（有机化学专业论文）磷酰化黄酮与钙结合型蛋白的弱相互作用研究.pdf

捧州大学囔惭捌i 曩晴e l 文 摘要 细胞功熊多怒宙生耪分子之闻的弱稳夏作用弓l 起瓣，它们包括：酶与底物之 间，蛋白质与瓢体之间，蛋白质与蛋白质之问以及抗体与抗原。在生物体中，蛋 包猿是必不可少豹生命物馥，在生命的运渤釉发展延续中起羞重要的撵塌。有关 蛋岛璜构象、缀成结构、趺及稻小分子稻互作孀的视瑗，是目前生愈秘学、亿学 和临床医学中燕同关注和感趣的课题。近年来，由于医药学和生命科学的发展， 磷究小分子，茏其是具有药效的，3 、分子与聚自矮的耱互 警瘸壤理过程，对药代动 力学认识和开发新药有极其整要的意义。自从电喷雾质谱闯世以来，它已经成为 一种检测气相中跟大分子相关的弱相互作用的有力工具。 谗多事实表明磷酸骏及茨醚类衙生物太多其奏广泛鹃生携活牲，在谗多生理 邋程中起着非常踅要的作用。黄酮类亿合秘与大分予的作用比较弱，作为有祝磷 小分子化合物，其磷酰酯类衍生物大多具肖广泛的生物活性。本文将缝改造的并 竣楚他的a t h e m 恻d 反疯扩大到黄酮霜黪黄酮兹磷黢位结橱改建上，选择了 7 一羟基黄酮，5 ，7 一二羟基黄戮，成功合成了系列耨的磷酰纯黄酮。 本文以现代生物质谱e s l ，开展了4 种磷酰化黄酮和黄酮的与d 一乳白蛋白蛋 自发生嚣稳互俸麓酌硬究，醛| 凌谱法戆缭聚显示了4 秘磷酸诬黄醪产物戆确链 够和n 一乳白蛋融发生弱相互作用，它们跟a 一乳白蛋白不同程度的缩合，证明它 们与旷乳白蛋嘲之间有着有较强的亲和力。而我们在相同的e s i 质满条件( 甚 至镶强毫压要甄) 一f 捡灞蓑藜本身与旷嚣是蛋叁熬弱麟互终曩，却寒发臻复合 物的存在。确立磷酰基在分子与蛋自发生栩互作用时的关键性的作用。提高锥孔 电压其实就是提高了复合物的内能，使其变的不稳定。本文将取样孔的电压( 锥 强邀莲) 没置缓莲( 接遥1 2 瓣) ，嚣仍糍麓察蘩复台物瓣存在，这靛蘧鞠，覆一 乳白蛋白与4 种磷酰化黄酮形成的复合物的结合能相对较强。此事实蕊进步证 明了经过磷酰化修饰的黄酮的生物活性得到提高，也因丽更有可能成为种潜在 熬接溺裁。 除了a 一乳白蛋白，本文还用荧光法研究r 磷酰化黄酮与另外一一种钙离子结合 性缀白钙调索蛋白之间的弱相互作用。本文参考文献从牛脑、牛心中分别提 郑州大孽嘎士掌位呛文 取了钙调素蛋白和磷酸二酯酶。并通过垂直平板电泳确定了两种蛋白质的分子 量，与文献报道的两蛋白质的分子量相符。本文测量了钙调素蛋白对磷酸二酯酶 的激活活性，发现本文所提的钙调素蛋白能使磷酸二酯酶的活性提高至原来的4 倍，这说明本文所提钙调素蛋白和磷酸二酯酶有一定的纯度适中。 此外，本文还用荧光法研究了黄酮及其磷酰化后的产物在液态环境中和钙调 素蛋白的相互作用情况，以及磷酰化黄酮对c a m p 信号传导系统的干预。结果 显示磷酰化黄酮能够和钙调素蛋白发生弱相互作用，与黄酮相比磷酰化后的黄酮 对蛋白更具亲和力。并根据荧光猝灭双倒数图计算了磷酰化黄酮与钙调素蛋白之 间的结合常数。同时，磷酰化黄酮对c a m p 信号传导系统确实有一定的影响， 这是因为磷酰化黄酮与钙调素蛋白发生的弱相互作用，影响了钙调素蛋白对磷酸 二酯酶的激活作用。 关键词：荧光法；电喷雾质谱法；a 一乳白蛋白；钙调素蛋白；弱相互作用 螂州大善峨出啦位论文 a b s t 酞a c t c e l l u l a rf h n c d o n sa r eo n e n 龋g g e r e db yw e a kn o n c o v a l 翩te l l z y r n 伽s u b s t r a t e ， p m l e i n - l i g a n 莲，p 羚l 砬1 - p 蹦藏o r 鑫n 螽b o d y i 鞠耄主g e 拉i n 把l 韪徽s 1 珏o f g 遗s 黼s ，p r 。t 西n s a 辩v i t a l 吼l b s t a n c e s ，b e i n gv 髓yi m p o r t a n td u r i n gt h eo o u r s eo fr n o v e m e n ta n d d 删e l o p m e n to f1 i f e 1 m em e 浊a n i 锄sa b o u tp r 。t e i n s s 咖曲玳a n dc o n s t i t l l t e sa n d 激e n t c f a c 畦黼w i 魄s m 羹lm o l e 瓣l e s 瓣o p i c si n 钯f e s t e db yl i 是s e i o n 矗s t s 秘d c h e m i s t sa n dc l i n i cd o c t o r s r e c e n t l md u i n gt om ed e v e l o p m e n to fi i f es c i n e n c ea j l d m e d i c i n es c i n e n c e ，s 抛d i c 8o nt h ei n t e f a c t i _ o nb e 柳e e ns m a hm o l e c m e s ，e s p e c i a n y 礅丽i e 越i v e 瓣a 重lo 琏e s8 蕺d 掣。赫赫黾a v eg o m e 凝i n 琴t o 攮e 镪硅，o l 摭o f n e w 蠡l g s 。 s i n c ei t si n 打0 d u c 娃o n ，e s i m sh a ss e r v e dap o w c r f u lt 0 0 1i np r o v i d i n gw i d e n c ej n s u 删o f l h ee x i s t e n c eo fn o m c o v 酿髓n ya s s o c i a t e dm 糊m 0 1 e c u l a rc o m p d e x e si n 壤e g a s p b a s o 。 i ti sa n 鹩t a b l i s h e df a c tt h a te s t e r so fp h o s p h 蹦ca c i d h a v ew i d eb i o * a c t i v i t i e s 张dp l a ya 啦据l l ei nm a n yb i o l o 垂e 奎p f o c 铺s e s 。王n 也es t 嬲yd e s 翻b e d 主n 蝴s 也e s i s ， a m i n o 婶e n o l s 撇dd i h 、翩x 谛髓z c n e sw e r e 娃r 啦p h o 蹲h o r y l a t o db ym o 毹6 c a 蛀o no f t h oc l a s s i c a la m e m n t o d dp r o c e d u r ei no u rp r i l l l a 巧s t a g e ；t h e nt h em e 。h a n j s mo f 搬移黝幽强融w e e ns 采i c y l i c 删d8 n dd i 搬y l 砖。壤溉t ew 髂蜘d 澍b yd 嗽掣毽y i 蝴o z a t i o nm a s s 印e c 抒o m e 田 a n d3 1 pn m r ； 4 a m n o a n t 磷n e w a s凫确e r p h o s p h o 巧l a t c db ym o 砌c a t i o no fm cd a s s i c a la t l l e r o n - t o d dp r o c e d u r e ；f i n a l iy w e h 鑫v eb e e na b l ot o n l 琶f g 搴也es p 嚣o f t ka 镪粼n _ t 斑df e a c 毫i o n 姆珏a v o 黼。 e l e c 幢o s p r a yi o i l i z a t i o nr e s u l t ss h o w e d 也a tm ep h o s p h o r y l a t e df l a v o f i o i d sc o u l d f b h nn o n c o v a l 。n tc o m p l e x e sw i mm a n yp r o t e i n ss u c ha s1 y s o z y m e ，m y o g l o b i n ， b o v ；转嚣i n 翻i n 黼琏蚋巍转勰oc ，w h 曩en o 羟* v 蠢e 扛t 。c 疰n 硝锻e sw e f e 聃躐d e 圭e 蕊e d w i f hm em i x c ds o j u t i o no ft h e 幽笋i na l l dp r o t e i n s 髓ep h o s p h o 删a t e dn a v o n o i d s p o s s e s sr e l 撕v d ys 奸0 n g e ra 微n i t i e s a 1 1 df b n t ln o n c o v a l 帆t c o m p l e x e 8 、v i t ht h e 搭镦斌然黜露e a s i y 魄融酶谢旗辩蹲酗l 彀e 莲浆p 疆拙惑+ n l a c t a l b u m i ni sap r o t 西nd e s e r v e da t t e 札t i o na c c o r d i n gt oi t so o m p o s n go f a m i n oa c 豳1 1 h ei n t 啪c i o nb e t w e e i la l 础枷u f n i na n dd i m y ln a 呦一7 一y lp h o s p h a t e 闻i 州大孽啊哇掌瑚啼鲁文 s y i l 血e s i z e dw e r es t l l d i e db ye l e c 缸d s p r a yi o n i z a t i o nm 硒ss p e c 订o m e 打y ( e s i m a s s ) i t h a sb e e nf b l h l dm a t l e ya l lc o u l df o n ni 啪c o v a l 髓t 卿1 e x e sw i t h 一l a c t 以b u m i n b u tt h en a v o n i d sc o u l dn o tf b r mn o n c o v a i e n t m p l e x e sw i 缸- l a c t a l b 啪i n t h i s s h o w e dm a tt h cb i o a c t i v eo fd i 血y ln a v o n 一7 一y lp h o s p h a t cs y n t l l e s i z e dw a si m p r o v e d a n di nt l l eh e n c ei tw o u l db eap o t t i a “l l l l i b i t o l f 1 u o r c c c n c oi n t h i sp a p e rw a sd i s ou s e dt o 咖d ym ei n t e r a c t i o n sb e t 、v e c n c a l m o d u l i n( c a m )a i l dp h o s p h o r y l a t e df l a v o n o i da 1 1 df l a v o n o i d f l u o r e c e n c e p m v i d e sg o o di n f o n l l 撕o na b o u tm ep h o s p 酬a t c dn a v o n o i d s p r o t c i n si n t e r a c t i o n s m o r e o v e r ，m er a p i d i t yo fd a t aa c q u i s i t i o na l l dt 1 1 er c l a t i v es i m p l i c i t yo fi n t e r p r e t a t i o n m a k en u r e s c e n c eap o w e r f i l _ it o o lf o rs c r e 翩曲gm 吼e r o u ss m a l lm o l e c u l e - p r o t e i n c o m p l e x e s k c rw o r d s ：f l u o r e s c e l l c e ；e l e c 仃o s p r a yi o n i z a t i o nm a s s ( e s i m s ) ；1 a c t a l b u m i n ； c a l m o d l 】1 i n ( c a m ) ；n o n - c o v a l e n 郑重声明 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论 文没有剽窃、抄袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为，否则， 本人愿意承担由此产生的一切法律责任和法律后果，特此郑重声 明。 学位论文作者( 签名) ：天：迎而 ，“年月6 r 绋州大攀硬士掌位论文 第一部分绪论 1 1 生命磷化学研究 生物虽然极其复杂，但其元素组成却非常简单，只有十多种元素，磷虽然只 占1 ，但它却是体内不可缺少的中心元素。磷在体内主要以羟基磷狄石 ( 3 c a 3 ( p 0 4 ) 2 ，c a ( o h ) 2 ) 的无机盐形式存在于骨和牙齿中，占其总量的8 7 6 ， 部分磷以h p 0 4 2 。和h 2 p 0 4 - 的形式存在于血、尿和组织液中，起调节p h 和c a 、p 平衡的作用，其余的磷则以磷酸酯、磷酸焦酯和三聚磷酸酯衍生物的形式存在， 这里所有的磷都是高氧化态的五价磷与碳以p o _ c 键连接。核酸极其重要的磷酸 双酯，其中磷的含量约9 。生命体中的磷酸双酯( d n a 和r n a ) 、磷酸酐( a t p ) 控制着生命过程。核苷、核酸、糖基磷酸酯等都是极为重要的生化物质， 他们 参与物质的代谢、能量的转化、遗传的表达等几乎所有的生化过程。磷酰化蛋白 和磷酰肽也具有同样重要的生理功能，它们在酶的活性调节、蛋白质的生物合 成、开关血浆膜上某些特殊离子的微孔、调节膜的渗透性等重要生理过程中起着 关键作用 1 _ 3 l 。 作为有机磷小分子化合物，磷酰胺及其酯类衍生物大多具有广泛的生物活 性，它们参与生命有机体内的物质转化并在其生命过程中发挥着重要作用【4 弓 。 从化学意义上讲，磷参与的绝大部分生命过程，其化学本质基本上都是磷酰基转 移反应，因此，对于这样一类生物体普遍存在的磷酰基转移反应，办可应用到医 药和农药上，对一些官能团进行结构改造，以改变其活性及仿生作用，1 9 8 5 年 在西班牙上市的磷柳酯就是很好的证明【6 】；有机磷试剂在有机合成中的应用也越 来越广，新的磷试剂不断的被丌发，新的反应不断地被发现，新的机理不断地 被提出和阐明。由于磷元素的存在和参与，更使得有机磷化物复杂多变，精彩 纷呈。自1 9 4 5 年a t h e r t o n 及t o d d 等人发现a t h e r t o n t o d d 反应m 】以来，使得 合成磷酰胺及其酯类衍生物得到了极大的发展，反应中所使用的一：烷基哑磷酸酯 就是一个很有特色，颇具潜力的有机磷试剂，已广泛用于农药、塑料、药物等 的合成，并发现它在塑料工业中可作稳定剂，氧化剂等，也可用作石油添加剂、 郑州大孽埔曩士尊呲说i 文 防火剂、防腐剂等9 1 。同时人们不断地对该反应进行了改进和发展，赵玉芬院士 把该反应扩展到水相，在水、醇、四氯化碳和三乙胺存在下，使氨基酸与二烷基 亚磷酸酯直接反应，成功对氨基酸进行了磷酰化改造，数年来，她所领导的 研究小组在亚磷酸酯的制备，反应活性，亚磷酸酯在氨基的保护，羧基的活化， 小肽的合成等诸多方面开展了卓有成效的研究 1 l 】：另外b o u a l e m0 等人发现在 超声波的辅助作用下，通过a t h e r t o n t o d d 反应可以对部分醇进行磷酰化【1 2 。 1 9 4 5 年f r a t h e r t o n 发现的a t h e r t o n t o d d 反应： o o 黧二k + c c l 4 + 2 r l r 2 n h - ：3 一n r l r 2 + r l r 2 n h + c h c l 3 r o 二p h + c c l 4 + 2 r l r 2 n h 斗r o ，p n r l r 2 + r l r 2 n h + c h c l 3 b o u a l e mo 等人对醇的磷酰化 0 o 舯h 十黔k 学3 哪 我们知道，在体内，细胞功能通常是由生物分子之间的弱相互作用即非共价 作用而引起的，如酶与底物、蛋白质与配体、蛋白质与蛋白质及抗原抗体的弱相 互作用，而常规用于检测非共价复合物的方法如凝胶色谱、超速离心、红外光谱、 差示紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱、x 一晶体衍射及核磁共振等各有其明显的局 限性，随着近年来软电离技术的发展，质谱技术在蛋白质非共价复合物研究方面 显示了很大的威力，磷作为生命的重要元素，又在生命体系中始终处于一个重要 的地位，因而利用以质谱为主，其它手段为补充的方法来研究磷参与的磷酰化化 学合成反应及其磷酰化物与蛋白的弱相互作用，通过对蛋白质进行详细的分析而 加深对磷参与的弱相互作用过程的了解，对于更好的认识生命体及人类自身，促 进新药开发，都具有重要意义。 1 2 小分子与生物大分子的相互作用研究概况 生物大分子具有特别重要的生物功能。许多重大生命现象，如遗传、生长、 发育、进化、行为和病变等等，无一部依赖于生物大分子。生物大分子的功能取 决于其空间三维结构，功能的行使则主要是通过生物大分子相互作用而实现的。 这些己被生命科学发展史许多研究成果所证实。生物大分子主要是蛋白质、核酸 郑娜大孽嚏士掌位谴文 和多肽及糖类，其中蛋白质和核酸是两类最重要的生物大分子，在生命活动中， 他们彼此依存，相互制约。小分子与核酸以及小分子与蛋白质的相互作用研究已 经引起人们的广泛兴趣和关注。 1 2 1 引言 当人类基因组的研究取得重大进展时，结构生物学作为一个引人注目的领域 出现了。蛋白及蛋白质复合物的结构测定对于初步理解和认识生物化学转化途径 方面意义重大，人们希望从结构可以推出性质，结构基因组学和结构蛋白组学也 努力从结构上揭示蛋白质各组分的功能性质【”。7 1 。常规用于检测非共价复合物， 获得其结构信息的方法各有各的优缺点。凝胶色谱、超速离心、红外光谱、差示 紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱等只能表明形成复合物后蛋白质的结构发生了变 化，但提供很少或不能提供关于分子量及复合物化学计量结合数的信息。x 一晶体 衍射和核磁共振方法被用于测定蛋白质的三维结构，可以提供详细的结构信息。 但都很费时和复杂。x 一晶体衍射只有在得到合适晶体的情况下彳4 能应用，但单晶 的培养是很不容易的。核磁共振分析所用样品量很大且不能分析分子量很火的复 合物( 大于4 0 k d ) 。 荧光分析法是1 9 世纪发展起来的一种分析方法，具有灵敏度高、选择性高、 用样量少、方法简便等优点。由于蛋白质分子中含有能发光的氨基酸残基：色氧 酸( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 以及苯丙氨酸( p h e ) ，所以荧光光谱法是研究蛋白质 有效的方法。荧光光谱可以提供激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、 荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，这些参数从各个角度反映了药物小分子与 蛋白质大分子的成键和结合情况。通过对这些参数的测定，不但可以做一般的定 量分析，而且还可以推断蛋白质分子在各种环境下与药物小分子作用机理，从而 阐明药物结构与效能之间的关系，进而指导新药的开发。比如利用药物对蛋白质 内源荧光的静态猝灭，可以求出药物与蛋白质的结合常数，b r o w n 就曾用尼罗红 作为荧光探针研究n 酸性糖蛋白与药物间的相互作用，研究了药物与蛋白质的 疏水性结合，并且计算了结合常数和结合点数目，另外，把荧光衍生物与毛细管 电泳结合起来测定混合液中存在的蛋白质药物，也能取得较好效果。 郑州大掣u 曩士学位能? 文 1 2 2 蛋白质非共价复合物的电喷雾质谱( e s i - m s ) 研究进展 细胞功能通常是由生物分子之间的弱相互作用即非共价作用而引起的， e s t m s 作为上世纪末出现的新型生物质谱，已广泛应用于弱相互作用、非共价 复合物的检测和研究，所研究的复合物包括蛋白质一抑制剂、蛋白质一金属离子、 蛋白质一碳水化合物、蛋白质一肽、蛋白质一蛋白质、酶一底物、蛋白质一核酸复合 物。通过测量复合物的质量以及形成复合物的单个分子的质量，复合物的化学计 量就很容易被推导出。这里回顾了研究非共价复合物方法的实验原理，以及早期 e s i m s 在此领域的发展和应用，同时对于e s i m s 现在和将来的应用进行了时论。 电喷雾质谱( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ，e s i m s ) 是近 年来发展起来的一类新的软电离质谱仪，它的电离过程是“离子雾化”，样品溶 液通过一根毛细管进入雾化室，在加热、雾化气( n 2 ) 和强电场( 3 5 k v ) 的共同作 用下，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂 蒸发，液滴表面积缩小，导致分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相( 图 1 ) 。电喷雾离子化的特点是可产生多电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降 低到多数质量分析仪都可以检测的范围，因而大大扩张了分子量的分析范围。离 子的真实分子量可以根据质荷比及所带电荷数计算出，一般由计算机软件完成。 因此非共价复合物能够用e s i 来研究，它能够在非常接近天然溶液状态的情况下 研究复合物，能够更加真实地反映生物大分子的生理状态。 图1 电喷雾质谱电离原理 自从f e n n 研究组开始研制和发展e s i 技术以来【1 8 】，在生物学、生物化学和 生物医学等领域，e s i m s 在研究非菇价复合物方面发挥了重要作用眇2 到。由于 其具有灵敏度高、快速和质量精确度高的优点，结合物的化学计量比能够很容易 地从分子量推导出。通过改变c o n e 电压、改变p h 值和毛细管温度，可以比较不 同化合物与蛋白质的亲合力的大小f 2 3 j 。在研究探索分子识别领域，e s im s 被视 4 郑州大孽蛹融掣啼全文 为一种十分重要的手段，蛋白质和其他的生物分子通过静电、疏水、和氢键而发 生相互作用，从而形成功能性大集团，它们各个组成部分的组成及分子量可通过 e s i 质谱测定。例如：一般通过对靶蛋白形成的复合物进行观察来丌发药物，但 近来的一些例子中，大的寡聚核苷酸和它们一些潜在的抑制剂也用于药物筛选中 1 2 4 】。总之，应用e s i 研究蛋白质复合物能够在样品用量少( 皮克摩尔到亚皮克 摩尔) ，快速的情况下得到可靠的数据和较多的信息，在蛋白质非共价复合物研 究方面显示了较大的威力，它的出现为生物质谱蛋白质功能方面的研究提供了极 其重要的帮助。 1 2 2 1 此领域早期重大发现 在早期，一些解吸离子化的方法，比如：场致解吸离子化、快原子轰击、 j ：次离子质谱、热喷雾和c 2 5 2 等离子体解吸，直到今天仍是非常可行的技术， 仍用于肽及一些小蛋白分子的分析当中。但相对于e s i 和凇l d i ，它们缺乏足够 的灵敏度和必需的分子质量范围来分析大分子蛋白。不仅如此，e s l 的“柔软性”， 即它在不破坏共价键的前提下使大分子离子化，而且能够维持弱的非共价键相互 作用，所有的这些，使e s i 在研究生物复合方面显出独特的优越性。 对于电喷雾质谱来说，使它区别与其他离子化方法( 除了热喷雾) 的一个方 面是生物分子结构和它的液相状态间的关系。溶液组成是否会影响蛋白质的结构 和构象呢? 如果如此，这种影响是否会在气相继续维持昵? 虽然p h = 3 4 的溶液 经常用于肽和蛋白质分子的测定，因为在这种溶液条件下灵敏度较高，但也有人 在中性生理状态和p h 值更高的条件下进行研究 2 5 2 7 。高p h 值对电荷分布的 影响不同于低p h 值，其结果是使其朝着低电荷或高质荷比( m z ) 的方向移动。 c h o w d h u r y 等人首次阐明e s i m s 可用来检测一个蛋白质分子的液态构象 2 8 。 对于已经研究颇多的细胞色素c ，他们发现电子分布的变化随溶液p h 值变化而 变化，而p h 值与蛋白质已知构象紧密相关；l o o 等用e s i 研究了有机溶剂的浓 度( 乙腈) 的变化对蛋白u b i q u i t i n 构象的影响 2 9 ，发现u b i q u “i n 的液态构 象随有机溶剂( 例如：乙腈) 含量变化时而变化，他们还用二硫苏糖醇还原古有 硫键的蛋白，如溶菌酶和r n a a 酶，发现在还原后，蛋白的多电荷分布朝着低质 核比和高电荷的方向移动，这和蛋白更为“敞开”、“伸长”的构象相对应【3 0 一3 1 。 5 郑州大掌马| _ b 掌位论文 诸如此类的研究了表明大分子的液相结构和e s i 谱有唯一对应关系。多电荷的特 性，也就是浇，质荷比位置，绝对电荷的多少，多电荷分布的相对宽度，都跟液 相中蛋白质的结构或构象相关。这些报道也改变了那些从事此领域的研究者们的 思维方式，不再是“仅仅”测量这些大分子的分子量( 现在不是通常的努力方向) ， 更多的是用质谱仪来获得蛋白更高级结构方面的信息。从实验观点来说，e s i 溶 液最好主要用水作溶剂并使溶液接近中性。但f e n n 等人 1 8 的早期工作表明， 有机调节剂，像甲醇、乙腈、异丙醇和有机酸，乙酸、甲酸都被使用，基本上是 因为这样能产生和保持稳定的电喷雾离子流，并且，大量的蛋白质和肽系列在酸 性p h 值环境下有很好的溶解性。大量含水和中性p h 值溶液中，很难产生电喷雾， 蛋白质也易聚集而从溶液中沉淀出来。但是，经过改进的e s i 电喷雾技术( 例如： 纳升电喷物质谱 3 2 ) 能增加电喷雾的效果，这将激励人们将之应用在非共价键 复合物研究上。 1 9 9 l 到1 9 9 3 年问，一系列杂志报道了e s i 骼在研究非共价复合物时的应 用。其中一大部分作为快报的形式发表在美国化学会志上，c o r n c e l 】大学的 g a n e m 和l i 还有h e n i o n 作了第一篇报道：蛋白质f k b p l 2 和其配体f k 5 0 6 和 r a p a i n y cin 的非共价键复合物已被e s i m s 观察到 3 3 。稍后，c o r n c e 1 大学 的研究者又用e s i 观测到溶菌酶和n 一乙酰葡萄糖胺及其与裂解产物所形成的复 合物 3 4 。这些早期报道不但建立了e s i _ m s 方法的可行性，而且还设计了实验 以确保观察的有效性。有人提出用控制实验条件的方法来观察e s i 过程，以考察 其产生气相加合物来代替液相中具有专一性的复合物的可能性。因此，建立能真 实反应液相中所形成的复合物的e s i 方法是十分重要的。以往的这些文章也推动 了生物学、生物化学和药物化学向运用e s i m s 技术的方向发展。k a t t a 和c h a i t 一篇关于血红素( p r o t o p o r p h y r i ni x ) 和肌红蛋白间非共价键的文章也是e s i m s 应用的一个罩程碑( 3 5 。肌红蛋白是一种很早就被e s i 一 i 【s 研究很透的蛋白，常 作为e s 卜m s 参考和使用的重要化合物。在早期的e s l 一m s 质谱测试中曾有过血红 素加合到肌红蛋白上的记录 3 6 3 7 。然而，p h 值低于3 5 和有机溶剂含量较高 的溶液环境提高了肌红蛋白复合物的变性程度。k a t t 和c h a i t 的报道显示了从 p i 悻3 5 5 到p h = 3 9 0 的水溶液中测得的肌红蛋白谱图截然不同。肌红蛋白在p h = 3 5 5 时完全变性，谱图显示这时只有脱去辅基的蛋白质的一组多电荷峰。p h 6 升到3 9 0 时，就允许蛋白质适度折叠到较“自然”或非变性状态，它同时以两 种状态( 脱去辅基与未脱辅基) 存在；p h 在4 4 或更大时它完全以自然状态存 在，此时全部蛋白以非共价键的形式和血红素结合。因为此蛋白在工业上可大量 获得，肌红蛋白在一些情况下，还被用作“调谐”化合物，优化实验条件，提高 灵敏度，同时也用来观察非共价键蛋白质复合物。 基于e s i 的许多优点，美国一实验室已致力于发展质谱方法来研究生物大分 子非共价复合物，以便寻找一种抗癌剂。他们的策略是从合成的或天然的资源中 筛选能够与致病蛋白非共价键结合的抑制剂，以便来干预致病机理【3 ”。该实验 室自1 9 9 0 年开始该项目以来，已用e s i 研究了r a s 一蛋白和其配体g d p l 3 9 】和g t p 【4 0 j 的非共价相互作用。在最近的工作中，他们用e s i 检测到了r a s g d p 和有机抑制 剂s c h 5 4 2 9 2 和s c h 5 4 3 4 l 的三元复合物【4 ”，在三元复合物r a s g d p - s c h 5 4 2 9 2 的 研究中，他们还确定了药物和r a s 蛋白的结合位点。从上述研究可以看出，e s l m s 作为研究蛋白质非共价键复合物的工具，具有很好的应用前景。 g 删和他的合作者用e s i 一惦研究过1 4 2 】d n a d n a 相互作用，或d n a 双螺旋 体。s m it h 研究组观察到一个2 0 个碱基的双螺旋d n a 【4 3 ，更大的d n a 曾用傅立 叶变换离子回旋共振质谱计测量过【“4 5 1 。也有人用带有特殊测试装置的质谱研究 分子量大于l m d a 的双螺旋d n a 【4 6 】。有关r i b o n u c l e a s es 的文章强调了使实验 条件最佳化的重要性 4 7 。4 8 1 ，该核糖核酸酶是由2 k d as 一肽和ll 。5 k d as 一蛋白通 过非共价键作用而形成，此s 一蛋白质和s 一肽形成的复合物对溶液的p h 值、温 度和气相解离都高度敏感。控制碰撞解离的能量有利于非共价复合物的检测，比 如碰撞诱导解离能量，毛细管表面温度和逆流气温度需要降到最小以便能最好地 检测到复合物。直到今天许多研究过的气相复合物对解离过程高度敏感。然而， 需要对气相复合物脱溶剂化，也就是说，在质谱检测之前从分子复合物中脱去溶 剂分子，但同时需要保持复合物的完整性。在很多方面，这些早期报道为以后的 e s 卜m s 研究非共价键复合物提供了坚实的实验基础，仪器和技术方面的改进已 经允许我们高水准( 例如：高分辨率、高灵敏度) 测试大分子复合物。 e s 卜m s 通过运用较大范围的j l l z 分析器已经观察到较大的蛋白质复合物。 在9 0 年代早期，电喷雾电离质谱仪普遍采用四级杆质谱分析法，它通常测量有 限的m z 范围，一般低于3 0 0 0 。象蛋白一蛋白四级结构复合物这样的多电荷离 郑州，“尊n b 拳位论文 子复合物，在商珊z 区表现出相对较少的荷电量，这是因为一个生物分子在质谱 图中表征的荷电量跟它在液态中的球形结构相关。一个低电荷状态的狭窄的电荷 分布状态再现了天然蛋白质复合物高度有序结构。通常认为这是由于暴露出来的 能离子化的位点较少，或者是对于个紧密的结构，库仑约束力限制了它的荷电 量【19 1 。 为了获得更宽的m z 范围，s m i t h 等人用经过改装的四级秆质谱研究了四聚 物的蛋白质，象血红蛋白、抗生物素蛋白和伴刀豆球蛋白a ，在此条件下，能观 察到m z 高于1 0 0 0 0 的离子【1 9 1 。l o o 等人用一个装有e s i 源的磁质谱研究了 a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e 和p y r u v a t ek i n a s e 形成的蛋白质复合物f 4 9 _ 5 。图3 显 示的便是带有离子的高六聚物的大肠杆菌i n o r g a n i cp y r o p h o s p h a t a s e 在m z 高于5 0 0 0 时的e s i 质谱图。k e ns t a n d i n g 的m a n i t o b a 实验室首次展示了应用 t o f 分析器检测通过e s i 源的大蛋白复合物离子52 1 。虽然像四级离子阱 5 3 1 和 f t i c r 质谱仪，目前在复合物测定上相对于其他系统表现出特别的优势，但是 e s i t o f 质谱仪已成为研究非共价蛋白复合物的个占有绝对优势的平台，高 m z 区，高灵敏度和分辨率，使得t o f 分析仪成为研究大的非共价复合物的理想 工具。 1 2 2 2 近来的应用 e s i 一鹇所研究的生物化学类型的范围相当宽。在蛋白质领域，质谱已探测 了它们与金属离子、辅酶、抑制剂、其他蛋自质、多糖、寡聚核苷酸的相互作用。 1 2 2 2 1 金属离子和肽的复合物 金属离子在许多生物过程都起着非常重要的作用。它们通过触发机理、 稳定结构及控制氧化还原反应来起作用。a m s t e r 等人在红毒扁豆硷型蛋白 质的金属结合性质，以及蛋白质一蛋白质相互作用的影响和金属的氧化状态方 面作了出色的研究【5 4 】。在所有的二价金属离子中，钙离子的作用最为重要。 借助于细胞膜内外的浓度差，钙离子在调节细胞过程中常充当第二信使的作 用。其调节细胞的过程常涉及钙结合蛋白质【5 s _ 5 9 1 。e f _ h a n d 蛋白质结合钙的 性质，如：钙调素和它们的靶肽已成为e s i m s 研究的对象6 0 。6 2 1 ，v e e n s t r a 等用电喷雾质谱研究了钙调蛋白和两个肽的非共价键复合物。一个肽是钙调 8 郑州大掌硬士掌位谴使 素依赖的蛋白酶ii 的钙调素结合区，一个是毒蜂肽，只有在钙离子存在时， 钙调素和两个肽及钙离子形成1 ：l ：4 ( 钙调素：肽：钙离子) 的三元复合物。 同时他们还证明三元复合物的稳定性与电喷雾质谱的源温有关。图3 显示了 钙调素一蜂毒肽复合物的一个正离子质谱，分子质量测量说明了它结合四个 钙离子的特性。n e m i r o v s k i y 【6 3 j 等用串联质谱( f a b 和e s i ) 研究了以兔肌钙 蛋白的钙离子结合位元点i i i 为模型的一系列小肽和钙离子复合物的高能和 低能碰撞活化裂解行为。电喷雾质谱中产生的钙离子肽段碎片有钙离子结合 控制，提供了钙离子结合位点的信息。表明钙离子结合位点涉及到1 个天冬 氨酸、一个谷氨酸和一个谷氨酰氨。蛋白质一核酸的相互作用发生在许多细 胞组织中，包括转录和转译过程。h ua n dl o o 【6 4 悃电喷雾质谱研究了小白蛋 白和钙调素与钙离子的化学结合计量数及其协同关系。研究发现小白蛋白的 两个钙离子结合位点与钙离子的结合有很强的协同性。在钙离子浓度高时， 钙调素可以和四个钙离子结合。第三个钙离子和第四个钙离子与钙调素的结 合有很强的协同性。钙调素分子中与钙离子结合的两部分也有很强的相互作 用。 例3 牛钙调蛋白( m 仁1 6 9 5 2 卜一蜂毒素( m 仁2 8 4 5 ) 复合物结合四个钙离子的e s i m s 谱图 质谱通过纳升电喷雾和q f 质谱采集( m i c r o m a s ，b e v e r l y ，m a ) 1 2 2 2 2 蛋自质和寡核苷酸的复合物 t r p 抑制蛋白质的e s i 质谱和它特定的d n a 操作基因被检测到，更说明了此 方法对特定相互作用的意义f 6 5 】。只有在结合位点间有合适空间的d n a 序列才能 跟蛋白质组合成复合物。n a y l a r 研究小组曾发现了影晌d n a 与配体结合的因素， 9 郑州大掌习l 士掌衄呻e 突 这些因素直接影响到这些配体是增强还是抑制基因转录6 6 1 。 蛋白质和d n a 的相互作用涉及到细胞过程的许多方面，因此具有重要的意 义。化学结合计量是蛋白质和d n a 相互作用的一个重要特性。当一个样品中含有 不同的化学结合计量数或结合后分子量差别很小时，化学结合计量的测定就更为 困斛6 7 1 。电喷雾质谱由于具有高灵敏度和高质量准确度的优点，因此可以很准 确的测定其化学结合计量。c h e n g 等用电喷雾质谱研究了从细菌噬菌体分离的 g e n e v 蛋白和几个寡核苷酸的化学结合计量数。在噬菌体的复制过程中g e n ev 蛋 白起稳定单链d n a ( s s d n a ) 的作用，并将合成的噬菌体d n a 从双链转变为单链。 已知g e n e v 蛋白在生理条件下主要以二聚体存在，k d 一1 2m 。在p h 7 01 0 i i l m 乙 酸氨溶液中，无论是正离子还是负离子电喷雾质谱，g e n e v 蛋白都主要以二聚体 存在。在负离子条件下，形成了最高所带电荷为一8 的四个多电荷峰。在p h 3 o5 0 i i l m 乙酸溶液中，形成了最高带+ 1 4 电荷的1 1 个多电荷峰。这与酸致蛋白质变性的 结果一致。将不同浓度比的g e n e v 蛋白和1 6 m e r 的寡核苷酸在p h 7 ol o 一5 0 i i l m 的乙酸氨中反应l o 分钟后进行电喷雾质谱分析，结果表明g e n ev 蛋白和1 6 m e r 寡核苷酸可以形成不同化学结合计量的非共价键复合物。主要是4 ：1 ( g e n e v ：1 6 m e ri ) ，当寡核营酸过量时，有少量2 ：l 的复合物存在。 c h e n g ”1 等同时用电喷雾质谱研究了g e n ev 蛋白和d ( p t ) 。、d ( p t ) 。d ( p t ) ，。三个同源寡核苷酸的化学计量结合数。当g e n ev 蛋白的摩尔浓度和d ( p t ) 。、d ( p t ) 。、d ( p t ) ，。混合物的总摩尔浓度比为1 ：1 时，d ( p t ) 。主要 形成4 ：l 的复合物，而d ( p t ) 。和d ( p t ) 。；主要形成2 ：1 的复合物。当g e n ev 蛋白的摩尔浓度和d ( p t ) 。、d ( p t ) 。d ( p t ) 。混合物的总摩尔浓度比为2 ：l 时，d ( p t ) 。和d ( p t ) 。形成4 ：1 的复合物，而d ( p t ) 。仍形成2 ：l 的复合物。 说明g e n ev 蛋白和d ( p t ) 。的主要化学结合计量数为2 ：l ，和d ( p t ) 。的为4 ：l ， 而和d ( p t ) 。的化学结合计量数则根据寡核苷酸和g e n ev 蛋白的相对浓度巧i 同 为4 ：l 或2 ：1 。 有文献报道g e n ev 蛋白与p 0 1 y ( d a ) 和p o l y ( d t ) 的亲和力相差两个数量级。 c h e n g ”等用电喷雾质谱也得到了相同的结论。将g e n ev 蛋白和d ( p t ) 。、d ( p a ) 。的混合物在p h7 0l o 础乙酸氨溶液中进行电喷雾质谱分析。当d ( p 1 1 ) 。 和d ( p a ) 1 4 摩尔浓度相同时，主要是g e n ev 蛋白和d ( p t ) 1 3 形成的2 ：1 的非共 郑州大孽唾士学位 鲁交 价键复合物。几乎没有g e n ev 蛋白和d ( p a ) 1 4 形成的复合物。当只有d ( p a ) 1 4 时， g e n ev 蛋白和d ( p a ) 1 4 可以很容易形成2 ：l 的复合物。当d ( p t ) 1 3 和d ( p a ) 1 4 摩尔浓度为2 ：l o o 时，g e n ev 蛋白和d ( p t ) 1 3 形成的2 ：1 复合物的丰度是g e n e v 蛋白和d ( p a ) 1 4 形成的2 ：l 复合物的8 倍。和浓度一起考虑，则g e n ev 蛋白 和d ( p t ) 1 3 的亲和力是和d ( p a ) 1 4 亲和力的4 0 0 倍。可见电喷雾质谱在研究蛋 白质和d n a 相互作用时有巨大的优越性。 1 2 2 2 3 蛋白质一蛋白质相互作用 电喷雾质谱在研究蛋白质四级结构方面显示出了巨大的能力。蛋白质复合物 有同源和异源两种。质谱根据质量的差别可以区分这两种复合物。b r o o k h a v e n p r o t e i nd a t a b a n kb r o o k h a v e n 蛋白质数据库的所有蛋白质中，3 3 的形成了多 聚体复合物【6 9 】。在这些复合物中，8 0 的形成了二聚体或四聚体。电喷雾质谱非 常适用于鉴定蛋白质的亚基数目。 l 0 0 【7 0 肄报道了h i v 整合酶突变体i nf 1 8 5 k 同源二聚体的电喷雾质谱研究。 h i v 整合酶在h i v 病毒复制过程中起非常重要的作用，有可能成为一个新的抗爱 滋病药物的靶点【7 1 1 。由于眦v 整合酶的溶解度很小，因此不易搞清它的构象。 i nf 1 8 5 k 是它的一个突变体，溶解度增大，但不影响其活性。研究表明，h t v 整合酶以二聚体的形式起作用，与晶体结构是一致的 7 2 1 。在p 1 2 5 的溶液中( 乙 腈：水= 2 ：l v v ，含3 乙酸) ，i nf 1 8 5 k i nf 1 8 5 k 的电喷雾质谱图是单体的多电 荷峰，所带电荷从+ 1 2 到+ 2 2 ，共1 1 个多电荷峰。转换后的分子量为1 8 17 2 0 。 在酸性及有有机溶剂