植株中表达的技术。农杆菌介导法转化是指利用自然