（微生物学专业论文）脱皮马勃液体发酵和马勃多糖提取纯化工艺的研究.pdf

摘要 马勃属伞菌亚纲( a g a r i c o m y c e t i d a e ) 、伞菌目( a g a r i c a l e s ) 、马勃科 ( l y c o p e r d a c e a e ) 的大型真菌，这一科除脱皮马勃( l a s i o s p h a e r af e n z f i ir e i e h ) 外 还有大马勃 c a l v a t i ag i g a n t e a ( b a t s c h ：p e r s ) l l o y d 和紫色马勃 c a l v a t i al i l a c i n a ( m o n t e tb e r k ) l l o y d 。马勃是一种很有开发价值和广阔应用前景的珍稀食药两用 菌【l 】。近代科学研究证明，马勃多糖具有特定的药理作用和功效。 本文对影响马勃液体培养的理化因子进行了研究，以菌丝生物量作为指标，筛选 出了适宜马勃液体培养的配方和培养条件；并对发酵产物中的马勃多糖进行了提取与 分离纯化实验研究；同时初步研究了发酵培养基中分别添加中药材对菌丝生物量的影 响。 碳源筛选实验显示：在供试的6 种碳源中，玉米粉为最佳碳源，而且价格便宜， 适宜大规模工业化生产使用。氮源筛选实验显示：在供试的6 种氮源中，黄豆粉对菌 丝生物量的影响优于其他氮源，因此选择黄豆粉为最佳氮源。无机盐及生长因子显示： 磷酸二氢钾、硫酸镁对菌丝的生长有促进作用。在碳源、氮源和无机盐的基础上，进 行了培养基配比正交实验，确定了马勃液体发酵的最佳培养基配比为：玉米粉3 o 、 黄豆粉1 5 、磷酸二氢钾0 1 、硫酸镁0 1 。以碳源、氮源为影响因子的菌丝生物 量响应面方程为： z = 1 7 9 5 0 x + 1 1 9 6 ，7 y 一0 1 9 6 7 x 2 - - 0 1 2 6 7 y 2 0 1 8 5 0 x y 一2 9 7 2 2 式中：z 一为菌丝生物量，x 一为碳源，y 一为氮源。 液体发酵培养条件因子中研究了温度、p h 值、装液量、转速、接种量、培养时 间等因子对马勃液体发酵中菌丝产量的影响。结果为：马勃菌丝体在p h6 7 的条件 下，按1 5 的接种量接种于装有1 0 0m l 最佳培养基的2 5 0m l 摇瓶中，在1 3 0r m i n 振荡培养箱中2 6 ，恒温发酵培养9 6h ，即可得到大量的菌丝体。 马勃粗多糖的提取工艺与提取时间、提取温度、提取次数、溶剂比等有密切关系。 本实验采用热水浸提法，对这些单因素影响进行了逐一实验，得到马勃多糖的最佳提 取时间为1 5h ，最佳提取温度为7 5 ，最佳提取次数为3 次，最佳料液质量比为1 ：2 2 。 采用了s e v a g 法对马勃粗多糖进行去蛋白实验，设计了三因素三水平的正交实 验，实验结果去蛋白质的最佳条件是s e v a g 溶液中氯仿和正丁醇的体积比为1 0 ：3 ，样 品和s e v a g 溶液的体积比为l ：1 ，振荡时间为1 5m i n 。 本研究采用了大孔吸附树脂( a b 8 ) 、d e a e 纤维素对马勃多糖进行了初步的 分离，得到多糖含量相对稍高的两个组分r a 和r b 。为了进一步分离，根据分子 量大小对r a 和r b 用凝胶柱层析( s e p h a d e xg 1 0 0 ) 进一步纯化，得到多糖含量较 高的r a 1 、多糖含量达到9 2 8 0 ，r b 1 多糖含量达到9 6 3 1 ，由此可知通过凝胶 柱层析( s e p h a d e xg 1 0 0 ) 可以很好地将多糖纯化和分级。 初步研究了向马勃液体发酵培养基中添加不同中药材及中药材的不同添加量对 马勃菌生长的影响，结果显示中药材对马勃菌的生长有不同程度的影响，为药用真菌 和中药材共发酵的进一步研究奠定了基础。 材 关键词：马勃；菌丝生物量；生长因子；液体发酵；马勃多糖；提取工艺；中药 i l a b s t r a c t p u f j f b a l l ，b e l o n g i n gt oa g a r i c o m y c e t i d a e ，a g a r i c a l e s ，l y c o p e r d a c e a e ，i sab i g - t y p e f u n g u s ，w h i c hi n c l u d e dl a s i o s p h a e r af e n z l i ir e i e h ，c a l v a t i ag i g a n t e a ( b a t s c h ：p e t s ) l l o y d ，c a l v a t i ab l a c i n a ( m o n t e tb e r k ) l l o y d ，a n ds oo n i ti sa r a r ee d i b l ea n dm e d i c i n a l m u s h r o o mw h i c hh a sg r e a td e v e l o p m e n tv a l u ea n db r o a da p p l i c a t i o np r o s p e c t s m o d e m s c i e n t i f i cr e s e a r c hh a s p r o v e d t h a t p u f f b a l lp o l y s a c c h a r i d e h a sad i s t i n c t i v e p h a r m a c o l o g i c a le f f e c t t i l i ss t u d yw a sf o c u s i n go ns u b m e r g e dc u l t u r e e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fp u f f b a l l p o l y s a c c h a r i d e w i t ht h em y c e l i ab i o m a s sa si n d e x ，i ti ss u i t a b l ef o rp u f f b a l ls u b m e r g e d c u l t u r eb ys c r e e n i n gt h ei n g r e d i e n to fc u l t u r em e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n t h er e s e a r c h o fe x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o nf o rt h ep o l y s a c c h a r i d ew a sm a d e a n db ya d d i n gt h e t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n ei n t om e d i u ms oa st os t u d yt h ee f f e c to nm y c e l i ab i o m a s so f p u f f b a l ls u b m e r g e dc u l t u r e c a r b o ns o u r c et e s t ss h o w e dt h a tt h ec o mf l o u rw a st h eb e s tc a r b o nf o rp r o d u c i n g m y c e l i ab i o m a s si na l l t h et e s t e dc a r b o ns o u r c e s n i t r o g e ns o u r c et e s t ss h o w e dt h a tt h e b e a np o w d e ri ss u p e r i o rt ot h eo t h e rn i t r o g e ns o u r c e s i n o r g a n i cs a l t sa n dg r o w t hf a c t o r s t e s t ss h o w e dk h 2 p 0 4 ，m g s 0 4c a np r o m o t et h ey i e l do fm y c e l i ab i o m a s s t h eo p t i m a l m e d i u mw a sd e t e r m i n e dw a sc o r nf l o u r2 o ，p o w d e ro fb e a n1 o ，k h 2 p 0 40 1 、 m 鹋0 40 1 t h r o u g ht h eo r t h o g o n a lt e s t r e s p o n s e p l a n eo fc a r b o ns o u r c ea n dn i t r o g e n s o u r c ew a s ： z = 1 7 9 5 0 x + 1 1 9 6 砂一0 1 9 6 7 x 2 - - 0 1 2 6 7 y 2 - - 0 1 8 5 0 x y - - 2 9 7 2 2 z ：m y c e l i ab i o m a s s ，石：c a r b o ns o u r c e ，y ：n i t r o g e ns o u r c e t h ec u l t u r ec o n d i t i o nf a c t o r si n c l u d i n gt e m p e r a t u r e , i n i t i a lp hv a l u e ，l o a d i n gc a p a c i t y o fc u l t u r em e d i u m ，r o t a t i n gs p e e d ，i n o c u l a t i n ga m o u n ta n dc u l t u r ed u r a t i o n ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ec u l t u r et e m p e r a t u r e2 6 ，i n i t i a lp h6 7 ， r o t a t i n gs p e e d13 0r p m ，t h ec u l t u r ed u r a t i o n9 6h o u r s ，t h ei n o c u l a t i n ga m o u n t15 ， c o n t a i n i n g10 0m lc u l t u r em e d i u mi nt h e2 5 0m le r l e n m e y e rf l a s k s t h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o no fp u f f b a l lp o l y s a c c h a r i d ew a sc o m b i n a t i o nw i t ht i m e ， t e m p e r a t u r e ，t i m e s ，a n ds o l v e n tp r o p o r t i o n t h eo p t i m a le x t r a c t i o n c o n d i t i o nw a s d e t e r m i n e dt h a tt h eb e s to fe x t r a c t i o nc o n d i t i o nw e r e1 5h o u r s ，7 5 ，3t i m e s ，a n ds o l v e n t p r o p o r t i o n1 ：2 2 i l l t h ee x p e r i m e n t , i s o l a t i n gp r o t e i nf r o mp o l y s a c c h a r i d eb ys e v a g , w a sm a d e ，w h i c hi s o r t h o g o n a lt e s to ft h r e ef a c t o r sa n dt h r e el e v e l s t h er e s u l tw a ss h o w nt h a to p t i m a l c o n d i t i o n so fi s o l a t i n gp r o t e i nw e r ew h a tv o l u m er a t i oo fc h l o r o f o r mt ob u t a n o li ns e v a g s o l u t i o ni s10 ：3 ，v o l u m er a t i oo f s a m p l et os e v a gs o l u t i o ni s1 ：1 ，a n ds u r g et i m ei s15m i n i nt h i ss t u d y , t h ef i r s t l yp u f f b a l lp o l y s a c c h a r i d ew a sp u r i f i e dw i t hm a c r o p o r o u sr e s i n a n dd e a e c e l l u l o s e ，a f t e rt h ep r i m a r ys e p a r a t i o n ，t h et w op o l y s a c c h a r i d es u b s t a n c e s ，r - a a n dr b ，w e r eo b t a i n e d f o rt h ef u r t h e rs e p a r a t i o n ，b a s i n go nt h ea m o u n to fm o l e c u l a r , r - aa n dr - bw e r ep u r i t i e db ys e p h a d e xg 一10 0 ，o b t a i n e dr a1w a s9 2 8 0 ，r b1w a s 9 6 31 s oa st ow ek n o wt h e p u f f b a l lp o l y s a c c h a r i d ew a sp u r i f i e da n dc l a s s i f i c a t i o nw e l l b y s e p h a d e xg - 1 0 0 b ya d d i n gd i f f e r e n tt y p e sa n dd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so ft r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e i n t om e d i a ，s oa st os t u d yt h eg r o w r hc o n d i t i o no fl a s i o s p h a e r af e n z f i ir e i c h i ti s w e l l c o m b i n e do u rt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n ew i t ht h em u s h r o o ma n di ta l s op r o v i d ea t h e o r e t i c a lb a s i sf o ri t sf u r t h e rs t u d yi nd e p t h k e y w o r d ：p u f f b a l l ，m y c e l i ab i o m a s s ，g r o w t hf a c t o r , l i q u i df e r m e n t a t i o n ，p u f f b a l l p o l y s a c c h a r i d e ，e x t r a c t i o nt e c h n o l o g y , c h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 岛 时间：2 。9 年6 月1 2 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：时间：2 0 0 9 年6 月1 2 日 第一导师签名：主生! 墨乡 时问：2 。9 年6 月。6 日 1 文献综述 1 1 马勃的历史 马勃最早记载见于名医别录【l 】，其“味辛、平、无毒，主治恶疮马疥 ，生 长环境为“久腐处。马勃除药用外，还用于装饰、食物、宗教等其他方面，如北美 印第安人不同部落用作神奇的驱赶符咒【2 】。中医认为马勃性平、味辛，有清热解毒、 清肺利咽的功效。传统上多用于热邪火毒、郁滞所致的咽喉肿痛、肺热咳嗽、咳嗽失 音等症。 最早关于马勃的药材性状描述的是南梁时期的陶弘景，在本草经集注中说： “马勃，紫色虚软，状如狗肺，弹之粉出，傅诸疮用之甚良也 ，显然陶氏所述是紫 色马勃c a l v a t i al i l a c i n a 无疑。此后的历代本草，诸如千金翼方、新修本草及 蜀本草等均列有马勃条，其性状描述“如紫絮 ，“紫尘出 等，很确切地描绘 了紫色马勃的性状特征。到宋代，马勃的品种有了变化，本草演义记载，“所谓 牛溲马勃，有大如头者，小亦如升 ，牛溲即牛屎菇。本草纲目也以牛屎菇为马 勃的异名，但从本草演义记载看，牛溲是当时药用马勃的另一品种。从本草纲 目和植物名实图考的附图来看，前者似乎指大马勃或脱皮马勃，后者为前者的 复制。中国药典2 0 0 0 年版共收载的马勃药材，均为灰包科( l y c o p e r d a c e a e ) 真菌， 有三个来源：脱皮马勃l a s i o s p h a e r a f e n z l i ir e i c h 、大马勃c a l v a t i ag i g a n t e a ( b a t s c h ： p e r s ) l l o y d 和紫色马勃c a l v a t i al i l a c i n a ( m o n t e tb e r k ) l l o y d 例。 1 2 马勃的分类学地位及生态分布 1 2 1 分类学地位【4 j 马勃主要包括马勃属l y c o p e r d o n 、灰球属b o v i s t a 、静灰球属b o v i s t e l l a 、秃马勃属 c a l v a t i a 、栓皮马勃属m y c e n a s t r u m 、脱盖马勃属d i s i c i s e d a 等属的成员，在第8 版菌 物词典( 1 9 9 5 ) 中隶属担子菌亚f - b a s i d i o m y c o t i n a 、腹菌纲g a s t e r o m y c e t e s 、马勃目 l y c o p e r d a l e s 、马勃科l y c o p e r d a c e a e ；第9 版菌物词典( 2 0 0 1 ) 归属伞菌亚纲 a g a r i c o m y c e t i d a e 、伞菌e l a g a r i c a l e s 、马勃科l y c o p e r d a c e a e 。马勃担子果球形、梨形、 陀螺形、扁圆形；外包被常有小疣或小刺等纹饰，成熟时脱落，纸质或膜质；顶端不 规则开口或闭合；假根明显或无，成熟时固定于着生处或与地面脱离；孢体粉末状， 成熟时孢子随风扩散至外界；孢子表面有不明显纹饰。马勃一般在夏末、深秋雨后， 单生、散生或群生于灌木丛、旷野湿草地、沙质土壤或腐朽树木落叶、粪草、腐粘质 等有机质上。 1 2 2 生态分布 马勃分布较广泛，世界上大部分地区均有记载，主要见于欧洲、亚洲、非洲、大 l 洋洲及美洲的不同地区。菌物词典第9 版记载马勃科1 8 属1 5 8 种。建国以来，我国 真菌工作者对全国不同地区的马勃资源进行了调查，共记载3 7 种，在不同的地方真菌 志如粤东粤中粤西大型真菌志( 毕志树等，1 9 8 8 ) 、中国的真菌( 邓叔群， 1 9 6 3 ) 和中国真菌总汇( 戴芳澜，1 9 7 2 ) 中都有所记载。马勃在我国各地几乎都 有分布，主产于内蒙、辽宁、安徽、甘肃、江苏、云南等地区。 1 3 马勃性状及鉴别【5 】 马勃是临床常用的清热药。具有清肺利咽、止血的作用。用于风热郁肺咽痛、咳 嗽、音哑；外治鼻创伤出血。发现常用伪品硬皮马勃科s c l e r o d e f m a t a c e a e 、光硬皮马 勃s c h e r o d e r r m ac e p ad e r s 、豆包菌p i s o l i t h u st i n c t o r i u s ( p e r s ) c o k e r & c o u c h 的干燥 子实体来混充马勃使用。对其进行原植物、性状特征和显微特征的研究综述，以利于 更好地开发马勃中药资源。 1 3 1 性状及鉴别 1 3 1 1 脱皮马勃【6 j 扁圆球形、扁球形，无不孕基部；鲜时外包被乳白色，摸之较光滑，按之松软。 成熟个体褐色，外包被初有坏状裂隙，缩向两端，脱落，露出青灰色至灰褐色的内包 被，纸质，初光滑，后大部分呈片状脱落，显出棉絮状褐色孢体，摸之略带粉性，触 之柔软、紧密、有弹性，并有尘状孢子飞扬，略带气味。 1 3 1 2 大马勃 不孕基部小或无。残留的包被由黄棕色的膜状外包被和较厚的灰黄色内包被所组 成，光滑，质硬而脆，成块脱落。孢体浅青褐色，手捻有润滑感。 1 3 1 3 紫色马勃 呈陀螺形，或已压扁呈扁圆形，不孕基部发达。包被薄，两层，紫褐色，粗皱， 有圆形凹陷，外翻，上部常裂成小块或己部分脱落。孢体紫色。 1 3 1 4 光硬皮马勃 呈不规则球形，一端有短柄。灰棕色至棕褐色，外壳硬而脆，厚薄不一，有凹陷 及皱纹。内部全为深棕色的絮状物，轻轻捻动孢子则呈尘烟状飞扬。 1 3 1 5 豆包菌 担子果呈扁杯状，有柄，包被薄，粗糙，棕褐色。多已脱落，露出无数颗粒状的 小包，小包黄棕色，包壁破裂，有许多棕褐色的粉状孢子。 1 3 2 粉末显微鉴别 1 3 2 1 脱皮马勃【6 】 ( 1 ) 外包被特征 薄壁细胞状细胞紧密排列，淡褐色，细胞呈椭圆形、长圆形、不规则形。 ( 2 ) 内包被特征 2 浅棕红色，孢丝长，常具分枝，大多呈“y ”形和“人 字形，淡褐色；散在棕 褐色孢子。 ( 3 ) 粉末特征 褐色，孢丝淡褐色，大多相互交织成团。散在的孢丝长，多具有分枝，以“y 形居多，亦有不分枝，呈稍弯曲的线状。孢丝壁颜色较深，中间透明；孢子众多，散 在孢丝周围，圆形，表面具有短刺状突起，淡褐色，中间呈淡绿色。 1 3 2 2 大马勃 粉末淡青褐色。( 1 ) 孢丝：稍有分枝，有稀少横隔。( 2 ) 孢子：淡青黄色，光 滑或有的具微细疣点。 1 3 2 3 紫色马勃 粉末灰紫色。( 1 ) 孢丝：有分枝，有横隔。壁厚。( 2 ) 孢子：紫色，有小刺。 1 3 2 4 光硬皮马勃 粉末棕褐色。( 1 ) 孢丝：无。( 2 ) 孢子：众多，呈圆球形，棕褐色，表面具稀 疏小刺突起。 1 3 2 5 豆包菌 粉末黄棕色。( 1 ) 孢丝：稀少，无分枝，无横隔，单根散离或成束，似纤维 状。( 2 ) 孢子：圆球形，黄色至黄棕色。 1 4 马勃的化学成分 马勃含有各种氨基酸，人体必需的8 种氨基酸含量较高，特别是赖氨酸、蛋氨酸 的含量很高，还含有马勃多糖、马勃素、无机盐和微量元素等。该属真菌中的部分化 学成分，国外已有相关报道川。 1 4 1 甾体化合物 金向群等【8 】从大马勃子实体中分得麦角甾2 7 ，2 2 一二烯一3 一酮、p 谷甾醇等。n o b u o k a w a h a r a l 9 从马勃属cc y a t h i f o r m i s 分离得至t j l 4 a 羟基麦角甾- 4 ，7 ，9 ，2 2 四烯一3 ，6 - - 酮和9 c t ，14 a 二羟基麦角甾4 ，7 ，2 2 三烯3 ，6 二酮两种新的甾类化合物。亦有人从硬 皮马勃属真菌sp o l y r h i z u m 的子实体中分得麦角甾4 ，6 ，8 ( 1 4 ) ，2 2 四烯3 酮和麦角甾 5 a ，8 a 环二氧6 ，2 2 二烯3 p 醇【l o 】。王晨英等从黄硬皮- - b 勃d p 分离得至l j ( 2 2 e ，2 4 r ) 麦 角甾2 5 ，7 ，2 2 一三烯3 p 醇等【1 1 1 。国外从灰包科马勃l y c o p e r d o n p y r i f o r m e 分得麦角固 醇、霉菌甾醇、麦角甾7 ，2 2 二烯3 p 醇等一系列甾体化合物1 2 1 。 1 4 2 萜类化合物 f a l l 【r a s s e r 等t 1 3 1 从马勃肋协勉够9 6 0 4 2 分离出苯乙酮缩二羟孕酮，补身素2 ，1 1 一 二醇等萜类化合物。a l f r e db a u m e r t 1 4 1 等从彩色豆马勃菌丝体中分得一系列三萜化合 物，有2 牛乙基羊毛甾烷一8 ，2 4 ( 2 4 ) - 双烯一3 b ，2 2 号二醇和( 2 2 s ) 2 4 ，2 5 二甲基羊毛甾 烷8 烯2 2 ，2 4 环氧- 3 b 醇一2 4 一酮等。有报道从硬皮马勃& a u r a n f i u m 中分得具有抗癌 活性的2 3 - h y d r o x y l a t e d l a i l o s t e r 0 1 三萜类化合物【6 。 1 4 3 小分子含氮化合物 龚先玲等从多根硬皮马勃中分得n ，n 二甲基一苯丙氨酸和2 三甲基3 ( 3 吲哚基) 丙氨酸盐等【1 5 】。y o s h i h i s at a k a i s h i 掣1 6 1 从c a l v a t i ac r a n i f o 册西中分得一系列羟苯基偶 氮甲酰胺类化合物，如4 羟苯基1 偶氮甲酰胺和4 一羟苯基1 o n n 甲酰胺等。国外从 c a l v a t i ar u b r o f l a v a r o ( f f 得的色素如r u b r o f l a v i n 等也为含氮化合物【1 7 】。与多根硬皮马勃 同一科的彩色豆马勃能产生吲哚和吲哚类的衍生物色氨酸三甲基内盐 ( h y p a p h o f i n e ) o 1 6 。 1 4 4 马勃多糖 将马勃用热水提取所得的粗品经溴代十六烷基三甲胺络合后，再通过d e a e 纤维 素和s e p h a d e xg - 7 5 柱层析得马勃多糖精品，进一步纯化依次得马勃多糖 p s i 】一, p s v t 1 9 1 。 1 4 5 蛋白质、肽类 有报道从马勃cc a e l a t a 的新鲜子实体中提取分离出一种新蛋i 兰t c a l c a e l i n ，运用 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳可将其离解成分子量1 9k d a 和2 0k d a 两个亚单位。y w l a m 等【2 l 】运用快速蛋白液相色谱法和凝胶过滤法从马勃c c a e l a t a d ? 分离出一种类似 泛激素的肽，其分子量为8k d a ，具有泛激素的氨基末端序列特征。 1 4 6 氨基酸 马勃含有各种氨基酸，总氨基酸含量为3 2 9m g 1 0 0 m g ：2 2 1 。人体必需的8 种氨基酸 含量较高，特别是赖氨酸、蛋氨酸的含量很高。据汪麟【l 】报道，大马勃c a l v a t i ag i a n t e a n ( b a t s c h ：p e r s ) l l o y d 幼子实体含氨基酸总量为3 4 2 6g ，人体必需氨基酸1 4 1 6g ，占 总量的4 1 3 3 ，谷氨酸最高达5 2 3 、赖氨酸2 0 4 。从氨基酸测定结果可知马勃含 有丰富的蛋白质，而且氨基酸种类和数量都十分优越，含有全部人体必须的氨基酸， 其中蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的含量都相当高。其中脱皮马勃蛋氨酸含量达1 3 6 6 。 1 4 7 其它成分 崔荣等测出马勃的1 0 种微量元素 f e 、m g 、c a 、z n 、m n 含量都极耐2 3 】；脱皮马 勃的子实体中含尿素、类脂质、磷酸钠等。 1 5 马勃的药用价值 1 5 1 抑菌作用 陈丽等【2 4 】从黄硬皮马勃子实体提取物正丁醇部分分离得到一种具有抑菌活性的 非蛋白氨基酸，经鉴定为n ，n 一二甲基苯丙氨酸。该化合物与黄硬皮马勃总浸膏以及黄 硬皮马勃正丁醇部分浸膏对5 种细菌和3 种霉菌均具有不同程度的抑制作用，且对于细 菌的抑制效果要明显强于霉菌。孙菊英等【2 5 1 实验发现十种马勃均有不同程度的体外抑 菌作用。现代药理研究显示马勃对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、绿脓杆菌及真菌均有 抑制作用。国外发现马勃化学成分中的麦角甾醇过氧化物具有抗分支杆菌的作用【2 6 】。 马勃具有抑制v s c s ，显示马勃适合作为预防和抑制口臭的保健用药【2 7 1 。 1 5 2 抗炎作用 黄硬皮马勃具有消炎作用，王晨英【2 8 】等对其化学成分进行了系统研究分离和鉴定 t a 种活性成分。其中5 a ，8 a - e p i d i o x y - ( 2 2 e ，2 4 r ) e r g o s t a 6 ，2 2 一d i e n e 一3 1 3 - o l 具有抗 炎作用【2 9 1 。左文英等【蚓通过炎症模型实验发现脱皮马勃能显著抑制二甲苯所致小鼠 耳壳肿胀，起到抗炎作用。对腹腔注射醋酸所致小鼠腹腔毛细管通透性增高影响实验 发现复方马勃冲剂( 含马勃、生石膏等) 具有抗炎作用，通过干酵母致热法实验发现 复方马勃冲剂具有明显的解热降温作用【3 1 】。 1 5 3 止咳作用 左文英等【3 1 】通过机械刺激致咳实验模型证明脱皮马勃有不同程度延长豚鼠咳嗽 潜伏期，起到止咳作用。 1 5 4 止血作用 陶文洲掣3 2 1 发现复方马勃液( 由马勃、大黄组成) 对家兔胃粘膜创伤性溃疡出血 可显著减少出血量和缩短出血时间。 1 5 5 杀虫作用 魏艳等【3 3 】发现黄硬皮马勃子实体的甲醇一氯仿总浸膏的石油醚萃取部分对3 龄粘 虫具有较强的杀虫活性，硬皮马勃的甲醇氯仿总浸膏的石油醚萃取部分对3 龄粘虫表 现出较强的拒食活性和毒杀活性。 1 5 6 抗肿瘤作用 多糖是由单糖连接而成的多聚物，人们对多糖的研究已经有很长的历史，对多糖 的初始研究可追溯到1 9 3 6 年s h e a r 对多糖抗肿瘤活性的发现，到2 0 世纪5 0 年代，陆续 发现一些真菌多糖和高等植物多糖具有明显的抑瘤活性。科学研究已经确认糖类物质 具有许多生物活性，包括抗肿瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且对机体几乎无毒副 作用。中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤降血糖等药理作用，而且几乎没有 毒性与副作用，因此引起国内外药理学家、生物学家及化学家们的关注。马勃多糖 p s i i i 在1 0 0 “m l 对移植内s 1 8 0 肉瘤细胞具有明显的抑制作用【1 2 】；有报道麦角甾 5 0 【，8 0 【环二氧6 ，2 2 二烯3 b 醇不仅对m c f 一7 和w a l k e r2 5 6 肿瘤细胞有抑制作用， 还具有将其杀死的作用1 9 1 。麦角甾2 4 ，6 ， h e p3 b 和a g s 肿瘤细胞均有抑制作用【3 4 1 。 8 ( 1 4 ) ，2 四烯3 酮对h t - 2 9 ，h e l a2 2 9 ， 崔磊等3 5 1 从灰包科脱皮马勃属真菌脱皮马 勃的干燥子实体的脂溶性部分首次分得了6 种化合物的抗肿瘤活性进行了初步的筛 选，发现化合物e r g o s t a 7 ，2 2 d i e n e 一3 p - o n e 在测定浓度范围内呈现出良好剂量依赖性抑 制作用。 1 5 7 变态反应 5 m a r i a n n eg e i s e rp h d a 等【3 6 】发现所吸入和存储的马勃孢子在呼吸道表面的分布， 以及其被吞噬细胞移位到房眼水内层吞噬的过程，对空气散播的真菌变态反应原所引 起呼吸器官的变态反应有重要作用。 1 6 马勃发酵研究概述 1 6 1 液体深层发酵 液体深层发酵技术这一概念是从2 0 世纪4 0 年代中期抗生素工业的兴起而开始的， 由当时的美国弗吉尼亚大学生化工程专家e l m e r l g a d e n ，j r 提出的，他设计出培养微 生物系统的生物反应器，成为该项技术的权威。在1 9 世纪末和2 0 世纪初，巴斯德学派 的后继人跨出了医学领域，试图将微生物用于工业生产，这一尝试取得了更为直接有 效的结果，并建立了食品酵母深层通风发酵工业。时至今日，在医药、食品发酵工业 方面已有比较先进的生物反应器及配套设施，在理论及实践上都己大大地向前推进 了。据资料报道，这一技术应用于食用菌方面的最早的是美国国防部h h u m f e l d 等人 对磨菇进行的深层培养。1 9 5 8 年j s z u e c s 率先采用发酵缸来培养羊肚菌。日本的衫恒 武等人于1 9 7 5 年和1 9 7 7 年报道了采用浓度为1 的有机酸和0 5 的酵母膏组成液体培 养基获得大量的香菇菌丝体。国内较早的报道是上海植物生理研究所的陈美聿等人于 1 9 8 0 年进行的香菇深层发酵研究。1 9 7 9 年杨庆尧开始研究香菇等的深层发酵，并研究 了液体培养基的粘度与菌球的关系。8 0 年代后，国内外纷纷开展了这一技术的研究与 应用探讨。随着微生物学、发酵工程学的相互交叉渗透，食药用菌液体培养的应用将 会更加广泛，前景更广阔 3 丌。 1 6 2 液体深层发酵优越性 1 6 2 1 菌丝体生长速度快，产量高 在液体发酵中，液体培养基的营养成分分布均匀，有利于菌体的充分接触和吸收。 菌丝细胞能在反应器内处于最适温度、酸碱度、氧气和碳氮比的条件下生长，能及时 排放代谢废气，新陈代谢旺盛，菌丝生长迅速，能在短时间内产生大量的菌丝体，生 产周期般为3 6d ，而固体发酵周期一般需要3 0 5 0d 。 1 6 2 2 提高代谢产物的产量 食药用菌的菌体发酵代谢产物可分为初级代谢产物( 如氨基酸、蛋白质、核酸、 类脂、多糖类、有机酸类等) 和次级代谢产物( 如抗菌素、生物碱、色素、植物生长 因子等) 。这两类代谢产物在营养与医疗上都具有重要作用。研究表明，食药用菌多 糖是具有抗癌活性的多糖类，它能刺激人体产生抗体，预防和抑制癌症的发生、发展。 这些多糖类除具有抗癌活性外，还有抗病菌、抗病毒、抗辐射、抗衰老等功能及降血 糖、降血压、降胆固醇、抗炎症、抗血凝等多种生理活性。临床实验表明，食药用菌 多糖类无任何副作用，可作为高效低毒药物【3 8 】。但是，如果通过固体培养获得的子实 体提取代谢产物，不仅劳动量大，耗时多，而且产量低。若改用液体培养，就能克服 6 上述缺点。 1 6 2 3 有效减少污染 液体菌种接入固体培养料时，具有流动快、易分散、萌发快、发菌点多等特点， 使袋栽食用菌接种污染得到较有效的控制。有数据显示【3 9 】，将液体培养基中生长的平 菇、香菇和猴头原种接入固体培养基中，污染率为2 2 ，而固体原种接种的污染率为 6 7 。便于工业化生产。 1 6 3 马勃液体发酵进展 张华山等【删对白马勃液体深层培养的工艺条件进行探索，得出其最佳摇瓶条件 为t 温度2 4 2 8 。c ，种龄4d ，接种量1 0 ，振荡转速为1 5 0r r a i n ，培养时间为6d ，在 最佳工艺条件下菌丝体干重可达1 1 7g l 。张华山掣4 l 】以菌丝含量为主要指标，研究 了6 种营养物质对白马勃深层培养的影响。实验结果表明，白马勃5 0 0m l d , 规模发酵 最适培养基配方为：土豆粉4 0 ，糖蜜1 5 ，黄豆粉2 o ，酵母膏0 2 ，k h 2 p 0 40 2 ， m g s 0 4 7 h 2 0o 1 5 ，p h6 0 。接种量为1 0 时，在1 5 0r m i n 摇床上2 6 。c 振荡培养5d ， 菌丝含量最高，为1 4 7 l ；土豆粉是白马勃生长的主要因素，糖蜜是次要因素，土 豆粉可以作为白马勃发酵培养基的主要原料。 刘雪峰等【4 2 】用思茅松林地采集的黄硬皮马勃子实体分离的纯菌种，进行该菌的培 养特性研究。通过不同碳源、氮源、维生素、p h 值以及培养温度的实验，结果表明： 在半组合培养基上，碳源以可溶性淀粉最好，乳糖最差；氮源以酵母浸膏最好，天门 冬素最差；培养基的p h 值以及培养温度对菌丝的生长影响很大，最适p h 值是4 2 5 2 ， 最适温度是2 5 3 0 ；说明该菌对维生素的要求不严格。 有研究表明彩色豆马勃子实体的水、乙醇和丙酮提取液对稗草和水稻幼苗生长有 极显著的抑制作用，丙酮提取液对狼尾草和油菜幼苗生长有抑制作用【4 3 】。林捷等【删 对彩色豆马勃发酵液和菌丝体提取液对几种植物的化感作用的研究表明，彩色豆马勃 的发酵液在6 2 5 、1 6 6 7 的体积分数下对稗草、水稻和萝卜等高等植物的幼苗生长 有显著的促进作用，在6 2 5 体积分数下对油菜的幼苗生长有促进作用；彩色豆马勃 菌丝体的乙醇提取液在1 5 0 0 、7 5 0 和3 7 5m g m l 等质量浓度下对稗草、萝卜和油菜均 有明显的抑制作用；在1 5 0 0m g m l 质量浓度下对水稻幼苗的生长有抑制作用，但在 7 5 0 和3 7 5m g m l 质量浓度下对水稻幼苗的生长有促进作用。 有研究表明，在适当浓度范围内，稀土元素能增强细胞对无机氨的吸收、转化和 利用，提高蛋白质的含量；促进菌丝体对磷的吸收和利用；提高菌丝体分泌胞外酶的 活性，增加对培养基中碳源物质的降解和转化、利用。陈立红等【4 5 】研究表明，稀土培 养基对彩色豆马勃( p i s a l i t u st i n c t o r i u s2 7 0 ) 菌丝体的前期生长有促进作用，后期生 长有抑制作用。 1 7 中药发酵制药技术 7 1 7 1 概况 传统的中药发酵多是在天然的条件下进行的，而现在的中药发酵制药技术是在充 分吸收了近代微生态学、生物工程学的研究成果而逐渐形成的。其先进的发酵工艺特 点是：以优选的有益菌群中的一种或几种、一株或几株益生菌，作为菌种，用中药材 粉末、中药提取液作为培养基的成分，再按照现代发酵工艺制成产品，它是一种含有 中药活性成分、菌体及其代谢产物的全组分发酵液的新型中药发酵加工制剂。利用微 生物( 尤其是药用真菌) 对中药进行发酵，不仅可对中药中的纤维、糖类、蛋白等物 质加以利用，同时中药中的成分亦会促进或抑制其次生代谢产物的生产，而且微生物 还可对中药中的某些成分进行转化，这样可生产出包含多种活性成分的制剂或新药 材。 中药发酵研究开始于8 0 年代，但仅是对真菌类自身发酵的研究，如灵芝菌丝体、 冬虫夏草菌丝体、槐芪发酵等，大都是单一发酵。虽有报道加入中药，但也仅是将中 药当作菌丝体发酵的菌质，同时研究发现，含有中药的茵质对原发酵物的功效有影响， 只是未见深入研究。近年来有学者提出用微生物发酵中药的倡议，1 9 9 2 年南京中医学 院的庄毅教授提出了菌质的概念，建议用中草药和营养基质为原料进行药用真菌的固 体发酵 4 6 1 ；1 9 9 4 年庄毅教授又提出了以药性基质为培养基的新型固体发酵技术，并介 绍了其以新型固体发酵技术研制的种制剂，经药理学研究和临床应用都表明以药性 基质发酵的制剂药效显著【4 7 1 。 1 7 2 中药发酵制药的特点、适用范围 1 7 2 1 特点 中药发酵制药技术的典型特点就是生物转化。可概括如下几点：药物的有效组 分、活性物质最大限度的得以提取、利用；药物进入人体后不能直接被利用的有效 活性组分，因在体外得以完成而被直接利用，迅速发挥应有效能；优选的人体有益 菌种本身具有补充或增强原有药物的功能；中药发酵制药与原有药物相比产生了新 的活性物质，从而具有新的保健、预防或治疗功能；是实现中药现代化、具有高科 技水平的又一新技术，生产工艺可控，所得产物精确，制剂方便，便于与国际接轨。 1 7 2 2 适用范围 中药发酵制药最适用于植物药和动物药植物药以补益理气、理血、祛风湿药等 为主，其中补益类以补气、补阳药为主。 1 7 3 对中药进行发酵的作用 1 7 3 1 提高药效 药用真菌在生长过程中能对中药中的纤