（微生物学专业论文）酿酒酵母snf1基因缺失突变株的构建及生物学特性研究.pdf

摘要 中文摘要 能源是整个世界发展和经济增长的最基本的驱动力，是人类赖以生存的基 础。然而由于世界人口的急剧膨胀以及世界经济的迅猛发展，能源危机、粮食短 缺和环境污染已经成为国内外注目的焦点。随着石油危机的加重和粮食危机的日趋 严重，生物可再生能源的开发显的尤为重要，非粮为原料的燃料乙醇优势凸显。酿 酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 做为真核模式生物，一直以来都是传统的乙醇 代谢菌，被广泛应用于生物乙醇的发酵生产。 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 中主要有五个基因( a d h l - a d h 5 ) 编码 与乙醇代谢相关的乙醇脱氢酶系，其中a d h l p 、a d h 3 p 、a d h 4 p 和a d h 5 p 这四种乙 醇脱氢酶在厌氧发酵过程中负责还原乙醛生成乙醇；而当环境中缺少作为碳源的葡 萄糖时，受葡萄糖阻遏的a d h 2 基因起始表达，生成a d h 2 p 开始催化乙醇作为碳源 进行生长；同时a l d 基因编码的乙醛脱氢酶a c d h 启动催化乙醛氧化为乙酸的生 化反应，从而减少乙醛生成乙醇的量。s n f l 基因编码的s n f l p 是一个依赖于a m p 激活的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，对受到葡萄糖阻遏效应的基因的转录具有重要的 调控作用，对a d h 2 p 和a c d h 的合成也是至关重要的。因此敲除s n f l 基因有望提 高酿酒酵母乙醇生物合成能力，并可为研究酿酒酵母的分子调控机制打下基础。 该论文通过l f h - p c r 的方法合成了两端各带有3 3 3b p 和3 2 3b p 与s n f l 序列 上下游同源的基因敲除组件。将该敲除组件转化至酿酒酵母y s 2 ，获得被 l o x p - k a n 1 0 x p 序列组件替换而产生k a n 7 的阳性克隆子。然后将质粒p s h 6 5 转入阳性 克隆子并诱导表达c r e 酶切除k a n 基因，进而通过传代丢失质粒p s h 6 5 后得到删 单倍体缺陷型菌株。重复转化敲除组件实现另一条等位基因的敲除，得到s n f l 双 倍体缺陷型菌株y s 2 s 们：l o x p k a n l o x p 。厌氧发酵试验表明该突变株的乙酸产量 较出发菌株y s 2 降低了l o 0 5 ，乙醇产量提高了8 7 4 。残糖量试验表明在培养 基中葡萄糖消耗殆尽后，突变株相对于出发菌株而言并没有利用乙醇作为碳源，乙 醇产量保持稳定未有下降。因此敲除s n f l 基因在一定程度上提高了酿酒酵母乙醇 的生物产量。 关键词：酿酒酵母；s n f l 基因；基因敲除；乙酸；乙醇 中文文摘 中文文摘 长期以来，化石燃料一直作为人类能源的主角支撑着世界经济的发展。然而， 随着科技进步、人口增多、工业化程度增高，能源需求已经显得捉襟见肘了。而且 这些不可再生的燃料的使用对自然环境会造成不同程度的污染和破坏。随着能源危 机、粮食问题和环境恶化等问题的日趋凸显，生物质能源成为当今国际上新能源开 发的热点，被誉为“绿色”能源。 燃料乙醇是未来可再生能源的主流，是一种良好的液体燃料。乙醇的热值仅为 汽油的三分之二，但由于含氧元素，是燃油氧化处理的增氧剂，使石油增加内氧， 燃烧充分，达到节能和环保目的；乙醇具有极好的抗爆性能，代替传统m t b e 作汽 油抗爆、增氧添加剂，可避免产生致癌物质；在“新配方汽油”中，乙醇还可以经济 有效地降低芳烃j 烯烃含量，降低炼油厂的改造费用；更重要的是乙醇是太阳能的 一种表现形式，在整个自然界这个大系统中，乙醇的整个生产和消费过程可形成无 污染和非常清洁的闭路循环过程，永恒再生，永不枯竭。燃料乙醇虽然是很好的替 代能源，但目前乙醇的规模化生产还存在许多需要改革的问题。首先，粮食危机日 趋严重，粮食储备短缺。其次，酿酒酵母的乙醇产率普遍偏低，无法满足工业化大 生产的需求。因此高产乙醇的微生物的选育以及非粮为原料燃料乙醇的发酵生产成 为近几年的研究热点之一。 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 是工业上用于生产乙醇的传统菌种，历 史悠久。因其乙醇耐受性好，工业应用广泛，发酵工艺成熟，生物安全性好，再加 上它的典型模式生物特性，因此在乙醇生物质能源研究中备受科学家的青睐，是生 产燃料乙醇的理想菌株。在燃料乙醇的发酵生产中，最为重要的因素就是优良高产 酿酒酵母菌株的选育。而成功选育一株高产、耐高温、乙醇耐受性好、能高效利用 底物及利用各种不同底物( 秸秆、纤维素类、淀粉类等) 的酵母菌株，不仅可以大 幅提高酿酒酵母乙醇的发酵能力，而且还可以大大降低生产企业的成本，提高社会 经济效益。为了这一目的人们正通过各种育种手段，从不同方面、不同角度来改进 酿酒酵母的生产性能。而分子育种是在分子生物学指导下一种自觉的、可预先设计 和控制的育种新技术，是最新最有前途的一种育种新技术。基因敲除是一种反向的 遗传学研究方法，是2 0 世纪8 0 年代后发展起来的一种新型的分子育种手段，通过 v 福建师范大学雷娟娟硕士学位论文 一定的途径使机体特定的基因失活或缺失，可以改变细胞的遗传特性，从而达到微 生物育种的目的。c r e l o x p 系统属于传统的同源重组载体，对研究酿酒酵母未知基 因的功能是一种十分有效的方法。该系统还可以进行标记挽救，使得在同一酵母菌 株中敲除和表达各种不同的基因时不需要更改抗性标记，解决了同时修饰许多基因 时，可用抗性筛选标记有限的难题。 在乙醇代谢过程中，酿酒酵母利用葡萄糖通过糖酵解作用生成丙酮酸，然后在 丙酮酸脱羧酶的作用下还原为乙醛，乙醛在乙醇脱氢酶的催化下生成乙醇，在乙醛脱 氢酶的作用下生成乙酸。酿酒酵母中主要有五个基因( a d h i - 删5 ) 编码与乙醇代谢 相关的乙醇脱氢酶系，其中a d h l p 、a d h 3 p 、a d h 4 p 和a d h 5 p 这四种乙醇脱氢酶在 厌氧发酵过程中还原乙醛生成乙醇；而当环境中缺少作为碳源的葡萄糖时，受葡萄 糖阻遏的a d h 2 基因起始表达，生成a d h 2 p 开始催化乙醇作为碳源进行生长：同时 a l d 基因编码的乙醛脱氢酶a c d h 启动催化乙醛氧化为乙酸的生化反应，从而减少 乙醛生成乙醇的量。s n f l 基因编码的s n f l p 是一个依赖于a m p 激活的丝氨酸和苏 氨酸蛋白激酶，对受到葡萄糖阻遏效应的基因的转录具有重要的调控作用，对a d h 2 p 和a c d h 的合成也是至关重要的。因此，在酿酒酵母中敲除s n f l 基因有助于酿酒 酵母乙醇的生物合成。 该论文利用c r e l o x p 筛选标记，成功地构建了s n f l 双倍体缺陷型菌株 y s 2 s n f l ：l o x p k a n 1 0 x p ，并对突变株与原始菌株y s 2 的生物学特性进行了比较研 究。 首先利用l f h p c r 的方法和c r e l o x p 系统中的p u g 6 质粒合成了两端各带有 3 3 3b p 和3 2 3b p 与s n f l 序列上下游同源的舒册基因敲除组件。将该敲除组件用 l i a c s s 载体d n a p e g 高效酵母转化法转化至酿酒酵母y s 2 ，获得被l o x p - k a n l o x p 序列组件替换而产生k a n 7 的阳性克隆子。然后将质粒p s h 6 5 转入阳性克隆子并在 y p g 诱导培养基中诱导表达c r e 酶切除k a n 基因，进而通过传代丢失质粒p s h 6 5 后得到s n f l 单倍体缺陷型菌株。重复转化敲除组件实现另一条等位基因的敲除， 得到s n f l 双倍体缺陷型菌株y s 2 s n f l ：l o x p k a n l o x p 。 突变菌株y s 2 a s n j 7 ：l o x p k a n 1 0 x p 构建成功后，对其生长情况、遗传稳定性和 酒精耐受性进行了检测，发现y s 2 一s n f l ：l o x p - k a n 1 0 x p 与y s 2 相比，生长周期和菌 落大小、形态相似，没有表现出明显差异。对y s 2 a a d h 2 a d h l 连续传代( 1 0 次) ， 随机筛选2 0 个单菌落进行重组鉴定，均为阳性结果，没有发现回复突变。说明所构 v i 福建师范大学雷娟娟硕士学位论文 建的菌株y s 2 s n f ：l o x p k a n l o x p 的突变发生在染色体水平，遗传性状较稳定，无 需在培养基中添加其它物质便可以维持其正常生长。y s 2 一a s n f l ：l o x p k a n l o x p 相对 出发菌株酒精耐受性没有显著差异，但在4 8 的酒精浓度之间酒精耐受性更好 些，稍显优越。 对突变菌株y s 2 一j n f l ：l o x p - k a n l o x p 进行厌氧发酵试验，d n s 法测定发酵液 残糖量，气相色谱分析其乙醇、乙酸生成量。实验结果表明该突变株的乙酸产量较 出发菌株y s 2 降低了1 0 0 5 ，乙醇产量提高了8 7 4 ，说明s n f l 基因的缺失对乙 醛脱氢酶启动的催化乙醛氧化为乙酸的生化反应起到了一定的阻断作用，从而使乙 醇的生成量有所增加；残糖量试验表明在培养基中葡萄糖消耗殆尽后，突变株相对 于出发菌株而言并没有利用乙醇作为碳源，乙醇产量保持稳定未有下降，这进一步 说明突变株y s 2 j n f ：l o x p k a n l o x p 在一定程度上阻遏了a d h 2 基因的表达活性， 对防止乙醇再次被利用起到了一定的作用。 v 摘要 a b s t r a c t e n e r g yi st h em o s tb a s i cd r i v i n gf o r c ef o rt h ed e v e l o p m e n ta n de c o n o m i cg r o w t h o ft h ew h o l ew o r l da n di sa l s ot h ef o u n d a t i o nf o rt h es u r v i v a lo fo u rh u m a n s h o w e v e r ， b e c a u s eo ft h er a p i de x p a n s i o no ft h ew o r l d sp o p u l a t i o n ，a sw e l la s t h e r a p i d d e v e l o p m e n to ft h ew o r l de c o n o m y ，t h ep r o b l e m sa b o u te n e r g yc r i s i s ，f o o ds h o r t a g ea n d e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o nh a v eb e c o m et h ef o c u so fa t t e n t i o nb o t ha th o m ea n da b r o a d w i t ht h ei n c r e a s eo ft h eo i lc r i s i sa n dt h ew o r s e n i n go ff o o dc r i s i s ，t h ee x p l o i t a t i o no f b i o r e n e w a b l ee n e r g ys o u r c e si si m m i n e n t ，t h ef u e le t h a n o li sp a r t i c u l a r l yi m p o r t a n t b e c a u s eo fi t sm a n ya d v a n t a g e s s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea s t h ee u k a r y o t i cm o d e l o r g a n i s m ，h a sb e e nw i d e l yu s e di nt h ef e r m e n t a t i o no fe t h a n 0 1 t h e r ea r ef i v eg e n e s ( a d h lt oa o h s ) t h a te n c o d ea l c o h o ld e h y d r o g e n a s e si n v o l v e d i ne t h a n o lm e t a b o l i s mi ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e d u r i n ga n a e r o b i cf e r m e n t a t i o n ，f o u r o ft h e s ee n z y m e s ( a d h l p ，a d h 3 p ，a d h 4 p ，a n da d h 5 p ) r e d u c ea c e t n d e h y d et oe t h a n o l w h i l ea d h 2 pc a t a l y z e st h er e v e r s er e a c t i o n n o x i d i z e se t h a n o lt oa c e t a l d e h y d ew h e n g l u c o s ew a se x h a u s t e d ( 0 2 ) ，a tt h i st i m ei tu t i l i z e se t h a n o la st h ec a r b o ns o u r c e t h e a c e t a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s ea c d ho x i d i z e sa c e t a l d e h y d et oa c e t a t ea tt h es a m et i m e s n f l pe n c o d e db yt h es n f lg e n ei sa na m p - a c t i v a t e ds e r i n e t h r e o n i n ep r o t e i nk i n a s e f o u n di nac o m p l e xc o n t a i n i n gs n f 4 pa n dm e m b e r so ft h es i pl p s i p 2 p g a l 8 3 pf a m i l y ；i t i sr e q u i r e df o rt r a n s c r i p t i o no fg l u c o s e - r e p r e s s e dg e n e s ，s oi ti sc r i t i c a lt ot h es y n t h e s i so f a d h 2 pa n da c d h i no r d e rt oe n h a n c et h ee t h a n o ly i e l da n dt os t u d yt h em o l e c u l a r r e g u l a t o r ym e c h a n i s mo fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，w ea t t e m p tt oc o n s t r u c tam u t a n t s t r a i nw i t hs n f lg e n ed e l e t e dt ob l o c kt h ec a t a b o l i s mo fe t h a n o la n dr e d u c et h e o x i d i z a t i o no fa c e t a l d e h y d et oa c e t a t e t h eg e n ek n o c k o u tc a s s e t t ew a sc o n s t r u c t e db yl f h - p c rw i t h3 3 3b pa n d3 2 3b p h o m o l o g o u ss e q u e n c e so ft h eu p s t r e a ma n dd o w n s t r e a mo fs n f lr e s p e c t i v e l y t h e no n e s n f lg e n eo fd i p l o i dy e a s tc e l lw a sr e p l a c e db yt h el o x p - k a n l o x pc a s s e t t ea n dy i e l d k a n 7c l o n e sa f t e rt r a n s f o r m a t i o nw i t ht h eg e n ek n o c k o u tc a s s e t t e t oc u tt h ek a n 7 m a r k e r , p o s i t i v ec l o n ew a sf u r t h e rt r a n s f o r m e dw i t hp l a s m i dp s h 6 5 ，t h e nf o l l o w i n gb y i n d u c t i o ni nt h em e d i u mw h i c hc o n t a i n st h eg a l a c t o s et oe x p r e s st h ee r ee n z y m e a n o t h e r s n f lw a sk n o c k o u t e db yr e p e a t i n gt h es a n l ep r o c e d u r e s f i n a l l yas n f lk n o c k o u t h i 福建师范大学雷娟娟硕士学位论文 h o m o z y g o u ss t r a i ny s 2 厶s 妒：l o x p k a n l o x pw a so b t a i n e d a n a e r o b i cf e r m e n t a t i o n s h o w e dt h em u t a n ts t r a i nr e s u l t e di na8 7 4 h i g h e re t h a n o lp r o d u c t i o na n da1 0 0 5 l o w e ra c e t a t ep r o d u c t i o nc o m p a r e dt oy s 2 ，w h i l es u g a rc o n s u m p t i o nt e s ts h o w e dt h a tt h e e t h a n o ly i e l do ft h em u m n ts t r a i nk e e p e ds t a b i l i t yc o m p a r e dt oy s 2 s ot h ek n o c k o u to f s n f lg e n ew a sa ne f f e c t i v e p a t h w a yt or a i s et h ee t h a n o lp r o d u c t i o nt os o m ee x t e n t k e y w o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；s n f lg e n e ；g e n ek n o c k o u t ；a c e t a t e ；e t h a n o l i v 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 本人( 姓名)置娟妲学号2 q q 鱼q 窆2 q 专业邀生堑堂 所呈交的学位论文( 论文题目：酿酒酵母肌研基因缺失突变株的构建 及生物学特性研究) 是本人在导师指导下，独立进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除论文中己特别标明引用和致谢的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本论 文的研究工作做出贡献的个人或集体，均已在论文中作了明确说明并表 示谢意，由此产生的一切法律结果均由本人承担。 本人完全了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 福建师范大学有权保留学位论文( 含纸质版和电子版) ，并允许论文被 查阅和借阅；本人授权福建师范大学可以将本学位论文的全部或部分内 容采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文，并按国家 有关规定，向有关部门或机构( 如国家图书馆、中国科学技术信息研究 所等) 送交学位论文( 含纸质版和电子版) 。 ( 保密的学位论文在解密后亦遵守本声明) 一虢蝴施燧镦 签字日期叫年啪日 签字日期 厶月莎日 绪论 1 课题背景 绪论 长期以来，化石燃料一直作为人类能源的主角支撑着整个世界经济的发展。然 而，众所周知，煤、石油、天然气等这些化石燃料是地球在漫长的地质演变过程中 逐渐形成和保留下来的，用一点少一点，属于不可再生的资源【1 1 。但随着现代社会 科技日益进步、人口急剧增多、工业化程度大幅增高，能源需求已经显得有些捉襟 见肘了。况且这些燃料的使用会对自然环境造成各种不同程度的污染和破坏。像人 们熟知的酸雨、温室效应、大气悬浮颗粒等，都与化石燃料的使用有着脱不了的干 系【2 1 。随着能源危机、粮食问题、环境恶化等问题的日趋凸显，生物质能成为当今 国际上新能源开发的热点，被誉为“绿色”能源。 1 1 生物质能定义及其分类 生物质包括各种速生的能源植物、农业废弃物、林业废弃物、水生植物以及各 种有机垃圾等【3 】。各种生物质都具有一定的能量，而所谓的生物质能( b i o m a s s e n e r g y ) ，则是太阳能以化学能形式贮存在生物质中的能量形式，即以生物质为载体 的能量。它直接或间接地来源于绿色植物的光合作用，可转化为常规的固态、液态 和气态燃料，是一种可再生的能源【4 】。 当前生物质能源的主要形式有生物制氢、沼气、生物柴油、燃料乙醇【5 ，6 1 。 生物制氢是通过微生物发酵利用生物质的方式得到的。氢是主要的工业原料， 它的燃烧产物只有水，是最清洁，也是最理想的未来能源。生物制氢的方式主要有 五类：利用藻类或青蓝茵的生物光解水法、有机化合物的光合细菌( p s b ) 光分解法、 有机化合物的发酵制氢、光合细菌和发酵细菌的祸合法、酶法制氢。目前，我国科 学家已获得了能高效产氢的微生物，可小规模地进行生物制氢，而要实现生物制氢 的大规模化以及工业化却还存在许多技术和经济问题。 沼气是各种有机物质在隔绝空气( 还原条件) ，并在适宜的温度、湿度下， 经过微生物的发酵作用产生的一种可燃烧的混合气体，它的主要成分是甲烷 ( 含量约为5 0 - - 8 0 ) 。沼气发酵系统与农村结合十分密切，能有效促进农 村经济的发展，有利于保护农村生态环境，使农业走可持续发展之路。沼气的 福建师范大学雷娟娟硕士学位论文 推广节约了资源，保护了环境，也提高了农民的生活质量。目前沼气的规模化 生产需要解决的是设备及提高甲烷含量等技术问题。 生物柴油是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及 动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再 生性柴油燃料。生物柴油的主要优点是其具有环境友好性，大气污染小，尤其 是硫含量低，是一种优良的清洁可再生燃料。生物柴油的制造方法有：物理 法，包括直接使用和混合以及微乳法；化学法，包括高温热裂解法、化学催化 酯交换法、均相、多相催化酯交换法等；生物法，包括生物酶催化酯交换法等。 欧洲已专门种植油料作物用来生产生物柴油，形成了一定规模，美国、日本、 巴西、南非等国也有生物柴油的小规模生产。截止2 0 0 7 年，中国有大小生物 柴油生产厂2 0 0 0 多家。生物柴油所遇到的问题是作为原料的植物油成本较高。 世界各国已有多个科学家小组和机构在从事生物柴油的研究开发。最近，科学 家们发现，一些微生物也能合成油脂，这也许可以为克服生物柴油的原料问题 起到重要的作用。 燃料乙醇是目前世界上生产规模最大的生物质能源。是指向汽油或柴油中加入 一定比例的无水乙醇，又称汽油醇。因其具有和矿物燃料相似的燃烧性能，而且属 于可再生、无污染的清洁能源而备受青睐。联合国工业发展组织曾在维也纳乙醇专 题讨论会上提出：“乙醇应该被当作燃料和化工原料永久的和可供选择的来源”【7 1 。 巴西和美国是世界上燃料乙醇的主要生产和消费国。巴西政府从1 9 7 5 年开始实施以 甘蔗为主要原料的全国乙醇能源计划，目前巴西年产酒精已超过1 2 0 0 万吨。美国燃 料乙醇生产主要依靠玉米，美国有3 0 的玉米用于燃料乙醇的生产。为推广燃料乙 醇，美国制定了积极的经济激励政策，计划从2 0 0 6 年至2 0 1 2 年，可再生能源燃料 年用量从1 2 0 0 万吨增加到2 3 0 0 万吨。我国是继巴西、美国之后的第三大燃料乙醇 生产和消费国家。自2 0 0 0 年推广乙醇汽油以来，“十五”期间，在吉林、黑龙江、河 南、安徽建立4 个乙醇生产厂家，生产能力为1 0 2 万吨。到2 0 1 0 年，我国乙醇汽油 预计达到6 6 5 0 万吨，届时燃料乙醇的生产将不少于6 6 5 万吨。 1 2 燃料乙醇的优势及发展方向 乙醇，俗称酒精，分子式c 2 h 5 0 h ，是一种重要的基础化工原料，广泛应用于 食品卫生，化学工业，医药工业及国防工业等。燃料乙醇是通过对乙醇进一步脱水， 绪论 再加上适量变性剂制成。目前，中国试点推广的e 1 0 乙醇汽油是在汽油中掺入1 0 纯度达9 9 9 以上的乙醇制成。燃料乙醇是未来可再生能源的主流，其应用优势如 下： ( 1 ) 乙醇是一种良好的液体燃料，其主要特性可以概括为：乙醇的热值仅 为汽油的三分之二，但由于乙醇分子结构中含氧元素，是燃油氧化处理的增氧剂， 使石油增加内氧，燃烧充分，达到节能和环保目的。乙醇具有极好的抗爆性能， 调和辛烷值一般在1 2 0 以上，它可有效提高汽油的抗爆指数( 辛烷值) 。代替传统 m t b e 汽油抗爆、增氧添加剂，可避免产生致癌物质，并且可有效降低汽车尾气排 放，是一种环保型能源。在“新配方汽油”中，乙醇还可以经济有效地降低芳烃、 烯烃含量，降低炼油厂的改造费用。更重要的是乙醇是太阳能的一种表现形式， 在整个自然界这个大系统中，乙醇的整个生产和消费过程可形成无污染和非常清洁 的闭路循环过程，永恒再生，永不枯竭。 ( 2 ) 由于化工原料石油、天然气、煤等价格逐年上涨，而相比之下燃料乙醇 的生产成本较低，用甘蔗、玉米、木薯生产燃料乙醇的成本分别为3 2 0 0 元吨、4 8 0 0 元吨、3 8 0 0 元吨左右【引，因此乙醇生产未来市场前景广泛。 ( 3 ) 用于燃料乙醇生产的生物质原料来源广泛，主要包括3 大类：第1 类是 糖质原料，包括甘蔗、甜高粱等；第2 类是淀粉质原料，包括薯类、谷物等；第3 类是纤维类原料，包括秸秆、芦苇、苎麻杆和稻壳等。除了玉米等谷物原料为粮食 作物外，其他几类原料都属于非粮原料。粮食危机日趋严重，非粮为原料的燃料乙 醇【9 】优势凸显。 在国际原油价格高、而对石油需求量日益大增的情况下，各国除了认识到燃料 乙醇的推广对替代和缓解化石能源不足具有重要意义，对其未来发展方向也都有一 定的共识： ( 1 ) 发酵产乙醇微生物的选育。选育优良的微生物菌种是提高乙醇转化生产效 率、降低生产成本的关键。自然界中发酵产乙醇的微生物主要有酵母和细菌两大类。 利用酵母发酵糖类生产乙醇已经有很长的历史了，在这期间人们通过各种育种方法 已经获得了一系列的优良菌株【1 0 1 。菌株选育的目标主要有两个：一是通过基因工程 和代谢工程这些现代生物技术手段，构建发酵性能优良的菌株，调控其代谢过程， 提高对糖的转化率，从而降低燃料乙醇生产的原料消耗比：二是提高菌株的耐温性 以及酒精耐受性，使得发酵温度和发酵终点发酵液中的酒精浓度得以提高【1 1 1 。 福建师范大学雷娟娟硕士学位论文 ( 2 ) 在原料方面提倡原料多元化。扩大使用薯类、甜高梁及甘蔗糖蜜等原料， “重点支持以薯类、甜高粱及纤维资源等非粮原料产业发展”。实现将纤维素转化为 乙醇，已被专家们列为2 1 世纪的1 0 0 个科学难题之一。以秸秆为原料生产燃料酒精 的工艺中存在亟待解决的技术难题，纤维素酶的生产是其中难点之一。 ( 3 ) 糖和淀粉发酵技术生产酒精已相当成功，但酿酒酵母的乙醇产率普遍偏低， 无法满足工业化大生产的需求，目前研究重点当是创新和改良发酵工艺以提高其发 酵速度和产量。 1 3 酿酒酵母是乙醇代谢传统菌株 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，又称鹦包酵母或者出芽酵母，是与 人类关系最密切的一种酵母，在现代分子和细胞生物学中被用作真核模式生 物。1 9 9 6 年4 月，国际互联网上公共数据库中公布了酿酒酵母完整基因组序列 1 2 】， 这是人们第一次获得真核生物基因组完整核苷酸序列。酿酒酵母的基因组包含有 大约1 2 0 0 万个碱基对，分成1 6 组染色体，共计6 2 7 5 个基因，序列长度为1 2 0 6 8 k b ，其中有5 8 8 5 个编码专一性蛋白质的开放阅读框( o r f ) ，平均长度为1 4 5 0b p 。 据估计其基因约有2 3 与人类同源。酿酒酵母具有典型模式生物特性，遗传背景 清楚、单细胞生物，易培养、生长代谢速度快、兼性生长、单双倍体、合适的生命 周期、高效的体内重组特性等，在基因工程和遗传学研究中应用广泛。 酿酒酵母是工业上用于生产乙醇的传统菌种，历史悠久。因其乙醇耐受性好， 工业应用广泛，发酵工艺成熟，生物安全性好，再加上它的典型模式生物特性，因 此在乙醇生物质能源研究中备受科学家的青睐，是生产燃料乙醇的理想菌株。 2 酿酒酵母育种方法的发展 现代发酵工业是以微生物菌种为核心组织生产的，菌种是最关键要素，产物产 量的高低与菌种本身的遗传息息相关，选育不同遗传特性的菌种对工业生产极为重 要。在燃料乙醇的发酵生产中，最为重要的因素就是优良高产酿酒酵母菌株的选育。 而成功选育一株高产、耐高温、乙醇耐受性好、能高效利用底物及利用各种不同底 物( 秸秆、纤维素类、淀粉类等) 的酵母菌株，不仅可以大幅提高酿酒酵母乙醇的 发酵能力，而且还可以大大降低生产企业的成本，提高社会经济效益。为了这一目 的人们正通过各种育种手段，从不同方面、不同角度来改进酿酒酵母的生产性能。 绪论 2 1 常规育种 常规育种广义上讲是指微生物、原生质体、细胞、组织等水平上的育种，主要 是通过有性或无性繁殖，使品种优良特性在基因中固定下来，所繁殖的后代仍具有 这种优良特性。主要包括自然选择育种和诱变育种等。 自然选择育种是利用微生物在自然繁殖过程中产生变异经过选择鉴定而孕育新 品种一种技术。其机理主要是d n a 半保留复制、校正酶系校正作用、光修复、切 除修复、重组修复、诱导修复等发生的自然突变引起的。 诱变育种是指用物理、化学因素诱导微生物的遗传特性发生变异，再从变 异群体中筛选符合人们要求的变异高产菌株，是传统育种的典型代表。目前利用 传统技术培育酵母菌种的目标是选育耐高温，耐高糖，发酵周期短，能直接利用淀 粉或能直接利用纤维素以及半纤维素的菌株。而利用诱变剂对酵母进行处理是一种 最简便有效的育种方法。k i r a n s r e e 等 ”1 从印度炎热地区的土样中分离得到酿酒酵母 v s 3 变株，该变株在含有1 5 0 班的蔗糖底物的培养基中，3 0 下酒精产量可达7 4 g l ，4 0 c 时则为6 4g l 。汪志君等【1 4 】采用紫外诱变方法对啤酒酵母进行处理，用 乳酸平板、麦芽汁，碳酸钙平板、t t c 上层平板进行显色分离，最终得到一株高级醇 产量降低约3 0 、双乙酰含量较低的新菌株。肖冬光【1 5 】以酿酒酵母s c 4 为出发菌 株，选择合适的u v 诱变剂量对出发菌株进行诱变，诱变处理液涂布在限制培养基 上，将生长的单个小菌落对应点接种于基本培养基和添加亮氨酸基本培养基( 亮氨 酸终浓度为3 0m g m 1 ) 平板上，2 8 培养，经诱变育种后获得一株亮氨酸缺陷型菌 株m s 1 1 。与出发菌株相比，该菌株杂醇油生成量下降了2 5 4 7 ，其他发酵性能 基本保持不变。m s 1 1 在较高主发酵温度( 1 4 ) 下的啤酒发酵实验表明，其杂醇油 生成量为6 5 3 5m g l ，与出发菌株在9 发酵条件下的杂醇油生成量6 3 2 4m g l 基 本相当，而双乙酰的生成量则下降了1 5 1 3 。菌株m s 1 1 生产的啤酒其保质期比 出发菌株s c 2 长，风味稳定性也更高。刘建军【1 6 】等人利用热冲击、紫外线和c o 6 0 y - 射线联合作用获得一株高产酒精酵母n h y 4 3 6 ，以玉米淀粉为原料，采用边糖化边 发酵工艺( ( s s f ) ，3 2 发酵6 0 6 8h ，该酵母菌株可产酒精度在1 7 5 ( v v ) 诊a _ k ， 耐酒精度在2 0 ( v v ) 以上。 2 2 原生质体融合育种 原生质体融合技术( p r o t o p l a s tf u s i o n ) 是将双亲细胞通过酶解脱壁，制成原生质 福建师范大学雷娟娟硕士学位论文 体，然后在高渗条件下加入助融剂，使双亲的原生质体发生凝聚，通过细胞质融合、 核融合，发生基因间的交换重组，进而在适当的条件下再生出细胞壁，形成重组子 的过程。原生质体融合技术起源于2 0 世纪5 0 年代，自w e i b u l l 利用溶菌酶首次得封巨 大芽孢杆菌的原生质体后【1 7 1 ，e d d y c 等$ 1 j 用蜗牛酶获得酵母茵原生质体的报道也相 继出现。7 0 年代，k a o 1 8 l 发现聚l - - 醇( p e g ) 在钙离子存在的条件下能促使植物 细胞的原生质体融合并提高融合率，此后原生质体融合技术得到了快速的发展，随 后酵母菌的属间、种间融合都有报道【1 蝴2 1 。钟桂芳等【2 3 】通过单倍体分离和诱变获 得休哈塔假丝酵母和高温酿酒酵母的营养缺陷型突变株，通过聚乙二醇和电诱导融 合等方法获得了融合子f 7 1 ，其在4 5 发酵木糖所产酒精积分数为1 6 7 5 ，转化率 为6 8 8 。c h i 等【2 4 】利用原生质体融合技术使醉母菌株w _ 2 和酿酒酵母1 2 0 0 的细胞 融合，与亲本相比，得到四倍体菌株c 4 能明显提高发酵速度。 2 3 分子育种 分子育种是借助分子生物学手段在分子水平对微生物的遗传物质进行改造的一 种新兴技术，包括基因工程育种和代谢工程育种。 基因工程育种诞生于2 0 世纪7 0 年代，实质上就是利用基因重组技术进行育种 的新方式。基因重组也称遗传传递，是指遗传物质从一个微生物细胞向另一个细胞 传递，达到基因改变目的的过程。基因重组技术是菌种改良的重要手段，是在分子 生物学指导下一种自觉的、可预先设计和控制的育种新技术，是最新最有前途的一 种育种新技术。近年来，应用基因工程育种手段已经构建出许多优良的酿酒酵母菌 种。例如酿酒酵母能发酵己糖( h e x o s e ) ，但是不能发酵木糖( x y l o s e ) 。t o i v a r i 【2 5 1 ( 2 0 0 1 ) 研究发现，木糖发酵菌p s t i p i l i s 和酿酒酵母基因重组菌x k s i 在有氧和无氧的状态 下都能够提高木糖的利用率，将木糖转化为乙醇。t o k s o y 等【2 6 】构建了一株能利用淀 粉的酿酒酵母工程菌，使乙醇转化率得到大幅提高。 代谢工程( m e t a b i l ce n g i n e e r i n g ) 主要是应用d n a 重组技术修饰或引入特定的 生化反应直接提高产物形成率并改进细胞特性的种方法。这里的生化反应除了一 般的生理代谢系统还包括细胞信号传导系统以及调控系统。代谢工程育种是一种有 效的微生物育种手段，它的实质就是就是如何使微生物的代谢主流流经理想载流途 径。在发酵生产中，为了达到这一目的，从营养物质进入细胞到产物生成一般从以 下三方面进行改造：拓展底物范围，主要是通过引入分解新底物的相关酶基因。 绪论 u l g e n 等【2 7 】利用基因重组技术构建了一株重组酿酒酵母菌株y p g a b ，该菌株能表 达c c 淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因，厌氧发酵时不仅可以分解淀粉，且乙醇产量 提高了3 4 。h i s a y o r i 等【2 8 】利用细胞表面展示技术在酿酒酵母细胞表面共同展示了 米根霉葡萄糖淀粉酶和牛链球菌伐淀粉酶，以粗玉米淀粉作为底物进行厌氧发酵， 淀粉的利用率达到了8 6 5 。改良细胞特性，比如提高菌株的乙醇耐受性和絮凝 能力等。k a j i w a r a 等【2 9 】在酿酒酵母中表达拟南芥f a d 2 基因并超表达了自身的o l e l 基因，使菌体在1 5 ( v v ) 的乙醇中仍具产乙醇的能力，显现出很高的乙醇耐受 性。降低副产物( 甘油、乙酸、双乙酰等) 的生成量，提高乙醇的生成量。v a l a d i 等p o 】构建了g p d l 、g p d 2 单基因敲除或双基因缺失型突变株。双基因缺失突变株 无法在厌氧条件下生长，g p d l 基因缺失突变株的甘油产量略低于亲株，而缺失 g p d 2 的突变株较亲本的甘油产量减少了4 0 ，酒精产量提升了约8 0 ，但生长 速率较亲本下降了4 5 ，在厌氧条件下生长缓慢，延长了生长周期。 3 基因敲除技术 2 0 0 3 年4 月1 4 日，美国联邦国家人类基因组研究项目负责人在华盛顿宣布， 始于1 9 9 0 年的国际人类基因组计划经美、英、日、法、德和中国科学家的不懈努力 比原计划提前两年完成。随着此项计划的完成，以功能基因组学为研究重点的后基 因组时代已经拉开序幕。研究基因功能的方法通常有两种：一个是增强其表达，另 个是减弱或者彻底终止其表达。前者因不能反映基因产物的真实表达情况，而逐 渐被后者所取代。后者不仅将基因与生物的整体功能联系起来进行考察，而且还能 为基因的功能提供直接证据，因此其技术得到不断地发展与完善，其中最常用、最 成熟的就是基因敲除( g e n ek n o c k o u t ) 技术。 基因敲除是一种反向的遗传学研究方法，是2 0 世纪8 0 年代后发展起来的一 种新型的分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术， 可以改变细胞的遗传特性。利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路，或通过引入 突变位点改变目的产物的产量或质量，从而达到微生物育种的目的。基因敲除技术 除了最早的同源重组技术，新的原理和技术也日渐发展，近年来比较成功的有基因 插入突变和r n a 干扰，这两者同样可以达到基因敲除的目的。 3 1 利用插入突变进行基因敲除 福建师范大学雷娟娟硕士学位论文 插入突变( i n s e r t i o n a lm u t a t i o n ) ，d n a 链上由于插入额外的核苷酸或d n a 片段 而引起的突变，可以分为t - d n a 插入突变和转座子插入突变。 t - d n a 插入突变是农杆菌介导的，是标记和获得植物病原真菌功能基因组的有 效途径之一。该突变法可以直接在植物的基因组d n a 中产生稳定的插入突变，而 且插入位点的随机性比较强，不过它也只适用于那些容易被转化的植物，且常常会 引起染色体重排现象，产生直接的串联、反向重复和边界缺失，致使突变体的表型 与t - d n a 插入无关从而难以对其进行随后的遗传学分析。尽管如此，近年来将该 突变法应用于拟南芥、水稻等模式植物中还是获得了广泛的成功【3n 。 转座子在染色体d n a 上可以从一个基因座跳到另一个基因座。转座子插 入突变就是利用它可移动的特点，当它跳跃而插入到某个功能基因时，可以起到 一种开关作用影响基因的表达，使该基因暂时性失活，并诱导产生突变型。因 此利用这些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞基因组d n a 中进行随机插 入突变，就可以建立一个携带随机插入突变的细胞文库，然后通过相应的标记就能 筛选获得相应的基因敲除细胞。转座子种类很多，常见的有原核生物体内的插入序 列和复合转座子、植物内源转座子a c 、d s 等。目前研究报道，以两种噬菌体m u 为基础的m i n i m u 转座子，是一种通用的转座子打靶载体，适用于任何物种。利用 该转座子进行基因敲除更具有极大的方便性，不需要知道基因组序列，只需已知外 显子即可，而且载体构建迅速，简便，载体可以携带多种抗性基因，可以同时处理 多基因。但是转座子的应用也有一定限制，比如要求转座子本身较短，容易操作， 且对任何拟敲除区域要有较高转座效率等【3 2 3 4 1 。 3 2r n a i 基因敲除 r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 是将与靶基因的m r n a 同源互补 的双链r n a ( d s r n a ) 导入细胞，特异性地降解该m r n a ，从而产生相应的功 能表型缺失，属于转录后水平的基因沉默，是生物体在进化过程中抵御病毒 感染及防御重复序列和突变引起基因组不稳定的保护机制。这种自然发生的 现象最早是在秀丽线虫中发现的，是序列特异性地使转录后的基因沉默的有 力机制。由于最近两年在r