（植物学专业论文）转ahbadh、pscat基因烟草和杨树的获得及其抗性分析.pdf

英文缩写符号及其中英文对照表 英文缩写 英文名称中文名称 o h a - n a a a b a a c t a t p 2 ，4 - d 岳b a a m p a p x b i s b p b s a c a m v 3 5 s c d n a c e f c h l c r b c 1 a b c 0 2 d a p i d 担2 0 d e p c d n a 国q t p d t t e c o i l e b h y d r o x y lr a d i c a l a - n a p t h a l e n ea c e t i ca c i d a b s c i s i ca c i d a e r y l a m i d e a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e 2 ，4 - d i c h l o m p h e n l x y a c e t i a c i d 6 - b e n z y l a d e n i n e a m p i c i l l i n a s e o r b a t ep e r o x i d a s e n n - m e t h y l e n eb i s a c r y l a m i d e b 蹴p a i r b o v i n es e r u l na l b u m i n 3 5 sp r o m o t e ro f c a l i f l o w e rm o s o i ev i r u s c o m p l e m e n t a r yd n a c e f h - i a x o n es o d i 眦 c h l o r o p h y l l c a r b e n i c i l l i n c e t y l t r i m e t h y l a m m o l l o n i u mb r o m i d e c a r b o nd i o x i d e 4 ，6 - d i a m i n o - 2 - p h e n y li n d o l e d i s t i l l e d a n td e i o n i z e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o c y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d i e t h i o t h r e i t o l e s c h e n e h i ac o f f e i b i d i u mb r o m i d e 羟基自由基 洳萘乙酸 脱落酸 丙烯酰胺 腺苷三磷酸 2 ，4 二氯苯氧乙酸 每苄基腺嘌呤 氨苄青霉素 抗坏血酸过氧化物酶 亚甲基丙烯酰胺 碱基对 牛血清蛋白 花椰菜花椰病毒3 5 s 启动子 互补d n a 头孢曲松钠 叶绿素 羧苄青霉素 十六烷基三乙基溴化铵 二氧化碳 4 , 6 - - 氨基2 - 苯基吲哚 重蒸水 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸 二硫苏糖醇 大肠杆菌 溴化乙锭 英文缩写英文名称 中文名称 e d l a f o v 瞪m g u s 口t g k a c k m l b m d a m o p s m r n a m s n a 3 p 0 4 n a o a c n p t 0 2 n g e p b s p c r p n p si p s l i p v p r j f r n a r n a s e a r p m s a e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c c t i ca c i d乙二胺四乙酸 i n i t i a lf l u o r e s c e n c eo f p s i nd a r k n e s s暗适应条件下p s i i 初始荧光 m a x i m a lp si ie i t i c i e n c ya to p e nc e n t e r s暗适应下p s 最大光化学效率 i nt h ea b s e n c eo f n p q p - g l u c u r o n i d a s e 8 葡糖醛酸酶 i s o p r o p y l t h i o p d g a l a e t o s i d e异丙基- p d 硫代半乳糖苷 k a l i u ma c e t a t e 醋酸钾 k a n a r a y c i n 卡那霉素 l u r i a - b e r t a n im e d i u ml b培养基 m a l o n d i a l d e h y d e 丙二醛 3 - ( n - m o r p h p l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i c3 - n 吗啉代丙磺酸 m e s s a g er n a信使r n a m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i am s 培养基 s o d i u mp h o s p h a t e 磷酸钠 s o d i u ma c e t a t e 醋酸钠 n e o m y c i np h o s p h o t r a n d f e r a s ei i新霉素磷酸转移酶 s u p e r o x i d ea n i o n r a d i c a l超氧阴离子自由基 p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 p h o s p h a t eb u f f e r磷酸缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 n e tp h o t o s y n t h e t i cr a t e净光合速率 p h o t o s y s t e mi ，光系统i p h o t o s y s t e m i 光系统 p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e聚乙烯吡咯烷酮 r i f a m p i c i n 利福平 r i b o n u c l e i ca c i d核糖核酸 r i b o n u e l e a s ea核糖核酸酶a r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 转分钟 s a l i c y l i ca c i d水杨酸 英文缩写 英文名称 中文名称 s d s s d s p a g e s s d n a t e m e d s 1 e t t e t r i s s o d i u md o d r 粥y ls u l f a m s d s p o l y - a c r y l a m i d cg e ld e c t r o p h o r e s i ss d s s a l m o ns p e r md n a n ，n n n - t e t r a m e t h y lc t h y l e n e d i a m i n e s o d i u mc h l o r i d e , t r i s h c i ，e d t a b u f f e r t r i s h c i ，e d t a b u f f e r t r i s h y d r y x y m c t h yl a m i n o m e t h a n e 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 鲑精d n a n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 n a c i ，t r i s h ( 2 1 ，e d t a , t r i t o n x - 1 0 0 。 t r i s h c l 、e d t a 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： e t 期：互生 山隶农业大学博士学位论文 转么j i l 删a 酞p s c a t 基因烟草和杨树的获得及其抗性分析 院( 系) ：生命科学学院 专业：植物学 研究生：蔺娜 指导教师；刘家尧教授 中文摘要 植物生长发育经常遇到的逆境以干旱、盐碱等最为严重，而干旱、盐碱胁迫通常伴 随着强烈的光照，在干旱强光等逆境胁迫下会导致植物的渗透胁迫和氧化胁迫伤害，使 叶绿体的结构和功能遭到破坏，以致光合作用大大降低。如果通过基因工程的手段将合 成甜菜碱的关键酶基因和参与清除活性氧中过氧化氢的过氧化氢酶基因共同导入植物， 发挥抗氧化、渗透调节和保护光合中心大分子蛋白质功能，将能有效的提高植物抗早， 抗高光强和耐盐等抗逆能力。因此，本研究将甜菜碱醛脱氢酶基因和过氧化氢酶基因转 入烟草和杨树。转基因植物的获得也可为探讨植物抗逆的生理和分子机制以及具有高抗 逆性状的转基因杨树的实际应用打下良好的基础。 主要实验结果如下： 1 将来自豌豆的过氧化氢酶基因p s c a t 与叶绿体r u b p 羧化酶小亚基转运肽 ( r b c s 3 ) 基因( 聊的融合基因与来自山菠菜的甜菜碱醛脱氢酶基因a h b a d h 基因构建 在同一个表达载体中，并且使其分别具有独立的表达框，然后利用农杆菌介导的叶圆盘 转化法将这两个基因导入烟草和杨树，并利用叶绿体r u b p 羧化酶小亚基转运肽的作用 使过氧化氢酶特异表达在叶绿体中。在含有抗生素的培养基上筛选获得单转a h b a d h 烟 草和杨树、单转p s c a t 烟草和杨树以及同时转这两个基因的烟草和杨树各3 0 多个株系， 并对其进行了分子生物学的鉴定和生理指标的检测。 2 p c r 、n o r t h e r nb l o t 、植株总蛋白w e s t e r nb l o t 和叶绿体蛋白w e s t e r nm 0 t 结果表 明，目的基因已经整合到烟草和杨树的基因组中，并能正常表达，且在叶绿体r b c s - 3 转 运肽的作用下能定向进入叶绿体中。 3 在2 0 p e g e o o o 模拟干旱条件下，不同转基因的植株( 包括单转a h b a d h 的烟草 和杨树，单转p s c a t 的烟草和杨树，以及同时转这两种基因的烟草和杨树) 的质膜损 伤程度、升绿素降解程度和p s i i 的损伤程度都小于野生型，表明转a h b a d h 和p s c a t 提高了植物的抗旱性。另外，结果表明同时转a h b a d h 和删r 植株豹抗旱性要高于 转a h b a d h ， 翻r 基因烟草和杨树的获得及其抗性分析 单转a h b a d h 和单转p s c a t 的植株 4 用不同浓度百草枯处理模拟氧化胁迫，结果表明不同转基因植株的抗氧化性高 于野生型植株的抗氧化性，且转双价基因植株的抗氧化性高于单转a h b a d h 和单转 删r 的植株。 5 经2 0 0m m n a c i 和高温，低湿胁迫实验发现，不同转基因植株的抗逆能力均高于 野生型植株，且转双价基因的植株高于单转a h b a d h 和单转p s c a t 的植株。 总之，转a h b a d h 和转p s c a t 提高了转基因植株的抗氧化酶活性和渗透调节能力， 从而提高了转基因植株的抗旱、抗氧化、耐盐和耐高低温的能力。且同时过量表达 a h b a d h 和删r 的植株更有效地提高了其抗逆性。 关键词：烟草，杨树，a h b a d h , 删l 植物抗逆性 2 山东农业大学博士学位论文 o v e r e x p r e s s i n ga h b a d ha n dp s c a tg e n e sc a ne n h a n c et h e a d v e r s er e s i s t a n c eo ft r a n s g e n i ct o b a c c oa n dp o p l a rp l a n t s d e p a r t m e n t ：l i f es c i e n c e s m a j o r ：。b o t a n y p h d c a n d i d a t e ：l i nn a s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r l i uj i a - y a o a b s t r a c t t l l ep l a n tg r o w t hi sa f f e c t e db ym a n yf a c t o r s e s p e c i a l l yd r o u g h ta n ds a i lw h i c ha r eu s u a l l y c o m p a u l e db yt h es t r o n gs u n s h i n e i na d d i t i o n ，d r o u g h ta n ds a l i n aw i t ht h es 血o n gs u n s h i n e w i l lh u r tr e g u l a t i n ga b i l i t yo fo s m o t i cp r e s s u r ea n do x i d a t i n n - r e s i s t a n c ea b i l i t yo ft h ep l a n t a n di nt u r nd e s 缸o yt h eo r g a n i z a t i n na n df u n c t i o no fc h l o r o p l a s t , 阳d l 坞i n gp h o t o s y n t h e s i so f p l a n tg r e a t l y i fw el 啪t h et r a n s f o r m a t i o no f a h b a d hi n t op l a n ta n do v e r e x p r e s s i n gi nt h e p l a n t , u t i l i z i n gt h ef u n e l i o no f o x i d a t i o n - r e s i s t a n c e ，o s m o s i sr e g u l a t i o na n dp r o t e i np r o t e c t i o n ， w ec a ne n h a n c ep l a n td r o u g h t - r e s i s t a n c ea b i l i t y ，r e g u l a t i n ga b i l i t yo fo s m o t i cp r e s s u r ea n d o x i d a t i o n - r e s i s t a n c ea b i l i t y t h e r e f o r e i nt h i ss t u d y , a l b a d ha n dp s c a tg e n e sw 髓e c o n s t m e t e di ns a m ee x p r e s s i o nv e c t o ra n dt r a n s f e r r e di n t ot o b a c c oa n dp o p l a r , r e s p e c t i v e l y , t o e n h a n c et h ep l a n ta d v e r s er e s i s t a n c e 1 1 1 em a i nr e s u l ti n c l u d e s ： 1 w bc o n s t r u o e dt h ef u s i o ng e n eo fp s c a ta n dt r ( r b e s 3 g e n e ) a n da j 耻m d 日i n t oa s a m ee x p r e s s i o nv e c t o rw i t hi n d e p e n d e n to r f s ，t h a nw a n s f e r e dt h ef u s i o ng e n ei n t ot o b a c c o a n dp o p l a rm e d l a rb ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e m s ，r e s p e c t i v e l y m o r et h a n3 0p l a n t sw e i e s e l e c t e dt os q l r v i v eo nt h ec u l t u r em e d i u mw i t ha n t i b i o t i 馏w h i c hi n c l u d e st o b a c c oa n dp o p l a r p l a n t sw i t hs i n g l ea h b a d hg e n e w i t hp s c a tg e n eo rw i t hb o t ht h e s et w og e n e s 1 h e m o l e c u l a rb i o l o g i c a lt c s t sa n dp l a n tp h y s i o l o g i c a la n a l y s i sw e r oc a r r i e do u tt ov e r i f yt h e s e g e n e - t r a n s f e r r e dp l a n t s 2 o b j e c tg e n e sh a db e e ni n t e g r a t e di n t op l a n tg e n o m ea n dc o u l de x p r e s sr e g u l a r l y , w h i c h v e r i f i e db yp c n o r t h e r nb l o ta n dw e s t e r nb l o t t ke x p r e s s e de l l z y m ec o u l db et r a n s f e r r e d i n t oc h l o r o p l a s td i r e c t i v e l yw i t ht h eh e l po f r b e s 3t r a n s f e r r i n gp r o t e i n 3 u n d e r2 0 p e g 6 0 e 0 , t h ed a m n i f i c a f i o no fp l a s m a l e m m a , d e g r a d a t i o nd e g r e eo f c h l o r o p l a s ta n dd a m n i f i c a t i o nd e g r e eo fp s i ii nt h et r a n s g e n i ct o b a c c oa n dp o p l a r ( i n c l u d i n g t o b a c c o a n d p o p l a r p l a n t s w i t hs i n g l e a h b a d h g e n e ，w i t h p s c a t g e n e o r w i t h b o t h t h e s e t w o g e n e s ) a r ea l l l o w e rt h a nt h o s ei nw i l dt y p et o b a c c oa n d1 3 0 p l a t , w h i c hi n d i c a t e dt h a ta j 蛔h d 日 a n dp s c a tg e n ea c t u a l l ye n h a n c e dt h ep l a n ta d v e r s i t y - r e s i s t a n ta b i l i t y i na d d i t i o n , t h e a d v e r s er e s i s t a n c ea b i l i t yo ft h ep l a n t sw i t hb o t ha h b a d ha n dp s c a t g e n ea r eh i g h e rt h a n t h a to f t h ep l a n t sw i t ho n l yo n e g c n e 4 t r e a t e dw i t hp a r a q u a t , t h eo x i d a t i o n - r e s i s t a n c ea b i l i t yo f t h r e ek i n d so f t r a n s g e n i cp l a n t s a r eh i e i 慨t h a nt h a to fw i l dp l a n t s a n dt h er e s i s t a n c eo ft h ep l a n t sw i t hb o t ha h b a d ha n d p s c a t g e n ea r eh i g h e rt h a nt h a to f t h ep l a n t sw i t ho n l yo n eg e n e 5 t r e a t e dw i t h2 0 0m mn a c l t h es a l t - r e s i s t a n c ea b i l i t yo f t h r e ek i n d so f t r a n s g e n i cp l a n t s a l eh i g h e rt h a nt h a to fw i l dt y p ep l a n t s a n dt h er e s i s t a n c eo ft h ep l a n t sw i t hb o t ha h b a d h a n dp s c a t g e n ea r eh i g h e rt h a nt h ep l a n t sw i t ho n l yo n eg c n e 3 转a i 扭a d h p s c a t 基因烟草和杨村的获得及其抗性分析 i nc o n c l u s i o n , t r a n s g e n i ep l a n t sw i t ha h b a d ha n dp s c a t g e n ee n h a n c e dt h er e g u l a t i n g a b i l i t yo fo s m o t i cp r e s s u r ea n do x i d a t i o n - r e s i s t a n c ea b i l i t y , i nt u r ne n h a n c e dt h ea b i l i t yt o r e s i s ta r i d i t y , s a l t , h i g ha n dl o wt e m p e r a t u r e a n dc o - o v e r e x p r e s s i n ga h b a d ha n dp s c a t g e n ec a n e n h s l l c et h ea d v e r s er e s i s t a n c ea b i l i t ym o r ee f f i c i e n t l y k e yw o r d s ：t o b a c c o ，p o p l a r , a h b a d h ，p s c a t , p l a n ta d v e r s er e s i s t a n c e 4 山东农业大学博士学位论文 1 日吾 不良环境会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性 抑制，严重时甚至引起不可逆伤害，导致整个植株死亡( 余玲，2 0 0 2 ) 。水资源短缺以及 土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题，全球约有2 5 的耕地受到盐害威 胁，6 5 的耕地为干旱、半干旱地区。在我国，仅2 0 0 1 年华北、西北和东北地区的4 6 6 7 万h m 2 稻的种植面积就因为缺水而减少了5 3 3 万h m 2 。在自然条件下，由于环境胁迫而 严重影响了作物生长发育，其遗传潜力难以发挥，干旱、盐渍不仅影响了作物的产量， 而且限制了植物的广泛分布，因此，提高农作物及林木的抗旱、耐盐能力已经成为现代 植物研究工作中急需解决的关键问题之一( 张彤，2 0 0 5 ；刘国花，2 0 0 3 ) 。 由于植物的胁迫耐性大多属于数量性状，现有可利用的种质源缺乏，采用常规育种技 术改良植物的胁迫耐性，耗时费力，困难大，至今尚未培育出真正的耐胁迫品种( 刘艳 芝，1 9 9 8 ) 。分子生物学的发展，使人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子 水平上认识植物对逆境胁迫的耐( 抗) 性机理。经过大量研究，现今人们已在植物抗逆 的形态学、生理生化、生物物理、生态及细胞遗传学等方面取得了广泛进展，并已克隆 到来自微生物等有机体的编码生化代谢关键酶和逆境胁迫信号传导的一些重要基因 ( h i b i n o 。2 0 0 1 ) 。 1 1 植物的抗旱性 干旱是植物生长发育经常遇到的主要逆境之一，有些植物在长期的干旱适应过程中 形成了一些耐旱的形态和生理生化特征。植物根系是植物直接吸收水分的重要器官，它 对植物的耐旱功能具有至关重要的作用。纵深发达的根系系统可使植物充分吸收利用贮 存在土壤中的水分，使植物度过干旱期( l i uy ，1 9 9 5 ) 。一般认为抗旱性强的植物，根 水势低，利于水分吸收。作为同化和蒸腾器官的叶片，在长期干旱胁迫下形态结构会发 生变化，其形态结构的改变与植物的耐旱性有着密切的关系。主要表现在：叶片表皮外 壁有发达的角质层，角质层是一种类质膜，其主要功能是减少水分向大气散失，是植物 水分蒸发的屏障。厚的角质层可提高植物的能量反射与降低蒸腾，从而增强植物的抗旱 性( 杨静慧，1 9 9 6 ) ；具有表皮毛，可以保护植物避免强光照射，减少蒸腾；具有大的 栅栏组织海绵组织比和小的表面积，体积比，发达的栅栏组织，分布于叶的背腹两面， 可使干旱缺水植物萎蔫时减少机械损伤。而小的表面积体积比，可以最大程度减少水分 转a h b a d h ，p s c a t 基因烟草和杨树的获得及其抗性分析 丧失。在生理生化方面，水分胁迫下植物会积累有机分子相溶性溶质或渗压剂，有效地 提高植物的渗透调节能力，增强植物的抗逆性。逆境胁迫对植物的伤害之一是产生活性 氧，对细胞造成损伤，植物体内形成了一套清除系统。在一定程度上能有效清除活性氧， 能保证细胞正常的生理功能。l e a 蛋白是指胚胎发生后期种子中大量积累的一系列蛋白 质，在植物细胞中具有保护生物大分子，维持特定细胞结构，缓解干旱、盐、寒等环境 胁迫的作用( b r a y ，1 9 9 3 ) 。 编码植物抗旱关键基因的克隆 ( 1 ) 与脯氨酸合成酶相关的基因，即脯氨酸合成酶基因族。其中包括了吡咯啉5 羧酸合成酶基因p 5 c s 及p v a b 2 ，吡咯琳- 5 - 羧酸还原酶基因p 5 c r 及p p r o c i ，榆钱菠 菜脯氨酸转运蛋白基因a h p p r o t l ，编码s 腺甘甲硫氨酸合成酶基因s a m l 和s a m 3 硫醇蛋白酶的r d l 9 a 、r d 2 1 a 基因等。将脯氨酸合成途径中的第1 个酶- p 5 c s 基因转 入烟草和水稻后，转基因植株中p 5 c sm r n a 的含量明显提高，转化植株的耐早能力也 比对照有所增加( k i s h o r ，1 9 9 5 ) 。此外，大量研究也表明，在干旱胁迫条件下，p 5 c s 水平提高，胁迫解除，p 5 c s 基因表达水平下降( p e n g ，1 9 9 6 ) 。乙酰胆碱由胆碱单 加氧酶( c h o l i nm o n o o x y g e n a s ec m o ) 或胆碱脱氢酶( b e t a i n ea l d e h y d e d e h y d r o g c n a s e ，c d h ) 、甜菜碱醛脱氢酶( b e t a i n a l d e h y d ed e h y d r a g e n a s e ，b a d h ) 两 步催化合成甜菜碱。此外，乙酰胆碱氧化酶( c h o l i no x i d a s e ，c o d ) 因为可以把乙酰 胆碱一步合成甜菜碱而日益受到人们的关注。目前c o d a 基因已从水稻、拟南芥中成功 克隆。s a k a m o t o 等( 1 9 9 8 ) 用编码c o d a 基因转化水稻，获得两种分别在细胞的两个不 同部位表达的乙酰胆碱氧化酶转化株，这两种转化株的耐盐、抗旱以及耐低温的能力均 有所增强( s a k a m o t o ，1 9 9 8 ) 。 ( 2 ) l e a 基因、水孔蛋白基因及脱水素基因。x u 等( 1 9 9 6 ) 用来自大麦的一种l e a 蛋白基因h v a l 转化水稻，使其在水稻中过量表达，结果发现水稻的耐旱能力明显提高， 且提高幅度与l e a 蛋白的表达量一致，为l e a 蛋白在植物耐旱、抗盐过程中的作用提 供了直接证据( x u ，1 9 9 6 ) 。棉花1 1 个l e a 相关基因分别是d 1 9 、b 1 9 、d l l 、t a b 、 1 6 a d 、h v 4 1 、d 1 1 3 、如2 、d 2 9 和d 3 4 ，以及拟南芥c o r l 5 a ，p r a b a t l 两个基因已 经成功分离( p e t e r ，1 9 9 8 ) 。拟南芥中有3 0 个基因编码水孔蛋白得到克隆。其中，1 2 种 属于t i p ，1 2 种属于m i p ，6 种属于n l m 。已经得到克隆的编码n a + i - f 反向运输蛋白 的基因包括：拟南芥中的a t n h x l 、s o s i ( s a l to v e r l ys e n s i t i v e ) ，小麦的t a n h x l 和 水稻的o s n h a l 基因( z h uj ，1 9 9 8 ：曾华增，2 0 0 3 ) 。脱水素是一种广泛存在于高等 6 山东农业大学博士学位论文 植物中的干旱诱导蛋白，具有很强的亲水性和热稳定性具有保护植物细胞的大分子在 脱水过程中不受伤害的功能。由于脱水素是在种子成熟时发挥作用，因此也把它归于 l e a 蛋白。脱水素基因是一个大的基因家族，目前已有多个脱水素基因或相关基因被克 隆及定位，如大麦中d h n i 、d h n h ，玉米中的d h n l r a b l 7 和d h n 2 以及拟南芥中的d h n x 、 c o r 4 7 、r a b l 8 等。 抗逆相关的转录因子及双组分系统基因 抗逆相关的转录因子的研究近来也日益受到重视，它们可以控制一系列的下游胁追 反应，从而启动信号传导中的级联反应，使细胞产生相应的抗逆性。至今，已克隆出了 大量的与植物抗旱相关的转录因子。例如，拟南芥d r e b l a - - c 和d r e b 2 a b ，c b f i 3 、 i - i s 、a t - g l u r 2 、a t h b 6 、s c o f l 、a t - m y b 2 等。在拟南芥和烟草中还发现双组分系 ( t w o - c o m p o n e n ts y s t e m ) 基因的存在，其基因产物为“感受器”和“反应调节器”合二为 一的激酶蛋白。如拟南芥的双组分系统基因a t i m i 和a t r r 2 受干旱、高盐及低温 的诱导。烟草双组分系统基因n t h k i 和n t h k 2 则受高盐胁迫处理的诱 导( 张劲松，1 9 9 9 ) 。双组分系统基因被诱导表达后，产生一系列的细胞应激反应，提 高植物的干旱胁迫适应能力。 1 2 植物的抗氧化性 当作物生长的外在条件如温度、湿度、土壤中的水分、盐浓度等发生急剧变化或当 大气污染( 如s 0 2 、臭氧) 、紫外线辐射、某些农药如p a r a q u a t ( 一种光动除草剂) 及病 原体等作用于植物时，都会使植物体内产生大量的活性氧( r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ，r o s ) ，形成氧化损伤。这些比氧活泼的含氧化合物包括：超氧阴离子( 0 2 。) 、 氢氧根离子( 0 壬r ) 、羟自由基( - o h ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 等。产生的活性氧可导致蛋 白质、膜脂和其它细胞组分的损伤( a s a d a ，1 9 9 4 ) 。某些活性氧可以充当信号分子，在 病原体的初始侵袭后传递信号，从而使植物组织产生一系列的抗病防御反应。 1 2 1 植物中的活性氧产生及清除 1 2 1 1 活性氧产生的机制 在植物细胞正常代谢过程中，活性氧可由多种途径产生。如叶绿体、线粒体和质膜 上的电子传递产生了一个不可避免的后果：即电子传递至分子氧上，随之产生活跃的、具 有毒性的活性氧。生物和非生物胁迫的介入都可使活性氧的水平升高。 高等植物叶绿体光合电子传递链p s i 的受体端存在大量的自动氧化酶类，能够通过 7 转a h b a d h p s c a t 基因烟草和杨树的获得及其抗性分析 米勒反应将氧光还原成超氧化物，这些超氧化物或参与p s i 电子循环，或从类囊体腔扩 散至基质膜表面，在那里超氧阴离子可通过酶促反应歧化成h 2 0 2 和0 2 ：或在f e 或c u 的存在下通过f c n t o n 或h a b e r - w e i s s 反应产生o r 和0 2 ( a s a d a k ，1 9 8 9 ) 。最近研究发 现，在强光处理的类囊体及完整的叶绿体中，超氧化物和h 2 0 2 同样可由p s i 产生。 1 2 1 2 活性氧造成的氧化损伤 当环境胁迫长期作用于植株，使其产生的活性氧超出活性氧清除系统的能力所及 时。就会产生氧化损伤。活性氧可以攻击蛋白质的氨基酸残基，尤其是t y r 、p h e 、t r p 、 m e t 和c y s ，形成羰基衍生物( s t a d t m a ne r ，1 9 9 2 ) 。此外，活性氧可以促进分子内和 分子间的交联，如二硫键的形成和蛋白质的断裂，超氧化物可使一些含金属的酶类失活， 或产生羟自由基，引发磷脂的过氧化( a s a d aa n dt a k a h a s h i ，1 9 8 7 ) 。1 0 1 a n o l l 的h 2 0 2 可以抑制碳固定，在1 t u n o p l 的低浓度下，它可使卡尔文循环中的一些巯基酶类失活。 最主要的是h 2 0 2 能够通过h a b e r - w e i s s 反应产生更活跃、更有毒性的o h ，从而导致膜 脂过氧化、碱基突变、d n a 链的断裂和蛋白质的损伤( a s a d aa n dt a k a h a s h i ，1 9 8 7 ) 。 o h 可以修饰一些蛋白质使它们对蛋白水解酶的作用更敏感( c a s a m o ，1 9 9 4 ) ，一旦被 破坏，蛋白质就会进一步被肽链内切酶降解，已发现在类囊体的膜上存在这样的酶。此 外，种具有多种催化功能的蛋白酶复合体己在哺乳动物和植物中被证实其具有选择性 地降解活性氧所破坏的蛋白质( p a c i f i c ，1 9 9 3 ) 。 1 2 1 3 活性氧的积极作用 虽然活性氧对植物细胞有很强的毒害作用，但在有些代谢过程中它却能被有效利 用：当病原体侵染植物后，细胞内的活性氧水平迅速提高，从而引起过敏细胞死亡。 活性氧参与细胞壁中富含羟脯酸的糖蛋白交联过程，这也有利于抵御病原体侵入细胞。 活性氧很可能作为第_ = 信使调控抗病相关基因的表达并启动植物抗毒素合成基因的 转录( i n z e ，1 9 9 5 ) 。 1 2 2 活性氧的酶促脱毒系统 1 2 2 1 超氧化物歧化酶( s o d ) s o d 作为植物抗氧化系统的第一道防线，清除细胞中多余的超氧根阴离子。在高等 植物中，s o d 根据其辅基部位结合的不同金属离子分为3 类：m n - s o d 、f e - s o d 、 c u z n - s o d ( b o w l e r ，1 9 9 2 ) 。对s o d 基因家族的深入研究是在玉米中进行的。已得到 的序列分析表明，广泛存在于真核生物中的c u z n - s o d 与f e s o d 和m n - s o d 不同源。 盛 山东农韭大学博士学位论文 现己从多种材料中分离纯化了c u z n - s o d ，该酶由两个亚基组成，每个亚基各含一 个铜离子及一个锌离子。在植物中，c u z n - s o d 是3 种超氧化物歧化酶中含量最丰富的 一类，主要存在于叶绿体、胞质和过氧化物酶体中( a s a d a ，1 9 9 4 ) 。m n - s o d 和f e s o d 每个亚基都只含一个金属离子，m n - s o d 主要存在于线粒体中，从f e s o d 的一些生化 指标及前导序列推测，该酶存在于叶绿体中。m n - s o d 与f e s o d 具有序列相似性。并 且含有完全相同的特征结构域，将存在于线粒体中的m _ n - s o d 导入烟草、苜蓿的叶绿体 后，转基因植物对臭氧及干旱胁迫的抗性增强。但将f e - s o d 过量表达的植株与m n - s o d 过量表达的植株同时p a r a q u a t 处理时，前者比后者具有更强的抗氧化性。为了解释这一 实验结果, v a n c a m p 等( 1 9 9 6 ) 提出了一个假说：一方面可能是由于这两种蛋白分子本 身的特性所决定；另一方面可能是由于它们在叶绿体中具有不同的亚细胞定位所造成。 1 2 2 2 抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) a p x 是清除h 2 0 2 的主要酶类，根据其在植物细胞中的定位分为4 类：类囊体a p x 、 基质a p x 、微体a p x 和细胞质a p x 。a p x 催化h 2 0 2 还原的化学反应如下；2 抗坏血 酸+ 1 2 0 2 - ，2 单脱氢抗坏血酸+ h 2 0 ( w f l l e k e n s ，1 9 9 4 ) 。产生的单脱氢抗坏血酸可通过不 伺的途径被还原。 臭氧可以诱导a p x 基因的表达，提高a p x 的活性可以增强植物对臭氧的耐受力。 研究发现，转基因烟草细胞质a p x 反义r n a 的表达降低了其内源a p xm r n a 水平及 a p x 的催化活性，从而加大了转基因烟草在高浓度臭氧下的氧化损伤；在低浓度的臭氧 中，转基因烟草较对照植株也表现出明显的区别，表明即便是a p x 活性的部分丧失也 不能全部被其他抗氧化剂所弥补。 1 2 2 3 过氧化氢酶( c a t ) 过氧化氢酶主要存在于檀物过氧化物酶体与乙醛酸循环体中，它与a p x 一样都是 清除h 2 0 2 的主要酶类。本文将在后面对其作详细介绍。 1 2 3 活性氧的非酶促清除及相关分子 非酶促清除机制具有一些形态学特征，如：植物表面及叶部具有蜡质、产生非光化 学抑制过程如紫黄质和玉米黄质循环及光呼吸等。非酶类抗氧化剂包括类黄酮、洳生育 酚、抗坏血酸、谷胱甘肽、胡萝卜素和甘露醇。这些物质既可直接同r o s 反应，将其 还原：又可作为酶的底物在r o s 的清除中发挥重要作用。 转a h b t d h ，p * c a t 基囡烟草和扬辫的获得及其抗性分析 1 2 3 1 抗坏血酸和谷胱甘肽 抗坏血酸和谷胱甘肽在活性氧脱毒过程中起重要作用，它们可直接同r o $ 反应， 将其还原又可作为酶的底物在活性氧的清除过程中扮演重要角色。抗坏血酸、还原型谷 胱甘肽及a p x 、g r 、s o d 和m d h a r 都参与了植物细胞中抗氧化剂的再生过程。此外， 抗坏血酸在小生育酚和玉米黄质的再生循环中充当还原剂。抗坏血酸的第三种功能是在 叶绿体类囊体表面作为还原剂参与抗坏血酸过氧化物酶介入的过氧化氢的清除，在这一 过程中，抗坏血酸被氧化成单脱氢抗坏血酸。在完全氧化的脱氢抗坏血酸产生的情况下， 还原型谷胱甘肽作为还原剂参与抗坏血酸的再生，产生的氧化型谷胱甘肽可以通过谷胱 甘肽还原酶得到还原。由于抗坏血酸在清除活性氧的过程中发挥了重要作用，故而在叶 绿体中，这一与氧的摄入、a p x 的功能及分子氧还原相关的过程最近被称为“米勒- 抗坏 血酸过氧化物酶光呼吸”( o s m o n d ，1 9 9 5 ) 。 1 2 3 2 甘露醇 甘露醇是已知的氢氧根离子清除剂。在氧化胁迫下，甘露醇可以保护巯基酶类或其 他巯基调控的斗绿体组分。知黄素蛋鑫、硫氧还原蛋台和谷胱甘