（植物学专业论文）非洲菊（gerbera+hybrida）再生和转化体系的建立与优化.pdf

华南师范大学硕士学位论文答辩合格证明 学位申请人猛麴i i ! 向本学位论文答辩委员会提交 题为矗i 进堕 堑蔓丝竺丝! 垄2 墨垒坐篓丝垡丝璃赣垒倦文， 经答辩委员会审议，本论文答辩合格，特此证明。 学位论文答辩委员会委员( 签名) 主席：务y 八 委员： 堑兰i 耋 建盗盎 论文指导老师( 签名) ：们着们有 抽，年月、7 日 ( 此框用j ：存档的学位论文贴学位论文答辩合格证明) 摘要 非洲菊( g e r b e r ah y b r i d a l 为世界六大切花之一，也是重要的笳栽花卉。由于 各种病毒、微生物和害虫的侵害以及本身的耐热性、耐冷性不高，使非洲菊的品 质提高受到很大限制。利用组织培养结合基因工程技术是一种具有前景的育种方 法。前人的研究表明，非洲菊不定芽冉生频率因品种不同而有很大差异。非洲菊 深圳5 号( s 5 ) 花色鲜艳，但组培中的愈伤组织诱导和植株币生系统的建立比较 困难。尽管非洲菊转基因工作国际上已有报道，但再生途径还不完善，导致转化 效率很低，国内目前还只是处于转化条件摸索的阶段，尚未有实质性突破的报道。 针对以上问题，本研究采用s 5 为实验材料，进行再生和转化体系的建立和优 化，获得了以下主要结果： 建立了两种s 5 不定芽再牛体系。研究表明附加有较高浓度b a 、n a a 和i a a 的1 2 m s 2 培养基对于s 5 花托的愈伤组织以及不定芽诱导效果最好。y y l 0 培养 基则最适丁从单芽基部切口处直接孬导出丛生芽。而目后者适宜做为转化受体的 再生途径。 通过根癌农杆菌介导法建立了非洲菊遗传转化体系。通过测定g u s 基因的瞬 时表达率和抗性芽发生频率，研究影响根癌农杆菌转化非洲菊s 5 的主要因素。结 果表明：菌液浓度o d 6 0 0 为0 4 0 5 ，侵染时问为1 0 m i n ，其培养时间为3 d 的处理 足最佳组合，g u s 的瞬时表达率( 2 0 ) 以及抗性芽的发生频率( 2 0 ) 最高； 农杆菌在植物诱导培养基中预培养2 h 为宜；农杆菌y e b 菌液先培养2 4 h ，再转部 分菌液到新鲜y e b 培养基中继续培养1 2 h 后转化效果最好；在植物诱导培养基和 共培养基上都添加a s 且浓度为2 0m g l 可以较好地活化农杆菌，提高转化效率。 对抗性芽进行g u s 的稳定性表达、p c r 以及s o u t h e r n 杂交检测，结果表明： 经t t y g 反复筛选得到1 2 株抗性芽经g u s 染色检测全为阳性：其中9 株来自上述 的同个最佳试验组合，平均转化率为7 4 3 。这9 株g u s 阳性抗性芽经p c r 扩增、s o u t h e r n 杂交检测，证实外源基因已整合进植物基因组。 哭键词：非洲菊，再生，转基因，g u s ，分子杂交 a b s t r a c t g e r b e r ah y b r i d ai so n eo ft h es i xm a j o rc u tf l o w e r si nt h ew o r l da n di sa n i m p o r t a n tp o t t e df l o w e r h o w e v e r ，g e r b e r ai sv u l n e r a b l et ov i r u s e s ，m i c r o o r g a n i s m s a n dp e s t s ，a n di ti ss e n s i t i v et oh e a to rc o l d ，w h i c hg r e a t l yl i m i t si t sw i d e a p p l i c a t i o n t ot h em a r k e t t h e r ea r ei n c r e a s i n gs t u d i e so nt h e i m p r o v e m e n to fg e r b e r ab ya l l k i n d so fm e a n s ，o n eo fw h i c hi st i s s u ec u l t u r ec o m b i n e dw i t hg e n ee n g i n e e r i n g i n t h ep a s ty e a r s ，g r e a ta c h i e v e m e n t si nt i s s u ec u l t u r eo fg e r b e r ah a v eb e e nm a d e a n d t h e r e g e n e r a t i o nf r e q u e n c y o f s h o o t sd i f f e r s g r e a t l ya m o n gd i f f e r e n t v a r i e t i e s s h e n z h e n 5 ( s 5 ) i so n e o ft h ev a r i e t i e sw h i c ha r ed i f f i c u l tt o e s t a b l i s hc a l l u s i n d u c t i o na n dr e g e n e r a t i o ns y s t e m s a l t h o u g ht h e r ea r eg r o w i n gs t u d i e so nt h eg e n e t r a n s f o r m a t i o no f g e r b e r a ，p r o b l e m ss t i l lr e m a i nt ob es o l v e d t h ea i mo ft h i s s t u d y i st oe s t a b l i s he f f i c i e n ta n ds t a b l es h o o t r e g e n e r a t i o n s y s t e m so fs 5a n dt od e v e l o pt h eo p t i m a lt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mt h r o u g hs c r e e n i n g t h ef a c t o r sa n dc o n d i t i o n si n v o l v e di ng e n et r a n s f o r m a t i o n i nt h i s s t u d y ，t w os h o o tr e g e n e r a t i o ns y s t e m so fs 5w e r ee s t a b l i s h e dt h r o u g h t i s s u ec u l t u r e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e o p t i m a lm e d i u mf o rc a l l u sa n ds h o o t i n d u c t i o nf r o mr e c e p t a c l ew a s1 2m s 2 c o n t a i n i n gb a ，n a a a n di a ai nh i g h e rl e v e l s t h eo t h e rm e d i u mf o rs h o o t r e g e n e r a t i o nf r o ms i n g l eb u dw a sy y l 0a n d a r a p i d a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o no fs 5b yu s i n gt h i ss h o o t r e g e n e r a t i o ns y s t e mw a s d e v e l o p e d m a j o r f a c t o r si n v o l v e di na g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o no fs 5w e r e s t u d i e d t h et r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c y w a sd e t e c t e dw i t ht r a n s i e n te x p r e s s i o no fg u s g e n e ( c o n t a i n i n ga ni n t r o n ) a n dt h er e g e n e r a t i o no fh y g r o m y c i n ( h y g ) 一r e s i s t a n ts h o o t t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lp r o t o c o li n c l u d e a g r o b a c t e r i u mc o n c e n t r a t i o na t 0 4 一o 5 ( 0 d = 6 0 0 ) f o rb a c t e r i u mi n o c u l a t i o n ，1 0m i n u t e sf o ri n o c u l a t i o no ft h ee x p l a n t a n d3d a y sf o rc o c u l t u r e t h e 爿g r d 6 c 耙r i “mp r e c u l t u r ei np l a n ti n d u c t i o n s u s p e n s i o nf o r2 h o u r sw a se f f i c i e n tf o rt r a n s f o r m a t i o n i tw a sag o o d w a y f o rk e e p i n g a c t i v i t yo f 4 a g r o b a c t e r i u m w h e n t h e yw e r e d i l u t e da n dt r a n s f e r r e di n t oa n o t h e rf r e s hm e d i u mf o r1 2h i n c n b a t i o na f t e rc u l t u r ef o r2 4 hi ny e bm e d i u m i na d d i t i o n ，t h ep l a n ti n d u c t i o nm e d i u m a n dt h ec o c u t u r em e d i u m c o n t a i n i n g2 0m g la c e t o s y “n g o n e ( a s ) w e r ep e r f e c tf o r a c t i v a t i o no f a g r o b a c t e r i u m ，w h i c hi n c r e a s e dt h et r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y t r a n s f o r m a n t ss h o w e ds t a b l ee x p r e s s i o no fg u s g e n e i nt h el e a v e so f p l a n t sa n dt h e h y g r o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s eg e n e ( 胛刁w a si n t e g r a t e di n t ot h eg e r b e r ag e n o m e ， w h i c hw a sc o n f i r m e db yh i s t o c h e m i c a lg u s a s s a y ，p c ra n ds o u t h e r n b l o tr e s p e c t i v e l y n i n ei n d i v i d u a l so ft h et r a n s f o r m a n t sw e r e d e v e l o p e df r o m t h es a m e o p t i m a lp r o t o c 0 1 a n d t h ea v e r a g et r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yr e a c h e d7 4 3 k e yw o r d s ：g e r b e r a ，r e g e n e r a t i o n ，g e n et r a n s f o r m a t i o n ，g u s ，m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n 6 b a a s b p c a r c e f d d n t p d d h ，o d f e d t a g u s h h y g h p t i a a k a n k b m c s m s n a a n a 0 h n p t i i n g 0 d p c r r r n a s e r p m c t a b s e c s s s t r t a q t d n a t i t r i s t r i s h c l x g l u c 芦l z m o l 缩略词( a b b r e v i a t i o n s ) 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e a c e t o s y r i n 9 0 n e b a s ep a i r c a r b e n i c i l i n c e f r a d i n e d a y d e o x y c y t i d i n et r i p h o s p h a t e d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d e g r e ef r e e d o m e t h l e n e d i a m i n et e t r a c e t i ca c i d 1 3 - g l u c u r o n i d a s e h o u r h y g r o m y c i n h y g r o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s eg e n e i n d o l ea c e t i ca c i d k a n a m i c i n k i l o b a s e m u l t i c l o n es i t e m u r a s h i g ea n ds k o o g m e d i u m n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d s o d i u mh y d r o x i d e n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e i i n a n o g r a m o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r a n g e r b o n u c l e a s e r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e s e c o n d s u m s q u a r e s t r e p t o m y c i n t h e r m u s a q u a t i c u sd n ap o l y m e r a s e t r a n s f e rd n a t u m o r i n d u c i n g t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e t r i sh v d r o c h l o r i d e 5 - b r o m o 一4 一c h o l r o 3 i n d o l y l b d g l u c u r o n i d e m i c r o l i t r e n l i c r o m o l a r 6 6 苄氨基嘌呤 乙酰丁香酮 碱基对 羧苄青霉素 头孢拉定 天 脱氧核糖核苷酸 双蒸水 自由度 乙二胺四乙酸二纳 b 葡萄糖苷酸酶 小时 潮霉索 潮霉素磷酸转移酶基因 吲哚乙酸 卡那霉素 千碱基 多克隆位点 m s 培养基 萘乙酸 氢氧化纳 新霉素磷酸转移酶 纳克 光密度 聚合酶链式反应 极差 核糖核酸酶 每分钟转速 十六烷基三甲基溴化铵 秒 平方和 链霉素 t a q 嗜热水生菌聚合酶 转移d n a 致瘤性的 三羟甲基氨基甲烷 t r i s 盐酸 5 一溴4 氯3 吲哚b d 葡萄糖苷酸酯 微升 微摩尔 1 研究概况 1 1 二l f 洲菊( g e r b e r ah y b r i d a ) 非洲菊别名扶郎花，为菊科大丁草属多年生革本，高可达6 0 c m ，茎缩短，多 数叶为基生。头状花序单生，直径8 1 2 c m 。花序共由三轮单花组成，外轮为舌状 化，中间为过渡型花，内轮为擞状花。非洲菊原产南非，现世界广为栽培，新品 种不断出现，为世界六大切花之，也是熏要的盆栽花卉。牛陡适温为2 0 2 5 。c ， 夜间1 4 1 6 。c ，喜冬季温和，夏季凉爽的气候条件。它的园艺品种很多，花枝清秀 挺拔，花梗修跃，装饰性强，花色艳丽，花朵硕大，观赏价值很高，在切花市场 上形势看好。 然而，非洲菊极易受到各种病毒、微生物和害虫的侵害。如非洲菊在室内盆 栽时常发生枯萎病、叶斑病和白粉病。虫害主要有红蜘蛛和蚜虫危害叶片和花茎。 另外，非洲菊不耐冷、热，i ：花适温不低于1 5 ，冬季休h 民期适温为1 2 1 5 ，低 j 二70 | c 则停j r - 长。而且非洲菊根及茎基部极易发生腐烂，特别是在阿涝天。所以 非洲菊在春季多雨、夏季炎热的天气情况下生长发育不好，开花更是受到限制， 花朵小，色泽变差。非洲菊切花瓶插寿命也较短。这些都使非洲菊广泛应用于市 场受到极大的限制。一方面，随着经济发展和生活水平的提高，人们对花卉质量 的要求越来越高。另一方丽，为了降低成本、提高产量和质量，生产实践中人们 急需培育优质的非洲菊新品种。 育种工作者及遗传工作者一直都在研究探索生产各种花色、花型、花香、以 及瓶插寿命长，具有抗性的花卉新品种。传统杂交育种技术在新品种选育方面做 出了巨人贡献，但存在杂交育种时问长、杂交难以引入亲源性较远种的优良性状， 引入某一或某些优良性状时往往伴随一些不良的性状引入等缺点。自1 9 8 7 年m e y e r 等获得转基因矮牵牛以来，花卉基因工程迅速发展，并已成为花卉育种的新趋势。 i 传统育种手段相比，基因t 程育种具有定向修饰花卉某个或某些性状而保持其 它性状不变的优点：通过引入外来基因可以扩大基因库( 傅荣昭等，1 9 9 5 ) ；转基 因花卉容易被公众接受；转基因花卉的观赏指标通过目测和少量辅助手段可以很 容易判断其性状优劣等特点( 傅荣昭等，1 9 9 4 ) 。因此，基凶工程技术在拢卉品种 改良和新品种选育方面的应用倍受关注。利用基因工程技术将有望实现对非洲菊 1 2 花色、花形、抗性、花期、瓶插寿命、花香等性状进行改良。 1 2 非洲菊植株再生体系的研究现状 成功的基因转化首先依赖于良好的植物基因转化受体系统的建立。高效稳定 的再! i ! 能力是植物转化体系应具备的条件之一，由于植物基冈转化的频率较低， 一般情况卜- ，只有0 1 的转化率，而且在植物基因转化操作巾的一些处理，如农 杆菌的侵染，使用抗牛素对转化体进行筛选和继代培养等都会使转化外植体比非 转化外植体的再生频率有不同程度的降低，有的甚至不能分化或只能分化形成芽， 且难以形成正常植株。若建立的受体系统再生频率较低，比如只有1 0 ，则实际 的转化频率可能是1 0 o 1 = 0 0 1 ，即1 万个转化外植体中可能有1 个获得转 化成功( 二e 关林和方宏筠，1 9 9 8 ) 。因此，植株再，卜是基凼转化的关键步骤，直 接决定能否获得转基因植株。 1 2 1 非洲菊植株再生体系的类型、特性和研究概况 早在2 0 世纪7 0 一8 0 年代，已有人着手对非洲菊进行组织培养。至今，对非洲菊 的植株离体再生的研究不断深入。非洲菊离体再生途径一般有两种：间接器官发 生途径( 愈伤组织再生途径) 以及直接器官发生途径。 1 2 1 1 问接器官发生途径( 愈伤组织再生途径) 愈伤组织再生系统作为基因转化系统其有如下优点和不足( 1 三关林和方宏筠， 2 0 0 2 ) ： ( 1 ) 外植体细胞经历了脱分化和再分化两个过程，使已分化的细胞均回复到脱分 化的分生细胞水平，具有易于接受外源基因的能力，因此转化率较高。 ( 2 ) 扩繁量大，可获得较多的转化植株。 ( 3 ) 外植体试材广泛，多种组织、器官均可诱导愈伤组织。 ( 4 ) 该再生体系获得的再生植株无性系变异较大。 目前非洲菊植株再生途径丰要通过间接器官发生途径即愈伤组织再生途径。 陈发棣等( 1 9 9 8 ) 采用m s 为基本培养基，添加不同浓度及配比的n a a 和b a ，对 两个非洲菊品种“奥林匹克”和“紫鹅绒”的叶片进行离体培养，诱导愈伤组织，但未 诱导出芽，川i 同品种培养效果不同。张建华等( 2 0 0 2 ) 用非洲菊“s a n g r i a ”品种 试管苜的叶片为诱导材料，在m s 添3 n b a 4 m g l 及i a a 0 2 m g l 的培养基上，愈伤组 1 3 织诱导率可达1 0 0 ，由愈伤组织分化芽的诱导率也可达1 0 0 。但叶华等( 2 0 0 3 ) 用非洲菊品 q , r 2 的试管曲叶片为外植体，结果表明很难直接诱导出芽，由愈伤组 织分化出芽也很困难。郑秀芳等( 2 0 0 2 ) 用四个一i 同的非洲菊品种，以花托、幼 叶、幼叶柄和花梗为外植体诱导芽，结果表明花托是所培养外植体巾再生能力最 强的部分；品种之问存在差异，但在2 个月内能从愈伤组织诱导出芽。 细胞分裂素类b a 诱导花托分化出芽的能力i ：l k t 强f 鲁雪华等，1 9 9 9 ) 。n a a 对 非洲菊愈伤组织的诱导作用优于l a a ，但其诱导芽的效果并不i z h l a a 强，这可能是 由1 二愈伤组织的过度生长而抑制了芽的分化( 郑秀芳等，2 0 0 2 ) 。一般细胞分裂 素与生长素的比例为1 0 ：1 或1 5 ：1 诱导的非洲菊芽分化率较高( 鲁雪华等，1 9 9 9 ) 。 一般采用的b a 浓度范围为2 1 0 m g l ，i a a 或n a a 采用的浓度范围y , a o 1 1 0 m g l 。 低浓度( 拘b a ( 0 - 5 m g l ) 难诱导非洲菊芽的分化，随着b a 质量浓度的升高，出芽效 果较好；生长素质量浓度增高，愈伤组织量也有所增加，但芽的分化会受到抑制 ( 郑秀芳等，2 0 0 2 ) 。 综上所述，前人利用组织培养技术对非洲菊离体再生已作了一定的研究，但 所采用的品种各不相同，外植体的种类，生理年龄也不一致， _ h 此报道的芽再e 的最佳培养条件及再生频率存在较大差异，距离高效稳定的再生体系还有差距。 就外植体种类而言，由不同品种的叶片诱导不定芽分化大多极其困难，从试管茁 的叶片、叶柄诱导不定芽再生频率略高。 1 2 1 2 亩接分化再生系统 所谓直接分化再生系统是指外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织阶段而直接 分化出不定芽获得再生植株。其特点如下( 王关林和方宏筠，2 0 0 2 ) ： ( 1 ) 获得再生植株的周期短，操作简单。 ( 2 ) 山于未经脱分化的细胞直接分化芽，所以体细胞无性系变异小，能较好地保 持受体植物的遗传稳定性，转化的外源基因l i 能实现稳定地遗传。 ( 3 ) 更适于无性繁殖地园艺植物如果树、花卉及某些木本植物。 ( 4 ) 但由于外植体细胞直接分化芽比诱导愈伤组织困难得多，要使转化细胞直接 分化成植株更是困难。因此其转化频率低于愈伤组织再生系统。 ( 5 ) 由于彳i 定芽得再生常起源于多细胞，因此直接再生系统同样出现较多的嵌合 体。 在非洲菊的组织培养研究中，不定芽直接再生的研究很少。成功转化的关键 是将外源基因导入那些具有再牛能力的细胞。农杆菌介导的转化方法主要作用于 外植体的表层细胞，如果再生植株细胞起源于深层细胞，则很难得到转化株，即 使得到转化株，其转化频率也很低，且转化植株表现为嵌合体，这就是所淄“转化” 和“再生”的矛盾。因此要获得转基冈苗以及提高转化效率，必须保证芽的再生部 位与转染部位一致。本研究拟在前人对非洲菊组织培养研究的基础上，一方丽探 索通过以卜两种再生途径提商植株再生频率以及提高再生稳定性，另一方面尽量 提高有效芽即提高从离切口较近处或是直接从切口诱导出芽的频率，这样才有利 于农杆菌转染，提高转化植株再生率。 1 3 基凶工程在非洲菊遗传改良中的应用研究 国外埘非洲菊转基因进行了初步的研究工作，但也仅限于一两个实验室的报 道，且转化效率很低。例如，e l o m a a 等( 1 9 9 3 ) 以红色品种t e r r ar e g i n a 试管茼的 叶柄为外植体，利用根癌农杆菌将外源基因导入外植体，然后进行卡那霉素( k a n ) 选择，最后每1 0 0 个外植休获得0 1 2 个转基因苗。k o t i l a i n e n 等( 2 0 0 0 ) 从杂乖fr 非 洲菊中克隆到一个与雄蕊发育有关的基因g r c d l 基因，并将其反义导入杂种非洲 菊，转化株的头状花序第二乏轮花器官中的雄蕊变成花瓣型，由此导致雄蕊败育。 而存凼内，非洲菊的转基因研究至今少见报道。叶华等( 2 0 0 3 ) 用非洲菊品种r 2 的试管苗带叶叶柄作为外植体，诱导愈伤组织和芽，并用愈伤组织作为农杆菌转 染的受体，由此对非洲菊的基因转化受体系统的建立做了初步的摸索工作。刘慧 ( 2 0 0 4 年) 采用不同品种的非洲菊叶片为外植体，研究非洲菊再生体系的建立， 同时也探索了遗传转化的一些条件和影响因素。总的来看，非洲菊转基因的有关 研究还处于起步阶段，有待进一步完善转化条件、技术并提高转化效率，在此基 础上才能实现非洲菊性状的改良并把相关技术推广应用到整个花卉基因l - 程的实 施。p 去。 1 4 根癌农杆菌介导的植物遗传转化系统 1 4 1 根癌农杆菌介导的遗传转化系统的优点 植物遗传转化技术是通过物理、化学或生物技术将外源基因导入受体植物的 基凼组并使其在后代植株中表达的技术，常用的有农杆荫介导法、病毒介导法、 基因枪法、电激法、脂质体法、微注射法、花粉管通道法、子房注射法等。农杆 菌是种土壤杆菌，属根瘤菌科，革兰氏染色阴性。介导基因转化的农杆菌有两 种类型：撤癌农杆菌和发根农杆菌，它们分别含有t i 和r i 质粒。根癌农杆菌介导的 遗传转化系统是目前研究最多、机理最清楚、技术最成熟的基因转化系统。利用 农杆菌t i 质粒转化系统己获得许多转基因植物，特别是双子叶植物。第一批能表 达外源基因的转基因植物就是用根癌农杆菌介导转化获得的( 王关林和方宏筠， 1 9 9 8 ) 。此后，根癌农杆菌介导基因转化的研究迅速发展，至今所获得的转基因 植物中8 0 以l 是利用该系统产生的。大量的实验证明，根癌农杆菌t i 质粒转化系 统与发根农杆菌r i 质粒转化系统、无转化载体引导的裸露d n a 转化系统( f l d n a 直接导入、基因枪轰击转化等) 相比，具有许多突出的优点：如转化效率高、导 入的目的片段确切且能导入大片段d n a 、导入的基因多为单拷贝目，遗传稳定性好 等。 根癌农杆菌介导基因转化的机理在于其t i 质粒中有一段t - d n a ，在农杆菌浸 染植物材料时，这段t - d n a 可从t i 质粒中分离出来，转入植物细胞并整合到植物 细胞的基因组中进行表达。根癌农杆菌转化植物的方法主要有叶盘法、整株感染 法、原生质体共培养法及创伤植株感染法等。 1 4 2 影响根癌农杆菌介导的遗传转化效率的因索 影响农杆菌介导的遗传转化效率的因素很多，主要取决于农杆菌菌株类型、 侵染能力和植物材料的再生能力。 ( 1 ) 菌株类型：根癌农杆菌有胭脂碱型、章鱼碱型和琥珀碱型。l b a 4 4 0 4 菌 株是一种含有双元载体的章鱼碱型根癌农杆菌，由于寄主范围广而被广泛用于植 物的基因转化。e h a l 0 1 ，e h a l 0 5 等属于琥珀碱型菌株，具有超毒力，也常用于 基因转化。 ( 2 ) 农十1 ：菌的侵染力。农杆菌侵染力的强弱主要与毒性区基因表达的强弱有 关，低浓度的酚类化合物如a s 、芥予酸、咖啡酸可诱导毒性区基因的活化从而增 强t - d n a 的转移。另外，有报道( h i e i 等，1 9 9 4 ) 认为：在农杆菌与植物细胞进行 共培养时，使用较低p h ( p h 5 2 以下) 的培养基有利于转化频率的提高：其原因可能 是在偏酸的培养条件下，有利于农杆菌v i r 区基因的表达。 ( 3 )外植体的种类和感受态细胞的选择。用于基因转化的外植体的种类对转 化效率有显著的影响。实验表明很多材料如几1 1 片、子叶、块茎、下胚轴、胚、花 序等都可用做外植体进行转化，但不同植物的最佳外植体不同。 植物外植体是否存在感受态细胞直接影响转化效率。农杆菌转化植物细胞的 另一个前提是植物细胞需处于旺盛的分裂期，具有较强的接受能力。有研究表明 玉米幼胚小同发育阶段对农杆菌的感受性不同，只有在某些发育阶段的细胞才处 于感受态时期，这些时期的细胞具有较高的农杆菌感染率( s c h l a p p i 等，1 9 9 2 ) 。 有研究报道对转化外植体进行预培养可使植物细胞处丁“感受态”( 何洪智等， 1 9 9 9 ) 。也有较多研究采用分裂能力强的愈伤组织作为转化材料，以其提高转化材 料的感染能力。 ( 4 ) 其培养时问。共培养对转化效率有很大的影响。共培养时问太短，t - d n a 1 i 能转移到植物中去：共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，会导致植物细 胞受到毒害而死亡。需要根据不同的植物材料和外植体确定最佳共培养时间。 ( 5 )农孝t 菌的浓度和外植体的浸染时间。二者对转化效率有很大的影响。菌 液浓度太低，浸泡时间太短，农杆菌不能接种到伤口面，不能发生转化；菌液浓 度太高，浸染时问太k ，会导致外植体褐化甚至农杆菌过度生长引起外植体死l 、：。 ( 6 )抑菌抗生素和选择抗生素的种类和浓度。它们对转化效率的影响主要表 现存对外植体分化的影响上。选择抗生素的浓度过高，会引起外植体的死亡，过 低又会增加假阳性发生的频率。 1 5 本研究目的 非洲菊备品种外面三层舌状花的颜色较多变化，有白、黄、桔红、红等色， 而最晕面一层盘状花颜色常见只有两种，黑色和淡黄色。各花色品种中，黑色盘 状花品种的植株再生困难，再生频率很低( 倪丹等，2 0 0 2 ；王红梅，2 0 0 0 ，刘福 i f 等，2 0 0 0 ) 。深圳5 号( s 5 ) 舌状花为桔黄色，盘状花为黑色。该品种在“东地 区广泛栽培，也是最受喜爱、市场销售情况较好的一科t ，然而该品种植株再生频 率很低。本实验室已经采用s 5 为实验材料，对非洲菊的花发育以及发育调控进行 了一系列研究工作( m e n ga n d w a n g ，2 0 0 4 ；m e n g 等，2 0 0 4 ；陈丹生等，2 0 0 4 ；谢 修志等，2 0 0 4 ) 。本研究试图以s 5 为实验材料，通过组织培养技术建立并优化获得 高效稳定的非洲菊植株再生体系和基因转化体系。以期在实践中为培育抗逆境、 抗虫害、提高花卉品质的非洲菊优良新品种奠定基础，同时为非洲菊功能基冈的 研究提供转化系统。 2 非洲菊植株再生体系的建立与优化 2 1 材料与方法 2 1 1 试验材料 以广州增城镇龙鲜花基地采摘的非洲菊深圳5 号( 简称s 5 ) 为材料。分别以 非洲菊花托( 花序轴) 、总苞以及s 5 组培茁( 继代6 代以内) 的单芽为外植体。 2 1 2 研究方法 2 1 2 1 间接器官发生途径 2 1 2 1 1 外植体及愈伤组织诱导 选取直径为l c m 左右的非洲菊s 5 花蕾，洗净后用7 0 的酒精浸泡3 0 s e c ，再 以o 1 升汞浸泡1 3 m i n ，无菌水漂洗7 8 次后，去掉外面的总苞片，切取花托部 位，分成4 小块接种于愈伤组织和4 i 定芽诱导培养基( y s l y s 8 ；y y l y y 4 ) 。各 种培养基均以m s 为基本培养基，附加升i 同浓度的b a ( 2 - 1 0 m g l ) 、 n a a ( 0 2 0 5 m g l ) 和i a a ( 0 2 0 5 m g l ) 。培养基中蔗糖3 ，琼脂0 8 ，p h 5 8 。 以下实验中蔗糖，琼脂及d h 值都与此实验卡h 同。 2 1 2 1 2 愈伤组织继代及诱芽培养 从2 ，1 2 1 1 筛选出两种愈伤组织诱导效果好的培养基y y 3 和y y 4 。在此基 础上，保持激素浓度不变，试验m s 、1 2 m s 和b s 这三种基本培养基对花托外植 体愈伤组织及不定芽诱导的影响。 在以上实验确定了诱导愈伤组织的最佳基本培养基和激素浓度组合的基础 上，将花托培养一定时间( 1 5 2 0 d ) 后，将诱导出的愈伤组织转至含较低浓度激 素的培养基上( a 、b ) 进行愈伤组织的继代和诱导不定芽。 在以上确定的最佳培养基的基础上，试验n a a 以及l a a 尊因子浓度变化 ( 0 - 0 5 r a g l ) 对花托诱导愈伤组织和不定芽的影响。 2 1 ，2 2 直接器官发生途径 2 1 2 2 1 总苞为外植体诱导芽直接再生 将i c m 左右花蕾如2 1 2 1 1 所述方法消毒，切取花托下的总苞( 1 c m x l c m ) h 植体接种在培养基( y y 5 y y 7 ) 中诱导不定芽。 2 1 2 2 2 单芽增殖 从组培曲( 继代6 代以内) 切取单芽为外植体，接于不定芽增殖培养基 ( y y 8 - y y l 0 ) 中直接诱导芽再生。 2 1 2 3 生根 不定芽移入生根培养基m s + i a a ( o 3 r a g l ) 上一个月后，统计成苗酉分率。 2 1 2 4 光照条件 光照培养( 1 2 h 光1 2 h 暗的周期) ，培养温度为2 4 _ + 1 。 2 1 2 5 结果分析的指标 统计各处理的愈伤组织发生频率，不定芽发生频率和不定芽形成的平均数。 通过统计分析，挑选愈伤组织诱导、不定芽诱导所需最适条件。以上实验每处理 外植体数为2 0 个，重复2 次。数据均采用最小显著差数法( 简称l s d 法) 统计分 析各处理问的差异性水平。 本次实验形成愈伤组织的外植体数 愈伤组织发生频率= 不定芽发生频率= 本次实验中接入的外植体总数 诱导出不定芽的愈伤组织块 本次实验中接入的外植体总数 不定芽形成的平均数= 诱导出的不定芽总数 诱导出不定芽的愈伤组织块数 1 0 0 1 0 0 1 0 0 2 2 结果与分析 2 2 1 间接器官发生途径 2 2 1 1 愈伤组织和不定芽诱导培养基的初步筛选 表2 1愈伤组织和币定芽诱导培养基的初步筛选 t a b l e2 - lp r i m a r ys c r e e n i n go fc u l t u r em e d i u mf o rc a l l u sa n ds h o o tr e g e n e r a t i o nf r o mr e c e p t a c l e 以花托为外植体，外植体培养1 0 d 后，一部分外植体上可见淡绿色愈伤组织， 到了1 5 d 左右，大部分外植体有明显愈伤组织，其中以培养基y y l y y 4 诱导愈伤 组织的效果最为明显。在2 0 d 左右，序号分别为y s 4 、y s 7 、y s 8 、y y 3 、y y 4 培 养基l 的花托愈伤组织发生率都达到1 0 0 。综合来看，其中y y 3 、y y 4 培养基 对于花托愈伤组织的诱导速度快，诱导率高。 在实验中发现，在b a 浓度较低的培养基中，花托外植体长至2 0 d 还未有芽点 出现，而且随后较多出现褐化。而在b a 浓度偏高的y y 3 、y y 4 培养基中，2 0 d 有芽点从愈伤组织上长出。3 0 d 后，大多数外植体出现褐化，并且未发现有新芽继 续产生。 2 2 1 2 无机箍埘愈伤组织及芽诱导的影响 以花托为外植体，接种在m s l 、m s 2 、i 2 m s l 、1 2 m s 2 、b 5 1 、b 5 2 培养基 ( m s 、i 2 m s 、b 5 基本培养基分别添加y y 3 、y y 4 培养基中的激素，序号为1 表明添加与y y 3 培养基相同浓度的激素，序号为2 表明添加与y y 4 培养基相同浓 度的激素) 。花托培养1 5 d 、2 0 d 后分别记录愈伤组钐 、不定芽诱导的情况，实验 结果如表2 - 2 所示。 农2 - 2无机盐对愈伤组织诱导及不定芽分化的影响 t a b l e2 - 2e f f e c t so fi n o r g a n i cs a l t so nc a l l u si n d u c t i o na n ds h o o tr e g e n e r a t i o n 注i 表中的数据为两次的平均值。同列中相同字母表示无品著性差异f a = 0 0 5 ) 。 n o t e ：d a t ai nt h et a b l ea r ea v e r a g e so ft w or e p l i c a t i o n s f o re a c hb a r ，m e a n sw i t ht h es a m el e t t e r a r en o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n ta ta = 0 0 5 ， 由表2 2 可知，基本培养撼b 5 诱导愈伤组织的效果都较差。1 2 m s 和m s 诱 导愈伤组织的效果没明显差别，而在愈伤组织诱导芽中，1 2 m s 的效果较好。而 且实验还发现i 2 m s 基本培养基诱导出的愈伤组织不易褐化，大多保持绿色。因 此我们认为在铵赫和硝酸盐保持一定的合适比例，面且含量不要太高的条件下， 对非洲菊花托外植体的愈伤组织及不定芽分化有良好的效果。 2 2 1 3 继代培养对不定芽诱导的影响 以化托为外植体，在1 2 m s l 、1 2 m s 2 培养基上诱导愈伤组织，1 5 2 0 d 后将愈 伤组织转至编号为a 、b 培养基中继代培养以及诱导不定芽，实验结果如表2 - 3 所 示。在含较低b a 浓度的a 培养基上愈伤组织继代及芽诱导效果较好。当愈伤组 织在转到含较高b a 浓度的b 培养基时，愈伤组织现褐化，最终没有不定芽的 分化。征前面实验中也发现，花托外植体一直存激素浓度较高的培养基培养时， 外植体褐化严重，极少有不定芽分化。所以在以花托为外植体进行愈伤组织及不 定芽诱导时，应该定期进行转瓶继代。而且愈伤组织由含高浓度b a 转至含较低浓 度b a 的培养基将有利于不定芽的分化。在含较低浓度b a 的a 培养基中，不定 芽发生率大于含较高浓度b a 的b 培养基，但在不定芽形成的平均数方而没有很 大差异。结合以上实验结果，花托初代培养诱导愈伤组织的最佳培养基为1 2 m s 2 ； 愈伤组织继代及不定芽分化培养基为a 。 表2 - 3继代培养对于不定芽分化的影响 t a b l e2 - 3e f f e c to fc a l l u ss u b c u l t u r eo i ls h o o tr e g e n e r a t i o n 注：表中的数据为两次的平均值。同列中相同字母表示无显著性著异f a = 0 0 5 ) 。 n o t e ：d a t ai nt h et a b l ea r ea v e r a g e so ft w or e p l i c a t i o n s f o re a c hb a r , m e a n sw i t ht h es a m el e t t e r a r en o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n ta ta = 0 0 5 ， 2 ，1 2 4n a a 对愈伤组织及不定芽诱导的影响 从图2 1 可知，n a a 对非洲菊花托诱导出愈伤组织以及不定芽的影响并不一 致。其浓度在0 m g l 至o 5 m g l 范围内，愈伤组织发生频率随n a a 浓度的提高而 增加。而在n a a 浓度为0 m e l 至o 2 m g l 范围内时，不定芽的发生频率也随n a a 的浓度的提高而增加；当n a a 浓度由0 2 m g l 增加到o 5 m g l 时，不定芽的发生 频率降低，这说明n a a 对于不定芽发生有较大影响。把1 2 m s 2 培养基中的b a 和i a a 浓度保持不变，n a