（有机化学专业论文）具有光学活性的羧基肽酶a抑制剂的设计合成及动力学研究.pdfVIP

延边大学颈士论文 摘要 本文根据羧基肽酶a ( c p a ) 最新研究进展，基于c p a 的活性部位及作用机 理设计了具有光学活性的新型抑制剂( 士，r _ ，s ) 2 苄基5 溴- 4 氧戊酸( a ) 、( 士， r - ，s 手2 苄基4 氧戊酸( b ) ，进一步探讨了c p a 中各个活性部位间的相互作用。 2 苄基5 溴- 4 氧戊酸和2 苄基- 4 氧戊酸的光学异构体都是以重氮酮作为主要中 间体来合成的。动力学测试结果表明，它们对c p a 有不同的抑制作用，( 】时- a 的 抑制效果比( s ) - a 强2 6 0 倍，( r ) - b 的抑制效果比( s ) b 强1 l 倍，通过旋光值的 测定证实( i u a 型是属于l 型系列，从( r ) a 抑制效果来看，它应该是一种过 渡态类似抑制剂，( r ) b 应该是一种底物类似抑制剂。测试结果表明在酮的a 位 引入溴能大大提高羰基的亲核性，2 苄基5 溴4 氧戊酸形成偕二醇的形式很好 的模拟了c p ：a 催化过程中的四面体过渡态，能够和c 队的活性部位紧紧结合， 这应该是( i u a 抑制作用强的最合理解释。 此外，以红景天立枯病菌( r 切咖 缸阳 册fk u l l l l ) 等1 2 种病原真菌为供试 靶标，我们合成了胡桃醌( 5 羟基1 ，4 萘醌) 及其衍生物5 ，8 二羟基1 4 萘醌。农 学院测试了它们的抑菌活性结果表明t 两者对丝核菌属病原真菌菌丝生长的抑制 作用大于镰刀属，对3 种丝核菌属病原真菌的e c 5 0 分别为l o 6 3 1 5 8 8 m g ，l 、 9 7 9 1 4 6 9 m g ，l ；两者对玉米小斑病菌孢子萌发的抑制作用最高，在1 2 5 m g ，l 时，抑制率均达到6 0 以上，对镰刀属4 种病原真菌孢予萌发，在5 嘶g ，l 时， 抑制率均达到6 0 。 关键词：羧基肽酶a ，抑制剂，2 苄基5 溴4 氧戊酸，2 苄基4 氧戊酸，抑 菌活性，胡桃醌，5 ，8 二羟基1 ，4 萘醌 延边大学硕士论文 a b s t r a c t c o m p o u n d sa ，b ，w e r cd e s i g n e d 勰i r r e v e r s i b l ei i l l l i b i t o rt oe x p l o r e 也ei n t e 阻c t i o 璐 o fn l ea c t i v es i t co fc p aa c c o r d i n gt o 廿l el a t c s tr e s e a r c h p r o 伊e s s e s a n dt h e m e c h a n i s mo fc 队b o t he n a n t i 伽a e r so f2 - b e n 巧l 5 - b m m 0 4 _ o x o p c n t 锄o i c 扯i da 趾d2 b e n z y l - 4 o x 0 1 ，髓i t a i l o i ca c i db w e p 托p a r e dm i l i z i n gt l l ed i a z ok e t o n e s 髂m c k e y 砌舶m c d i a t e s 觚da l l o fm e m 部s a y e df o r 蛳b 的r y a c t i v i 哆a g a i l l s t a ) o x y 脚t i d a s e at of i r i dt l l a tm e僻) 一f o 娜sa 陀m o r cp o t e mt 1 1 a nt l l e i r c o 玎e s p o n d i n ge n a i n i o m e 硌，i e ，2 6 0 - f o l df o ra a i l dl l - f o l d 矗) rb ，r c s p e c t i v e l y 1 k f i n d i l l gt h a tt l l e 俾) aw l l i c hb e l o n g st ot h e 卜s c r i e si sm o s t l yr e s p o 璐i b l e 斯t h c i n l l i b i t o r y 枷v i t ya c c o r d s 、) l ，i mt h ee x p l a i l a t i o nm a l “i sa 吣i ! t i o ns t a t e 锄a l o g i n l l i b i t o r i i lt l l eo t 圭l e rh a n d t 1 1 em o 他t h 锄1 2 0 f o l dw e a ki n l l i b m o no f c a r b o x y p e 面d a s eab y 俾) - bs u g g e s t e dt l l a tt l l en o n - h a l o g e n a t e dk e t o n cs h o l l l db ea 劬s 订a c c 姐a l o gi n l l i b i t o ro fc a r b o x y p e 砸d a s ca t h e s e 叭l t sf i l m l e rd i s c l o s e d 廿l a ：t t h ei m r o d u c t i o no fb r o m o 粤0 1 叩a ：tt l l e 吐- p o s “i o no fk 咖n e sc o u l ds i g n i f i c a m l y 卸h 卸c et h ee l e c n d p l l i l i c i t yo fm ec 盯b o l l y l 伊o u p 趾dt l l eg e n e r 锄e dg 口小- d i o lf b 锄o f ai ns i t l l ，w i l i c hm i m i c st l l e 仃a n s i t i o ns t a t ei nt l l ec 删y t i cp r o c e s s ，s h o u l db e 础驴o m i b l ef o r n l ep o t e l l t 通i l i b i t i o no f c 抽o x y p 印t i d a s c a 1 1 l e a m i 如n g a l t i v m e so f j u g l o n e a n di 乜 d c r i v a t i v e ， 5 ，8 一d i h y d r o w - l ，4 1 1 a p h t h o - q u i n i n c ，w e r et c s t e da g a i n s t1 2p a m o g e i l i cf h n g i b o m c o m p o 岫d ss h o w n 吐1 eh i 曲e fi n h i b i t i o ne 彘c t s 也eg r o w i 量lo fm y c e l i a l 0 f r 切咖n 缸p 砒o g e n yc o m p 甜e dt 0 也ec a s eo f 砌蜊f “舰叼印d 儿删s p 。t h ee c 5 0 v a l u c so fj u 百o n e 强d5 ，8 锄h y d r o x y - 1 ，4 - n a p b 胁o q u i n i i l ea g a i n s t 恤e e 觚酉o f 胄舰r d c 加细p a 如g e n yw e r c1 0 6 3 一1 5 8 8m g la n d9 7 9 - 1 4 6 9m g l ，f e 驴c t i v e l y b 劬o fm e me ) 【l l i b i t e dt h eh i 曲e s 【i 出b i t o r ye 彘c t s0 nc o n i d i a lg e r i i i i m t i o nt o 口枷胁妇枷卿sa n d ，w h i c hw e r cd e t e 肌i n e d 解6 0 a tm cc o n c c n 仃a t i o 船o f1 2 5 m g ，l f o rc o i l i d i a lg 咖i n a l j o no ft h ef o 毗l 【i n d so fp 础o g e i l i c 劬西o f 砌锨r 缸胤卿唧口，删s p ，也e i r i l l l l i b 的r yr a t cc 姐b ea b o m 6 0 a t t l 坞d o s a g eo f 5 0 m g l k e yw o r d s ：c p a ，i n h i b i t o r ，2 - b e i l 巧l - 5 - b r o m o 4 o x o p e m a n o i ca c 斌 2 一b e n z ) ，l - 4 一o x o p c n t a 】i ca c i d ， 觚t i f h n g a la c t i v 慨j 蚶o m ，5 ，8 d i h y d r o x y - l ，4 - n a p l 曲o q u 舢 i i 延边大学硕士论文 第一部分具有光学活性的羧基肽酶- a 抑制剂的设计 合成及动力学评价 第一章序言 1 1 羧基肽酶a 的简介 1 1 1 酶的简介 酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，绝大多数的酶是活细胞产 生的蛋白质，作为一种生物催化剂，细胞内的几乎每一个化学反应都由酶催化。 催化剂可以加快反应的平衡，但不能改变反应的平衡点。酶的催化作用具有高度 的选择性，即酶对底物的专一性。生物体内不断进行着各种各样的化学变化，实 际上所有的生命现象，如生物个体的繁殖，生长分化，新陈代谢等，都是各种复 杂的化学变化的结果。所有的这些生命变化几乎都是在特殊的物质即酶的催化下 进行的。酶的催化作用几乎表现在生物体所有的新陈代谢过程中。可以说，没有 酶的参与生命活动一刻也不能进彳亍l ”。 任何能够阻碍酶催化反应，或者降低其催化速度的物质称作酶抑制剂。对 酶和酶抑制剂之间的作用研究能够提供有关酶的专一性、催化反应的动力学机制 以及其活性部位的物理和化学结构的大量信息。通过抑制作用来调节酶的活性是 细胞生活中的主要内容之一，同时也是一种重要的诊断方法。很多疾病是由于新 陈代谢过程中酶的活性调节失常引起的。通过相关的酶的抑制作用，使得底物的 浓度的增加同时降低了产物的浓度，由此可以导致细胞内的代谢物过度消耗或者 过度积累，进而导致疾病的发生。这是酶抑制剂在临床药物开发方面的理论根据 【2 】。 1 1 2 羧基肽酶a 的简介 羧基肽酶a 是研究最为广泛的含锌蛋白水解酶，在众多生物反应过程中扮演 重要的角色，同吐引起了广泛的关注【3 】。它代表了一系列的如血管紧张转化素 ( a i l 舀o t c r l s i n c o n v e n i n g e n z y m e s ，a c e ) 川和基质金属酶( m d t r i x 延边大学硕士论文 m e t a l l o p r o t e i n 髂e s ) 【s l 等在生理和药理学及生物有机都具有重要意义的含锌金属 蛋白酶。对药学和生物有机研究而言，c p a 是开发含锌蛋白酶的抑制剂类药物时 考查抑制策略的模型。它常常作为靶酶来研究和开发含锌蛋白水解酶抑制剂类药 物。羧基肽酶a 为一个外切肽酶，催化肽链c 末端的肽键水解，对羧基末端芳 香族或大的脂肪族侧链较为敏感，它能催化肽链c 端氨基酸的水解，按下式切 断肽链： r 且n 上c 。，+ h 2 。 h r t r c 0 2 + h 3 n 人c 0 2 _ ( r l 是蛋白质或多肽的碳末端芳香族残基。) 1 1 2 1 羧基肽酶a 的结构1 6 l 羧基肽酶a 是由其前体羧肽酶原经胰蛋白酶水解部分肽段断裂加工而成。 前体是3 个亚基构成的复合物，经胰蛋白酶激活后变成由3 0 7 个氨基酸残基组成 的单肽链活性酶。1 9 6 7 年l i p s c o m b 以o 2n m 分辩率解析出了羧基肽酶a 的三 维结构图。羧基肽酶- a 具有紧密的外形，是一个5 om x 4 2 姗3 8 姗的球体。 其中大约含有3 8 a 螺旋，1 7 d 折叠片，还有一个结合紧密的z n 2 + ，z n 2 + 对 酶的活性很重要，z n 2 + 位于分子表面附近的一个裂缝中。z n 2 + 同h i s 6 9 、h i s - 1 6 9 、 和g l u - 7 2 的两个羧基氧配位，z n 2 + 在无底物时为5 个配位价，而且第五个配体 是一个水分子。当与底物结合时，被裂解的肽键羰基氧与z i l ”形成第六个配位。 搿+ 附近的口袋正好容纳底物羧基末端的侧链。对底物结合重要的残基包括 a r g 7 l 、姆1 2 7 、a 蚰- 1 4 4 、a r g 1 4 5 、t y r - 2 4 8 、g i u - 2 7 0 i l 】d 下面是羧基肽酶- a 三维结构如f i g 1 一l ，f i g 1 2 示意图： f i g 1 - lc p a 含z n 三维图f i g 1 2 c p a 没有z n 三维图 c p a 是分子量为3 4 4 7 2 的一个具有3 0 7 个氨基酸残基的含z n 2 + 蛋白金属水 2 延边大学硕士论文 解酶。它能把多肽链c 端肽键水解为氨基酸，而且优先水解c 端具有较大疏水 性侧链的多肽底物，同时表现出对左旋体的手性选择性【7 1 。c p a 的活性部位中对 识剔、结合以及催化起关键作用的氨基酸残基是培1 4 5 、g i u 一2 7 0 、a f g 一7 1 、舡争 1 2 7 、键合的2 r 皿2 + 和与之络合的水分子。下图是c p ：a 活性部位的结构示意图 f 噜1 3 ： f 嘻l 一3c e 活性部位的结构示意图 1 1 2 2 羧基肽酶a 的作用机理i 缸1 7 1 羧基肽酶对l 氨基酸构成的肽专一，底物与羧肽酶a 的结合方式已从甘氨 酰酪氨酸与酶结合复合物的x 射线晶体结构分析得到。甘氨酰酪氮酸是一个水 解缓慢的底物，同酶的相互作用存在以下一些重要的方面： ( 1 ) 二肽的研侧链进入酶的疏水口袋，该口袋适合于芳香侧链和大的脂 肪族侧链，这就解释了该酶选择的底物要有大的疏水侧链。 ( 2 ) 活性部位的z n 2 + 直接同断裂肽键羰基氧配位，该底物有效的置换预先 占据该位置的水分子。 ( 3 ) a 唱的胍基移动大约o 2 衄，同底物末端羧基形成一个静电键，g 1 u 一2 7 0 与底物结合也经历了同样的位移。 ( 4 ) 当底物的t y r 侧链与活性口袋结合时，至少有另外4 个水分子从其中 被置换出来。最大的构象变化是羧基肽酶t y 卜2 4 8 的酚羟基移动了1 2 衄，大 约相当于这个蛋自分子直径l ，4 距离。这个移动主要是通过t y r - 2 4 8 的c 广b 单健转动而实现的。t y 2 4 8 的羟基从分子表面移动到底物肽键附近，同底物敏 感键n 端侧链残基的氨基形成氢键。这个移动的一个重要后果是把活性部位的 延边大学硕士论文 空腔关闭了，并完成了这个空腔从由水充填的区域成为疏水区域的转化。这些结 构的变化可能是通过a 唱- 1 4 5 结合到底物的末端羧基上引起的。羧肽酶a 与底物 结合，引起构象的改变，正是诱导契合的典型例证【j j 。 在一些机理中g l u - 2 7 0 的丫羧基作为亲核试剂进攻酰胺和酯的结合处，形成 中间体酐( a ) 。在一些机理中，g l u - 2 7 0 的y 羧基作为一般的碱，协助外部的水分 子或与z i l 2 + 键合的水分子( c ) 进攻底物，不形成中间体酐【引。 ( a )( b )( c ) 羧基肽酶- a 未结合底物与结合底物的构想图如f i g 1 4 ，f i g 1 5 所示； f i g 1 - 4 羧基肽酶a 未结合底物的构想图 x r 1 4 延边大学硕士论文 f i g 1 - 5 羧基肽酶a 结合底物的构想图 甘氨酰酪氨酸不是羧肽酶a 理想的底物类似物，用底物类似物( 。) 2 苄基3 - ( p 甲氧苯甲酰) 丙酸进行x 射线晶体结构研究，得到了羧肽酶a 与底物相互 作用的更好的描述图。在这个复合物中，羰基不同z n 2 + 配位，但是与a r g 1 2 7 胍基形成氢键。根据x 射线晶体结构分析和动力学的研究，提出了关于羧肽酶- a 的催化机制。假定产生的e s ( 酶与底物结合) 复合物如上图所示，则3 个基团 是催化作用所必需的：z n ”、a r g 1 2 7 的胍基和g l u - 2 7 0 的羰基。 羧肽酶a 催化的第一步是活化水分子的亲核氧原子攻击底物羰基碳原子， 同时，g l u - 2 7 0 作为广义碱，从z n 2 + 结合水吸取一个质子，形成一个带负电荷 四面体过渡态中间物，通过z n 2 + 和舢争1 2 7 带正电荷的侧链的静电相互作用给以 稳定( a b ) 。催化的第二步，g l u 2 7 0 的c 0 0 h 作为广义酸提供一个质子给肽 的n h 基，肽键随着断裂( b c ) ，释放出氨基酸，经扩散离开活性部位，从而 完成这一水解过程。研究发现，在羧基肽酶a 的催化机制中，肽键和酯键对z n ” 的配位优先于历2 + 的水合作用。在底物和羧基肽酶a 形成酶底物复合物过程中， 羧基肽酶a 首先识别底物的末端羧基，a r g 1 4 5 的胍基移动2 a ，并与之形成盐 键。由此引发t y 卜2 4 8 的羟基移动到底物的肽键附近，它的移动追使水分子退出 活性部位，形成疏水环境，能够容纳底物上的芳基侧链，并最终由t v r - 2 4 8 移动 5 延边大学硕士论文 的终止而完成疏水口袋的关闭。对于不同的底物，c p a 催化的水解机制也不相同。 对于c p a 能够水解酯健和肽健的能力，人们已经认识很久【1 4 】。c p a 对这两种物 质在结构上要求是一致的，即需要l 构型和自由的末端羧基。但是催化速度是 不同的。一般认为c p a 催化酯水解过程中，g l u 2 7 0 的羧基亲核进攻底物的羰基 碳原子而生成了酸酐中间体【1 5 】。断裂的酯基的羰基上的氧原子和锌离子配位， 使酯基健更加容易地被亲核进攻。酸酐产生酰基化酶中间体，随后被锌离子络合 的水分子水解，重新得到c p a 大多数的研究对于肽类的底物的水解机理，普遍 公认的是“活化水”途径。断裂的羰基通过与锌离子配位以及与a r g 1 2 7 的胍基 形成氢键而得到活化的，使之易于被亲核进攻【嘲。g l u - 2 7 0 的羟基作为碱，从与 锌离子络合的水分子上夺取一个质子，进而产生亲核的氢氧根离子1 1 7 】，随后， 这个氢氧根离子进攻被活化的断裂肽键的羰基碳原予，生成四面体过渡态。具体 机理参见f i g 1 - 6 和f i g 1 7 ： n a f o 。) 墨私。 ，k 乜，。 f i g 1 - 6 羧基肽酶- a 水解酯底物的机理 碟 o n h a 吨1 惦 6 叔 饥 州乙 q o 、 吖 州 。几 队 矿 a 屹 g 延边大学硕士论文 卧2 嚣_ 侉k 懈 乜” ，厕 7 吣p 、h 、人一 o l h i ! i 子“ r c 0 90 4 a 吁1 2 7 f i g 卜7 羧基肽酶- a 水解肽底物的机理 1 。2 酶抑制剂的简介l l i n h i a 哼 醇 一些物质，它们并不能引起酶蛋白的变性，而能与酶的活性部位结合，或在 活性中心以外的调节部位上与酶分子起相反作用，结果引起酶活力下降。甚至完 全丧失活性，这类物质统称为酶的抑制剂。酶的抑制作用可以从酶与底物形成中 问物认识的，抑制剂之所以能抑制酶的活性，就是由于它破坏或改交了酶与底物 结合的活性中心，阻碍了中间物的生成或分解，因此影响了酶的活性。 酶是蛋白质，凡可使酶蛋自变性而引起酶活力丧失的作用称为失活作用 ( i i l a c t i v a t i o n ) 由于酶催化必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶 活力的降低或丧失而称为抑制作用( i n h i b j _ t i o n ) 。变性剂对酶的变性作用无选择 性，而一种抑制剂只能使一种酶或一类酶产生抑制作用，因此抑制剂对酶的抑制 作用是有选择性。所以，抑制作用与变性作用是不同的。 研究酶的抑制作用是研究酶的结合与功能、酶的催化机制以及阐明代谢途径 的基本手段，也可以为医药设计新药物和为农业生产新农药提供理论依据，因此 抑制作用的研究不仅有重要的理论意义，而且在实践上有重要价值。抑制作用的 7 延边大学硕士论文 类型根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，可把抑制用用分为两大 类。 不可逆的抑制作用是抑制剂与酶催化的必需基团以共价健结合而引起酶活 力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，称为不可逆抑制 ( i 仃e v 粥i b l ei n h i b i t i o n ) 由于被抑制的酶分子受到不同程度的化学修饰，故不可 逆抑制也就是酶的修饰抑制。 可逆的抑制作用是抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能 用物理方法除去抑制剂而使酶复活，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制 ( r e v e r s i b l ei l l l l i b i t i o n ) 。 根据可逆抑制剂与酶结合方式的不同，可逆抑制作用分为3 种类型：竞争性 抑制( c 伽叩e t 硒v ei r i l 曲“i o n ) 是最常见的一种可逆抑制作用。抑制剂( i ) 和底 物( s ) 竞争酶的结合部位，从而影响了底物与酶的正常结合。因为酶的活性部 位不能同时既与底物结合又与抑制剂结合，因而在底物和抑制剂之间产生竞争， 形成一定的平衡关系。大多数竞争抑制剂的结构与底物结构类似，因此能与酶的 活性部位结合，与酶形成可逆的e i 复合物，但e i 不能分解成产物p ，酶反应速 度下降。其抑制程度取决于底物及抑制的相对浓度，这种抑制可能通过增加底物 浓度而解除。这类抑制最典型的例子是丙二酸和戊二酸对琥珀酸脱氢酶结合，但 不能催化脱氢。非竞争性抑制( n o n c o m p c t i t i v ei n l l i b m o n ) 这类抑制作用的特 点是底物和抑制剂同时和酶结合，两者都没有竞争作用。酶与抑制剂结合后，还 可以与底物结合：e i + s e i s 。但是中间的三元复合物不能进一步分解为产物， 因此酶活力降低。这类抑制剂与酶活性部位以外的基团结合。其结构与底物无共 同之处，这种抑制作用不能用增加底物浓度来解除抑制，故称非竞争性抑制。例 如亮氨酸是精氨酸酶的一种非竞争性抑制剂。某些重金属离子a g + 、c u z + 、h 矿、 p b 2 + 等对酶的抑制作用均属这类抑制剂。反竞争性抑制( u n c o m p c t i t i v ei n l l i b i t i ) 酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合，即e i + s e i s ，e i s * p 。反竞争性 抑制作用常见于多底物反应中，而在单底物反应中比较少见。有人证明，l p h e l 同型精氨酸等多种氨基酸对碱性磷酸酶的作用是反竞争性抑制，肼类化合物抑 制胃蛋白酶，氰化物抑制芳香硫酸酶的作用也属于反竞争性抑制。 3 延边大学硕士论文 1 2 1 羧基肽酶a 抑制剂的简介 到目前为止，大量的羧基肽酶a 抑制剂己被合成和表征。依据酶抑制剂复 合物能否恢复其催化活性，大致可分为两大类：羧基肽酶a 不可逆抑制剂和可 逆抑制剂两类。 1 2 1 1 羧基肽酶a 不可逆抑制剂 不可逆抑制剂通常带有一个潜在的反应部位，可以与酶的活性中心有催化作 用，与氨基酸残基形成共价健。因为抑制剂在活性部形成共价健而被锁住，所以 酶的活性不能通过透析进行再生。化学上稳定的酶抑制剂复合物完全失去了催 化的能力，因此不可逆抑制剂通常被称为失活剂。经典的羧基肽酶a 不可逆抑 制剂如，m o b a s h e r ys 等人设计并合成的2 苄基3 碘代丙酸【1 8 1 ，硒m 等人设计合 成的2 。苄基3 ，4 环氧丁酸【1 9 1 。其结构式如f i g 1 - 8 所示： p幻 l c 。h 占少c 。h 2 一苄基一3 碘代丙酸 2 苄基3 ，4 - 环氧丁酸 f 毽1 8 羧基肽酶- a 的不可逆抑制剂 1 2 1 2 羧基肽酶a 可逆抑制剂 可逆的抑制剂通常利用了在酶催化过程中底物和酶之间的一些非共价健结合 方式来抑制酶的活性。正是由于在酶和抑制剂问形成了非共价健，自由的酶通过 透析能够从非生产性的末端酶抑制剂复合物可重新游离出来。 羧基肽酶a 可逆抑制剂可分为底物类似物和过渡态类似物两种。 我们知道酶催化反应的底物能够和酶活性部位相结合，并且产物也会有类似 的能力。因此，如果一个分子具有和底物的断裂键或是产物具有类似电子排布的 基团，同时该基团对于酶的催化反应是惰性的，这个分子就应该是一个活性部位 定向的竞争性可逆抑制剂。这些抑制剂属于底物类似物抑制剂鳓。底物类似物 抑制剂与c p ：a 的结合类似于底物的情况，而且不能被水解。研究发现这类物质 都具有能与c p a 活性部位的锌离子发生强烈络合的基团。经典的羧基肽酶一a 底 物系列抑制剂如：b y e r s 和w b l f e n d c n 设计并合成的2 苄基丁二酸【2 “，2 - 苄基- 3 巯基丙酸【2 2 】等。其结构式如f i g 1 9 所示： 9 延边大学硕士论文 p舸 h o o c 人c o o h h s 上c o o h 2 - 苄基丁二酸 2 苄基3 巯基丙酸 f i g 1 9 羧基肽酶- a 底物系列抑制剂 为了加速酶促反应的速率，酶必须能够有效的稳定所催化的化学转变过程中的过 渡态。酶巧妙的调整e s 复合物的构象，使在底物处于过渡态时，达到了酶和底 物之间的最强的相互作用。因此可以推断，和底物比较，具有类似过渡态结构的 化合物将更加牢固的与酶结合。因此，具有类似于在反应途径中出现的过渡态结 构的化合物与酶的活性部位结合亲合能力最高，将是酶的强的抑制剂【2 3 】。过渡 态类似物是一类特异的竞争性抑制剂，底物与酶相互作用时形成过渡态，过渡态 的能量大于初始状态的能量。基于这种差异，若某稳定的化合物其电荷分布和立 体形状类似于底物的过渡态，则应与酶结合得更牢。这是由于底物呈过渡态时与 酶的亲和力非常强，大约是基态与酶结合力的1 0 8 1 0 1 4 倍。过渡态类似物作为酶 抑制剂，与酶的结合力强于与底物的结合力1 0 4 - 1 0 5 。反应的过渡态是不稳定的， 只能短时间存在。但具有类似过渡态结构的分子应当与酶有效地结合，进而可以 作为一种强的抑制剂。醛和酮类似物具有易受亲核进攻的羰基，与锌离子络合的 水分子结合而形成缩醛或缩酮的中间体。经典的羧基肽酶- a 过渡态系列抑制剂 如，2 苄基4 氧5 ，5 ，5 三氟戊酸。其结构式如f i g 1 1 0 所示： 、愈 f 。c j l 人c o o h 2 苄基，舢氧5 ，5 ，5 三氟戊酸 f 培l l o 羧基肽酶a 过渡态系列抑制剂 a i 唧一吖人q 孵1 2 7 一只 i， 幺pz n 。 f 嘻l l l 三氟甲基酮水合物的模拟过渡态 1 0 延边大学硕士论文 第二章羧基肽酶i a 抑制剂的设计合成与动力学评价 2 1 羧基肽酶a 抑制剂的设计 酶抑制剂有几种不同的类型，过渡态类似抑制剂能够和酶紧密结合，在酶催 化过程中形成能量高的四面体过渡态中间体。过渡态类似抑制剂为酶催化机制提 供大量信息，也可以为医药设计新药物提供理论依据【2 5 1 。在c p a 过渡态类似抑 制剂众多不同种类中，有磷胺【2 6 1 、醛嘲、酮网，通常把c p a 和酮的相互作用作 为a c e 抑制剂研究基础。例如：3 僻甲氧基苯酰) 2 - 苄基丙酸，它不仅是c p a 甲基酮底物类似物抑制剂咂产1 1 0 洲) 【2 9 1 ，同时也是a c e 甲基酮三肽底物类似 物抑制剂( k | - o 1m m ) 【3 0 】。许多研究揭示了过渡态类似物所具有的抑制作用中的 立体化学。g a l a r d y 和k d 啊l e 耐c z 在研究中发现2 一苄基3 甲酸丙酸是一种过渡 态类似物抑制剂，探讨了它的不同光学异构体和酶结合的关系1 2 7 1 。随后飚m 和 c h u n g 阐述了c p a 抑制剂的立体化学，发现抑制活性高的主要是l 系列的( r ) 一 异构体【3 ”。融c h a i de g a l a d y 和z b i g n i e wp k o 啊l e 晰c z 曾经报道过用2 苄基 5 溴4 氧戊酸和2 苄基3 溴4 氧戊酸口习的混合物作为羧基肽酶- a 的抑制剂 时。其抑制效果很好，磁：o 5 7 州。是属于羧基肽酶- a 的过渡态系列抑制剂。 他们是从2 苄基4 酮戊酸直接合成a 和b ，但没有对这些化合物进行分离和拆 分【3 引。 为了进一步明确两种化合物对c p ：a 的抑制作用，我们想单独得到2 苄基一5 - 溴4 氧戊酸和2 一苄基3 溴- 4 氧戊酸。而通过以往的研究我们知道酶催化作用的 一个重要特征就是立体特异性，而二种化会物各自的光学异构体的抑制效果一定 会有所不同。弄清两种构型的抑制效果，对于进一步理解羧基肽酶- a 的性能有 一定的意义。我们设计并合成了( 士，r - ，s ) - 2 苄基一5 一溴4 一氧戊酸的三种构形 为了证实a 溴的引入对c p a 的抑制效果有何影响，我们又合成了( ，r ，s ) 一2 苄基4 氧戊酸。 过渡态类似抑制剂和底物类似抑制剂2 苄基- 5 一溴4 - 氧戊酸( a ) 和2 一苄基 4 i 氧戊酸( b ) 的结构式如图巧9 2 1 ，f i g 。2 2 ： 延边大学硕士论文 b ，霹 f 培2 - l2 - 苄基5 一溴4 氧戊酸 f 地2 - 22 - 苄基4 氧戊酸 在制备化合物a 的时候，我们得到了一种环状化合物经过红外，c 、h 谱和 元素分析确定了此化合物的结构，即化合物3 苄基一2 h 吡喃- 2 ，5 一酮( o 。同时我 们也得到了它的光学异构体，( r ) c 和( s ) c 型。我们也对其三种构型进行了动 力学测试，但结果表明其抑制效果不理想。其结构式如图f i g 2 - 3 。 越薅g 广p “r p h f p “ ( r s )( r ) ( s j f i g 2 - 33 苄基- 2 h 一吡哺- 2 5 一酮 在此我们推测了化合物a 和b 对a ，a 的抑制机理如下图： f i g 2 42 苄基- 5 一溴4 氧戊酸的抑制a ，a 机理 延边大学硕士论文 f i g 2 52 苄基- 4 氧戊酸的抑制c p 机理 2 2 羧基肽酶i a 抑制剂的合成与动力学评价 2 2 1 羧基肽酶a 抑制剂的合成 2 2 1 1 化合物2 - 苄基i s l 溴- 4 - 氧戊酸( a ) 的合成 对于c p a 的立体化学测试还存在很多问题。以往的制备方法中，2 苄基_ 4 - 氧戊酸用溴溴化得到2 苄基5 ，溴4 氧戊酸和2 苄基3 溴4 氧戊酸。一些关于二 取代- 4 氧戊酸溴化研究已经被m 锄ye ta 1 详细报道过，表明在2 一苄基4 - 氧戊酸 上直接引入溴来制得2 苄基5 溴4 氧戊酸并不是一个最佳的选择。 目前我们已经有效合成了( 士，r ，s ) 2 苄基5 溴4 氧戊酸的三种构型，并作 为c p a 抑制剂进行测试。我们设计了一个具体的合成2 苄基5 溴- 4 氧戊酸的路 线。这个路线从起始原料丁二酸酐开始，得到了丁二酸单叔丁酯，和2 - 苄基丁酸 单叔丁酯，把2 - 苄基丁酸单叔丁酯作为起始原料来合成具有光学活性的目标化合 物，从2 苄基丁酸单叔丁醣开始拆分，在反应过程中保留了其光学活性。再形成 重氮酮2 苄基5 重氮基4 氧戊酸，并把重氮酮作为合成的主要中间体，通过溴 化氢溴化，再水解得到了2 苄基5 - 溴4 - 氧戊酸。 2 苄基5 溴4 氧戊酸的合成路线： 延边大学硕士论文 q 弋兰厂l h 0 2 文 c 。伊鼬 u 一“u 2 h 、o 伊鼬 b ( r ，s ) 、t ， 峨以一心一以以 ( s ) ( s ) ( s )( s ) 晦2 9 ( a ) n 掘基丁二酰亚胺，d m 5 7 4 7 ； l d a ，b n b f ( 1 e q ) n 珥7 8 ，7 8 ；( c 1 ) l a - 甲基苄胺； ( c 2 ) d - a _ 甲基苄胺；( d ) 氯甲酸异丁酯，e t 3 n ；( c ) c h d 岵乙醚，o w os t 印y i e l d ： 9 l ) 髓l 乙醚，1 0 ，“；( g ) 1 2 nh c l - h o a “1 ：1 ) ，8 1 本文中为了得到光学纯的化合物a ，以n - 羟基丁二酰亚胺、4 二甲基氨基吡 啶等催化剂作用下和叔丁醇反应，以5 7 4 的产率获得了丁二酸单叔丁酯。在 4 - 二甲基氨吡啶的作用下，n 羟基丁二酰亚胺进攻丁二酸酐，形成中间体p 。在 中间体p 中，n 羟基丁二酰亚胺氧基是一个易离去基团，和叔丁醇反应形成丁 二酸单叔丁酯。其机理如f i 吕2 1 0 所示。 p h 0 2 c c o o b u 一丁二酸单叔丁酯在二异丙胺基锂的作用下，和苄基溴反应，选择性地以7 8 的收率生成2 - 苄基丁二酸单叔丁酯，产率明显高于文献值5 2 【3 渊。 2 苄基丁二酸单叔丁鳍用a 甲基苄胺拆分朋吲。先加入等量的i ，a 甲基苄胺， 乙酸乙酯做溶剂，冰水浴搅拌2 个小时，抽滤得到白色固体，l a 甲基苄胺和2 1 4 以 峨 延边大学硕士论文 苄基丁二酸单叔丁酯形成的盐，用乙酸乙酯重结晶，干燥至恒重，测其熔点及旋 光度，重复若干次，直至旋光度不变为止。l 一甲基苄胺和2 苄基丁二酸单叔丁 酯形成的盐的熔点为1 4 1 1 4 2 ，旋光度值为 a d 2 0 = 2 8 1 0 0 ，酸化得到的2 苄基丁二酸单叔丁酯 a d 2 0 = - 2 7 9 0 0 【。 重结晶得到的母液酸化后，加入等量的d 心甲基苄胺，重复上面的程序，拆 分得到的2 苄基丁二酸单叔丁酯的旋光度值为 a d 2 0 = + 3 0 1 0 0 。 。拆分得到的l 2 苄基丁二酸单叔丁酯和d 2 苄基丁二酸单叔丁酯分别在1 0 下，和氯甲酸异丁酯反应【3 8 】，绲到混合酸酐。考虑到该混合酸酐也不是稳定 的化合物，不经分离精制直接用在下一步反应【2 4 1 。 将含有过量重氮甲烷的乙醚溶液加入到含有酸酐的滤液中，低温搅拌半小 时，然后室温搅拌过夜，柱层析分离，以9 l 的收率得到淡绿色液体，2 苄基5 重氮基- 4 氧戊酸叔丁酯。 所得的重氮化合物，用干燥的溴化氢处理，柱层析分离得到无色液体，2 苄 荆5 溴4 氧戊酸叔丁酯，其收率为8 4 。再经过1 2 nh c l h q a c ( 1 ：1 ) 盐酸酸化 得到i 广2 苄基5 溴_ 4 氧戊酸和d 2 苄基5 溴4 氧戊酸【3 9 1 。 2 2 1 2 化合物2 - 苄基4 酮戊酸) 的合成 进一步和l n 溴乙酰基- n 甲基苯丙氨酸( l b a m p ) 比较，l - n 一溴乙酰基n 一 甲基苯丙氨酸是c 队的亲和标记物，快速而又不可逆抑制cp = a ，它同时也能水 解反应的底物h 们。l n 溴乙酰基- n 甲基苯丙氨酸的氨基被羰基取代就得到了 c p a 的可逆抑制剂2 苄基5 溴4 酮戊酸。h 龉s 和n e u r a t l l 曾经报道过被 l b 舢佃修饰的c p a 活性部位，探讨了g l u - 2 7 0 的烷基是导致c 队失活的原因。 以上提到的g l u 2 7 0 残基在以酮为底物的cp ：a 抑制剂中扮演着不同的角色1 4 l j 。 因此，我们设想c p a 的g l u 2 7 0 在l b a m p 为甲基酮类似物时或许也能改变它 的作用方式，a 溴酮可能被c p ：a 的活性部位识别。此外，为了进一步研究溴的 弓 入是否能提高2 苄基4 酮戊酸的亲电性，也为了证实a 溴的引入对c p a 的抑 制效果有何影响，我们又设计合成了( 士，r _ ，s - ) 一2 - 苄基- 4 - 氧戊酸。2 一苄基4 氧戊 酸也是从重氮酮开始经过氢化，在酸性条件下水解得到。这条路线是合成2 - 苄基 4 氧戊酸的比较合理的合成方法，产率也是相当高的。经过红外，c 、h 谱和元 延边大学硕士论文 素分析确定了此化合物的结构。 2 苄基4 氧戊酸的合成路线： 畦一瑶一啦 啦。一螺 f i g 2 - 1 l ( a ) p d c ， k n ，9 0 ；( b ) 舳lr t ，8 4 2 2 1 3 化合物c3 苄基2 h 吡喃2 5 - 酮的合成 我们在水解2 苄基5 溴4 氧戊酸叔丁酯得到化合物a 时，得到了化合物c ， 我们得到了化合物c 的( + ，r ，s ) 三种构型，并也对它们进行了动力学测试。 取2 苄基5 溴4 氧戊酸单叔丁酸，加入吡啶，4 0 回流，室温搅拌过夜，收率 为8 0 。在碱性条件下，羧基进攻溴代亚甲基发生亲核取代反应。我们对化合物 c 的三种形式进行了动力学测试。经过动力学测试结果表明其抑制效果并不理 想，在本文中没有给出其墨值。 8 以一毋 ( r ) b 以一毋 ( s ) 晦2 - 1 2 ( a ) 吡啶， 延边大学硕士论文 2 2 2 动力学实验评价 竞争性抑制作用的动力学方程 通常酶催化反应可由下面的方程表示： e + s ；皇。e s 兰已，e + p 根据准平衡或快速平衡假设，米式方程式可以写成如下式： ， 【s 】 。墨+ 【s 】 1 ，代表催化反应的初始速率： 墨代表酶底物复合物的解离我常数。 1 9 2 5 年，b r i g g s 和h a l d 锄e 指出不需要假设酶一底物复合物与酶和底物之间 存在平衡。他们认为在催化反应开始的一段时间后，酶底物复合物即可以达到 一个“稳态”。在“稳态”下，产物的生成速率与酶一底物复合物的浓度成正比。 通过“稳态”理论，他们对米氏方程做了很得要的修正。根据稳态理论推导出的 动力学方程如下： ， 【s 】 。j + 【s 】 其中， 疋l + 。f j | ；，m 是动力学平衡常数，表示实际的稳态浓度高于平衡浓度的关系。 对于一个简单的竞争性抑制体系可由下式表示： 其速率方程式如下： i e i ；= 兰e + s ；= 兰e s e + p v 。 【s 】 h 罢+ 詈 1 7 延边大学硕士论文 其中，墨为抑制剂的抑制常数。 进一步整理得到如下方程： l v 。 s 】蜀田+ 学+ 上式说明，在一定的【s 】o 下，1 ，o 和田之问有简单的线性关系( d i x o n 图) 。 当【i 】o = 墨，时，v 0 = 。，此线性关系与 s 】o 无关。因此在同一酶浓度下，不 同的【s 1 0 下的d i ) 【o n 图将相交于【i 】o ；& 这一点。 竞争性抑制作用的d i x o n 图f i g 2 1 3 。 i e i = 专e 十s = = 兰e s e+p ls j2 1 锄 s 】l 每么 彳 f l 1 v m “ o 【i 】 一 在o 0 5m 强帕5mn a c l ，p h7 5 缓冲溶液中，2 5 下以邻一( 反- 对氯肉桂 酰) 【广3 苯乳酸( c l c p l ) 为底物。测量c p a 对底物的催化水解速率。抑制常数 蜀是根据d i x o n 图来拟合的。动力学测试结果表明，我们设计合成的每一种光 学异构体对c p a 的活性部位表现出了不同的结合能力。 1 8 延边大学硕士论文 ( ) 2 一苄基- 5 - 溴4 氧戊酸的d i 】【图f i g 2 1 4 。 1 2 一 1 咖- - 【s 】： 【s 】： 8 j i ( i ：。州卢 r i 一一 么j 幽 7 - 3 0 2 5 - 2 0 1 5 1 0 - 5 05 1 01 5 2 02 53 0 【i 】枷 ( r ) - 2 苄基- 5 - 溴- 4 氧戊酸的d i x o n 图f i g 2 1 5 。 5 0 “m 1 0 0 u m 之1 0 5 0 o 7 5 0 一 6 0 0 k i 2 0 8 1 州 够 2o - 1 5 - 1 o o5 o o o 51 o1 52 o 【i 】p m 延边大学硕士论文 ( s ) 2 - 苄基- 5 - 溴- 4 - 氧戊酸的d i ) 【0 n 图f i g 2 一1 6