（微生物学专业论文）苏云金芽孢杆菌nu1、nu2毒力提高与保护的研究.pdf

摘要 本实验研究了苏云金杆菌n u l 、n u 一2 毒力的提高与保护。 研究了n u 一1 、n u 一2 的菌种培养、种子培养，筛选了适宜的培养条件；出于 工业化生产的目的，利用正交方法优化筛选了发酵培养基，并测定了晶体蛋白含 量。结论为：菌种培养7 2h ，采用1 号种子培养基，4 接种量，种子培养7 h ， n u 。l 在2 号、1 0 号发酵培养基上，n u 2 在4 号发酵培养基上发酵结果最高。 n u 一1 在2 号培养基上发酵4 0 h ，菌数达8 5 5 1 0 8 个m l ，p h 8 2 ，晶体蛋白含量 为6 3 2 0 m g m l ，在1 0 号培养基上的生长情况与其相似；n u 一2 在4 号培养基上 发酵4 2 h ，菌数达到7 8 0 x1 0 8 个m l ，p h 8 1 ，晶体蛋白含量为6 0 8 5 m g m l 。为 了进一步研究n u 一1 、n u 2 的生长情况，还测定了其生长和p h 曲线。 筛选出两种添加剂，试验了它们对b t 发酵的影响。结果表明：添加剂1 号 和添加剂2 号都能提高b t 的发酵菌数并缩短发酵时间。 采用不同防腐剂处理b t 制剂，研究了防腐剂的防腐效果。试验结果表明防 腐剂l 号，2 号都是良好的防腐剂，防腐剂1 号用量0 1 5 ，防腐剂2 号用量0 0 4 就可取得理想的防腐效果。 用s d s p a g e 、酶活测定、电镜观察等方法研究了紫外线照射对b t 的破坏， 并初步探寻了保护方法。结果表明；紫外线照射能破坏晶体蛋白的表面结构和形 态，照射2 4 h 后，酶活性几乎全部丧失，s d s - p a g e 显示晶体蛋白几乎完全不溶。 添加0 ，5 苋菜红做保护剂，再经紫外线照射后，酶活降低较小，电泳显示伴孢 晶体碱溶产生的1 3 5 k d 和6 5 k d 原毒素蛋白几乎无变化，证明染料类是较好的 保护剂。 关键词：苏云金芽孢杆菌，毒力，提高与保护，发酵，晶体蛋白 荣经作耆、导师同意 细垒文公布 a b s t r a c t t h em a i nt o p i co ft h e p a p e ri st h ei n c r e a s ea n dp r o t e c t i o no ft o x i c i t yo ft w o s t r a i n s ，n u - 1a n dn u - 2 ，o f b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s t h ec u l t u r eo fs t r a i n sa n ds e e d so f n u l ，n u 一2w a sr e s e a r c h e dt os c r e e no u tt h e s u i t a b l ec u l t u r ec o n d i t i o n t h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n tw a st e s t e dt os e l e c tt h eb e s t f e r m e n t a t i o nm e d i u m t h ec r y s t a lp r o t e i nw a s p u r i f i e da n di t sd e n s i t yw a sm e a s u r e d ， r e s u l ts h o w e d ：w h e nt h en o ls e e dm e d i u m ，t h ei n o c u l a t i o no f 4 ，7 2h o u r s c u l t u r e o fs t r a i na n d7h o u r s c u l t u r eo f s e e dw e r eu s e d ，t h ef e r m e n t a t i o no f n u 一1 i n n 0 2a n d n o l0f e r m e n t a t i o nm e d i aw e r e h i g h e s t a n df e r m e n t a t i o no fn u 一2i nn o 4 f e r m e n t a t i o nm e d i u m g e tt h eb e s te f f e c t i nn o 2f e r m e n t a t i o nm e d i u m o f n u - 1 ，t h e q u a n t u mr e a c h e d8 5 8 1 0 8 m 1 a n dt h ed e n s i t yo fc r y s t a lp r o t e i nw a s6 3 2 0 m g m l a f t e r4 0h o u r s t h er e s u l to fn u li nn o 10f e r m e n t a t i o nm e d i u mw a ss i m i l a rt on o 2 i nn 0 4f e r m e n t a t i o nm e d i ao fn u - 2 ，t h eq u a n t u mr e a c h e d7 8 o 10 8 m l ，a n dt h e d e n s i t yo fc r y s t a lp r o t e i nw a s6 0 8 5 m g m la f t e r4 2h o u r s t h ec u r v e so fg r o w t ha n d p h w e r et e s t e d c h e m i c a la d d i t i v e sw e r eu s e dt oe n h a n c et h ea c t i v i t yo fb t t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tn o 1a n dn o 2a d d i t i v e sb o t hi n c r e a s e dt h eq u a n t u mo fs t r a i n sa n ds h o r t e n e dt h e t i m eo ff e r m e n t a t i o n e x p e r i m e n t sw e r ed e s i g n e dt o t r e a tb tw i t hd i f f e r e n t p r e s e r v a t i o n s r e s u l t s s h o w e dt h a tn o 1a n dn o 2r e s t r a i n e ds t r o n g l yt h es p r o u t i n go f s p o r e sa n d t h eg r o w t h o fb tw i t h i n0 9 6h o u r s ， t h eu l t r a v i o l e t m e d i a t e di m p a i r m e n ta n dp r o t e c t i o no fn u la n dn u - 2w e r e s t u d i e db yt h en l c a n so fs d s - p a g e ，t e s to fe n z y m ea c t i v i t i e sa n ds e m r e s u l t s s h o w e d ：t h em o r p h o l o g ya n ds u r f a c eo fp cw e r ed a m a g e db yu v r a y s ；t h ea c t i v i t i e s o fe n z y m e sa n dt h e s o l u b i l i t y o fp a r a s p o r a l c r y s t a l w e r ea l m o s tl o s ta f t e r2 4 h r a d i a t i o n b ts u s p e n s i o nw i t ho 5 a m a r a n t he x h i b i t e dt h eg o o ds o l u b i l i t ya n d r e t a i n e dm o s ta c t i v i t i e so fe n z y m e sa f t e ru vr a d i a t i o n i tw a sp r o v e dt h a tb t s u s p e n s i o n w i t ha m a r a n t hs h o w e d s t r o n ga n t i u l t r a v i o l e te f f e c t k e y w o r d s ：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ；t o x i c i t y ； i n c r e a s ea n d p r o t e c t i o n ； f e r m e n t a t i o n ；p a r a s p o r a lc r y s t a l 独创性声明 互 o j 廿z z 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得酉j e 盔堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：塑熏受签字日期：皿年j 月目 第一部分前言 近年来，环境安全问题日益突出，随着人们环保意识的增强，生物农药和杀 虫剂以其无公害绿色的特点，日益受到人们重视，其中，苏云金杆菌己成为目前 研究较深入、应用较广泛的生物杀虫剂。苏云金杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) ，名称来源于t h u r i n g i e n s i s 的译音，是b e r l i n e r1 9 0 1 年从德国苏 云金城( t h u r i n g i e n ) 一个面粉厂的一批染病地中海粉螟中分离出的一种杆菌，并 定名为b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s 简称b t ( 下文均b t 以表示) 。由于其伴孢晶体 能毒杀昆虫，1 0 0 多年来受到广泛而深入的研究。 1 研究历史“1 ： 为了叙述的方便，我们将对苏云金杆菌的整个研究划分为三个阶段，实际上 其研究内容不能截然分割，而是相互交织在一起的。 1 1 起步阶段( 1 9 0 1 19 5 2 年) ： t 9 0 1 年，日本学者石渡繁胤( s i s h i w a t a ) 在日本蚕丝会报上，第一 次报道了1 8 9 8 年发现的家蚕( b o m b y x m o r i ) 患软化病急剧死亡的现缘，被称之 为“猝倒病”，并从虫尸体液中分离出一种所谓的猝倒细菌( s o t tb a c t e r i a ) 。 用培养的芽孢和菌体分别喂食家蚕，均能使家蚕致死。按现在的分类系统，该菌 就是现在苏云金杆菌猝倒变种( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i sv a t s o r t ) ，属于血清 型4 a ，4 b 。 石渡繁胤的发现，标志着日本蚕病学已经脱离从西欧的引进阶段，达到独立 做出贡献的阶段，同时，也成为苏云金杆菌研究的起点。接着，石渡繁胤( 1 9 0 5 ) 发表了论猝倒芽孢杆菌( o dt h e “s c o t t o ”b a c i l u s ) 等论文，描述了它的 形态和培养特征，再次证明了对象蚕幼虫的毒杀效果。1 9 0 8 年，岩渊( 1 w a b u c h i ) 正式使用猝倒芽孢杆菌( b a c i l l u ss o t t o ) 的菌名。 b e r l i n e r ( 1 9 1 1 ) 在粮业杂志上报道了德国苏云金省( t h u i n g e n ) 的一 个面粉厂1 9 0 9 年寄出的一批染病的地中海粉螟中分离出一种杆菌，1 9 1 5 年4 月， 他详细描述了该菌的形态和培养特征，并定名为苏云金杆菌( b a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ) 。他指明苏云金杆菌含伴孢晶体( p a r a s p o r ac r y s t a l ) ，但不曾 说明伴孢晶体有杀虫作用。b e r l i n e r 所定名的苏云金杆菌按现在的分类系统， 应该是苏云金杆菌苏云金变种( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s 阳r 拍竹功f j e 疗s j 5 ) 属于血清型l 。 虽然猝倒芽孢杆菌最先发现，日本作为一个养蚕大国只考虑到它对蚕的致 病性，却未注意到利用它防治害虫。在欧洲，发现苏云金杆菌对一些害虫有致病 性后，就把它作为防虫的潜在措施进行了研究。但是早期试验的不稳定结果，一 度对应用的前途失去了信心。从1 9 2 0 年到1 9 3 0 年，大量论文又肯定了它作为生 物防治剂防治玉米螟的效果。s t a n h a u s l 9 5 1 年有苏云金杆菌的培养物防美洲苜 粉蝶，也获得了鼓舞人心的结果。1 9 3 8 年，第一个苏云金杆菌商品制剂 s p o r e i n e ，在法国问世，并用于防治地中海粉螟。 从1 9 2 0 年到1 9 5 0 年这一段时间，有许多人曾用苏云金杆菌进行防治害虫 的田间试验。但直到5 0 年代，才发现了苏云金杆菌的杀虫活性物质。 1 2 认识本质和实用化阶段( 1 9 5 3 1 9 7 6 年) ： 1 9 5 3 年，h a n a r y 第一次发现了苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关。随 后，h a n n a r y f i t z j a m e s l 9 5 5 年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。以伴孢晶体为中 心，进行了微生物学、生物化学、形态结构、致病机理等一系列的研究，表明伴 孢晶体蛋白伴随着芽孢的形成而形成。各种伴孢晶体形态结构虽有不同，但所含 氨基酸成分差异不大。晶体蛋白只是一种原毒素( p r o t o x i n ) ，它只有经过昆虫 肠液或在碱性条件下消化激活，刁能形成毒性肽。 到5 0 年代末，相继发现了苏云金杆菌产生的其它几种毒素。h e i m p e l 于1 9 6 7 年将它们划分为四类，即n 一外毒素、b 一外毒素、y 一外毒素、6 一外毒素( 伴孢 晶体蛋白消化激活后产生的毒性肽) 。 苏云金杆菌杀虫毒素的本质被揭示后，又证实了活芽孢数与毒力不一定相 关。b o n n e f o i 等1 9 5 8 年描述了全面反映毒力的生物测定方法。1 9 6 6 年，在荷兰 的w a g e n i n g e n 举行的昆虫病理学和微生物防治国际会议上，e 一6 1 被推荐为国际 标准品，其效价被指定为1 0 0 0 国际单位毫克( i u m g ) ，其标准试虫为地中海粉 螟，首次为苏云金杆菌制剂标准化提出了统一的规格。 1 9 5 8 年，美国第一个商品制剂t h u r i c i d e 投入市场，粮食和药品管理局 ( f d a ) 批准暂行免除容许量限度，1 9 6 0 年正式批准，并允许在2 0 多种作物上 防治2 3 种害虫。 2 d u l m a g e l 9 7 0 年筛选出比当时生产菌株毒力高2 0 2 0 0 倍的h d l 菌株。由 于h d 一1 菌株对夜蛾科害虫毒力较高，很快取代了美国各公司的生产菌株。此后， 苏云金杆菌制剂在全世界范围得到了广泛的应用。据统计，到8 0 年代末，全世 界至少有3 0 种制剂，年产量约8 0 0 0 吨o 3 。 我国研究和应用苏云金杆菌起步较晚，5 0 年代末才从国外引种苏云金杆菌， 6 0 年代投入工业化生产，但发展相当快，在7 0 年代，我国的苏云金制剂年产量 就达1 0 0 0 吨以上，部分产品出口到泰国、新加坡及我国台湾、香港等地。 在这个时期，分类问题逐步得到完善。1 9 5 7 年s t a i n h a u s 等主张把苏云金 杆菌作为独立种，为此，伯杰氏细菌鉴定手册第七版。正式把苏云金杆菌列 为独立种：1 9 5 8 年，h e i m p e l 和a n g u s 第一次提出苏云金杆菌亚种的概念；1 9 7 3 年，b a r j a c 和b o n n e f o i 提出了以鞭毛抗原的血清反应为主要依据的分类系统； 1 9 7 4 年伯杰士细菌鉴定手册第八版正式列出了苏云金杆菌以下分亚种。 1 3 开拓视野及全面发展阶段( 1 9 7 7 一) ： 如果把h d 一1 菌株的分离看作是苏云金杆菌实用化的转折点，那么，对双翅 目蚊幼虫有特异敏感性的以色列变种菌株( s u b s p i s r s e e n s i s 丑 ，1 8 9 7 ) 的 分离( g o l d b e r g 和m a r g l i t ，1 9 7 7 ) 就成为苏云金杆菌开拓性研究的起点。以色 列亚种的发现，打破了长期以来认为苏云金杆菌只对鳞翅目昆虫有效的固有观 念，不仅把应用目标扩充到医学领域，还为研究不同毒力的菌株的特异性提供了 启迪。以此为契机，对鞘翅目幼虫有毒效、而对鳞翅目和双翅目幼虫无毒的新菌 种拟步行甲亚种( s u b s p t e n e b r i o u s ) ，于1 9 8 2 年从前联邦德国分离出，它 属h 8 a 8 b 型。而从美国分离的圣地亚哥皿种( s u b s p s s nd e i g n ) 产生的伴孢晶 体蛋白毒素，至少对2 0 多种鞘翅目昆虫有毒性。 值得一提的是自7 0 年代以来，我国科技工作者分离到了不少苏云金杆菌菌 株，已报道了国际上发表过的2 2 个血清型中的1 2 个，另有两个新的血清型，其 中由华中师范大学汪耀南等分离的b t i 1 8 9 7 菌株对蚊幼虫的毒效作用明显高 于b t i 1 8 9 7 。 d u l m a g e 博士于1 9 7 4 1 9 8 1 年组织国际合作，以确定3 1 9 菌株对2 0 种昆虫的 杀虫谱。在研究过程中，他们发现一些菌株对某一特定昆虫比h d 一1 菌株具有更 高的活性，这对于发展实用的杀虫剂有重大意义。更进一步的研究表明，杀虫谱 是由伴孢晶体的种类、活化方式和目标昆虫上皮细胞的类型决定的。 z a k h a r y a n 等1 9 7 6 年最先提出，质粒可能对伴孢晶体的编码起作用。接着， d e b a b o v 等和o a l u s h k a 等于1 9 7 7 年证实，苏云金杆菌含有质粒，它与伴孢晶体 的形成有关。从而激起了苏云金杆菌遗传学研究的热潮。通过转化、转导、接合、 融合等传递系统，使控制伴孢晶体形成的基因不仅在苏云金杆菌亚种之间，而且 在不同中细菌之间，甚至与高等植物进行了转移或克隆，并获得了表达。 1 9 8 1 年，s c h n e p t 和w h i t e l e y 首次将h d l 菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠 杆菌中，并得到表达；1 9 8 7 年，美国m o n s a n t o 公司用自己构建的s e v 载体系统 转移k u r s t a k i 的内毒素基因，获得抗鳞翅目害虫的番茄转化株。 总之，苏云金杆菌的研究进入8 0 年代后，研究范围越来越广，包括内毒素 毒性蛋白成分，作用机理、苏云金杆菌遗传与育种技术、基因工程、杀虫谱、抗 性等的研究。 2 b t 的基础性研究进展： 2 1 作用机制和特点： 苏云金杆菌的侵染方式是“病从口入”，毒素通过胃毒作用使昆虫致死。除 了毒素对敏感昆虫造成毒血症外，该菌还可以由消化道侵入到昆虫体腔中，通过 大量繁殖而引起败血症。当昆虫食入后，毒蛋白被碱性肠液激活，并被肠蛋白酶 降解，形成较小的6 一内毒素分子，破坏昆虫的肠上皮细胞，渗进体腔引起败血 症，导致昆虫死亡。有些b t 变种的毒蛋白还能碱解出b 一外毒素，在昆虫体内 抑制r n a 的合成，使细胞分裂受阻而导致死亡。高等动物肠胃分泌物呈酸性，不 能激活b t 毒蛋白，故b t 制品对其安全无毒”1 。 苏云金杆菌毒素大致可分为四类：( 1 ) 杀虫晶体蛋白( i n s e c t i c i d a lc r y s t a l p r o t e i n 。i c p ) ；( 2 ) 苏云金素；( 3 ) 芽孢；( 4 ) v i p ( v e g e t a t i v e i n s e c t i c i d a l p r o t e i n ) 2 2b t 的分类研究： b t 的分类是细菌学家争论不休的问题之一，直到1 9 7 5 年在伯杰氏细菌鉴 定手册中才正式列为一个独立的种，种以下又区分为不同的亚种。亚种的划分 主要依据鞭毛抗原的血清型( h 一血清型) 和生理生化特性的不同，后来由于无鞭毛 亚种的出现，人们又采用了营养细胞的酯酶型作为辅助分类依据。b t 自发现以 来，在亚种分类鉴定上出现了一些混乱现象，并表现为几个阶段：1 9 7 4 年伯 杰氏细菌鉴定手册收录了儿个血清型共1 2 个亚种；1 9 8 1 年鉴定为1 5 个血清 型2 2 个亚种，1 9 8 4 年鉴定为2 2 个血清型，1 9 8 6 年鉴定为2 3 个血清型3 0 个亚 种，1 9 9 6 年喻子牛等应用血清学技术对b t 分类，发表分属于4 5 个血清型的6 4 个亚种。到目前为止，全世界已发表和定名并得到公认的为2 3 个血清型4 8 个亚 种“1 。应当指出的是，不同学者由于研究方法和材料的不同得出的结果也难免有 差异。 2 3 杀虫晶体蛋白的多态性及其抗虫谱： b t 的大多数菌株都能产生多种类型的晶体蛋白，不同亚种甚至同一亚种的不 同菌株晶体蛋白的多肽成分都不同。l e r e c l u s 等( 1 9 9 3 年) 将b t 杀虫毒蛋白( i c p ) 的s d s p a g e 图谱分为5 类：一类含c r yi 署f l c r y i i ，分子量6 7 k d a 和1 3 0 1 4 0 k d a ：二 类仅含c r y1 分子量约为1 3 0 1 4 0 k d a ；三类仅含c r y l l l ，分子量约为6 7 k d a ；四类 含c r y v ，分子量为1 3 0 k d a 、6 7 k d a 和2 7 k d a ；五类仅含分子量4 0 4 5 k d a 的杀虫晶 体蛋白“3 。b t 的各类晶体蛋白都表现出不同的杀虫活性谱“3 。c r yi 高抗鳞翅目 昆虫，c r yi i 抗鳞翅目和双翅目昆虫，c r y l i i 高抗鞘翅目昆虫，c r y i v 抗双翅目昆 虫。最近几年又发现了兼抗鳞翅目和鞘翅目的b t 毒蛋白c r y v 、抗线虫的c r y i v 。 大多数b t 株系可产生几种晶体蛋白”1 。 2 4 杀虫晶体蛋白的辅助蛋白： 在b t 晶体蛋白超量表达和晶体形成过程中有时还表达一些小分子量的辅助 蛋白质，它们本身不具杀虫活性，但对晶体蛋白的正常表达和晶体形成却有帮助 作用，有时甚至是必需的。1 。它们有的能够防止正在翻译的杀虫晶体蛋白被菌体 内的蛋白酶降解，起着分子伴侣的作用；有的在晶体形成过程中起着脚手架的作 用。现已发现的辅助蛋自主要有p 1 9 、p 2 0 、o p f l 和o p f 2 等。p 1 9 又称为帮助蛋白； p 2 0 对多种晶体蛋白的表达都有促进作用；o p f 2 在c r y i ia 晶体的形成中是必不可 少的”1 。 2 5 杀虫晶体蛋白基因类型： 自从1 9 8 1 年s c h n e p f 和w h i t e l e y 从库斯塔克亚种中克隆到杀虫晶体蛋白的第 一个基因，至今已发现了许多伴孢晶体蛋白的基因，这反映了杀虫晶体蛋白基因 的多态性，它是晶体蛋白多态性的遗传基础。人们先后提出了几个方案对晶体蛋 自基因分类。其中1 9 9 5 年提出的按晶体蛋白氨基酸序列相似性4 5 、7 5 年h 9 5 ， 将已知的9 4 种晶体蛋白基因分成4 个等级，n 日c r yi 、c r y i i 、c r y l i l $ 口c r y i v 4 个主 要类型共1 7 群、3 6 个亚群、5 2 类9 4 个亚类基因，至1 9 9 7 年底增至2 1 个群、4 4 个亚 群、6 4 类1 1 6 个亚类基因。最近几年已发现了c r y v 和c r y v i 基因类型n 0 1 。 2 6 杀虫晶体蛋白基因在b t 中的分布： 现在发现的1 1 6 个杀虫蛋白基因，分别分布于b t 不同菌株中。不同血清型、 不同亚种之间，其基因数和种类有明显差异，1 6 个不等。同一菌株的杀虫晶体 蛋白基因，也可能定位于不同的质粒上；或者多个晶体蛋白基因定位于同一质粒 上：而有的则定位于染色体上。同一杀虫晶体蛋白基因在不同的菌株中可定位于 不同的质粒上，即使在同一菌株中的同一杀虫晶体蛋白基因也可定位于不同的质 粒上，甚至有的菌株的同一杀虫晶体蛋白基因可同时定位于质粒和染色体上3 。 2 7b t 质粒的多态性： b t 菌中普遍有质粒存在，但不同菌株质粒的数量和大小各不相同，表明了b t 质粒的多态性。根据质粒的大小和特性，可将b t 质粒分为2 种类型；i 型为小质 粒，分子量小于1 5 m d a ，相互之间及与大质粒和染色体d n a 都无同源性，其功能不 详：i i 型为大质粒，分子量大于1 5 m d a ，相互之间及与染色体d n a 间存在d n a 序列 的同源性，在菌株间可通过接合方式转移，大多数杀虫晶体蛋白基因定位于这类 质粒上。b t 不同亚种质粒数是不同的，并非任何一种质粒在所有亚种中都存在， 不同亚种质粒数及大小不同，而且同一亚种不同来源的菌株，质粒数及大小也不 一致，这充分反映了b t 质粒的多态性。 2 8b t 核基因的多样性和保守性： d n ag + cm 0 1 是细菌分类的重要指标之一，它反映了d n a 链中不同类型的碱 基的相对比例。一般细菌种内个体间d n a g + cm 0 1 的差异不超过3 ，属内种问不 超过1 0 ；细菌群体内变化为2 4 7 6 n 2 1 。b t 的d n ag + cm 0 1 变化范围在3 5 7 3 7 o “”，表明b t 群体中不同菌株d n ag + cm 0 1 组成仍存在一定差异，表现出其 基因组d n a 碱基组成的丰富多样性。同时，利用d n a d n a 分子杂交分析可有效分析 其不同来源菌株d n a 碱基顺序同源性，实验证明：b t 作为一个种d n a 同源性达6 0 以上，表现出b t 基因组d n a 的稳定性和保守性。 3b t 的应用性研究进展： 多年来对b t 的基础研究也推动了其应用的研究，其制剂是世界上产量最大的 微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的9 0 9 5 “。而且近年来的研究表明，b t 发酵液上清液与菌剂混合旋用可明显增强其对敏感害虫的毒杀作用“。 3 1 b t 遗传工程菌研究进展： 由于天然b t 制剂具有杀虫谱窄，残效期短，因此国内外科学家利用遗传工程 方法对其进行了改造“。主要在以下几个取得了进展。 3 1 1 扩大杀虫范围： 1 9 9 5 年c r i k m o r e 将c r y l i i a 基因转入b t 以色列亚种中，使其不仅能杀鞘翅目昆 虫，还能杀鳞翅目昆虫有人将c r yia 基因转x b t 拟步甲亚种中，使能杀死鞘翅 目昆虫的同时，又能杀死双翅目昆虫，这就扩大了这些b t 亚种的杀虫范围。 3 1 2 增强持效性： 1 9 9 1 年m y c o g n 公司推出了一种新的b t 杀虫剂，它是利用c e l l e a p 系统，成功 将c r y 基因转入荧光极毛菌中，使杀虫剂的持效期延长了l ，5 倍，获得了巨大的经 济效益。 3 1 3 植物内生性利用： i n c i d e 系统，将c r y 基因转入植物内生菌( c l a v i b a c t e r x y l i ) 中，使玉米对稻 纵卷叶螟具有中等防治作用。 3 1 4 提高在水体中的活性： 1 9 9 0 年，成功将c r y 基因转入到蓝细菌中，使蚊虫易于摄取，对蚊虫的防效得 到了很大的提高。 3 ，1 5 改善在土壤中的活性： 将c r y 基因转入根际细菌如极毛杆菌、根瘤菌中，防治地下害虫，已获得广 泛应用。 3 1 6 提高毒力： 以点突变原理与技术改造c r y 基因碱基，改变毒蛋白构型，可提高对目标昆虫 的毒力。如一种毒蛋白5 4 5 位异亮氨酸被脯氨酸取代后，失去了对伊蚊的毒性， 但提高了对大菜粉蝶的毒力。 。 3 2 转b t 毒蛋白基因抗虫植物的研究： 近年来对b t 的研究已发展到将b t 晶体蛋白基因转入其它物种获得抗虫作物 如抗虫的棉花、烟草、番茄、马铃薯、紫花苜蓿、大豆、玉米、水稻、白杨、油 菜等都已获得成功，杀虫死亡率达5 0 7 0 ，开辟了抗虫育种新途径。 3 2 1 抗虫棉及其杂交后代的抗性表现： 抗虫棉是由美国岱字棉公司利用岱字、爱字与岱字5 0 棉杂交，1 9 8 7 年与孟 山都公司合作利用转基因技术育成的“”。由于b t 毒蛋白基因来自原核生物，影 响了b t 毒蛋白基因修饰，后来改变了2 1 的核苷酸序列。，在c a m v 3 5 s 启动子 的控制下，人工合成全长的b t 毒蛋白基因，再引入棉花中，获高效表达，表达 量从占可溶性蛋白的0 0 0 1 上升到0 0 5 0 1 ，抗虫性大大增强。而且b t 杀 虫基因在棉花中可以稳定遗传“。中国农科院生物技术研究中心己完成类似的基 因改造工作，并将改造后的b t 毒蛋白基因导入我国主栽棉泗棉3 号，晋棉7 号、 中棉1 2 号，得到了高抗棉铃虫的转基因工程棉。虫棉现有单抗、双抗及三抗( 抗 虫一棉铃虫、蚜虫、红蜘蛛一抗枯萎一抗黄萎，世界首例由我国育成，现在山东省 梁山县试种。”) 。转b t 棉花在我国河北、山东、河南等地已大面积种植，我国自 行研制的抗虫棉种植面积已达1 3 万亩。如果以b t 抗虫棉选系为抗虫亲本，以各 种陆地棉常规品系为非抗虫亲本杂交，f 1 代均表现高抗棉铃虫，抗性不分离； f 2 代抗性下降，出现不抗株系，表现抗性分离”。这种抗性下降现象在田间锦 铃虫自然协迫条件下，通过连续多代进行抗性选择，可使抗性迅速稳定。从f 2 代连续3 次选择到f 5 代可获得理想的抗性纯合稳定株系。利用这种方法，可以 打破抗虫棉公司的种子终止技术( 即转基因作物被设计成雄性不育，农民不能自 己留种) 。 3 2 2b t 作物的生态效应及昆虫对毒素的抗性： b t 作物可毒杀许多农业害虫，但也会毒杀害虫天敌昆虫和一些珍贵的昆虫。 1 9 9 9 年5 月2 0 日的自然杂志发表研究论文报道：帝王蝶吃了转b t 玉米花 粉后，4 4 死亡。，幸存的也不能正常发育。这个现象立即引起了轩然大波，因 为帝王蝶是珍贵的蝴蝶品种，秋天飞到墨西哥越冬，春天飞回美国中陌部的玉米 带交配繁殖，如果在这些地区大量种植转b t 玉米，将对这一物种人为地造成劫 难。另外，转b t 作物的长期种植也会造成昆虫对b t 毒素形成抗性，从而降低杀 虫效果。小菜蛾是在田间已对b t 生物制剂产生抗性的第一种害虫；抗虫棉田的 第四代、第五代棉铃虫也会产生抗性危害，应酌情防治。昆虫对b t 毒素产生抗 性的机理有二”：一是毒素与肠刷状缘细胞膜泡上的受体结合能力下降、结合位 点的数目和结构改变；二是昆虫经长期适应，中肠中水解晶体蛋白的酶如类胰蛋 白酶、类糜蛋白酶少或酶活性较低有关“”1 。 4b t 发酵研究： 工业应用的发酵方法有多种，在发酵过程中按培养基的状态分为固态发酵和 液态发酵。多采用液态发酵法。 苏云金杆菌液体深层发酵的生产过程一般包括四个阶段试管斜面菌种 培养，种子扩大培养，发酵及产品后处理。生产上使用的菌种要不断进行分离选 种，做成斜面培育好放在冰箱中，用时先将其活化后转接到新鲜培养基上培养。 在进行大规模的生产时，不仅要求一定质的种子，还要求一定的量，所以必须将 种子逐步扩大。b t 发酵中种子扩大是从茄子瓶或斜面试管中长满大量孢子后再 接种到种子罐中培养。发酵过程主要是在发酵罐内进行，主要是控制各种条件， 促使b t 不断繁殖，大量形成芽孢和伴孢晶体。 世界上第一批工业品苏云金杆菌制剂于1 9 5 8 年诞生于美国，至今已经4 0 余年。国家科委于1 9 6 4 年建立了首家b t 制剂工业化生产基地一武汉燃料厂青虫 菌车间，对b t 制剂的研究和发展起到了一定的推动作用。但真正的发展始于8 0 年代中期，湖北农科院成功研制了b t 乳剂，从1 9 8 5 年全国年产1 6 8 t ，迄今全国 年产已达5 万t 以上。我国科技人员在经历了：“七五”、“八五”、“九五”攻关 十多年的努力，在b t 液体发酵技术上已经取得长足的进步，特别是发酵水平已 经由1 5 0 0 i u u l 提高到4 5 0 0 i u u l 以上，噬菌体倒罐率从1 0 以上下降到1 以下， 两项指标均达到国际先进水平。此外还完成了产品质量标准化，实现了产品质量 与国际标准接轨。 4 1b t 菌株的优选： 优良菌株是微生物发酵中影响发酵水平的基础。目前，大多数生产厂家主要 使用血清i i i 型、v 型、型菌株，包括h d 一1 、m p 一3 4 2 、c t 一4 3 、b r k 、7 2 1 6 、g c 一9 1 、 8 0 1 0 等。顾真荣1 等针对h d 一1 菌株在发酵中容易产生“空泡”和小方形晶体的现 象，通过连续3 代单菌落分离筛选到“空泡”较少、毒力较高的优良菌株h d 一卜3 2 等。采用化学诱变是获得优良菌株的有效方法之一，以硫酸二乙酯( d e s ) 处理c t 一 4 3 菌株，得到菌落形态、菌形和产生褐色色素三种类型的突变株。光滑型( s 一 型) 菌落自发突变率依亚种不同而异，除个n s 一型菌落外均不产生苏云金素，菌 形变异株有纯芽孢、纯伴孢晶体、芽孢和伴孢晶体混合体等6 种类型，它们产生 苏云金素的水平各不相同；还获得了苏云金素产量比出发菌株明显提高的两个菌 株。采用物理诱变如紫外线连续照射，选育出对阳光中紫外线抗性有较大提高的 肯尼亚亚种突变型菌株。突变株与亲本株相比较，对紫外线抗性提高了1 0 0 倍， 对棉铃虫的毒力提高2 3 倍。采用亚硝基胍和紫外线处理h d l 、7 2 1 6 菌株，获 得了具有应用前景的8 6 6 3 、8 7 1 4 、8 7 0 8 5 z 株无芽孢突变菌株，而发酵水平与原 出发菌株相当”1 。从自然死亡的昆虫、土壤中筛选仍是获取b t 优良菌株的有效方 法之一。1 9 7 9 年从舍蝇( m u s c av i c i n a ) 幼虫中分离获得的7 9 0 0 7 菌株。“，具有天 门变种( 7 2 1 6 ) 的典型特征，其对棉铃虫的毒力大大高于7 2 1 6 、h d l 等已知菌株。 此外，华中农业大学生科院、湖北农科院b t 研究开发中心、中山大学、河北农科 院植保所等自然分离的c t 一4 3 、m p 一3 4 2 等菌株在发酵中已获得广泛的应用。值得 一提的是，b t 3 2 程菌株正进入我国发酵工业领域，前景看好。 4 2b t 发酵培养基的筛选： 优良的培养基是微生物发酵中影响发酵水平的关键之一。我国8 0 年代中期便 完成t b t 发酵培养基从低浓度( 3 - 4 ) 向高浓度( 9 一1 1 ) 的转变，而高浓度培养 基中各种营养素的配比对b t 菌株的生长和晶体毒素的产生至关重要。 4 2 1 正交试验是培养基筛选的有效力法之一： 华中农业大学采用正交试验筛选b t 高产苏云金素的培养配方。”。将两次正交 试验获得的1 1 种培养基用3 个菌株评选，发现尽管不同菌株在同一培养基中产生 苏云金素的量不同，但3 个菌株均在m 。培养基上产苏云金素量最高。“正交试验一 浓度加倍一生物测定”是b t 发酵培养基配方优选中一种简便、实用、快速的优选 模型。”。采用7 9 0 0 7 菌株和5 号配方，以b t 发酵罐进行试验，平均发酵效价达 2 8 8 7 i u u1 。湖北农科院b t 研究开发中心将5 号配方进一步优选，使发酵水平大 大提高，经过1 9 9 9 年4 0 t 发酵罐连续2 0 批发酵液进行检测，其平均发酵水平达 5 4 9 6 i u “l 。 4 2 2 不同b t 菌株的营养需求不同： 使用豆饼粉做碳源，对7 2 1 6 的发酵试验表明，当p h 值达n 8 2 以上时，细胞 内原生质浓缩，芽孢开始形成。根据不同菌株的伴孢晶体及芽孢中各种氨基酸 的比例差异，经对8 0 1 0 菌株进行研究，发现该菌株生长中需要培养基中提供较多 的谷氨酸1 。 4 2 3 b t 培养基中的工业废液利用： 利用淀粉厂的玉米浸泡液、酒精厂的废醪液、化工厂的丙酮一丁醇废醪液等 工业废液作为b t 发酵的培养基原料，既可降低成本，又可变废物为有用。经发酵 试验，已筛选到较好的培养基配方。大麦芽根是啤酒工业的副产物，含有丰富 的粗蛋白和可溶性无氮物，以h d l 菌株进行了麦芽根培养基试验。结果表明， 只要配比适当，菌体生长良好，产毒能力正常，活孢子数通常可达到3 7 亿m l 以 上，而原料成本仅相当于常用玉米培养基的1 1 4 。 4 3b t 发酵过程的调控技术： 4 3 i 培养条件： 对中国b t k e n a g 菌株培养条件的研究表明，最适p h 6 7 - 7 2 。通气量水平 对菌的生长及芽孢和晶体的形成均具有明显影响，培养基与空气容量之比为1 ：1 6 时，总菌数为7 2 亿r a h ，芽孢形成率为9 8 ；但低于l ：6 时，菌数和芽孢形成率分 别下降7 6 和2 9 。“。刘序章等研究了通气量对发酵的影响”“。当发酵全程采用 1 ：0 8 通气量时，最终发酵菌数3 8 亿m l ；当前期( o 一4 h ) 1 ：1 0 、中期( 4 - 1 4 h ) 1 ：1 4 、 后期( 1 4 - 2 0 h ) 1 ：1 2 时，菌数可达7 4 亿m l ，发酵水平提高约一倍。 4 3 2 代谢： 通过对b t 发酵的代谢研究，了解营养的利用情况，从而指导发酵过程的调控。 有人经对发酵过程中总核数、菌数、总糖还原糖、溶磷、氨基氮等测定，发现核 酸曲线与b t 典型生长曲线的形状相似，意味着其随着培养基浓度而增减，即发酵 液的核酸含量可以反映菌体数量。马天良。”等采用1 2 l 玻璃发酵罐，经过总糖等 1 2 ；f r p 参数的测定，获得t b t 生长过程的代谢曲线，从中分析了各参数变化间的相 互关系，证实了核酸曲线与b t 生长曲线的一致性。认为核酸法具有快速、准确、 简便的优点，可用于b t 发酵过程的中间检测；b t 对数生长期各种代谢相当活跃， 是提高发酵菌数的关键阶段，碳素代谢调节主要在此阶段进行，因此供氧必须强 化。 4 3 3 溶氧： b t 发酵水平与溶氧关系密切。采用培养基含固量9 5 、以h d 一1 为供试菌株 进行了b t 发酵溶解氧研究“，结果表明，在对数期内最低溶解氧量下降6 ，增加 供氧量的效果不大，而提高搅拌转速可提高供氧量。当转速从3 0 0 r m i n i ：调到 6 0 0 r m i n 时，菌数提高4 7 。在对比发酵生理特性研究的基础上，证实b t 发酵 过程中发酵液中溶氧( d o ) 浓度是影响发酵水平的关键因素“。在1 2 l 玻璃发酵罐 试验中，通过优化供氧条件，使发酵水平大大提高。适当增加搅拌桨直径，菌数 可提高1 3 6 。发酵全过程采用3 0 0 6 0 0r m i n 变速搅拌，菌数e t 3 0 0 r m i n 定速 提高3 6 ，轴功耗较6 0 0 r m t n 定速节约5 0 。在2 0 t 发酵罐放大试验，调整搅拌结 构，使溶氧水平提高，菌数比改造前增加1 5 3 。有人研究了菌株7 9 0 0 7 、g c - 9 1 、 m p 一3 4 2 、9 4 0 0 1 、9 4 0 0 2 在4 种配方条件下的溶解氧特性，表明溶氧在高浓度发酵 培养基中显得尤为重要。 4 4 高密度培养技术： 高密度培养基是提高发酵水平的有效手段之一。b t 在以葡萄糖为限制性基质 的恒化培养中，维持系数m 为0 1 7 m g ( 葡萄糖) m g ( 菌) h ，基质得率系数y g m a x 为0 5 3 9 ( 菌) g ( 葡萄糖) ，最大比生产速率hm = 0 6 9 h ，饱和系数k s = 0 9 3 m g m l ，理论最适稀释率d m 为0 3 9 8 h ，最大产率d m x m 为0 6 3 m g m l h ， 比分批培养的生产水平提高4 7 4 倍。杨自文“等以葡萄糖、牛肉膏、酵母浸出粉 和无机盐为培养基，采用德国贝朗公司生产3 l 和1 5 l 自动发酵罐，以m i c r o m f c s 微机监检软件实行在线监测和控制发酵过程研究了恒速补料、变速补料、代谢调 控等策略对高密度培养的影响。结果表明。当葡萄糖用量3 5 3 9 l 增5 0 h 至l j l 0 8 3 9 l 时，最大生物量由2 3 4 9 d c w l 增2 n n 6 5 2 9 d c w l ，晶体含量则由4 8 5 m g m l 增加 到1 7 1 8 m g m l 。由此认为，恒速补料在底物浓度过