（无机化学专业论文）蛋白质、酶影响难溶钙盐结晶的协同作用研究.pdf

摘要 以蛋白质、酶为基质模拟研究生物矿化的机理不仅对认识生命现象、理解生命过程具 有重要的理论意义，而且对仿生合成出具有优异性能的特殊纳米材料以及防治由异常矿化 产生的疾病具有广泛的应用前景。羟基磷灰石( h a p ) 、碳酸钙( c a c 0 3 ) 是生物矿化产物 中的重要矿物质，具有很好的骨修复和再矿化性能。设计不同的结晶过程，采用圆二色光 谱( c d ) 、傅里叶变换红外吸收光谱( f r - i r ) 等手段对结晶前后的蛋白质和酶溶液进行测定； 用x 射线粉末衍射( m ) 分析、扫描电子显微镜( s e m ) 、透射显微镜( t e m ) 等手段对所 得的复合无机盐进行了形貌与结构的表征。进而探讨了结晶过程中基质与无机盐结晶之间 的相互影响，即协同作用的讨论，并对生物矿化机理进行了推测。 主要研究内容包括： 1 概述了生物矿化的研究意义、分类、主要特征和机理；介绍了生物矿化发展的历 程和目前存在的问题，提出了本论文的研究重点。 2 采用气一液扩散法，利用牛血清白蛋白、溶菌酶为基质，分别仿生合成了通常不稳 定的球霰石和文石碳酸钙，重点研究了它们之间的协同作用。结果表明：基质对球霰石和 文石结晶有指导作用，同时碳酸钙结晶对基质高级结构也产生了影响。 3 采用液一液扩散法，利用牛血清白蛋白、牛血红蛋白、溶菌酶和胃蛋白酶为基质， 仿生合成了不同形貌的羟基磷灰石，重点研究了蛋白质和羟基磷灰石结晶的协同作用。结 果表明：基质对羟基磷灰石结晶有诱导作用，羟基磷灰石结晶对基质高级结构产生影响。 4 巧妙设计胶原自组装实验，重点研究了胶原自组装和碳酸钙结晶同时发生的过程。 纯胶原纤维为基质碳酸钙结晶出现团聚现象，而组装过程中则生成了球霰石纳米粒子并形 成网络结构。结果表明：组装对碳酸钙结晶的取向有调控作用，碳酸钙结晶对组装有影响 作用。 由本实验推测生命体内基质组装和无机矿物结晶同时进行的过程，对认识生命体内生 物矿化机理有指导作用。 关键词：蛋白质酶碳酸钙羟基磷灰石 自组装协同作用 a b s t r a c t hw a sv c r ys i 班丘c a n tf o ru n d e r s t a i l d i n gl i f cp h e n 咖e n aa n dl i f e p r o c e s st or e s e a r c ht h e m e c h a n i s mo fb i o m i n e m l i z a t i o nu s i n g p m t e i i l so re n z y m e sa so r g a n i cm a t r i x f u r t h e 珊o r e ，t h i s r e s e a r c h 、“na l s oh a v ee x t e n s i v ep m s p e c to fa p p l i c a t i o f o rt h eb i o m i m c t i c s y n t h e s i so fs p e c i a l n a n o - m a t e r i a l sw i t he x c e n e n tp r o p c n i e sa i l df o rt h ep r e v e m i o no fd i s e a s e sc a u s e db y 曲n o r m a l m i n e r a l j z a t i o n h r y d r o x y a p a t i t e a l l dc a l c i u mc a r b o n a t ea r et h em o s ti m p o n a n tm i n e r a l si n b i o m i n e r a l i z a t i o np r o d u c t s 如dh a v eg o o dp r o p c n j c sj nb o n e p r o s t h e s e sa n df e m 抽e r a l i z a t j o n s o ， d i 如r e n ts i m u l a t i o np m c e s s e sa r ed e s i g n e da i l dc i r c u l a rd i c l l r o i s ma n df o u r i c rt r a n s f o 珊a t i o n i n f r a r e ds p e c 仃o s c o p ya r eu s e dt oc h a r a c t e r i z et h ep m t e i n sa i l de n z y m e ss o l u t i o n sb e f o r ea n d a f t e rc r y s t a l l i z a t i o n t h e0 b t a i n e dc o m p o s i t ei 1 1 0 唱a n i cs a l t s 盯ec h 啪c t e r i z e d b yx r a yp o w d e r d i m a c t i o n ( x r d ) a i l a l y s i s ，s c a i l n i n ge l e c t m nm i c r o s c o p y ( s e m ) a n dt r 趾s m i s s i o ne l e c t m n m i c r o s c o p y ( t e m ) f h n h e r ，e f 绝c to ft 王l em a t r i xo nt h ec r y s t a l i i z a t i o no ft h ej n o r g a n i cs a i t sa n d e f f e c to ft h ci n o r g a n i cs a n so nt l l em a t r i xw c r ee x a m i n e d ，r c s p 枷v e l y n a ti st o s a y t h e r e s e a r c ho fc o o p e r a t i v i t yi sp m v i d c d t h ep o s s i b l ei m e r a c t i o nm e c h a n i s mb e t w r e e nc r y s t a l sa n d t h ep r o t e i ni sa l s od i s c 札s s e d m a i np o i m sa r e 舔f o l l o w s ： 1 n er e s e a r c h s i 盟i f i i c a l i c e 、 c a t e g o r i e s 、 c h i e fc h a r a c t e r i s t i ca i l dm e c h a l l i s mo f b i o m i n e r a l i z a t i o na r ei n t f o d u c e d t h eh i s t o r yo fi t sd e v e l o p m e n ta n dc u n n tr e s e a r c hd i f f i c u n i e s a r es u m 珂盯i z e d t h e nr e s e a 础f o c l l s e so f 也i st h e s j sa r ep u tf o r 盯d 2 w er e p o n e dab i o m i m e t i cm e t h o dt os y n t h e s i z eu n s t c a d yv a t e r i t ea i l da r a g o n 主t ec a l d u m c a r b o n a t ep a n i c l e su s 抽gp m t e i na st e m p l a t eb ym e a l l s0 fg 踮l i q u i dd i f m s i n gm e t h o d a n d c o o p e r a t i v i t yb e 俯e c np r o t e i na i l dc r y s t a l l i z a t i o no fc a l c i u mc a r b o i l a t ei s l p h a s i z e di nt h es t ud y _ t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp r o t e i nc o u l dd i r e dc a l c i u mc a n 0 n a t ec r y s t a l l i z a t i o na l l dc a l d u m c a r b o n a t eh a ds i g n i f i c a n te 丘 e c to n 恤es e c o n ds t n l c t u r e0 fp r o t e i n 3 w ec h o s ef o l l r n d so fp f o t e i n s 竭o r g 姐i cm 删xt os y l l t h c s i z el l r y d r o x y 印a t i t eb ym e a i l s 0 f l i q u i d - l i q u i dd i 铂s i i l gm e t l i o d c o 叩e r a t i v i t yb e 咐e e np m t e i n 蛆dc r y s t a l l i z a t i o n o f h r y d r o x y a p a t i t ei sp a i da t t e m i o n t h er e s u l t si i l d i c a t c dt h a tp r o t e i n sc o m r o l l e dt h ec r y s t a l l i z a t i o n o f h y d r 印a t i t ea i i dc r y s t a u j z a t i o no f h y d r y 印a t i t ea f f c c tt h ea d v a n c c ds t r u c t u r eo fp r o t e i n 4 t h ee x p e r i m e n to fs e l f - a s s e m b l yo fc o l l a 謦mi ss h l l f u l l yd e s i g n e d i ti se m p h a s i z e dt h a t t h ef o 加a t i o n0 ft h ec r y s t a l so fc a l c i u mc a t b o n a t et a k e sp l a c es i m u l t a n e o u s l yw i t ht h e s e l f a s s e m b l yo fc o l l a g c n a s s e m b l y o f p u r ec o l l a g e n c 咖e si i i t o b e i n gw i md i s o r d e r a g 酎e g a t i n g b 1 叽d u r i n gt h e 镐s 锄b l yv a t e r i t ec a l d u mc a r b o n a t en a n o p a r t i d e sf o r i nn e 呐o r k f m m e m e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a t s e l f - a s s e m b l y i n d u c e dv a t e r i t e c r y s t a l l i z a t i o n a d c r y s t a l l i z a t i o no fv a t e r i t eb e n e f i t e da s s e m b l yo fm a t r i x i nc o n d u s i o n ，b yt h ee x p e r i m e n tw es p e c u l a t et h a tt l l ef 0 咖a t i o no ft h ec r y s t a l so fi n o 卿i c m i n e r a lt a k e sp l a c es i m u l t 柚e o l l s l yw i t ht h es e l f - a s s e m b l yo fm a t r i xi nt l l e1 i f e ni sv e r y i m p o n a n ti n s t m c t i o n a ls i 印i f i c a n c et 0k n o wa b o u t 恤em c c _ h a n i s mo fb i o r n i n e r a l i z a t i o n k e y w o r d s ：p r o t e i n ，e n z y m e ，h r y d r o x y a p a t i t e ，c a l c i u mc a r b o a t e ，s e l f - 觞s e n l b l y ，c 0 0 p e r a t i v i t y n l 一苎二兰丝笙 第一章绪论 生物矿化的研究是化学、医学、生物和材料等多学科相互渗透和相互交叉的前沿领域 u 叫，研究生物矿化不仅对认识生命现象有重要的理论意义，而且可以为人工合成具有特殊 功能材料和生物智能材料提供了一种新的方法，因此生物矿化研究已成为材料科学、生命 科学、医学和生物无机化学等领域的热点。目前，对生物矿化的模拟研究主要集中在三个 方面：基质的种类、组成对无机物结晶的影响，如研究泡囊、表面活性剂、l b 膜等有 机组合体对无机物结晶的影响；基质的物理化学性质对无机物结晶的影响，这方面的研 究主要集中在有机基质的表面自由能、过饱和度、酸碱度、粘度等对无机物结晶的影响； 对生物矿化过程形成的无机物的研究，这包括晶体的组成、形貌与它们的功能之间关系 的研究。 蛋白质是生物体的重要组成部分，一些蛋白质在生物矿化中发挥着重要作用。近3 0 年来，蛋白质的生物功能引起人们的普遍关注，特别是随着生物高分子研究新技术、新方 法在该领域研究上的应用，使国内外对蛋白质及其复合物的研究迅速发展。目前蛋白质化 学已成为分子生物学、医学、食品科学等领域的研究热点之一。我们的实验体系采用蛋白 质作为有机基质，这使得我们的研究体系更加接近生命体系，并且有可能得到有机无机复 合材料。 生物矿化机理的研究属于微观体系的研究，利用现代光谱学技术，可以使我们的视野 扩展到微观领域，从而对生物矿化过程中有机基质和无机盐之间的相互作用进行深入的研 究，期望在分子和超分子水平上认识生物矿化机理。 1 1 生物矿化概述 生物矿化是指在生物体内生成矿物质的过程，即在生物体的特定部位，在一定的物理 化学条件下和有机基质的指导下，生物体将无机物与生物有机基质通过自组装形成具有生 物功能的特殊材料的过程，是一个高度受控的生命过程。生物矿物质与地质上的矿化作用 产物明显不同的是无机相的结晶严格受控于天然生物大分子，在常温常压下，利用环境中 极其简单常见的组分通过一系列节能、无污染的处理，并通过生物分子的超分子预组装， 在隔室中进行晶体的成核、生长和精确的加工修饰【5 】，形成天然有机无机复合材料：其外 形优美、排列有序、结构合理、性能优越，是传统的材料科学工程所不能及的。许多生物 体依靠矿化的硬组织来支持、保护、营养和防御，并显示出生物陶瓷结构的多样性、完美 1 一一 釜二童笪望 的微结构和物理性能f 6 州】。图1 1 一图1 3 是存在于生物界的各类生物矿物的显微结构示意 图，具有非常优异的性能。 图1 1o w e n d t i i 背部骨骼微结构和矿化后骨架组织光受体系统显微结构示意图 胃毡u 1 - ls e mo f t h ep e d p h e r a l l a y o f a d a po f o w e n d t j j 柚da p p 曲瑚m c e 肋ds k e j e f a j s m l c i u r ew i t hf o r i n j n gm i n e r a lo fo p h i o c o m i db r i t n e s t m 图1 2 仿生合成的高抗磨性涡旋状结构氯铜矿c c “2 ( o 田3 a 】显微结构示意图 f 咖一l - 2 ( r a p h i cm o d e lo f h i g ha b m s i o nr e s i s t a n c ec o p p e rb i o r n j r a li nw o mj a w s 图l - 3 仿生合成的s i 0 2 的s e m 图和石球藻中形成的球石的s e m f i g u r el - 3s e mo fs i 0 2b yb i 0 l i i n e t i cs y n 也e s i s 蛆ds e m o fs p h e r el a p i sf o 肌e di na l g a 生物矿物的分布相当广泛，从细菌、微生物的细胞壁，植物的叶子、针刺，昆虫的甲 壳、螯刺，节肢动物的外壳，软体动物的骨针、禽蛋的外壳直至动物的骨骼和牙齿。它们 的功能十分齐全，除了广泛用作细胞的离子库以及结构、支撑和保护的材料之外，往往还 具有某种特殊的功能。例如，趋磁细菌中有序排列着的数颗单磁畴大小的f e 3 0 。被用于游 2 篁二兰堕鲨 动时识别方向，同样，金枪鱼、鲑鱼的头部也以f e 3 0 4 作为导航的生物磁罗盘，三叶虫以 c a c 0 3 作为眼棱镜，而头足纲动物如乌贼则以c a c 0 3 作为它的浮力装置，鱼类的头部以及 哺乳动物的内耳都是以c a c 0 3 作为重力接受器的，不过前者是文石结构而后者则是方解石 结构，如此等等，不而足。这些生物矿物还具有特定的显微结构。如软体动物的贝壳珍 珠层，它是由定向排列的文石小板片及少量有机质( 含量5 左右) 形成层状结构 1 2 ，1 3 1 ， 具有硬度大及韧性高的特点，破裂韧度比相应的无机成因文石大2 3 个数量级【1 4 】：海胆骨 针由方解石单晶组成，但又不像无机成因方解石单晶那样极易沿解理面裂开，其力学性能 独特f 1 5 l 。生物矿化的原理为制造高级复合材料提供了新的思路和途径 1 6 删。 1 1 1 研究生物矿化的意义 近年来，有关生物矿化的研究十分引入注目。其主要原因是生物矿化的研究已成为化 学、医学、生物和材料等多学科相互渗透和相互交叉的前沿课题【】，更为重要的是它为人 工合成具有特殊功能晶体材料和生物智能材料提供了一种新的思路和方法。 1 1 1 1 在材料科学领域的意义 最近二十余年的研究表明，基于生物矿化的原理合成无机材料，即仿生材料工程，是 一种全新的材料设计和制造策略，它将会给材料科学带来一场革命【1 9 ，2 1 ，2 2 1 。随着仿生合成 化学这一新兴领域的出现，材料科学家越来越意识到无机材料合成中传统的高温高压合成 方法已经不能适应未来对先进材料的要求。而与普通天然及合成材料相比，生物矿化材料 具有特殊的高级结构和组装方式，有很多独特的近乎完美的性质，如非常好的断裂韧性、 减震性能、表面光洁度以及光、电、磁、热、声等特殊功能【矧。正是这些独特的性质，引 起了科学家的兴趣，通过各种手段，揭示生物矿化材料形成的奥秘，研究生物矿化材料的 形成过程，为人工合成材料提供新的理论指导与设计依据【矧。研究生物矿化机理及仿生矿 化材料，是基础理论的需要，也是具有巨大潜力的应用项目。生物矿化中的自组装、动力 学、反馈和再模拟将为合成生物活性陶瓷、功能生物材料、非传统资源利用提供新的理论， 也将为这些领域的发展开辟新的研究天地。目前已经成功地仿生合成了纳米材料、半导体 材料、陶瓷薄膜材料、金属和有机聚合物基体上的陶瓷薄膜涂层材料、人造骨材料及复杂 形貌的类生物矿物材料等等瞵】。 1 1 1 2 在医学领域的意义 结石病是世界性的常见病和多发病，结石的形成机理、诱导因素及抑制因素，形成机 理尚不十分清楚，一些结石中含有大量的无机物及少量有机基质，是生物体内异常矿化形 成的产物，大量的研究证实基质在结石的形成中起到了非常重要的作用。对生物矿化的研 第一章绪论 究有助于找出异位矿化、结石和矿物溶解( 龋齿、骨质疏松) 的病理原因，为治疗这类疾 病提供有用的信息，同时也为临床上用药提供参考，从而达到更有效地预防和治疗结石、 骨质疏松，具有重要的临床意义。 长期以来，大范围骨缺损的临床修复一直是困扰医学界的主要难题之一。天然骨组织 结构的复杂性以及材料加工方法的局限性使已临床应用的骨修复材料的化学组成、相组 成、微细结构、生理学功能及其对生理环境的响应特性很难达到与人体骨组织完全一致 ”，矧。羟基磷灰石( h a p ) 是人体骨组织的主要无机物成分，与骨矿物质相似，能够引导骨 骼生长，无毒性，并且与人体组织具有良好的相容性，可以作为骨替代物而进行骨缺陷修 复，或涂覆于接骨材料表面，使其植入体内后有更好的修复效果，与其它骨替代材料相比， 羟基磷灰石拥有不可比拟的优势，因而在新型骨替代材料领域占有极其重要的地位f 2 9 。2 】。 羟基磷灰石作为植入材料可引导新骨的生长，为新骨的形成提供生理支架。在齿科方面， 可用于生产人工齿根、骨水泥、牙膏。2 0 0 3 年崔福斋用胶原蛋白作基质制各了h a p 的复 合材料，实验结果表明，作为骨修复材料与本骨有十分相似的生物功能。h a 与医用高聚 物复合作为骨替换材料使得h a _ p 韧性增强，并充分发挥了m 址良好的生物相容性【3 3 列， 这是今后h a _ p 应用研究的主要方向。随着合成技术的进步，羟基磷灰石在生物组织工程、 硬组织整形和修复、医药等领域将发挥愈来愈重要的作用。 1 1 1 3 在生物无机化学领域的意义 生物矿化是生物无机化学研究中的一个重要领域，生物矿化的研究是化学与生物科学 融合而形成的前沿学科，是从分子水平认识生命过程的机理所必需的，也是把生命科学引 进实际领域的基础和桥梁。模拟生物矿化是控制材料合成的种很有前景的方法，尤其是 超分子排列，有可能是实现无机材料生物合成的新途径。今后应加强在细胞和基因水平的 研究工作，实现无机材料生物合成的新途径。此外，由于纳米科学和纳米药物的兴起，( 纳 米) 固体生物无机化学将是未来生物无机化学研究的一个崭新领域。 1 1 2 生物矿化的分类 从不同学科领域出发，生物矿化分类不同。医学把矿化分为正常矿化和异常矿化，化 学则从反应发生的机理上分为生物诱导矿化和生物控制矿化两大类【卅。 l 。1 2 。1 生物诱导矿化( i n d u db i o m i 叶m i i z a h 0 n ) 生物诱导矿化是指由生物的生理活动，如新陈代谢产物的析出，呼吸作用引起吸八0 2 和呼出c 0 2 ，沉淀位置如细胞擘的建立等，引起周围环境物理化学条件改变而发生的生物 矿化作用。在这种矿化过程中，矿化是有机体的生物活性和周围物理环境之间的相豆作用。 4 第一章绪论 这种矿化作用没有固定的局限空间，没有专门的细胞组织或生物大分子引导，只接受很少 的生物控制。细胞内和细胞外的矿物形成都没有有机物的糟心设计，也没有任何活性生物 化学媒介的参与。其形成的矿物晶体习性与无机化学沉淀矿物非常类似，晶体任意取向， 缺乏独特的形态等。这种矿化过程所形成的矿物的类型可以由环境条件决定，同样的生物 在不同环境下可以形成不同矿物。如硫酸盐还原细菌诱导沉淀的黄铁矿与无机成因的黄铁 矿显著不同。 1 1 2 2 生物控制矿化( c o n t m l i e db i o m i 耻r a l i z a t i o n ) 生物控制矿化是指由生物的生理活动引起，并在空间、构造和化学三方面受生物控制 的矿化作用。这种矿化作用发生在局域化的空间内，如脂质泡囊的微区远离矿化过程初始 阶段的细胞外，通过泡囊内离子浓度的生物控制、离子输运的选择性控制及泡囊膜内部的 化学信息反馈系统控制。在这种矿化过程中，生物矿物成核和生长通常受过饱和度和共沉 淀离子的浓度控制，生物能决定活性离子穿过生物膜的运动速度，因此决定矿化位置的离 子浓度。进一步的化学控制是矿物相与有机分子的相互作用，其中有机分子起加速和抑制 矿物生长的作用，从而控制所形成的矿物的形态、排列、取向和内部结构。生物控制矿化 作用形成的生物矿物结晶习性独特，大小均匀，形态一致，排列规则，甚至晶轴方向一致。 我们一般所谈的生物矿化作用通常是指生物控制矿化作用。 1 1 3 生物矿化的主要特征 一切生物矿化作用都是受控的、动态的过程，矿化过程中的每一步骤都发生在一定的 时间和精确的位置上。这是因为生物体内进行的矿化作用不同于实验室里的结晶形成，而 是在细胞基质的参与下，受到代谢调控，在特殊的反应介质中进行的，故整个过程具有以 下三个明显的特征： 1 1 3 1 生物矿化发生在特殊的隔室中 细胞在生物矿化中的重要作用从根本上来说是隔室化，它可使反应物富集、定位并催 化反应的发生。隔室的空间是由细胞所分泌的生物大分子经过自组装而形成的，它可以是 纤维状、片状的基质，也可以是先在细胞膜上形成，然后从膜上分离出来的基质泡。晶体 成核和生长过程被隔室在时间上加以分开而调节，基质作为模板，可以诱导生物矿物的结 晶方式与大小，提供矿物形成的生长点，使其具有有序结构并将矿物与软组织相连。在基 质的有机无机界面上，可以通过调节离子运送、离子的配合与解离、氧化还原性质等达到 准确地控制局域的离子过饱和度，甚至还可以通过离子结合强度和水流方向来改变矿化位 点处的离子活性，从而对晶核的形成、晶体习惯面的形成与改变以及晶体生长过程中的相 第一章绪论 变等产生影响。隔室内的过饱和度则受到离子载体或离子泵的控制，而且基质泡、聚电解 质、磷蛋白或其他的钙离子成键蛋白、磷脂以及酶催化所释放的新生离子等都会对过饱和 度产生影响，不过迄今为止，对于此机理还不是很了解。 1 1 3 2 生物矿物一般具有确定的晶体大小和取向 晶体生长与有机基质的结构和化学性质密切相关，晶体的选择性常常是由有机无机界 面的特殊位置诱导而产生的，它可以包括：周期性的带负电荷的表面；同时带有疏水 基团和亲水基团的双功能骨架分子；含有对于成核作用的临界位点数目的外延单元。同 时，由于成矿过程是细胞指导和基质参与的，故矿物相可以不断地再生，大多数晶体是在 基质结构中生长的，但某些结构分子也可能结合到晶格之中。 1 1 3 3 矿物的宏观生长是通过许多增长单元的填充与组装而完成的 由细胞分泌所形成的隔室单元或基质，在完成形成矿物的密度及形状之后，分泌过程 将会产生新的单元，矿物的沉析作用处于一个动态的不断更新的运动面之中。在溶液中， 分子间的特殊相互作用如大环配体的主客体相互作用，酶底物的反应以及抗体抗原偶联 等，都是分子大小、电荷、形状和动力学等的互补性所决定的。 生物矿化过程存在着不同层次的控制作用，向每个隔室中运送成核所需要的分子和离 子是受到隔室内物理化学参数以及外部生化反应的过程，生物能学的调控而最终是受到基 因库的控制，这是一个极其复杂的过程。而主要的难点则集中于有机无机界面。这是由于 界面的性质与界面两侧的体材料有很大的区别，在界面上更易发生化学反应。只有深入了 解界面的几何特征，化学键台，界面的化学缺陷和结构缺陷等，才能在分子水平上去认识 生物矿化过程，从而方可利用晶体工程去模拟生物矿化过程，发展新型的人工晶体。 1 1 4 生物矿化的机理 生物矿化区别于一般矿化的显著特征是，它通过有机大分子和无机物离子在界面处的 相互作用，从分子水平控制无机矿物相的析出，从而使生物矿物具有特殊的多级结构和组 装方式。生物矿化中，由细胞分泌的有机物通过自组装对无机物的形成起模板作用，使无 机矿物具有一定的形状、尺寸、取向和结构。 m a i l n 等人认为生物体内矿化过程可以分为四个阶段【3 阳8 】：超分子预组装，界面分子 识别，化学矢量调节、细胞水平调节和再加工。 1 1 4 1 超分子预组装( s u p m m o l e 甜i a rp n o r g a n i 豫t i o n ) 这一阶段指在矿物相沉积前构造出一个组织化的反应环境，该环境决定了无机矿物成 核的位置1 3 9 】。生物矿化中常用的超分子预组装方法有两种：一种是蛋白质笼和脂类泡囊的 6 第一章绪论 自组装，另一种是扩展蛋白质一多糖网络的构筑。前者主要用于细胞内生物矿化，后者则 主要用于多细胞生物的细胞外和细胞间生物矿化。 1 1 。4 2 界面分子识别( i l i t e r 衄c i a lm o i e c u i a rr 毒c o 酗i h o n ) 在生物矿化的第二个阶段，无机矿物相在已形成的超分子预组装体的控制下，在无机 有机界面处自溶液中成核。生物矿化中的界面分子识别包括静电匹配、结构和立体化学互 补，主要从两方面讨论【柏】：一方面，无机生物矿物生长的空间定位与空间约束【4 1 】有机界面 为矿物晶体的定位生长提供了一个有效空间，晶体就在这个有效空间内形成，同时，它又 对晶体生长在空间上的扩展给予约束和限制，从而使得晶体在结构、形态及尺寸上都得到 控制。例如贮铁蛋白是由2 4 个多肽亚单位通过自组装所形成的一个内径为8 0 a 的球体， 它的内部球腔为生物矿化作用提供了一个特定的反应空间1 4 2 ，捌。 另一方面，晶体生长的局域化学控制【4 3 】理论上，晶体的成核过程必须克服一个从饱和 溶液中自发形成固相的活化能垒，即晶体的成核活化能。在生物矿化过程中，可以通过降 低表面能和增大过饱和度来降低晶体的成核活化能。晶体生长的局域化学控制主要是指控 制有机界面附近的化学微环境，而其中最主要的环境因素是局域过饱和度，它不仅反映了 矿化环境的非平衡态状况，而且还是决定晶体成核与生长的基本条件。 1 1 4 3 化学矢量调节( v e c t o r i a lr e g l l l a n ) 无机物矿化材料，在不同的位置上可以形成特定的晶型结构。很明显，生物隔室内溶 液的物理化学性质的调节作用是晶体生长、聚集和结构的一个重要因素。矿物相通过晶体 生长进行组装得到亚单元，同时形态、大小、取向和结构受到有机分子组装体的控制。这 一阶段通过晶体的生长和终止与矿物相的组装紧密联系起来。生物矿物最为惊人的特性就 是它们所具有的精确的修饰作用。例如，对于同一种生物矿化材料，在不同的位置上可以 形成特定的晶型结构。 1 1 4 4 细胞水平调节和再加工( c e l i u l 盯p r o c e s s i n g ) 已形成的矿物核在超分子预组装体的控制下继续生长，在细胞的参与下，形成高级结 构，其中生物矿物被赋予了独特的结构和形态，并产生了复杂的微结构和超微结构。生物 矿化的这一阶段包括了许多构筑过程，这些过程产生了具有复杂的微结构和超微结构的更 为高等的构筑模式。正是在这一级别的构筑模式上，生物材料与人工合成材料存在着明显 的差异。但是令人遗憾的是，这一阶段中所涉及的识别和组织化过程的细节尚不清楚。 1 2 生物矿化的研究进展 7 第一章绪论 1 2 1 仿生合成和生物矿化的研究历史 生物矿化的研究始于上世纪2 0 o 年代。德国、丹麦、瑞典的学者用偏光显微镜对生 物矿物进行了系统的观察，人们对生物矿物的形貌已经有了粗浅的认识。5 0 6 0 年代，西 北欧及美国的学者借助于透射电镜和扫描电镜对生物矿物做了深入的研究并建立了有机 基质的概念。1 9 7 2 年c r e n s h a w 采用e d t a 这种温和的去钙化剂来处理双壳类贝壳，使有 机质大分子能较完整地保留下来，开始了生物矿物中有机质的研究。1 9 7 6 年k l w e n s t 锄和 w e i n e r 研究发现，在生物矿化过程中“有机基质调制”是决定生物矿化材料的优异性能的 关键，这时人们已经对生物矿化的概念有了初步的认识，开始对生物矿化过程中无机物与 有机物的界面分子识别进行研究。 8 0 年代以来，随着各种微区分析技术的发展，人们利用各种不同的专门仪器，如红外 拉曼、穆斯堡尔谱仪、核磁共振、顺磁共振、中子活化等，不仅探明了绝大部分门类的主 要矿体结构和矿物成分，而且将生物矿物的研究提高到细胞生物学、分子生物学乃至生物 无机化学的水平。1 9 8 6 年s t 印h e nm 枷等人以卵磷脂( p c ) 作为有机基质，在其形成的单层 泡囊内产生分立的完美球形或圆盘形磁铁矿晶体，而不存在卵磷脂泡囊时，则在本体溶液 内形成针状的y f e o o h 和a f e o o h 沉淀。在生物体内发生的矿化作用，通常是采用泡囊 来形成矿物的隔室化。许多生物体的细胞都是通过细胞膜形成泡囊，然后在泡囊内发生矿 化作用，生成无定形材料和晶体材料。随后在1 9 8 8 年，s t e p h e nm a n n 等人又用阳离子表 面活性剂双十二烷基二甲基溴化铵( d d a b ) 、介稳态磷酸钙水溶液和长链烷烃的混合物制 备出具有扩展网络微结构的磷酸钙，其中矿化过程的成核反应发生在双连续网络互联的水 的通道中m j 。 有机高分子由于稳定性、易修饰性和可加工性，很适合作为矿物或材料沉积的基质。 1 9 9 2 年k a w a g l l c h i 曾报道将n a 2 c 0 3 加入到聚苯乙烯磺酸钠口s 系列) 和c a 畔0 3 ) 2 混合溶液中 恒温搅拌，可以产生球形的c a c 0 3 晶体。同年，m e l d r u mfc 等人研究了贮铁蛋白，结果表 明它主要是由2 4 个蛋白质的亚单位有序排列而形成的一个的球状体，贮铁蛋白脱去铁后， 就变为脱铁铁蛋白，脱铁铁蛋白含有一个空腔，该空腔为仿生合成提供了一个特定的空间。 将f e ( i i ) 溶液加入到脱铁铁蛋白溶液中，就会产生大小均匀的、分立的纳米级晶体微粒， 每个微粒被蛋白质壳围绕着，这表明分立的晶体是在特定的脱铁铁蛋白空腔内形成的。 1 9 9 3 年s t e p h e nm 咖所领导的研究组的工作最为出色，在m o l e c u l a rt e c t o n i c si n b i 锄i n e r a l i z a t i o na n db i o m i m e t i cm a t e r i a l sc l l 锄i s 圩y 一文中详细、系统地讲述了生物矿化 的机理和过程，指出了生物矿化的第二阶段一界面分子识别，认为矿物晶核的装配受到无 第一章绪论 机一有机界面上静电、结构和立体化学互补性控制。1 9 9 7 年，d e o l i v e i r a 等人在设计合成了 一种基本由a 残基组成的以a 螺旋构象为主的多肽( c b p ) 。在不同的温度下，c b p 有不 同含量的a 螺旋构象，因此在不同条件下以它为基质生长出的碳酸钙晶体的形貌不一样， 这说明单一的生物分子可以控制无机晶体的形貌，而且生物分子的构象对无机矿物的形貌 有着重要的影响。1 9 9 8 年，d s c h u l e r 和r b f m k e l 等人根据生物控制矿化的原理，在磁 细菌中形成了磁性纳米微粒，这种广泛存在于生命体中的磁性矿物能在十分温和的条件下 在实验室合成出来。一些生物活体组织中的矿物在基因调控下的形成机理的研究取得了进 展，开始从分子生物学的水平上探究诱导生物陶瓷生长的有机金属酶的遗传受控机制【矧。 2 0 0 0 年，o g a s a w a r a 等人利用动物组织复杂的结构进行了生物模拟材料的合成。在2 0 0 1 年，随着对一些蛋白质和酶的结构解析，可以从枯草牙孢杆菌得到2 ，4 二氧四氢喋啶合 成酶( l m m a z i n es y n t l l a s e ) ，它是由6 0 个亚基构成的中空多孔壳状二十面体，s h e n t o n 等人 在氧化铁合成体系中加入这种酶，发现在酶的空腔内部形成了氧化铁纳米粒子，而且粒子 的直径随着所加入铁与酶亚基的摩尔比变化。2 0 0 4 年，德国的m b e i e r 利用钙示踪器揭示 了鱼的内耳石的生物矿化过程中的结晶位点【明。2 0 0 5 年，日本的t a d a s h i 等模拟生物矿化 的过程设计合成出了一系列具有生物活性的骨替代材料l 勰】。 综上所述，人们先用两亲分子作为基质模拟研究了生命体系中的脂类泡囊内进行的矿 化机理；由于有机高分子在结构方面与生物矿化过程中所用到的生物高分子具有一定的相 似性，接着又用高分子作为有机基质来模拟生物体内矿化的过程来进一步探讨生物矿化机 理。近来，人们使用了与生物体更接近的生物大分子作为有机基质模拟生物矿化过程，模 拟体内形成的蛋白质笼来指导无机矿物的形成，取得了一定的进展，由此人们对生物矿化 的机理有了比较深入的认识。 1 2 2 我国生物矿化的研究现状 上世纪8 0 年代以来，我国学者也开展了生物矿化方面的研究，并已有专著问世【4 9 ，5 0 j 。 崔福斋【5 l 】等采用x 壕f 线分析等方法，对象牙从纳米到厘米的分级结构做了详细的研究， 结果表明象牙与人类牙齿的牙本质相似，是由羟基磷灰石晶体和胶原纤维所组成。然而， 由于羟基磷灰石中的钙部分的被镁所取代，从而导致象牙中钙的化学环境要比羟基磷灰石 晶体中的更复杂。他们还用扫描电镜、透射电镜和x 射线衍射等方法，研究了在硬脂酸单 分子膜下碳酸钙的受控结晶作用【5 2 1 ，发现当无膜存在时，碳酸八钙( o c p ) 晶体以2 0 砌o o i l i n 的微小晶簇混乱地从溶液中析出，且不具有择优取向。邰子厚等人f 5 3 j 在1 9 9 6 年来合成 了一系列新型的两亲配体，它们既具有通常两亲分子的结构特征，又具有配体的化学性质， 9 第一章绪论 只要改变配位基团中杂原子的数目与种类，原则上就可能在气、液界面上形成不同结构类 型的单分子膜，用它不仅可以诱导形成难溶性的矿物，而且也为诱导形成水溶性的无机矿 物开辟了途径。温树林等【跏对生物陶瓷的显微结构特征做了深入的研究后指出，生物陶瓷 的物理化学性质及生物功能，最终取决于它的结构特征，如原子间的键长、键角、空间结 构以及晶体结构的缺陷、位错及晶界等。潘永信【5 5 】等研究了趋磁细菌磁小体的生物矿化作 用，这对于揭示高级生物体内磁铁矿的形成作用机理具有重要的参考价值。王成毓【5 q 等模 拟了生物矿化过程，原位合成出活性纳米碳酸钙，为指导工业化生产提供了依据。 1 3 目前存在问题和本文研究内容 1 3 1 目前存在问题和本文动机 生物矿化在仿生材料合成中的应用已取得了令人振奋的成果 5 7 59 1 。但是，由于生物的 多样性和生物矿物形成过程的复杂性，目前得到的材料在其功能上与天然矿化材料相比还 有很大的差距。这就要求我们应当更深刻了解结晶条件、过程、界面、结构和功能等多方 面的相互关系，解决仿生材料合成中的一些基本理论问题。近期的研究还表明，生物矿物 的形成受基因的控制1 6 0 越】，这也增加了生物矿化研究的难度。目前对于生物矿化机理的研 究存在着以下几个基本问题： 第一目前人们常用的是一些两亲分子和高分子等非生物大分子作为有机基质，在静 态下模拟生物矿化过程，虽然这些生物大分子对无机物的矿化有一定的影响，但是它们与 生物大分子的差距很大。实验中采用的有机基质的官能团、立体构象和多级结构对无机矿 物的形成的关键作用与生物活体中的矿化过程有很大的差别，因此从非生物大分子得到的 研究成果很难对生物矿化过程有正确的认识。 第二现在人们对生物矿化机理的研究大多注重有机基质对无机晶体的晶型、外貌等 的影响，但是对有机基质和无机晶体之间的界面分子识别的研究，以及从分子水平、超分 子水平上研究矿物与基质之间相互作用的本质和规律的研究等鲜有报道，即反过来，无机 物对有机基质的结构也有一定的影响，它们之间的协同作用还受制于蛋白质、酶等生物大 分子的立体构象和多级结构。 第三生命体内的矿化过程是由无序到有序的动态过程，即有机基质的自组装和无机 矿物质的形成是同时发生的，而不是在预制好的基质上无机矿物质成核结晶，而目前的模 拟过程主要是预制好的基质上进行静态过程，这种体系与生命体内生物矿化过程相差很大， 1 0 笙二兰堕堡 其结果不能很好的认识生物矿化机理。 针对以上存在的问题，我们进行了下列研究： 第一 直接选取生命体系中存在的蛋白质、酶作为基质，更好地模拟生命体系中的 有机质。 第二 我们不仅研究了基质对无机盐结晶的影响，而且着重研究了无机盐结晶对基 质影响，即探讨无机矿物和有机基质之间协同作用，从分子水平上探讨无机矿物与基质之 间相互作用的本质和规律。 第三 我们采用的模拟实验过程更接近生物矿化过程，巧妙设计实验，采用液液扩 散和气液扩散方法，克服了以往静态或受控过程。 1 3 2 研究内容 本文研究蛋白质、酶影响碳酸钙和羟基磷灰石结晶协同作用，主要有三个部分： 第一选用牛血清白蛋白和溶菌酶作为基质，液一液扩散条件下，调控碳酸钙的结晶。 在牛血清白蛋白中生成通常不稳定的球霰石碳酸钙，而溶菌酶中形成通常不稳定的文石碳 酸钙，它们分别具有不同形貌。同时研究了不同晶型碳酸钙晶体对牛血清白蛋白和溶菌酶 高级结构的影响，重点研究了它们之间协同作用。 第二分别以牛血清白蛋白、牛血红蛋白、胃蛋白酶和溶菌酶作为基质，调控羟基磷 灰石的结晶，仿生合成的羟基磷灰石具有不同形貌，同时研究了它们对四种基质的二级结 构的影响。 第三巧妙设计胶原自组装实验，重点研究了组装过程对球霰石型碳酸钙结晶的影 响，即研究了有机质组装和无机盐结晶同时进行的过程，很好地模拟了生命体内由无序到 有序的动态组装过程，研究了它们之间的协同作用。 1 3 3 结果处理和所用蛋白质特征 1 3 3 1 结果处