（植物学专业论文）拟南芥β葡萄糖苷酶调节aba含量动态变化与耐旱性关系研究.pdf

河南大掌研究生博士掌位论文 中文摘要 植物激素a b a 不仅参与调控种子休眠和萌发过程，还广泛参与干早、盐碱和冷害等多种 非生物胁迫应答反应。这些生理功能的实现依赖于细胞t 勾a b a 水平动态且快速的精细调控。 细胞内a b a 含量受复杂的从头合成途径、羟基化分解代谢和共价结合失活的共同控制。a b a 葡萄糖酯( a b a g e ) 是植物体内a b a 结合失活的主要形式，这种结合态的a b a g e 能否重新 释放出具生物学活性的游离a b a ，目前所知甚少。 我们筛选了功能获得性a b a 不敏感突变体g a i 6 ，该突变基因编码6 葡萄糖苷酶b g l u l 0 。 b g l u l 0 的t d n a 插入纯合突变体气孔无论胁迫与否均趋于较大的开放状态，导致水分丧失过快 而不耐干旱；相反b g l u i o 的超表达株系比野生型耐早性更强，而且a b a 、n a c i 及甘露醇等胁 迫处理时b g l u i o 的超表达株系比野生型萌发后子叶变绿数量更少，而b g l u l 0 突变体则表现更 好的萌发后幼苗生长态势。无论正常浇水还是干旱处理条件下b g l u l 0 的超表达株系中a b a 含 量均高于野生型w t ，而b g l u l o 突变体q u a b a 含量却比野生型稍低。a b a 或干旱反应的标志性 基冈的表达分析表明，脱水处理可诱导r a b l 8 、r d 2 9 b 和r d 2 2 的表达显著上调，而且 b g l u i o - ( 圯植物中此三个基因的表达量高于、t ，而b g l u l 0 突变体中该三个基阒的表达量则低 于w t ；a b a 响应的转录冈子彳乃培6 同样表现出类似的表达模式。此外，干旱处理条件下植物 体内总p 一葡萄糖苷酶活性与植物的耐旱性呈正相关。这些结果均暗示b g l u l 0 可能通过调控 a b a 含量进而使干旱耐性基因表达量升高而增强植物的耐旱性。 带g f p 标签的b g l u l 0 融合蛋白及r f p 与液泡膜标志蛋白1 ，t i p l 融合蛋白的原生质体瞬时 表达的荧光共定位结果显示，b g l u l 0 酶蛋白定位于液泡中；且我们的实验也显示拟南芥总d 葡萄糖苷酶活性的最适p h 值为6 0 左右，与已知的液泡酸碱环境相吻合。b g l u i o 基因组织表 达的g u s 染色结果表明该基因在植物各组织包括根、茎、叶、花及果荚均有表达，尤其是成 熟的输导组织中表达更为强烈。此； f a b a 、盐害、脱水及冷胁迫均可诱导b 吼己，d 基因的表达 上调，暗示了p 一葡萄糖苷酶b g l u l 0 可能参与了多种胁迫下游离a b a 的水解释放与植物的胁迫 耐性反应。 总之，本研究使人们对植物体i 为a b a 水平的动态调节机制有了新的认识， i o a b a 的从头 合成、羟基化分解代谢、共价结合失活及结合态a b a 的重新酶解释放，协同精细调控植物体 内游离a b a 含量，使植物体得以应对复杂多变的胁迫环境和生长发育需要。 关键词：拟南芥；b - 葡萄糖苷酶；a b a ；a b a - g e b g l u l 0 l 拟南芥口一葡萄糖苷酶调节a b a 含量动志重化与对罩性关系研究 a bs t r a c t t h ep h y t o h o r m o n ea b a p l a y sc r u c i a lr o l e si nv a r i o u sp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e si n c l u d i n gs e e d d o r m a n c y , g e r m i n a t i o na n da d a p t i v er e s p o n s e st oe n v i r o n m e n t a ls t r e s ss u c ha sd r o u g h t ，c o l da n d h i g hs a l ti ns o i l t h ec o n t e n tf l u c t u a t eo fc e l l u l a ra b al e v e l sa l l o wp l a n t st oa d a p tt ot h ec h a n g i n g p h y s i o l o g i c a la n de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s c e l l u l a ra b ai sc o n t r o l l e db yc o m p l e xd en o v o s y n t h e s i sp a t h w a y s ，h y d r o x y l a t i o na n dc o n j u g a t i o nr e a c t i o n s a b ag l u c o s ee s t e r ( a b a g e ) i st h e d o m i n a t i n gf o r mc o v a l e n tb o u n d i n ga b ai np l a n t s h o w e v e r , t h ei s s u eo fw h e t h e rt h ei n a c t i v e a b a - g ec o u l dr e r e l e a s ea n dp r o d u c et h eb i o l o g i c a la c t i v ea b ar e m a i n st ob ec l a r i f i e d w es c r e e n e dag a i n - - f u n c t i o no fa b a i n s e n s i t i v em u t a n tg a i 6 , t h em u t a t i o ng e n ee n c o d e d i b - g l u c o s i d a s eb g l u i o t - d n a i n s e r t i o nh o m o z y g o u sm u t a n tb g l u l os h o w e df a s t e rw i t h e r i n ga n d d e a t ht h a nw tu n d e rd r o u g h ts t r e s s ，a n ds t o m a t a lb e h a v i o ra n a l y s i ss h o w e dt h a ts t o m a t ao fb g l u l o t e n dt ok e e p i n gb i g g e ra p e r u r et h a nt h a to fw t w h i c hl e a d st og r e a t e rl o s so fw a t e rw h e t h e ru n d e r s t r e s so rn o t b yc o n t r a s t , t h eo v e r - e x p r e s s i o nl i n e so fb g l u i os h o w e ds t r o n g e rd r o u g h t - t o l e r a n c e t h a nw t i na d d i t i o n ，b g l u i o o el i n e sb e h a v e df e w e rg r e e nc o t y l e d o n sa f t e rg e r m i n a t i o nt h a nw l w h i l et h em u t a n tb g l u l op e r f o r m e db e t t e rs i t u a t i o na f t e rg e r m i n a t i o na n ds e e d l i n gg r o w t hu n d e r a b a ，n a c ia n dm a n n i t o ls t r e s st r e a t m e n t s d e t e r m i n a t i o no fa b a c o n t e n ti np l a n t su n d e rb o t h n o r m a lw a t e r i n ga n dd r o u g h tc o n d i t i o ns h o w e db g l u i o o el i n e sh o l dh i g h e ra b ac o n t e n tt h a n t h a ti nw t b u ta b ac o n t e n ti nb g l u l os l i g h t l yl o w e rt h a nt h a ti nw t t h er e s u l t so fe x p r e s s i o n a n a l y s e sf o rm a r k e rg e n e sr e s p o n d i n gt oa b aa n d o rd r o u g h ts h o w e dr a b l 8 , r d 2 9 ba n dr d 2 2 w e r ed r a m a t i c a l l yi n d u c e db yd e h y d r a t i o ns t r e s s ，a n di tw o r t h yn o t e dt h a tt h ee x p r e s s i o n sl e v e lo f t h e s eg e n e sw e r eh i g h e s ti nb g l u i o - o el i n e sb u tl o w e s ti nb g l u l om u t a n t t h es i m i l a re x p r e s s i o n p a t t e r nw a sf o u n df o rh o m e o d o m a i n l e u c i n ez i p p e rt r a n s c r i p t i o nf a c t o rg e n ea t h b 6 , w h i c hw a s k n o w ns i g n i f i c a n t l yu p r e g u l a t e db ya b a f u r t h e r m o r e ，t h et o t a l1 3 - g l u c o s i d a s ea c t i v i t yi sp o s i t i v e c o r r e l a t et ot h ed r o u g h tr e s i s t a n c ei nb g l u l om u t a n t ，w ta n db g l u l o - o ep l a n t s t h e s er e s u l t sa l s o e f f e c t i v e l ye x p l a i n e dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e na b a c o n t e n ta n dd r o u g h t - t o l e r a n c eo fd i f f e r e n tp l a n t s ， s u g g e s t i n gb g l u 10m a yh a v et h ef u n c t i o no fh y d r o l y s i n ga b a g ea n dr e l e a s i n go ff r e ea b at o e n h a n c es t r e s s - t o l e r a n c er e s p o n s eo fp l a n t s f l u o r e s c e n c ec o - l o c a l i z a t i o nr e s u l to f b g l u l 0 ：g f pa n d1 , - t i p l ：r f p ( at o n o p l a s tm a r k e rp r o t e i n ) f u s i o np r o t e i n su s i n gt r a n s i e n te x p r e s s i o ni np r o t o p l a s to fm e s o p h y l lc e l l ss h o w e db g l u10e n z y m e 2 词雨大写酗开冤生佴士学位论文 p r o t e i nl o c a l i z e di nv a c u o l e ，a n do u re x p e r i m e n ta l s os h o w e dt h eo p t i m a lp hi sa b o u tp h6 0o ft o t a l 1 3 - g l u c o s i d a s ea c t i v i t yi na r a b i d o p s i s ，w h i c hm a t c h e dt h ek n o w nv a c u o l a rp he n v i r o n m e n t g u s s t a i n i n ga n a l y s i so fb g l u i og e n eo r g a n s p e c i f i ce x p r e s s i o ns h o w e dt h a tt h i sg e n ei st r a n s c r i p t e di n v a r i o u so r g a n i z a t i o n s ，i n c l u d i n gr o o t s ，s t e m s ，l e a v e s ，f l o w e r sa n ds i l i q u a , e s p e c i a l l yi nm a t u r e c o n d u c t i n gt i s s u e s i na d d i t i o n ，b g l u i ow a si n d u c e db ya b a ，s a l t ，d r o u g h ta n dc o l ds t r e s s ， s u g g e s t i n gt h a ti b - g l u c o s i d a s eb g l u 10m a yb ei n v o l v e di nv a r i e t yo fs t r e s s e sa n dh y d r o l y s i so f a b a - g e p r o d u c i n g f r e ea b ai np l a n ts t r e s st o l e r a n c er e s p o n s e i nc o n c l u s i o n ，t h i ss t u d yp r o v i d eu san e w u n d e r s t a n d i n go fa b a l e v e ld y n a m i ca d j u s t m e n t m e c h a n i s mi np l a n t s ，n a m e l y , b yf i n ec o n t r o l l i n go ff r e ea b a c o n t e n tt h r o u g hc o l l a b o r a t i v e l yt u n i n g p a t h w a y so fa b a d en o v os y n t h e s i s ，h y d r o x y l a t i o nc a t a b o l i s m ，c o v a l e n tc o n j u g a t i o na n dr e l e a s i n g f r e ea b af r o ma b a - g e ，s op l a n t sc a nc o p ew i t hc o m p l e xa n d c h a n g i n gs t r e s se n v i r o n m e n ta n dt h e d e v e l o p i n gn e e d s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s ；i b - g l u c o s i d a s e ；a b a ；a b a - g e ；b g l u1 0 3 拟南芥口一葡萄糖苷酶调节a b a 含量动态变1 匕与对罩佳关系研完 缩写表 a b b r e v i a t i o n s 英文缩写英文名称中文名称 a b aa b s i c i da c i d 脱落酸 b g l u 1 3 - g l u c o s i d a s e b 葡萄糖苗酶 a b a g ea b a g l u c o s ee s t e r a b a 葡萄糖酯 a b a g sa b a g l u c o s ee t h e r a b a 葡萄糖苷 p ap h a s e i ca c i d 红花菜豆酸 d p a d i h y d r o p h a s e i ca c i d 二氢红花菜豆酸 u g t g l u c o s y l t r a n s f e m s e s 糖基转移酶 b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基砜 d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s ( m i xo f 脱氧腺苷三磷酸 d n t p( 椰p d t t p d c t p d g t p d a t p d t t p d c t p d g t p ) 的混合物) e d l a e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 对硝基苯- b d - 半乳糖吡喃 p n p g p - n i t r o p h e n y l p - d - g l u c o p y r a n o s i d e 糖苷 g u s i b - g l u c o r o n i d a s e p - 葡糖苛酸酶 i p t g i s o p r o p y l t h i o p d - g a l a c t o p y r a n o s i d e异丙基一d d 一硫代半乳糖苷 d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 d e h y d r a t i o n r e s p o n s i v ee l e m e n t b i n d i n g d r e b 脱水应答元件结合因子 f a c t o r d l 也 d e h y d r a t i o n - r e s p o n s i v ee l e m e n t s 脱水应答元件 b z i p b a s i cl e u c i n ez i p p e r 碱性亮氨酸拉链 m e s 2 - ( n m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i ca c i d2 ( n 吗啡啉) 乙磺酸 k a n k a n a m y c i n卡那霉素 4 河南大学研究生博士掌位论文 a m p a m p i c i u i n 氨苄青霉素 r i f r i f a m p i n 利福平 r n a s e ar i b o n u c l e a s ea 核糖核酸酶a r o sr e a c t i v eo x i d es p e c i e s 活性氧 r e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i n i t t p c r逆转录p c r r e a c t i o n s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 g f pg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 绿色荧光蛋白 r f pr e df l u o r e s c e n tp r o t e i n 红色荧光蛋白 t i p t o n o p l a s ti n t r i n s i cp r o t e i n s 液泡膜内在蛋白 g s tg l u t a t h i o n es t r a i l s f e r a s e 谷胱甘肽转移酶 嘶s t r i s o a y d r o x y l m e t h y l ) a m i n o - m e t h a n e三( 羟甲基) 氨基甲烷 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l - p d - g a l a c t o s i5 一溴1 4 一氯3 - 吲哚1 3d 半乳 x g a l d e 糖苷 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o - 3 - i n d o l y l - p d g l u c u r o5 一溴- 4 一氯- 3 吲哚p d - 葡糖 x - g l u e n i ca c i d醛酸 3 - g a l1 3 - g a l a c t o s i d a s e 3 - 半乳糖苛酶 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 g h g l y c o s i d eh y d r o l a s e 糖苷水解酶 l e al a t ee m b r y o g e n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n 胚胎发生晚期丰裕蛋白 m a nm a n n i t o l 甘露醇 t a i l p c rt h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r 热不对称交错p c r e r17p e s t r a d i o l1 76 - 雌二醇 w t w i l d t y p e 野生型 5 关于学位论文独立完成和内容创新的声明 本人向河南大学提出博士学位中请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是 本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有创造性的见解。据我所知， 除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或 撰写过百勺研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位申请人( 学位论文作者) 签名：圣堡盟盘 2 0p 年，月肜曰 关于学位论文著作权使用授权书 本人经河南大学审核批准授予博士学位。作为学位论文的作者，本人完全 了解并同意河南大学有关保留、使用擘住论文的要求，即河南大学有权向国家 图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学住论文( 纸质文 本和电子文本) 以供公众检素、奎阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校 学术发展和进行学术交流等目的可以采取影印、缩印、扫描乖拷贝等复制手 段保存、汇编学住论文( 纸质文本和电子文本) 。 ( 涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书) 学位获得者( 学位论文作者) 签名：至翌：盟2 盘 p、， 2 0 ，p 年参月多日 学位论文指导教师签名： 拟南芥口一葡萄糖苷翻 调节a b a 含量动态麦1 艺与耐罩性关系研究 第一章：文献综述 第一节：a b a 生物合成及代谢失活 2 0 世纪6 0 年代初人们发现a b a 。之后通过分子遗传学、细胞生物学和生物化学方法，人 们对高等植物a b a 生物合成途径及代谢失活过程已经有了较为详细的了解( 图1 1 ) ( f i n k e l s t e i n a n dr o c k ，2 0 0 2 ；s c h w a r t z e te ta 1 ，2 0 0 3 ) 。目前a b a 被认为是一种胁迫激素，参与调节植物的生 长发育和气孔的开度变化，尤其在植物受到干旱和盐胁迫时发挥作用，植物体a b a 含量增 加对植物的干旱适应过程至关重要，甚至a b a 含量增加与否已成为评价植物抗旱能力的重要 指标之一( h e y e ta 1 ，2 0 1 0 ) 。 1 a b a 的生物合成过程 1 1a b a 的合成部位 早期人们认为，干旱条件下植物体映j a b a 人量合成主要在根中进行，并由根运送到地上 部而诱导气孔关闭。例如，人们观察到当根系统遭受缺水胁迫时，在叶片水势未发生变化前 气孔已经关闭( n e a l e se ta 1 1 9 8 9 ；k h a l i la n dg r a c e1 9 9 3 ；s t o l le ta 1 ，2 0 0 0 ) ，暗示某种根源的信 号诱导了叶片气孔关闭反应( s c h u l z ea n dh a l l ，1 9 8 2 ) 。气孔关闭伴随着木质部汁液a b a 水平 上升，说明干旱条件下气孔关闭可能是来自于根源的a b a 信号( d a v i e sa n dz h a n g1 9 9 1 ；s a u t e r e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。总之，a b a 可能作为长距离信号介导干旱条件下地下部与地上部的信息传递 ( w i l k i n s o na n dd a v i e s ，2 0 0 2 ) 。 然而，近年来这种观点受到质疑，i k e g a m i 等( 2 0 0 9 ) 分析了离体叶片和根中干旱处理前 后a b a 水平的变化，发现离体叶片中a b a 含量增加的方式与完整植物的叶片类似，且稍高于 完整植株；相反，离体根a b a 水平在干旱处理4 d , 时后却没有明显的变化，而且当离体根遭 受缺水处理时，根中并没有a b a 的积累，这些结果说明a b a 主要在叶片中合成，并进一步通 过【”c a b a 雕j u j 位素示踪实验证明叶片中合成的a b a 在干早胁迫条件下运输到根部。此外， c h r i s t m a n n 等( 2 0 0 7 ) 认为根部干旱产生的液压信号( h y d r a u l i cs i g n a l ) 可能作为长距离信号 介导干旱条件下地下部与地上部的信息传递。 1 2 a b a 的合成途径 研究表明，高等植物体内可能存在直接和间接两条a b a 合成途径。直接途径是由三个异 6 河南大掌研究生博士掌位- 论- 文 戊烯单位聚合成c 1 5 前体法呢基焦磷酸( f a r n e s y lp y r o p h o s p h a t e ，f p p ) ，由f p p 经环化和氧 化直接形成1 5 碳的a b a ；而间接途径由甲羟戊酸( m e v a l o n i c a c i d ，m v a ) 聚合成c 4 0 前体一 类胡萝卜素，再由类胡萝卜素裂解成c 1 5 的化合物，如黄质醛( x a n t h o x i n ，x a n ) ，最后由x a n 转变成a b a ( n a m b a r aa n dm a r i o n p o l l ，2 0 0 5 ) 。近年来，c 4 0 途径被公认为高等植物a b a 的主 要合成途径。高等植物细胞内a b a 的合成涉及质体( 叶绿体) 和细胞质两个区域，质体内发 生的反应主要包括叶黄素的合成和降解，形成黄质素。黄质素通过质体被膜进入细胞质，经 过两步氧化过程最终形成a b a ( n a r n b a ma n dm a r i o n p o l l ，2 0 0 5 ) 。 1 3 参与a b a 合成的关键酶 在阐明a b a 合成途径的过程中，人们也较为清晰的认识了参与a b a 合成的酶，其中玉米 黄质环氧化酶( z e a x a n t h i ne p o x i d a s e ，z e p ) 、9 顺环氧类胡萝卜素双加氧酶 ( 9 c i s e p o x y c a r o t e n o i dd i o x y g e n a s e ，n c e d ) 、短链醇脱氢还原酶( s h o r t - c h a i na l c o h o l d e h y d r o g e n a s e r e d u c t a s e ，s d r ) 和a b a 醛氧化酶( a b s c i s i ca l d e h y d eo x i d a s e ) 催化的反应是a b a 合成途径的重要步骤( x i o n ga n dz h u , 2 0 0 3 ) 。z e p 是a b a 生物合成中第一个在d n a 及氨基酸 序列水平上研究的酶，在烟草中由a b a 2 基因编码，催化玉米黄质环氧化形成新黄质( m a r i ne t a 1 ，1 9 9 6 ) 。n c e d 的作用是转运到质体中切割裂解9 一顺新黄质和9 一紫黄质转化形成黄质醛( t 觚 e ta 1 ，l9 9 7 ) 。目前认为，n c e d 催化的反应可能是a b a 合成的最关键限速步骤( l u c h ie ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。a b a 生物合成最后一步反应由a b a 醛氧化酶( a a 0 3 ) 催化完成，是a b a 合成途径 的重要步骤，a b a 醛氧化酶在钼辅阂子硫化后才具有活性( k o i w a ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 2 a b a 生物合成的调节 2 1a b a 生物合成的发育调节 a b a 在胚中的合成受发育的严密调节。拟南芥种子发育过程中有2 次a b a 累积高峰，第1 次在传粉后1 0 天，第2 次高峰a b a 累积量约为第1 次的l 3 ：种子成熟后期a b a 含量下降很快， 干种子中a b a 很少，在胚和发育的种子可检测到所有a b a 合成基因的转录产物( f i n k e l s t e i ne t a 1 ，2 0 0 2 ) 。在种子发育第1 次a b a 累积高峰出现之前，z e p 基因即在胚中表达，推测发育种子 中的可溶性糖、渗透胁迫及a b a 自身可能是激发a b a 合成的信号( c h e n g e t a l ，2 0 0 2 ) 。番茄 中n c e d 可能也调节种子的a b a 水平，因为l e n c e d l 过量表达延长了种子的休眠( t h o m p s o n e l a 1 。2 0 0 0 ) 。 7 拟龠芥口一葡萄糖苷酶调节a b a 含量动志变化与耐罩性关系研究 2 2a b a 合成的非生物胁迫调节 胁迫条件下，a b a 合成增加，分解代谢减少，最终导致a b a 含量增加。对a b a 合成影响 最人的环境信号是干早和盐胁迫，两者诱导a b a 合成主要通过上调a b a 合成基因的转录而实 现( x i o n ga n dz h u ，2 0 0 3 ) 。拟南芥的z e p 基因在地上部分和根中的表达可被干旱、盐和p e g 等诱导上调( x i o n g e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。此外，多种植物中n c e d 基因的表达受干旱强烈诱导，n c e d 基冈超表达的转基因植物a b a 含量显著升高，并表现出耐早性增加的表型( 1 u c h ie ta 1 。2 0 0 1 ) 。 除彳f j r ，( a b a 2 g i n l ) 的表达不被胁迫诱导外( c h e n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) ，其他所有的a b a 合成 基因都被干旱和盐胁迫诱导表达( x i o n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 2 3 a b a 合成的自我调节 植物体内a b a 可以通过激活其代谢酶的活性负反馈调节a b a 的累积( c u t l e ra n dk r o c h k o ， 1 9 9 9 ) 。外源a b a 可以激活细胞色素p 4 5 0 酶a b a87 羟化酶的活性：过量表达 ，c 肋基因的转 基因烟草中，a b a 代谢产物红花菜豆酸( p a ) 的过量累积与a b a 的积累程度或水平有关( q i n a n dz e e v a a r t ，2 0 0 2 ) ，这些结果表明在非胁迫条件下a b a 可通过激活其分解代谢途径而限制自 身的累积。如上述及9 顺环氧类胡萝卜素双加氧酶( n c e d ) 是a b a 生物合成的关键限速步骤， 因而脚基因是否被a b a 反馈调节倍受人们的关注。番茄n c e d 基因( t h o m p s o ne ta 1 2 0 0 0 ) 和豇豆的n c e d 基因( i u c h ie ta l 。，2 0 0 0 ) 都不被外源a b a 诱导，说明a b a 可以促进自身降解， 但不能促进其合成。 总之，精确调控a b a 的合成速率，控制植物体i 为a b a 含量，对于植物应对复杂多变的环 境胁迫及自身生长发育需要至关重要。 3 a b a 代谢失活 相对于a b a 生物合成途径而言，a b a 分解代谢的研究起步较晚。近些年的研究表明，a b a 含量降低主要通过氧化分解代谢和共价结合失活两条途径完成。a b a 氧化失活主要有三个位 点，耳p a b a 的7 、8 和9 位甲基发生羟基化反应，分别生成7 ，羟基a b a ( 7 - o h a b a ) 、8 ，- 羟基a b a ( 8 - o h a b a ) 和9 羟基a b a ( 9 - o h - a b a ) ，继而引发进一步失活，其中8 位甲 基羟基化途径是高等植物a b a 分解代谢的主要途径( c u t l e ra n dk r o c h k o ，1 9 9 9 ：z h o ue ta 1 2 0 0 4 ； n a m b a r aa n dm a r i o n p o l l ，2 0 0 5 ) 。另外，在有些植物中检测到a b a4 - - 位酮基还原产物一l ，4 ，- 反二醇a b a 或l7 47 顺二醇a b a 等的少量积累，它们是a b a 还原途径的代谢产物( o r i t a n ia n d k i y o t a , 2 0 0 3 ) 。 8 词r 南大掌研究叠；博士掌位论文 3 1a b a 的氧化失活途径 3 1 18 ，- 羟基化代谢途径 a b a 在8 羟化酶催化下生成87 羟基a b a ，后者自身不稳定，在酶的作用下易发生亲核反 应生成红花菜豆酸( p h a s e i ca c i d , p a ) ，在有些植物中p a 的4 ，位酮基被还原，生成二氢红花菜 豆酸( d e h y d r o ph a s e i c a c i d 。d p a ) 或其差位异构体e p i - d p a 。在87 - 甲基羟基化代谢途径中，a b a 的激素活性逐渐减弱。z o u 等( 1 9 9 5 ) 的研究表明，在催化甘蓝型油菜( b r a s s i c a n a p u s 巩r e s t o n ) 小孢子胚合成长链单不饱和脂肪酸的实验中，8 - o h a b a 具有与a b a 相同的活性。但j a d h a v 等( 2 0 0 8 ) 利用甘蓝型油菜( b r a s s i c an a p u sc v h e r o ) 为试验材料的研究却表明8 o h a b a 的 催化活性较a b a 弱的多。因8 o h - a b a 自身分子结构不稳定，增加了对其研究的难度，其激 素活性有待于进一步研究确定。 p a 是8 ，甲基羟基化途径的主要代谢产物，植物体1 内9 8 的a b a8 羟化产物以p a 的形式存 在。研究表明，在抑制玉米细胞生长，催化甘蓝型油菜小孢子胚合成长链单不饱和脂肪酸， 以及诱导大麦糊粉层原生质体表达砌基闪等方面p a 的活性较a b a 弱，其抑制小麦胚萌芽的活 性不足a b a 的1 2 0 0 ( b a l s e v i c he ta 1 ，1 9 9 4 ；z o ue ta 1 ，1 9 9 5 ；h i l le ta 1 ，1 9 9 5 ) 。另外，苹果和大 麦糊粉层细胞的a b a 结合蛋白不能结合p a ( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 1 ；r a z e me ta 1 ，2 0 0 4 ) 。以上结果 说明在植物的某些生理过程中，p a 是没有激素活性的代谢物，a b a 分解代谢至此其激素活性 大大降低，但p a 可以使鸭跖草气孔完全关闭，在大麦糊粉层中，p a 具有与a b a 相一的抑s t j a - 淀粉酶分泌的活性( t o d o m k ie ta 1 ，2 0 0 0 ；z a h a r i ae ta 1 ，2 0 0 5 ) 。总之，有关p a 的激素活性还存 在异议。 在有些植物中p a 还原生成d p a 。在大豆( g l y c i n em a x ) 、鳄梨( p e r s e aa m e r i c a n a ) 、菜 _ 豆( p h a s e o l u sv u l g a r i s ) 等植物中都检测到d p a 及其差位异构体e p i d p a 的存在( z e e v a a r t ，1 9 9 9 ) 。 多种生物活性鉴定表明d p a 不具激素活性，a b a 代谢至此激素活性完全丧失( z a h a r i ae ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。 3 1 1 18 ，羟化酶的生物学特征 8 羟化酶在快速降低a b a 激素浓度和活性方面具有重要作用，其催化的( + ) a b a 分解代谢 反应迅速。含有放射性同位素的( + ) - a b a 在玉米和鸭跖草叶片中的半衰期分别为4 2m i n 和6 4 m i n ；外源( + ) - a b a 进入玉米根尖细胞l h 后降解率高于6 0 ( j i ae ta 1 ，1 9 9 6 ；c u t l e ra n dk r o c h k o , 1 9 9 9 ) 。 8 羟化酶具有很强的底物专一性，可催化( + ) - a b a 生成8 - o h a b a ，但催化( ) 一a b a 的速 9 拟龠芥口一葡萄糖苷酶调节a b a 含量动志变化与耐罩性关系研究 率仅为( + ) a b a 的1 0 ，对甲酯化的( + ) a b a 没有催化活性( c u t l e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。8 羟化酶的 活性可被其底物( + ) a b a 诱导，且受色素依赖的信号途径以及多种环境胁迫调控( c u t l e ra n d k r o c h k o ，1 9 9 9 ：k r o c h k oe ta 1 ，1 9 9 8 ：r e ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 3 1 1 2a b a8 羟化酶属细胞色素p 4 5 0 单加氧酶 细胞色素p 4 5 0 广泛存在于动植物、细菌及真菌等细胞内，是与内质网、线粒体、质体、 高尔基体等细胞器膜结合的一类具有混合功能的血红素氧化酶系。p 4 5 0 最早是以c o 结合蛋白 形式被发现的，因其在波长4 5 0a m 有最大光吸收而得名，这类蛋白质是由原卟啉i x 的血红素 基团通过半胱氨酸与底物特异的脱辅基蛋白结合而成，其实质为血红素硫铁蛋白。p 4 5 0 酶系 参与高等植物的许多代谢反应( s c h u l e r , 1 9 9 6 ) 。 k r o c h k o 等( 1 9 9 8 ) 首次从悬浮培养的玉米细胞微粒体中提取出a b a8 ，羟化酶，通过实验 证明该酶是膜结合蛋白，催化反应需分子氧和n a d p h 的参与，活性可被c o 抑制，且这种抑制 作用可被蓝光解除，这些描述都符合典型p 4 5 0 酶的特征，从而证实a b a87 羟化酶是一种细胞 色素p 4 5 0 单加氧酶。 3 1 1 3 拟南芥中编码a b a8 羟化酶的基因 对拟南芥2 4 6 个全长p 4 5 0 基因进行系统发生分析发现，拟南芥p 4 5 0 基因分布于4 5 个家族 中，分为a 型和非a 型两大类( s c h u l e ra n dw e r c k r e i c h h a r t ，2 0 0 3 ) ，约6 0 的拟南芥p 4 5 0 属 于a 型，参与植物体内不同次生代谢物如类萜、植物抗毒素、硫代葡萄糖苷、苯丙素等的合成； 而非a 型p 4 5 0 在胆同醇、氧化脂肪酸和植物激素的生物合成中起重要作用。 h o t h 等( 2 0 0 2 ) 用a b a 溶液处理拟南芥植株的研究表明，在所有受a b a 诱导表达的p 4 5 0 家族基因中，只有存在于c y p 8 5 簇的c y 尸7 d 勿家族的四个基因c 加列，c y 尸7 d