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来自深海宏基因组的盐耐受相关基冈的筛选及克隆 来自深海宏基因组的 盐耐受相关基因的筛选及克隆 申请人：张炯 导师：周世宁教授 专业：微生物学 摘要 深海环境通常具有高盐，高压，低温，无光照等特点，其海底沉积物的微生 物往往具有适应特殊环境的独特生理代谢机制和分子细胞结构。其特定的生态环 境蕴藏着独特而又极其丰富的微生物资源，其中大部分还鲜为人知，为研究中度 嗜盐菌盐适应机制提供了新的材料。面对海洋环境中随时存在的失去胞内外渗透 压平衡的威胁，大部分微生物在长期的进化过程中形成了其独特的应对机制，其 中最重要的就是大多数中度嗜盐菌通过在胞内积累相容性溶质来调节渗透压的 变化并维持细胞正常的代谢活动。由于这是一种非常灵活的短期或瞬变的反应， 随外界渗透压的变化而变化，它成为目前微生物渗透压研究的模型和热点。 在文库筛选过程中发现一株在6 n a c i 浓度l b 培养基中生长良好的克隆子 f o s 3 6 k ，在分析f o s 3 6 k 的外源片段酶切图谱的基础上，选用b a m hi 和n h el 依次进行两次亚克隆，将f o s 3 6 k 质粒外源片段大小从3 6 k 缩小至9 k ，获得了 一株同样有耐盐特性的亚克隆f o s 9 k 。分析f o s 9 k 外源片段序列，含有六个 o r f ，推测耐盐特性的产生与其中o r f 6 ( 命名为p u t p - s e a ) 单个基因的表达产 物有关。p u t p - s e a 基因编码产物为4 9 2 个氨基酸，分子量约为5 3k d a 。通过互联 网对p u t p s e a 蛋白分别进行了氨基酸疏水性分析，发现p u t p s e a 蛋白存在1 1 个疏 水区，说明p u t p s e a 蛋白是1 个跨膜蛋白。将o r f 6 的序列在g e n b a n k 中用b l a s t 软件进行同源性比较，结果表明o r f 6 编码的蛋白质序列与i d i o m a r i n ab a l t i c a o s l 4 5 来源的n a + 和脯氨酸转运子( p u t p ) 有8 2 的相似性。通过p c r 的方法 把包括整个p u t p - s e a 基因o r f 框及可能的启动子核苷酸序列在内的2 2 k b 的片 段克隆到p b r 3 2 2 载体上，构建了重组质粒p b r p u t p - s e a ，转化e c o l ie p l 3 0 0 后 得到转化子为e p i p b r p u t p - s e a ，其耐盐特性和原始克隆子f o s 3 6 k 类似，为此 中山大学硕士学位论文 我们认为o r f 6 为耐盐相关基因。 本研究使用了r e d 同源重组技术，在e c o l ie p l 3 0 0 菌株中通过敲除染色体 上的p u t p 基因，构建p u t p 基因缺失的新菌株e p i a p u t e 。该菌株在含脯氨酸为 单一碳源的m 8 基本培养基上不能生长，而将p b r p u t p - s e a 重组质粒转入到e p i a p u t e 中，使该菌株在含脯氨酸为单一碳源的m 8 基本培养基上生长。说明 p u t p - s e a 基因具有将外界脯氨酸转运至胞内的功能。在不同n a c l 浓度的l b 培 养基中测定四种菌株胞内自由脯氨酸含量，发现e p i p b r p u t p - s e a 和e p i a p u t p p b r p u t p - s e a 在一定n a c l 浓度范围内脯氨酸转运量的多少和培养基中的盐浓度 呈正相关，而e p i p b r 3 2 2 和e p i a p u t e p b r 3 2 2 不相关。说明了p u t p - s e a 基因 表达受外界渗透压调控，通过提高脯氨酸的转运量来提高耐盐能力。 关键词：深海沉积物，中度嗜盐菌，n a + 脯氨酸转运子 来自深海宏基因组的盐耐受相关基因的筛选及克隆 s c r e e n i n ga n dc l o n i n go fa s a l t - t o l e r a n c er e l a t e dg e n e f r o mm e t a g e n o m i cd n a l i b r a r y o fd e e p - s e as e d i m e n t s a p p l i c a n t ：j i o n gz h a n g s u p e r v i s o r ：p r o f s h i - n i n gz h o u a b s t r a c t d e e ps e ae n v i r o n m e n ti su s u a l l yc h a r a c t e r i z e db ye x t r e m e l yh i g hs a l i n i t y , h i g h p r e s s u r e ，l o wt e m p e r a t u r ea n dd a r k n e s s t h ep h y s i c o c h e m i c a lf e a t u r e se n s u r et h a t m i c r o o r g a n i s m se x i s t i n gi ns e d i m e n t sm a yh a v eu n i q u em e t a b o l i ca n dp h y s i o l o g i c a l a c t i v i t i e s ，m o l e c u l a ra n dc e l l u l a rs t r u c t u r et oa d a p tt ot h e s ee x t r e m ec o n d i t i o n s t h e s p e c i f i ce c o l o g i c a le n v i r o n m e n to f f e r sr i c hm i c r o b i a lr e s o u r c e sa n dm o s to ft h e ma r e s t i l lu n k n o w n s o m eo ft h e ma r e g o o do r g a n i s m sf o rt h es t u d yo fa d a p t a t i o n m e c h a n i s mi nm o d e r a t eh a l o p h i l e m o s tm i c r o o r g a n i s m sh a v ee v o l v e dt h e i ro w n s t r a t e g i e st oc o p ew i t ht h ee v e r - p r e s e n tt h r e a to fl o s i n go s m o t i ce q u i l i b r i u mi nt h es e a a m o n gt h e s es t r a t e g i e s ，a c c u m u l a t i n gi n t r a c e l l u l a rc o m p a t i b l es o l u t e s t ow i t h s t a n d t h ee x t r a c e l l u l a rf l u c t u a t i o n si no s m o l a r i t ya n dm a i n t a i nn o r m a lc e l lm e t a b o l i s m s e m p l o y e db ym o s to fm o d e r a t eh a l o p h i l ei sc o n s i d e r e da st h em o s ti m p o r t a n to n e a s as e n s i t i v e ，s h o r tt e r mo ri n s t a n t a n e o u sr e a c t i o nw h i c hi st o t a l l yc o n t r o l l e db yt h e e n v i r o n m e n t a lo s m o t i cc h a n g e s ，i tb e c a m eap r e f e r a b l em o d e la n dah o t s p o tt o r e s e a r c ho s m o r e g u l a t i o nm e c h a n i s m s d u r i n gt h el i b r a r ys c r e e n i n gp r o c e s s ，w eh a v es e l e c t e dm e t a g e n o m i cc l o n e st h a t e n h a n c e dt h es a l t t o l e r a n c eo fe c o l ih o s t s t h ec l o n e ，d e s i g n a t e df o s 3 6 k , g r o w i n g w e l li nl bm e d i ac o n t a i n i n g6 n a c i ，w a sf u r t h e ra n a l y z e d b a s e do ns e q u e n c e i n f o r m a t i o no ff o s 3 6 k , b a m h ia n dn h e iu s e dt od i g e s tt h ep l a s m i da n dc o n s t r u c t s u b c l o n e si nt u r n o n es u b c l o n ew i t h9 k bi n s e r t e df r a g m e n t ，d e s i g n a t e df o s 9 k , g r e w w e l li nl bm e d i ac o n t a i n i n g6 n a c ia sc l o n ef o s 3 6 k t h es e q u e n c i n gr e s u ro f f o s 9 ks h o w e dt h a tt h ei n s e r t e df r a g m e n tc o n t a i n e ds i xo r f s ，a n do r f 6m a yb e 1 1 1 中山大学硕十学位论文 r e s p o n s i b l ef o rs a l t t o l e r a n c eo ft h eb a c t e r i a s e q u e n c ea n a l y s i so fo r f 6 ( d e s i g n a t e d a sp u t p - s e a ) i n d i c a t e dt h a ti te n c o d e sap r o t e i no f4 9 2a m i n oa c i d sw i t hm o l e c u l a r w e i g h to fa p p r o x i m a t e l y5 3k d a h y d r o p h o b i c i t yp l o ta n a l y s i ss h o w e dt h a tp u t p - s e a h a s11 p r e d i c t e d t r a n s m e m b r a n ed o m a i n sw h i c h s u g g e s t e d t h a t p u t p i sa t r a n s m e m b r a n ep r o t e i n t h eb l a s t ps e a r c hs h o w e dt h a tt h ed e d u c e dp r o t e i ns h a r e d 8 4 i d e n t i t yw i t ht h ep u t p ( n a + p r o l i n es y m p o r t e r s ) f r o mi d i o m a r i n ab a l t i c ao s 14 5 p u t p - s e ag e n ew a sc l o n e dt op b r 3 2 2b yp c rw i t ht h ep r i m e r sd e s i g n e da c c o r d i n gt o t h es e q u e n c eo fo r f 6t oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp b r p u t p - s e a ，t h e ni tw a s t r a n s f o r m e dt oe p l 3 0 0t o g e tt h et r a n s f r o m a n tn a m e de p i p b r p u t p - s e a t h e s a l t t o l e r a n c eo f e p i p b r p u t p - s e aw a ss i m i l a rt ot h a to f f o s 3 6 i ct h i ss u g g e s t e dt h a t o r f 6w a st h es a l t t o l e r a n c er e l a t e dg e n e e p i a p u t p w a sc o n s t r u c t e d b yk n o c k i n g t h ep u t pg e n eo u tf r o mt h e c h r o m o s o m eo fe c o l ie p l 3 0 0u s i n gr e dr e c o m b i n a t i o ns y s t e m e p i 一础t pc a n ! t g r o wo nt h ep l a t eo ft h em 8m e d i u mc o n t a i n i n gp r o l i n ea ss o l ec a r b o ns o u r c e ，w h i l e e p i - a p u t p p b r p u t p - s e aw h i c hw a sc o n s t r u c t e db yt r a n s f o r m i n gp b r p u t p - s e ai n t o e p i a p u t e , c a l lg r o wo nt h es a m ep l a t e i ts u g g e s t e dt h a tt h ef u n c t i o no f p u t p - s e a g e n e i st o t r a n s p o r tp r o l i n ef r o mp e r i p l a s mt oc y t o p l a s m e p i p b r p u t p - s e a ， e p i a p u t p p b r p u t p - s e a ，e p i p b t l 3 2 2a n de p i a p u t p p b r 3 2 2w e r ec u l t u r e di nl b m e d i ac o n t a i n i n g1 6 n a c ia n dt h ea m o u n to ff le ep r o l i n ei nt h ee e u sw e r e d e t e r m i n e d ，i ti sd i s c o v e r e dt h a tt h e r ew a sap o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ea m o u n t o fp r o l i n ei nt h e e p i p b r p u t p - s e ao re p i - a p u t p p b r p u t p - s e ac e l l sa n dt h e c o n c e n t r a t i o no fn a c l ，w h i l et h e r ew a sn oc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ea m o u n to f p r o l i n e i nt h ee p i p b r 3 2 2o re p i - a p u t p p b r 3 2 2c e l l sa n dt h ec o n c e n t r a t i o no fn a c l i t s u g g e s t e dt h a tt h ea c t i v i t yo ft h ep u t pp r o t e i nw a sr e g u l a t e di nr e s p o n s et ot h e o s m o l a r i t yo ft h ee n v i r o n m e n t ，a n di te n h a n c e dt h es a l t t o l e r a n c eo fe c o l ih o s tb y i n c r e a s i n gt h ea m o u n to f p r o l i n et r a n s p o r t e d k e y w o r d s ：d e e p - s e as e d i m e n t ，m o d e r a t eh a l o p h i l e ，n a + p r o l i n es y m p o r t e r s i v 来自深海宏基因组的盐耐受相天基因的筛选及克隆 a m p b p d a d d h 2 0 d n t p e d t a h k b m i i l o d o i 强 p c r s d s i r i s t t l a m p i c i l l i n b a s ep a i r d a r o n 缩略词 d o u b l yd i s t i l l e dw a t e r 氨苄青霉素 碱基对 道尔顿 双蒸水 d e o x y r i b o n e o c l e a s i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核苷三磷酸 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 7 , - - 胺四乙酸 h o u r k i l o b a s e m i n u t e o p t i c a ld e n s i t y 小时 千碱基对 分钟 光密度 o p e nr e a d i n gf r a m e 开放阅读框架 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n多聚酶链式反应 s o d i u md o d e c y ls u l p a t e十二烷基硫酸钠 t r i s - h y d r o x y m e t h y l - a m i n o m e t h a n e 三一羟甲基一氨基甲烷 m i c r o l i t r e 7 l 微升 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容夕b 本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：雄3 f ：q 日期：纠年厶月j 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：弦吠r 日期：p f 年二月1 日 来自深海宏基因组的盐耐受相关基因的筛选及克隆 第一章绪论 1 1 中度嗜盐菌研究进展 地球上存在多种多样的高盐环境，如一些盐水( 盐湖、海水) 和盐土( 盐池、盐 碱地) 等，在高盐这种典型的极端环境下，生物多样性相对较低，只有很少种类 的动植物，但生长着许多不同类群的嗜盐微生物【1 1 。l a r s e n 和v r e e l a n d 【2 3 】根据 细菌生长对n a c l 的需求和最适生长的n a c i 浓度从高到低，将细菌分为4 类： 1 极端嗜盐菌( e x t r e m eh a l o p h i l e s ) ：其生长对n a c l 的要求很高，一般在9 以 上，可在9 3 5 n a c l 浓度范围内生长，最适生长n a c l 浓度为1 3 1 5 。；2 中度 嗜盐菌( m o d e r a t eh a l o p h i l e s ) 其生长离不开n a c i ，它们可在0 1 3 2 5 的n a c l 条件下生长，最适生长n a c i 浓度为5 1 0 ；3 轻度嗜盐菌( s l i g h th a l o p h i l e s ) ： 其生长需要少量的n a c i ，其最适生长的n a c l 浓度为1 3 ；4 非嗜盐菌 ( n o n h a l o p h i l e s ) ：其生长不需要n a c i ，低浓度的n a c l ( l ) 就会对它们的生 长产生抑制作用。对于中度嗜盐菌菌株来说，它的盐浓度范围会随着培养的环境 条件的改变而改变，如温度和培养基的组成等。因此根据生长所需盐浓度范围定 义中度嗜盐菌时应该注意这一点。 中度嗜盐菌是嗜盐真细菌的主要种类，中度嗜盐菌比嗜盐古菌分布更广泛， 对营养要求低，更易于适应环境，如h a l o m o n a $ h a l o d e n i t r i f i c a n s 和s a l i n i v i b r i o c o s t i c o l a 两种细菌，它们能在n a c l 浓度接近于淡水到接近与于饱和n a c l 的浓度 之间生存【4 】。由于中度嗜盐菌属于真细菌，所以可以利用以真细菌为基础发展起 来的分子生物学方法和手段对中度嗜盐菌进行有关耐盐机制方面的研究。 1 1 1 中度嗜盐菌的主要类群 中度嗜盐菌是对一个类群微生物的统称，它并不是分类学意义上的划分单 位。1 9 1 9 年，l e f e v r e 和r o u n d 5 】在研究腌制黄瓜的盐卤中的微生物时，分离得 到4 种不同类群的中度嗜盐菌，它们能在5 2 5 的n a c i 浓度范围内生长。1 9 3 5 年，h o f 6 1 从筛盐场分离得到一株能在3 1 8 n a c i 浓度生长但不能在o 5 以下 巾山大学硕士学位论文 生长的贝氏假单抱菌( p s u e d o m n o ab e e i j r n i c k i i ) ，为典型的中度嗜盐菌。1 9 5 6 年， b a x t e r 和g b b o n s t 7 】第一次使用中度嗜盐菌这一名词来描述这类微生物。在此之后 的二三十年内对中度嗜盐菌的研究都很少。到1 9 8 0 年时，在细菌名录里只 收录了中度嗜盐菌的6 个种。1 9 9 0 以来，实验人员广泛的研究了各种地理条件 中的高盐环境，从中分离并命名了大量的中度嗜盐菌，更深刻的了解了中度嗜盐 菌这一类群。他们发现中度嗜盐菌分布于细菌域的各主要系统发育分枝上，是由 具有不同生理生化特征的、分布于很多不同属的细菌组成，其中包括好氧厌氧 化能异养菌、光能自养异养菌、化能无机营养细菌等多种营养类型的细菌。 1 1 2 中度嗜盐菌的分布 中度嗜盐茵通常生活在盐湖、晒盐池、盐碱地、海洋、沙漠等天然高盐环境 中，在腌制食物等人工高盐环境中也有发现。其在环境中的分布及盐生长浓度是 动态的，与环境温度和营养条件密切相关。 1 1 2 1 盐湖、晒盐池和海洋 二十世纪7 0 年代以来，实验人员陆续在一些盐湖、晒盐池和海洋中分离到 中度嗜盐菌。位于法国s o m a l i l a n d 的a s s a l 湖表面湖水的含盐量为2 7 7 ，而2 0 米深度处的湖水的含盐量高达3 9 8 。r a t h i n a s a b a p a t h i 等从该湖水中分离出1 6 4 株细菌，通过对它们生长的n a c i 浓度的测定，发现其中1 1 株为中度嗜盐菌【引。 美国犹他州的一个大盐湖【9 , 1 0 , 1 1 】在历史上的盐浓度发生过巨大的变化。这个大盐 湖由于被一条铁路铺道分成南北两部分，淡水只能流入北端湖体中，盐浓度只有 8 5 ，南端湖水由于没有淡水的补充，湖水慢慢蒸发，盐浓度高达2 2 。实验 人员调查了该湖湖水中的微生物种类，发现北端湖水中含有大量而且种类非常丰 富的中度嗜盐菌，如h a l o m o ，z 鲫砌6 f 凰【1 2 , 1 3 】、h a l o b a c i l l u sl i t o r a l i s 和 h a l o b a c i l l u st r u e p e r i 1 4 1 、p s e u d o m o n a sh a l o p h i l a ，而南端湖水样品中存在的主要 是极端嗜盐古细菌。d e f r a n k 等从位于西班牙海边含盐量在1 5 3 0 之间的h u e l v a 晒盐池中筛选得到1 4 0 株中度嗜盐菌，大多属于s a l i n i v i b r i o 、p s e u d o m o n a s 、 a l t e r o m o n a s 、a l c a l i g e n e s 、a c i n e t o b a c t e r 和f l a v o b a c t e r i u m i s 】。p r a d o 等在智利 阿塔卡马沙漠的盐湖中分离筛选得到的菌株分别属于v i b r i o 、a c i n e t o b a c t e r 、 2 来自深海宏基因组的盐耐受相关基因的筛选及克隆 m a r i n o m o n a s 和么z 纪，d 聊d n 口j 16 1 。从死海中分离得到的菌株有：e ，l 口廊研d ，加7 1 、 ph a l e s t o r g u s 、hh a l m o p h i l a 1 8 】和h 西m p 彪脚d 1 9 】；a d a m s 等从o k l a h o m a 的一 个油田的地表盐水中分离得到株能够在6 2 0 的n a c l 中培养的中度嗜盐 菌，经过研究表明，该菌株为彳a q u a e o & i ，最适生长盐浓度为1 5 【2 0 】。 1 1 2 2 腌制食物 通过单纯的分离培养的方法就可以从咸鱼，酱油以及其它的腌制品中分离到 中度嗜盐菌【2 1 2 2 1 。例如v i l l a r 等在凤尾鱼的腌制品中分离到最适生长盐浓度范围 为6 5 - - 1 0 的中度嗜盐菌，经过研究表明，该菌株为p e d i o c o c c u sh a l o p h i l u s ， 最高生长的盐浓度高达1 5 t 2 3 1 。2 0 0 3 年，j u n g h o o n y o o n 等在一种韩国传统的 咸肉腌制品中分离到两株革兰氏阳性中度嗜盐球菌，分别命名为j e o t g l i c o c c u s p s y c h r o p h i l u s 和d e o t g l i c o c c u sh a l o t o l o r a n s 。 1 1 2 3 盐碱地 由于盐碱地中的含盐量差别特别大，所以从中分离出来的中度嗜盐菌更多表 现的是耐盐性，而非嗜盐性【2 4 2 5 1 。不过盐碱地中的嗜盐菌还是相当丰富的。盐土 中菌群组成和盐池、盐水中发现的嗜盐菌种类有较大的不同，盐土中的嗜盐菌主 要属于a l c a l i g e n e s , ，m i c r o c o c c u s ，b a c i l l u s 属和p s e u d o m o n a s 【2 5 2 6 1 。在意大利的 p a n t e l l e r i a 岛，v e n e r e 湖的沙子中，r o m a n o 等人曾分离到l 株h a l o m o n a s 属的 新种，定名为h a l o m a n a sp a n t e l e r i e n s e 。其耐盐范围是1 2 5 1 5 n a c l 。从埃 及的w a d in a t r u n 的g a b a r a 湖中筛选得到一株能够在3 1 8 的盐范围中生长 良好的中度嗜盐菌，经过研究表明，该菌株为b a c i l l u sh a l o a l k a l i p h i l u s ，最高盐 浓度可达2 4 【2 7 2 8 1 。实验人员对生长在a l i c a n t e 地区含盐量为5 - 1 0 7 的高盐 土壤中的根际微生物进行了研究，结果表明，根际微生物的耐盐范围和该土壤中 非根际微生物的耐盐范围不一样，平板分离时，在 2 0 n a c i 的平板上 分别长出来的大多数是g + 的杆菌和球菌，而1 0 - - 2 0 n a c l 的平板上长出来的 大多数是g 的杆菌 2 4 2 5 1 。 1 1 2 4 其它一些比较特殊的生境 中度嗜盐菌可以存在在南极，在对南极的v e s t f o l d 地区的一些含盐量达到 2 8 的冷盐湖进行研究时分离得到了许多可以在0 5 - 2 0 n a c i 的范围内生长 3 中山大学硕士学位论文 的中度嗜盐菌菌株【2 9 1 。 中度嗜盐菌还可以存在在沙漠中，a t r i p l e sh a l i n u s 是位于以色列境内的 n e g e v 沙漠中非常常见的一种植物，它的叶子能够通过盐腺分泌盐，在干旱的季 节中，叶子表面经常可以看到一层盐，晚上由于露水的形成，附着层的盐浓度发 生变化。p s e u d o m o n a ss p 就是生长在其叶子上面的一种菌株，它们生长的n a c i 浓度范围是o 0 5 - 2 0 3 0 】。更令人惊奇的是，沙漠的蜥蜴鼻腔中有盐腺，能够 分泌出高浓度k c i ，有人在鼻腔中分离出属于b a c i l l u s 的中度嗜盐菌【l 引。 1 1 3 中度嗜盐菌的渗透调节机制 一般说来，当溶液中溶质的浓度越高，溶液的水势就会越低。所以，在高盐 条件下，由于n a c i 等盐类溶质的浓度很高，所以水势很高。中度嗜盐菌为了避 免细胞内的自由水从高水势的细胞内流向低水势的细胞外而造成细胞脱水而影 响其生命活动，必须保持细胞内低水势【3 l 】。高盐环境中水势的降低也意味着水 分活度减小和渗透压增加。中度嗜盐菌对渗透压的适应主要通过使细胞膜内外的 渗透压保持平衡来实现，即细胞质的渗透压应与外界环境的渗透压保持一致【3 2 1 。 否则，细胞内的自由水就会从高化学势的细胞内流向低化学势的细胞外而造成细 胞脱水而影响其生命活动。 总的来说，嗜盐细菌中有两种适应高渗透压的机制：一种是k c l 型，另一种 是相容性物质型【3 2 3 3 ，3 4 1 。具有k c l 型耐盐机制的细菌，通过在细胞内积累高浓度 的盐离子( 1 ( c l 和n a c i 等) 来升高细胞内的渗透压，从而平衡外界环境升高的渗 透压【1 9 】。具有相容性物质型耐盐机制的细菌，通过在细胞内积累高浓度的相容 性溶质，来升高细胞内的渗透压，来抗衡周围的盐环境形成的负面影响。一般来 说，极端嗜盐古细菌的细胞结构特殊，胞内酶能抵抗高浓度的盐，耐盐机制属于 前一种。而大多数中度嗜盐菌的细胞内不存在高浓度的盐环境，胞内酶对c l 一敏 感，属于相容性物质型的耐盐机制 3 5 , 3 6 , 3 7 1 。 当中度嗜盐菌受到盐渗透冲击时，细胞内1 0 和用来中和k + 的谷氨酸根离子 浓度会很快升高。以前科研人员将这种现象归类于盐适应机制范畴内，但随着实 验研究的进展，科研人员发现中度嗜盐菌受到盐渗透冲击时，k + 的作用有四个， 1 、暂时的恢复细胞形态和膨压，2 、酶活性和调节基因表达的细胞信使，3 、影 4 来自深海宏基因组的盐耐受相关基因的筛选及克隆 响细胞膜的质子梯度周期，4 、支持细胞的呼吸作用。总之，k + 浓度增加仅仅是 一个短期效应。随着时间的延长，中度嗜盐菌就会从外界吸收或合成相容性溶质 作为渗透保护物质。所以，科研人员认为在中度嗜盐菌中k + 应该被排除在盐适应 机制之外，其盐适应机制属于相容性物质型的耐盐机制【3 3 1 。 1 2 相容性溶质研究进展 b r o w ng l s i m p s o n t 3 8 】于1 9 7 2 年首次将与细胞内体系相容而不影响其它生 物大分子功能的溶质定义为相容性溶质。他们认为这种溶质为在生理p h 范围内 不带电荷、极性和易溶的小分子有机物质，在细胞内的积累可使细胞内外渗透压 达到平衡，并且不防碍重要的细胞活动，所以称之为“相容性溶质 。中度嗜盐 菌在高渗条件下能积累很高浓度的相容性溶质，升高细胞内的渗透压来平衡外界 环境升高的渗透压。反之，中度嗜盐菌在低渗条件下能释放一些相容性溶质到周 围环境中或分解代谢一些相容性溶质，降低细胞内的渗透压来防止外界水分渗入 细胞内过多而造成损害，相容性溶质成为目前微生物渗透压研究的热点。某些中 度嗜盐菌积累的相容性溶质种类具有选择性，常常在不同生长时期和营养条件下 发生变化。目前，实验人员在中度嗜盐菌中主要发现了以下四类相容性溶质： 糖类和糖苷类：在中度嗜盐菌中，蔗糖和海藻糖作为细胞内相容性溶质普遍 存在【3 9 1 。此外，在一些中度嗜盐的蓝细菌中发现了葡萄糖苷作为细胞内相容性 溶质【4 0 1 ，在肿胀土壤杆菌中发现了甘露蔗糖作为细胞内相容性溶质【4 l 】。研究发 现，蔗糖对于根际周围受到盐、水胁迫的根瘤菌而言是一种容易获得的渗透保护 物，而海藻糖广泛存在于细菌、酵母、真菌、藻类、昆虫和低等动植物中f 4 2 4 3 一】。 细胞内糖类浓度过高，往往对某些酶有抑制作用【4 5 1 ，所以糖类被认为是一类较 低级的相容性溶质。中度嗜盐菌仅靠糖类作为细胞内相容性溶质还不足以平衡细 胞外界的高渗透压。因此，中度嗜盐菌还需要积累其它的一些相容性溶质来升高 细胞内的渗透压。 氨基酸类：游离氨基酸作为相容性溶质已有很多的报道【4 6 ，4 7 1 。v r e e l a n d 发 现，在h a l o m o n a se l o n g a t a 中，细胞内总游离氨基酸浓度随着外界盐浓度的增加 而增加，当n a c l 浓度达到1 9 8 时，细胞内总游离氨基酸浓度为3 5 8 m m o l l ， 中山大学硕士学位论文 其中谷氨酸的浓度是最高的，其次是谷氨酰胺和丙氨酸1 4 引。脯氨酸是s a l i n i c o c c u s r o s e u s 和s a l i n i c o c c u sh i s p a n i c u s 主要的相容性溶质 2 2 , 3 9 1 。而在b a c i l l u s h a l o a l k a l i p h i l u s 中，脯氨酸不是主要的相容性溶质【2 8 】。尽管谷氨酸的含量在许多 细菌胞内都较高，但它在生理p h 条件下呈阴离子形式，需要钾离子来中和，其 胞内浓度最多只能达到0 2 m o l l t 4 9 1 ，因而不是很好的相容性溶质。而脯氨酸在胞 内可积累到更高浓度，表明它是较好的相容性溶质【5 0 】。 氨基酸衍生物：氨基酸的甲基化衍生物是一种不带静电荷而且溶解度很高的 四价铵类化合物，主要包括谷氨酸甜菜碱，甘氨酸甜菜碱，脯氨酸甜菜碱【5 ， 有非常好的渗透保护效果，是许多中度嗜盐菌细胞内主要的相容性溶质 5 2 , 5 3 】。十 九世纪八十年代初，甘氨酸甜菜碱被发现是一类在光合紫细菌和蓝细菌渗透压调 节中起重要作用的有机渗透溶质【5 4 】。研究发现，a c t i n o p o l y s p o r ah a l o p h i l a 可以在 以葡萄糖为唯一碳源的培养基中从头合成甜菜碱，而其他中度嗜盐菌不能从头合 成甜菜碱，只能从培养基中直接吸收甜菜碱或利用前体胆碱来合成【3 9 , 51 , 5 5 , 5 6 】。 四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶：四氢嘧啶及其羟基衍生物羟基四氢嘧啶是一类 广泛存在于细菌中的相容性溶质。四氢嘧啶是n 乙酰化的二氨基丁酸通过分子 内脱水形成的一种嘧啶类似物，最早发现能进行光合作用的e c t o t h i o r h o d o s p i r a 能将其作为相容性物质，目前已经发现在m i c r o c o c c u s h a l o b i u s ，彪h a l o p h i l u s ， 玢6 砌c o s t i c o l a ，hh a l o p h i l u s ，b a c i l l u s 及h o l o m o n a s 中累积 2 2 , 3 9 , 5 7 】。当 h i s r a e l e n s i s 生活在6 1 2 的n a c l 的培养基中时，作为相容性物质的四氢嘧啶 浓度很低，只有0 1 - - 0 2 m 【5 引。& c o s t i c o l a 也能合成浓度很低的四氢嘧啶，远远 不能平衡外界环境的高渗透压【5 9 1 。 1 3 脯氨酸的代谢 c h r i s t i a n 等人早在1 9 5 5 年就发现s a l m o n e l l ao r a n i e n b u r g 细胞体内能积累大 量脯氨酸，以平衡外界的高渗透压环境。大多数细菌在渗透胁迫时均能在细胞内 积累高浓度的脯氨酸。研究发现，在高渗环境中，革兰氏阴性菌主要是通过提高 转运水平来增加脯氨酸的含量，而革兰氏阳性菌则通过在细胞内增加脯氨酸的合 成来增加脯氨酸的含量。 6 来自深海宏基因组的盐耐受相关基因的筛选及克隆 1 3 1 脯氨酸的合成 脯氨酸的合成是以谷氨酸为底物，通过3 个酶催化反应的。三种酶分别是y - 谷氨酞激酶、y - 谷氨酞磷酸还原酶和- 吡咯羧酸还原酶，分别由p r o b 、p r o a 和p r o c 编码。合成途径如图所示： p r o bp r o ap r o c 谷氮酸叶y 谷氨酰磷酸叶谷氮酸一y 一半醛砷脯氮酸 4s t s d a - r p n p , d p h4 - 旷i 忧o p h + 妒 a 撑 n 删+ p ；瞄片 c l u t , a m a t e 图1 1 脯氨酸合成途径 f i g 1 1p r o l i n eb i o s y n t h e s i sp a t h w a y 1 3 2 脯氨酸的转运 o p c o l i n e 当处于高渗环境下时，绝大多数细菌通过在细胞内积累相容性溶质来升高细 胞内的渗透压来平衡外界环境升高的渗透压。但是细菌自身合成相容性溶质需要 消耗相对多的能量。所以当外界环境中存在相容性溶质时，细菌会通过其在细胞 膜上的转运系统将外界的相容性溶质转运进入细胞内，这个生物过程相对耗能较 低，使细胞节约了在高盐环境下的能量消耗。 7 ”一大学顺学位论i | 生| l2 人肠杆甜中p u t p 的角色 f i g12 r o l e o f p u t p i n ec o l l 革兰氏阴性细菌中，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌f 觚6 i 有3 种不同的脯氨酸转 运系统，分别为p u t p 、p r o p 和p r o u 。其中，p u t p 是一种催化脯氨酸和n a 十同向 运输的捌有1 2 个跨膜区的膜蛋白，其转运的脯氨酸仅用于作为细胞的碳源和氯 源储备，而不受细胞渗透调节的影响。p r o p 蛋白是篇二类转运系统的低亲和的 转运蛋白，p r o u 是依赖结合蛋白的高亲和性的转运蛋白，是原核生物转运系统 a b c 家族的成员。p r o p 和p r o u 都在基因转录、蛋白表达和酶活水平上受外界 渗透压的调控，其中转录水平的调节起主要作用。p r o u 和p r o p 均由渗透压冲击 诱导，负责高渗条件下细胞内脯氨酸的积累，但它们的功能并不一样，对p r o p 和p r o u 的突变缺失实验表明，p r o p 缺陷株不能生存r 高渗环境中，而p r o u 缺 陷株能生存于高渗环境中，说明p r o p 是渗透调节中脯氡酸的主要转运系统。 革兰氏阳性细菌中金黄色葡耱球菌1 6 2 , 6 3 】对于脯氨酸的转运，存在若高亲 和力和低亲和力两种转运系统。高亲和力转运系统对脯氨酸的转运是特异的，与 大肠杆菌的p u t p 有很高的同源性，而日转运脯氨酸仪用于作为细胞的碳源和氢 源储备，也不受细胞渗透调节的影响。而低亲和力转运系统p r o p 和p r o u 在基因 转录、蛋白表达和酶活水平上受外界渗透压的调控。枯草芽孢杆苗畔) 咔，脯氨酸 的渗透激活转运是由