（植物学专业论文）木糖筛选系统在黄瓜转化中的应用.pdf

r ， j j 摘要 随着转基因植物商业化，转基因植物的生物安全性，尤其是转基因植物中的抗性标 记基因，受到了越来越多的关注。因为人们担心这些抗性标记基因能够潜在地流向杂草、 微生物，对环境造成危害，以及植物产生意外的性状，从而引发食品或生态安全问题。 在植物遗传转化系统中，目前应用较为广泛的筛选标记基因主要有两大类：抗生素 抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。常用的抗性酶基因包括n p t f i 基因、c a t 基因、h p t 基因、b a r 基因等。转化的细胞可以在含有抗生素和除草剂的培养基中正常生长，因此 利用这些标记基因的筛选体系都可能存在生物安全性问题，因而采用无害的正筛选系统 进行植物遗传转化是基因工程的重要目标之一。 木糖筛选是一种正选择筛选体系，木糖异构酶基因( x y l a ) 是一种安全的标记基因。 我们首先通过七组对照实验确定木糖作为选择剂的最佳浓度。本实验以大肠杆菌x y l a 作为选择标记基因，利用木糖作为选择剂获得能够表达带有g u s 报告基因的转基因黄 瓜。同时，为了获得对肿瘤有积极作用的a f g f 的单链抗体，本实验还构建了p x 3 9 0 一s c f v 载体，以木糖作为筛选剂，进行黄瓜遗传转化研究。本研究初步建立了农杆菌介导的基 于木糖选择系统的黄瓜转化体系。以黄瓜真叶为外植体，预培养2 天，以携带表达载体 的农杆菌l b a 4 4 0 4 侵染黄瓜，选择培养基添加1m 砌的2 i p 和lm g m l 的2 ，4 d ，待 愈伤长出时，选择培养基添加0 3 m g m l 的2 i p 。选择培养基中加入1 5 9 l 的木糖和1 5 9 l 的蔗糖，获得的转化效率较高。通过这套程序，我们获得了1 9 株转基因黄瓜植株，通 过p c r 和g u s 组织染色，初步证明1 2 株为阳性植株。 关键词：缈l a ：a f g f 单链抗体；转基因黄瓜；g u s 组织染色 i c u c u m b e rw i t hg u sg e n ei nt h i s s y s y t e m t h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp x 3 9 0 s c f vw a s c o n s t r u c t e di nt h i ss t u d y i nt h i sp r o c e d u r e ，c u c u m b e rc o t o l e d o nw e r eu s e df o re x p l a n t ，w h i c h w a si n o c u l a t e dw i t ha g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n sl b a 4 4 0 4c o n t a i n i n gt h eb i n a r yv e c t o r s e l e c t i o nm e d i u mc o n t a i n e d1 m g n a2 i pa n d1m g r n l2 , 4 d ，15 9 lx y l o s ea n d15 9 l s u c r o s e ，w h i c hc h a n g e dt o0 3 m g m l2 i pw h e nc a l l u sg r e w w eo b t a i n e dp o s i t i v et r a n s g e n i c p l a n t sd e t e c t e db yp c ra n dg u s s t a i n i n g k e yw o r d s ：x y l a ；a f g f ；s c f v ；t r a n s g e n i cc u c u m b e r i i 目录 中文摘要i 英文摘要i i 目录i i i l 弓i 言1 1 1 植物遗传转化的正向选择标记l 1 1 1 与糖代谢相关的选择标记基因l 1 1 2 与激素代谢相关的选择标记基因3 1 1 3 正筛选系统在植物转化中的应用前景4 1 2 人类酸性成纤维生长因子及其单链抗体。5 1 3 植物生物反应器5 1 3 1 植物生物反应器的优越性6 1 3 2 植物生物反应器两种表达系统7 1 3 2 1 植物稳定转化系统7 1 3 2 2 植物瞬时表达系统8 1 3 3 植物生物反应器目前存在的问题8 1 4 黄瓜遗传转化研究进展8 2 材料与方法1 0 2 1 材料10 2 1 1 植物材料1o 2 1 2 质粒和菌种1 0 2 1 3 化学试剂lo 2 1 4 培养基1o 2 1 5 实验所用的p c r 引物1 0 2 2 实验方法11 2 2 1 木糖作为选择剂的最佳浓度。1 1 2 2 2 植物表达载体p x i ：g u s 的鉴定12 2 2 3 植物表达载体p x 3 9 0 s c f v 的构建1 3 2 2 4 植物表达载体p x 3 9 0 s c f v 的鉴定14 2 2 5 农杆菌介导的黄瓜转化1 6 2 2 6 植物基因组d n a 分离1 7 2 2 7 再生植株的p c r 检测1 7 2 2 8 再生植株的g u s 组织染色检测18 3 结果19 1 1 i 3 1 木糖作为选择剂的最佳浓度1 9 3 2 植物表达载体p x i ：g u s 的鉴定一1 9 3 3 植物表达载体p x 3 9 0 s c f v 的鉴定2 0 3 4 农杆菌介导的黄瓜转化2 0 3 5 转基因植株的p c r 检测2 2 3 6 转基因植株g u s 组织染色检测2 2 4 讨论：2 4 4 1 木糖正选择体系的优化2 4 4 2 黄瓜遗传转化过程的分析2 4 4 3 黄瓜作为生物反应器的表达宿主2 4 5 结论2 6 参考文献2 7 致谢31 i v 东北师范大学硕士学位论文 1 引言 1 1 植物遗传转化的正向选择标记 自从1 9 8 3 年世界上首次获得转基因植物以来，植物基因工程发展日新月异。迄今为 止，全世界已分离的目的基因有几百个，获得转基因植物近2 0 0 种。我国有5 0 余种植物 和1 2 0 种功能基因被科学家用于基因工程的研究工作中，这使中国处于全球领导者地位 在植物遗传转化领域心3 。n 2 0 0 0 年全世界转基因作物的种植面积已上升 ! u 5 2 6 0 万公顷， 2 0 0 8 底累计达8 亿公顷口3 ，至u 2 0 0 9 年，全世界种植转基因作物的面积达到1 3 4 亿公顷。其 中，中国种植转基因作物达至! u 3 7 0 万公顷，主要种植棉花，番茄，甜辣椒等作物。利用 基因工程技术定向改造作物，可大大加速优良作物的筛选和培育过程，提高食物产量和 品质、增加作物的抗虫抗害能力等h 一1 。 近年来，大部分研究集中于农杆菌介导植物转化，通过标有抗生素或者除草剂抗性， 在转化的植物细胞进行筛选，这使转化的细胞在含有抗生素或者除草剂的培养基中生 长，未转化的细胞被杀死。因此，随着转基因作物产品的大量广泛应用，目前几乎所有 的转基因植物中都含有标记基因，且标记基因已被转入不同的作物中，因此食品中含有 标记抗性基因，其安全性自然也引起了普遍关注。原因就是抗性标记基因被应用于植物 的遗传转化技术中。这些抗性标记基因通常与目的基因一起转化，使转化细胞具有抗生 素抗性或除草剂抗性。其中存在着潜在的危害性7 ，。例如，抗生素标记的基因转移， 可使其在环境中传播；除草剂抗性标记基因可以通过花粉，种子等途径传播扩散，最终 产生抗除草剂的“超级杂草”。 目前，基于人们对转基因食品安全性的考虑，在植物遗传转化中，多采用正选择标 记基因作为筛选标记，从而，减轻了对环境的危害。正向选择标记基因不是将非转化的 细胞杀死，而是将转化的细胞中特殊的碳、氮或者生长调节激素阳9 1 叫，在代谢或发育 过程中表现出生长优势，而非转化的细胞生长受到抑制，使其停留在某个代谢途径中， 从而筛选出转化的细胞。正选择系统克服负选择的缺点，获得了较高的转化效率 ，。更 重要的是，正选择系统被公众所接受，从而加快了植物产业化的步伐。目前正选择安全 标记基因主要包括激素代谢相关基因和糖类代谢酶基因等。 1 1 1 与糖代谢相关的选择标记基因 这类基因编码的是某种糖类的分解代谢酶，转化的细胞导入该种酶，可以利用培养 基中的糖类作为碳源而在选择培养基上生长，而非转化的细胞，不能利用培养基中的碳 源，生长受到抑制，停止生长。目前植物转化利用糖类标记基因有磷酸甘露糖异构酶基 因( 删) 和木糖异构酶基因( x y l a ) 等池引。 1 2 木糖异构酶基因( x y l a ) 木糖异构酶基因来源于红色链霉菌( s t r e p t o m y c e sr u b i g i d o s u s ) 、高温厌氧芽孢杆 菌( t h e r m o a n a e r o b a c t e r i u mt h e r m o s u l f u r o g e n e s ) ，编码木糖异构酶基因，其产物能 催化d - 木糖与d 一木酮糖的可逆转变n 耵。在含有木糖的筛选培养基中，转化的细胞可以利 用木糖作为碳源，使植物细胞可以正常生长。而非转化的细胞不能利用木糖作为生长所 需的碳源，而被抑制生长，但细胞不会被杀死。原因在于，由于转化的细胞转入了木糖 异构酶基因，它可以催化d 一木糖转化为d _ 木酮糖，从而进入糖酵解途径，保证植物细胞 正常生长。 利用木糖进行筛选植物转化细胞不同于利用除草剂或者抗生素进行筛选，后者筛选 2 东：i l o $ 范大学硕士学位论文 系统会使非转化的植物细胞杀死。因此，利用木糖在植物转化过程中作为筛选剂优于抗 生素或者除草剂筛选“朝。如表一所示，利用木糖作为筛选剂，其转化效率高于抗生素筛 选效率。此方法在在马铃薯，番茄中已得到应用n 们。 表1 木糖筛选和抗生素筛选获得不同的转化效率n 卵 t a b l e1 t h ee f f e c to ft h es e l e c t i o na g e n td x y l o s eo nt r a n s g e n i cs h o o t sf r o m p o t a t oi n t e r n o d e s ，t o b a c c ol e s fd i s c sa n dt o m a t oh y p o c o t y l st r a n s f o r m e dw i t ht h e x y l ag e n ef r o mzt h e r m o s u f u r o g e n e s 1 耵 c o l l s 电n l c t ( 载体构建) x y l o s e s u c r o s eg u s p ( g j d ( 木糖) ( g 1 ) ( 蔗糖) e x p 1 t o t a l n l 工b 吧fo fe x p l f r e q u e n c yo ( 转化率) a p o t a t o ( 马铃薯) p v i cx - y l a h 3 7 57 58 亿82 8 6 p v i cn i ： t i i 3 7 57 50 亿80 p v i cn i p t i i 5 0m g 13 01 2 83 6 k a n a m y c m b t o b a c c o ( 烟草) p v i cx y l a h1 0 5 p v i cx y l a h2 0 5 p v i cx y l a h1 0 10 p v i c 套堙t 1 05 p v i c 套印t 2 05 p 、t i cn p t 1 0l0 p v i cn p t 3 0 0m g l 3 0 k a n a m y c m c t o m a t o ( 番茄)，j h ， p v i cx y l a h 100 p v i cx y l a h 150 p cn p t 1 0 0 删 3 0 k a n a m y c m 1 15 列15 l 15 o 15 0 15 0 l5 4 尼2 l 2 0 1 11 3 ，4 0 6 7 l3 3 6 7 0 0 0 l8 2 5 o 9 1 7 5 1 1 2 与激素代谢相关的选择标记基因 与激素代谢相关的选择标记基因有i p t ( 异戊烯基转移酶) 、i a a h ( 吲哚一3 一乙酰胺 水解酶) 基因、玉米同源异性盒基因( k n l ) 、r o l 基因等等。 1 i p t 基因 i p t 基因从农杆菌的t d n a 中克隆而来，其编码异戊烯基转移酶基因，它能催化异戊 3 东北p 币范大学硕士学位论文 烯基焦磷酸和单磷酸腺苷的分解n 7 ，墙3 ，使得转化i p t 基因的细胞或组织在没有外缘激素的 培养基上分裂、再生和生根。i p t 参与植物吲哚乙酸( i n d o l ea c e t i ca c i d ，i a a ) 的合 成，i 从能促进植物的生长，因此，在没有添加工从的培养基中，转化的细胞可以正常生 长，能形成不定芽。而非转化的细胞，在不含有i a a 的培养基中，不能正常生长而死亡1 。 利用i p t 作为选择标记基因，其转化效率高于利用卡那霉素进行筛选n 引。目前，i p t 作为 选择标记基因，在水稻汹2 1 l ，西红柿乜刳，烟草_ 3 3 中已得到广泛的应用。 2 i a a h 基因 i a a h 基因( i n d o l e 一3 - a c e t a m id eh y d r o l y s e ，吲哚一3 一乙酰胺水解酶) 是另一种与激 素代谢相关的正选择标记基因，主要通过调节植物体内激素代谢，使转化的细胞与非转 化细胞分开，从而达到筛选出转化的细胞。利用农杆菌介导的烟草转化研究中，利用i a a t t 基因筛选转化苗，其转化效率比单用i p t 基因高，而且，两个基因混合连用，其转化效 率要比单用i p t 基因要高的多1 。 3 玉米同源异性盒基因( k n l ) 玉米同源异性盒基因k n l ( m a i z eh o m e o b o xg e n ek n o t t e d l ) 是与分生组织分化与增 值相关的一种基因。转化k n l 基因的植物细胞在没有外源激素的培养基上可以进行分化 和再生，因此可以筛选出转化细胞和非转化的细胞n 射。在研究转基因烟草中发现，在培 养基中没有外源激素时，转化k n l 的烟草叶片，可以直接长出愈伤并生出再生苗，其转 化效率是卡那霉素筛选转化效率的3 倍汹1 ，从而证明，k n l 基因是一种能提高转化效率的 正向选择标记基因。 4 r o l 基因 r o l 基因是发根农杆菌t i 质粒上的一段d n a 序列，包括r o l a 、r o l b 、r o l c 和r o l d 四个基因。r o l 基因能诱导植物细胞再生，并产生大量的毛状根，从而促进根的正常生 长发育，易于获得再生苗n 5 1 。利用农杆菌介导，使转化r o l 基因的植物细胞在m s 培养 基中，能正常再生出毛状根，而非转化的植物细胞不能再生根，从而筛选出转化与非转 化细胞。 用含有r o l 基因的根瘤农杆菌侵染烟草叶片，在烟草中表达夕j 葡萄糖酸苷酶，在 侵染1 2 天后，可以检测到表达的夕前萄糖酸苷酶，其获得了较高的转化效率啪1 。 h e b i n u m a 等利用r o i - m a t 型载体p n p l 7 0 2 ，其中包含有r o l 基因和3 5 s r 基因，侵染 烟草和金鱼草，获得了较高的转化效率嘲。 1 1 3 正筛选系统在植物转化中的应用前景 自2 0 世纪以来，转基因植物产业化进程不断加快，同时，其标记基因安全性受到 了极大了关注。利用传统的抗生素和除草剂标记基因，已获得了很多成果，但其对人和 环境存在潜在的危害性，已成为社会关注的焦点。转基因植物的安全性问题，是决定转 基因植物是否商业化的主要因素。因此，标记基因的发展成为基因工程的研究热点。目 前，己报道的正选择标记基因很多，其筛选原理和作用都不相同，因而，可以根据研究 4 东北9 币范大学硕士学位论文 目的的不同，选择合适的正筛选标记基因，才能获得较高的转化效率。 生物安全性标记基因主要在于，其对人和环境不会产生危害性，无毒副作用。而且， 所报道的正选择筛选系统，所获得的转化效率要高于利用抗生素和除草剂的转化效率。 目前，去除标记基因的研究虽然取得了一些成果，但其转化效率低，而且实验步骤繁琐， 应用受到了限制。因此，采用无争议的生物安全标记基因一正选择标记基因，可以排除 人们对转基因食品安全性的担心。随着植物基因组学和标记基因研究进展，植物转基因 技术必将不断的合理化和精确化，随之，转基因植物的安全性问题将得到解决，转基因 作物也会被人们所接受。 1 2人类酸性成纤维生长因子及其单链抗体 酸性成纤维细胞生长因子( a c i df i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，a f g f ) 是成纤维细胞 生长因子( f g f ) 家族成员之一。a f g f 具有广泛的生物学作用，a f g f 对来源于中胚层和神 经外胚层的各类细胞，有广泛促分裂作用的微量活性物质，是一种广泛的细胞生长因子。 据报道，a f g f 具有多种生物学活性，具体表现为：( 1 ) 促进细胞分裂和分化的作用汹3 。 ( 2 ) 促进血管形成，直接参与新生血管的的形成。( 3 ) 对神经生长具有促进作用。( 4 ) 促进细胞扩散，可能参与肿瘤的侵袭与转移。据报道，研究脊髓损伤后a f g f 的表达情 况时，当机体受到损伤时，机体产生大量的a f g f ，表明a f g f 在机体自我修复和再生过 程中起到自我保护机制啪1 。 a f g f 单链抗体一s c f v 在临床上已经得到了广泛的应用。研究表明，在体外，a f g f 可 以刺激肿瘤细胞增殖，可通过a f g f 的单链抗体来抑制a f g f 与其受体结合，从而抑制肿 瘤细胞的增值1 。 1 3 植物生物反应器 随着植物基因工程技术的广泛发展，以植物作为生物反应器进行产业化生产，如生 产抗体，疫苗等是生命科学在将来研究最热门的领域b 。植物生物反应器是指利用植物 作为工厂大规模生产各种有价值的生物制品口别。因此，转基因植物又被称为分子农场姐引。 利用植物生产有重要药用价值和商业价值的蛋白已得到广泛应用，因为这是一种安 全而且廉价的表达重组药用蛋白的生产系统。分子农场具有潜在无限量提供重组蛋白， 作为诊断和治疗工具在医学和生物科学领域应用。同时，转基因植物还可以在某一特定 器官高量表达重组蛋白，并长期储存在植物体内。从1 9 8 6 到1 9 9 0 年，人们成功在植物 体内成功表达人生长激素融合蛋白m 1 、人血清蛋白口鲫后，为转基因植物作为生物反应器 生产药用蛋白开辟了道路。目前，人们利用植物生产更安全、廉价的人血清蛋白、激素、 干扰素等重要的药用蛋白( 表2 ) 阻劓。 东北师范大学硕士学位论文 表2 转基因植物表达药用蛋白 t a b l e2 s e l e c t e dp h a r m a c e u t i c a lp r o t e i n se x p r e s s e di n t r a n s g e n i cp l a n t s 1 3 1 植物生物反应器的优越性 近年来，以分子生物学的理论为基础，转基因植物技术迅猛发展，尤以植物作为“化 学工厂一，其在医药和农业上具有不可比拟的优点。 ( 1 ) 成本低廉，容易推广 利用植物生物系统可大规模生产细菌，病毒等的外源蛋白。在田间大量种植植物， 6 东北师范大学硕士学位论文 其生产成本低，操作简单使其优于利用微生物或动物生产外源蛋白 。植物可以大规模 收获，其药用蛋白储存在植物的茎，叶片，根，种子甚至整株植物中，在运输方面方便， 有些植物可以直接食用，避免了药用蛋白在加工过程中的损失。 ( 2 ) 稳定、大量地生产重组蛋白 由于植物可以在田间大规模耕种，植物可以进行光合作用，不需要大量的人工和物 质材料投入。利用植物稳定表达系统，获得转基因植株后，可以在田间大规模生产重组 蛋白。 ( 3 ) 合成外源蛋白相对比较安全 细菌作为生物反应器时，不能对真核生物的蛋白进行有效的翻译后加工，而且其本 身可能是人类病原物。动物细胞作为生物反应器时，在操作过程中会受到感染，从而 给人类健康造成危害啪1 。 ( 4 ) 产物便于贮存 转基因产物可贮藏在种子，子叶，果实，块茎中，其便于贮存运输，其那些能直接 食用的植物疫苗，不需要特定的贮藏条件，而且可以在植物体内表达多种基因 4 0 o ( 5 ) 表达的蛋白加工相对保守 利用植物表达的外源蛋白，其产物能进行正确的糖基化，磷酸化，酰胺化及翻译后 的加工，因此表达的外源蛋白具有与高等动物细胞一样的免疫原性和生物活性h 。 1 3 2 植物生物反应器两种表达系统 1 3 2 1 植物稳定转化系统 所谓稳定表达系统，就是利用遗传学手段，将编码的外源基因整合到植物基因组中。 通过遗传转化方法，使外源蛋白可以稳定的表达，并遗传给子代副。目前，常用植物转 化技术利用较多的是农区杆菌介导转化法。此方法应用广泛，其优点在于：( 1 ) 该系 统转化成功率高，效果好。( 2 ) t - d n a 区可以容纳相当大的d n a 插入片段，目前己把长 达5 0 k b 的异源d n a 序列通过t - d n a 区可以整合到植物细胞中。( 3 ) 整合到基因组中的 外源基因不仅可以在整个植物细胞中表达，可以根据需要，连入不同的特异表达的启动 子，可以在根，茎，叶中特异的表达。( 4 ) 此表达系统稳定性好，多数符合孟德尔遗 传规律，因此转基因植株能较好的为育种提供了较好的中间选育材料。 稳定转化表达的蛋白时间由植物本身的生长状态所决定，一般3 - 9 个月可以检测蛋 白表达的状况。虽然瞬时表达要比稳定转化表达蛋白时间短，但是从长远来看，要长期 在植物体内表达药用蛋白，稳定转化系统是较好的选择。高密度耕种转基因植物，可以 获得大量的药用蛋白。例如，种植转基因烟草，每公顷大约可以收获1 7 0 顿的生物量h 3 1 。 如果以这种水平收获转基因植物表达的蛋白，在一公顷烟草，就可以收获5 0 k g 或者 1 0 0 k g 的i g a 蛋白h 钔。由此可见，利用稳定转化生产药用蛋白的产量是很可观的。 1 3 2 2 植物瞬时表达系统 瞬时表达系统是利用植物病毒为表达载体，将带有目的基因的病毒表达载体感染植 大。在我国栽培黄瓜面积居世界蔬菜栽培面积第四位。长久以来，国内外专家利用传统 育种手段培养了大量的优良品种，但是还不能突破优良性状在较大范围物种间传递的限 制。随着生物技术的发展，黄瓜在遗传转化方面取得了显著成果，一定程度上打破了生 物间的生殖隔离，使植物育种更有目的性和针对性。由于黄瓜具有可以生食的特点，利 用黄瓜作为生物反应器，生产工程疫苗，具有较大的应用价值。 影响黄瓜转化效率的因素很多，包括外植体与苗龄，预培养时间，侵染菌液的浓 度，选择培养时，培养基中激素的配比，培养过程中光照等等，这些因素会对黄瓜转化 造成影响瞄。外源激素对黄瓜不定芽的诱导和生长起着重要的作用。由于黄瓜的基因型 不同，因此，对激素的组合及浓度要求也不相同。张承妹等认为，在培养基中加入适量 的g a 3 有利于芽的分化嘟1 。在组织培养过程中，外植体的类型不同，对芽的再生有很大 的影响。目前，已利用子叶、真叶、下胚轴、花药等作为外植体，进行植物组织培养。 z i vm 和g a d a s ig 等，认为利用子叶作为外植体，其产生不定芽的效率较高1 。董灵迪 用子叶和真叶做比较，在相同的培养基中培养两种外植体，发现，真叶产生不定芽的再 生率可达蛰j 6 4 。 8 东北师范大学硕士学位论文 现在应用于植物转化的方法主要有农杆菌法，基因枪法，显微注射法，花粉管通道 法等等。在黄瓜遗传转化过程中，主要应用农杆菌转化法。其中利用根癌农杆菌介导的 黄瓜转化最为广泛m 3 。c h e e 晦朝利用子叶为外植体，将g u s 基因导入黄瓜，获得了卡那霉素 抗性植株。l e e 呻3 等以黄瓜作为生物反应器，将木薯的超氧化物岐化酶基因( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ，s o d ) 转入黄瓜，获得的s o d 活性比未转化黄瓜高3 倍。白吉刚嫡l 删将生长激素 受体一生长素结合蛋白( a u x i n b i n d i n gp r o t e i n1 ，a b p i ) 基因转入黄瓜，获得的转基因 黄瓜对生长素的敏感性增强，提高了单性结实率。金红嘲3 将抗除草剂基因b a r 转入黄瓜 外植体中，经过分化，生根等过程获得转基因黄瓜。 虽然黄瓜遗传转化研究进展很快，但是转化过程中还存在一些问题。( 1 ) 转化率 较低，由于黄瓜品种的不同，获得的转化效率也不同。( 2 ) 蛋白表达量低，以黄瓜作 为植物生物反应器，其表达的外源蛋白量低，有待解决。( 3 ) 黄瓜组织培养技术还不 完善，尚需进一步研究。本研究基于以上问题，对黄瓜遗传转化体系进行了优化，选用 无害的筛选系统，以黄瓜作为生物反应器，利用其表达s c f v 基因。由于黄瓜可以生食， 因此可以利用此特点，通过生食黄瓜就可以达到治疗的效果。 9 东北师范大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 植物材料 由波兰农科院z h i m i ny i n 惠赠，波兰种，拉丁名为c u e u m i ss a t i v u sl ，雌雄同 株，自交系。 2 1 2 质粒和菌种 质粒p c a m b i a 3 3 0 1 由本实验室保存。 质粒p m 3 9 0 一s c f v 由本实验保存。 大肠杆菌( b s c h e r i c h i ac o l i ) 菌种d h 5q ，根瘤农杆菌( a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ) 菌种l b a 4 4 0 4 空菌和l b a 4 4 0 4 ( 含p c a m b i a 3 3 0 1 ) 为本实验室保存菌种及 质粒。 2 1 3 实验所用的p c r 引物 用p r i m e r5 o g l 物设计软件设计x y j a 引物和s e f v 弓l 物，划线部分是引物的酶切位点， 序列后的括号内都已注明。引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下： x y j as e n s e ：5 一鱼鱼! a t g c a a g c c t a t t t t g a c c 一3 ( b a l i ) x y l aa n t i s e n s e ：5 一鱼鱼! 盟t t a t t t g t c g 从c a g a t a a t g g 一3 ( k p ni ) s c f vs e n s e ：5 t c c c c c c g g g a c c a t g g g c a g c a g c c a t 3 ( x m ai ) s c f va n tis e n s e ：5 鱼鱼! 鱼! c t a t g a g g a g a c g g t g a c 一3 ( $ pi ) 2 1 4 化学试剂和酶 p c r 产物回收及d n ag e le x t r a c t i o nk i t 凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程公 司。 t 。d n a 连接酶，核酸限制性内切酶k p n i , b a r n x m a ，购自n e b 公司，预混t a q 酶， d n a 分子量m a r k e rd l 2 0 0 0 ，m a r k e ri v 购自于大连宝生物公司。 各种抗生素，激素，琼脂粉等购自于北京鼎国生物技术发展中心。 2 1 5 培养基 ( 一) 组织培养培养基 1 0 东北师范大学硕士学位论文 培养基 成分o l )p h 发芽培养基 1 2m ss a l t s ，b 5v i t a m i n s ，1 0g 1s u c r o s e ，7 5g 1p h y t a g e l 侵染培养基 m ss a l t s ，b 5v i t a m i n s ，3 0g 1s u c r o s e ，2 0 0uma c e t o s y r i n g o n e 预培养及 m ss a l t s ，b 5v i t a m i n s ，3 0g 1s u c r o s e ，2 0 0uma c e t o s y r i n g o n e ， 共培养培养基 7 5g 1p h y t a g e l 5 8 5 6 5 8 选择再生培养基 m ss a l t s ，b 5v i t a m i n s ，1 5g 1 s u c r o s e ，1 5g 1x y l o s e ， 1m g 12 i p ，0 1m g 12 ，4 - d ( 愈伤生成后只加0 3m g 12 i p ) ，5 8 5 0 0m g lc a r b e n i c i l l i n ，7 5g 1p h y t a g e l 生根培养基1 2m ss a l t s ，b 5v i t a m i n s ，1 0g 1s u c r o s e ， 5 8 0 1m g 1 萘乙酸( n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d ，n a a ) ( 二) l b 培养基 l b 液体培养基( 1 l ) ： l o g 胰蛋白胨，5 9 酵母提取物，l og n a c l ，p h 值为7 o 。 l b 固体培养基： l b 液体培养基中加入1 5 9 l 琼脂粉。 2 2 实验方法 2 2 1 木糖作为选择剂的最佳浓度 由于不同类型的植物细胞对木糖的耐受能力不同，根据本实验室王洪伟的工作经 验，本研究首先设计了预实验，以确定最佳的筛选浓度。因此，本实验一共设计了7 组 对照实验，在保证总碳源不变的情况下，将未侵染的黄瓜外植体放入不同木糖浓度的m s 培养基中，通过观察外植体生长的情况，来确定木糖在培养基中的最佳浓度。由于黄瓜 品种不同，培养基中所需要的木糖与蔗糖的比也不同。根据外植体再生的情况，本实验 最终以波兰品种( c u c u m i ss a t i v u sl ) 作为实验材料。 t a q 酶 d d h 。0 总体积 1 2 5p 1 1 0 0p 1 2 5 0p 1 p c r 反应条件： 9 5 ，5m i n 9 4 ，3 0s 、 5 2 ，6 0s 3 0 个循环 7 2 ，6 0sl 7 2 ，1 0m i n 1 2 霉 行 沉 使 通过双酶切质粒p x i ：g u s 与p m 3 9 0 一s c f v 得到基因片段和植物表达载体大片段，均 用1 0 琼酯糖凝胶电泳，将片段与载体大片段用d n ag e le x t r a c t i o nk i t 纯化回收 后，然后用t 4 d n a 连接酶进行连接反应。1 6 c 过夜反应后，将连接体系加到大肠杆菌 d h 5q 感受态细胞中，进行转化，然后将转化茵液涂于含5 0i lg m l 卡那霉素固体l b 平板上，3 7 过夜培养。 制备基因片段酶切反应体系： 质粒( p x i ：g u s ) 1 5 0m 1 0 b u f f e r ( 4 ) 5 0g l x h oi 1 o “l h i n d 力71 0p l b s a0 5p 1 d d h 2 0 2 7 5 肛l 总体积 5 0p 1 3 7 温浴3 - 4h ，1 0 琼酯糖凝胶电泳分析，在紫外光下用手术刀片切下约为2 3 0 0 b p 的亮带，用d n a 凝胶回收试剂盒回收基因片段，并将其溶于2 0 肛1d d h 。0 中。 制备p m 3 9 0 - s c f v 载体大片段反应体系： 质粒( p m 3 9 0 - s c f v ) 1 5 0p l 1 0 b u f f e r ( 4 ) 5 0p 1 x h o 1 10 肛1 h i n d 肌1 0 “l b s a0 5 “1 d d h ：0 2 7 5g l 总体积 5 0 “l 3 7 温浴4h ，1 o 琼酯糖凝胶电泳，在长波紫外光下用手术刀片切下约9 0 0 0b p 的大片段，以d n a 凝胶回收试剂盒回收载体片段，将其溶于2 0 斗1d d h ：0 中。 东北师范大学硕士学位论文 基因片段与p m 3 9 0 - s c f v 载体骨架连接，连接反应体系： t 。d n a 连接酶 1 0 肛l t 4 d n a 连接酶b u f f e r 2 5g l 载体片段 4 5 肛l 基因片段1 2 5 肛1 d d h 2 0 4 5p l 总体积 2 5 斗1 1 6 过夜反应，将连接反应产物转化到大肠杆菌感受态细胞d h 5q 中，然后将转 化产物涂于含5 0 “g m l 卡那霉素l b 平板上，3 7 过夜培养。 2 2 4 植物表达载体p x 3 9 0 一s c f v 的鉴定 将重组质粒进行p c r 和x h oi 、h i n di i i 双酶切鉴定。 ( 一) p c r 反应体系1 ： 引物s c f v - s e n s e 1 0 “l 引物s c f v - a n t i s e n s e1 0 肛l 模板 0 5 肛l 预混t a q 酶 1 2 5p 1 d d h ：0 1 0 0g l 总体积 2 5 肛l p c r 反应条件： 9 8 ，5m i n 9 4 ，3 0s1 5 2 ，4 0s - 3 0 个循环 7 2 ，6 0sj 7 2 ，1 0m i n ( 二) p c r 反应体系2 ： 引物x y l as e n s e 引物x y l aa n t i s e n s e 模板 预混t a q 酶 d d h ：0 总体积 1 0 肛l 1 o 肛l 0 5 “l 1 2 5 “l 1 0 0p l 2 5 肛l 1 4 东北师范大学硕士学位论文 p c r 反应条件： 9 5 ，5m i n 9 4 ，3 0s 、 l 5 2 ，6 0s 3 0 个循环 7 2 ，6 0sl 7 2 ，1 0m i n 1 o 琼酯糖凝胶电泳分析结果 ( 三) 酶切鉴定反应体系： 重组质粒 6 o “l 1 0 x b u f f e r ( 4 ) 2 5 肛1 彪强， 1 0p 1 s p ei 1 0g l b s a 0 5p 1 d d h 。0 1 4 肛1 总体积 2 5 肛1 1 o 琼酯糖凝胶电泳分析结果 ( 四) 农杆菌感受态的制备 ( 1 ) 在冰上融化冻存的d h 5q 菌种，用接菌环挑取少量单菌落，置于无抗生素的l b 固 体培养基上划线，3 7 培养过夜。 ( 2 ) 挑取单菌落于lm 1 无抗生素抗性的l b 液体培养基中，3 7 振荡培养过夜。 ( 3 ) 培养至对数生长期时，将培养物倒入5 0m 1l b 液体培养基，3 7 振荡培养，用 紫外分光光度计测定o d 值，每隔半个小时测一次，至o d 鲫= o 3 ( 约3 4 小时) 。 ( 4 ) 冰浴培养基及枪头，3 0 分钟。 ( 5 ) 5 0 0 0r p m ，4 。c ，1 0 分钟，离心去掉液体培养基。 ( 6 ) 去上清，每管加入等体积冰冷的0 0 2m o l lc a c l ：( 含1 5 甘油) ，冰浴3 0 分钟。 ( 7 ) 重复一次，去上清，每管加入等体积冰冷的o 1m o l lc a c l ：，冰浴3 0 分钟。 ( 8 ) 3 5 0 0r p m ，4 ，1 0 分钟离心( 去掉c a c l ：溶液) ( 9 ) 短期贮存：加2m 1 冰冷的o 0 2m o l lc a c l 2 ( 含1 5 甘油) ，分装于e p p e n d o r f 管( 每管1 0 0u1 ) 中，4 保存，一周内使用。长期贮存：加2m 1 冰冷的o 1m o l l c a c l ：， 2m l 无菌甘油( 1 ：1 ) ，分装于e p p e n d o r f 管( 每管1 0 0u1 ) 中，- 7 0 c 保 存。 1 5 东北师范大学硕士学位论文 ( 五) l b a 4 4 0 4 农杆菌转化 ( 1 ) 向感受态细胞中加入2ul 质粒( 约1ug ) 将e p p e n d o r f 管放入液氮中冷冻5 m i n ，取出后3 7 热激5 m i n 。 ( 2 ) 向e p p e n d o r f 管中加入1m l 液体l b 培养基，并将离心管放入2 8 c 的摇床中，振荡 培养2 - 4 小时。 ( 3 ) 5 0 0 0r p m ，5m i n 离心，去除上清溶液，重悬剩余部分涂于含有质粒相应抗性的l b 固 体培养基中，2 8 过夜培养1 - 2 天，对转出的单菌落进行鉴定。 2 2 5 农杆菌介导的黄瓜转化 ( 1 ) 无菌苗种植 将黄瓜的种子用7 0 的乙醇浸泡1 分钟，用清水冲洗3 - 4 次，然后用1 0 n a c i o 溶液中灭菌5 8 分钟，再用无菌水冲洗5 - 6 次，将种子置于无菌干燥的滤纸上将水吸干。 然后把种子横放在发芽培养基上，2 5 ，1 6h 光照、1 6 ，8h 黑暗培养，1 0 天左右 种子萌发，待第一片真叶长到2 - 3 c m 左右的时候是用于组织培养的最佳时期。 ( 2 ) 预培养 用剪刀取黄瓜真叶，将真叶切成直径5 7m m 左右的小块，放入含有lm g l 的2 i p ( 2 一异戊烯基腺嘌呤) 和1m g l 的2 ，4 - d 的m s 培养基表面( 表面上铺一层无菌的滤 纸) ，2 3 黑暗培养，4 8 小时。 ( 3 ) 农杆菌培养 在含相应抗生素的l b 平板上划线培养含有质粒p x i ：6 u s 的农杆菌，2 8 培养2 - 3 天，选择单克隆菌落接种于含有相应抗生素的5m l 液体l b 培养基中，2 8 振荡过夜 培养。生长到o d 值达到0 6 以上。然后，取5 0 - 1 0 0ul 菌液接种于1 0 0m l 含相应抗 生素的新鲜l b 培养液中，振荡培养6 - 8 小时。每个小时测一次o d 值，直到o d 值达到 1 o 。将菌液倒入大离心管，5 0 0 0r p m 离心1 0 分钟，去上清。用m s 液体( p h = 5 6 ) 重 悬至0 d 值到达0 6 ，即可以用于侵染。用侵染培养基重悬，使最终菌液浓度为 o d = o 4 - 0 6 ，室温放置3 小时。 ( 4 ) 农杆菌侵染及共培养 将黄瓜外植体置于侵染液中( 无菌操作) ，1 5 分钟，然后将外植体取出，置于无菌 滤纸上，吸干菌液。最后将外植体移入共培养培养基中，2 3 黑暗培养2 - 3 天。 ( 5 ) 选择培养到愈伤生成 将外植体从共培养培养基中移入选择培养