（微生物学专业论文）嗜热厌氧乙醇杆菌体外转录系统的构建及应用.pdf

摘要 摘要 嗜热厌氧乙醇杆菌( t h e r m o a n a e r o b a c t e re t h a n o l i c u s ) 作为嗜热菌中乙醇产 量较高的菌种，它具有高生长温度，较好的耐酸性以及完整的纤维素和半纤维素 代谢系统，这些优点使其成为乙醇生产茵改造的热点。转录系统因背景干扰低， 反应组分明确，结果清晰准确成为研究菌体转录情况的有力工具。本研究构建 ze t h a n o l i c u s 的体外转录系统，并运用该系统对ze t h a n o l i c u sj w 2 0 0 中的未知蛋 白t e t h l l 的功能进行研究。 体外转录系统的构建关键是获得r n a 聚合酶。这方面的研究主要是通过异 源菌表达体外重组r n a 聚合酶以及提取天然菌的r n a 聚合酶两个方面来进行 的。体外重组中，首先分别构建含有值、p 、p 、和仃亚基的表达载体p e t - a l p h a - h i s 、 p e t - b e t a - h i s 、p e t - b e t a - h i s 、p e t - o m e g a 以及p e t - s i g m a - h i s ，在大肠杆菌中异 源表达并纯化获取纯的亚基。其中将o c 、p 、p 和按照2 2 ：1 ：1 ：1 的比例进行 体外重组r n a 聚合酶核心酶，并通过h i s - t a g 亲和层析技术获得了纯化的核心酶。 天然酶的纯化是利用聚乙醇胺粗沉淀与n a c l 抽提、硫铵沉淀、肝素亲和层析以 及d e a e 阴离子交换层析技术经过4 步纯化获得了纯度为9 5 天然r n a 聚合 酶核心酶。另外我们根据ze t h a n o l i c u sj w 2 0 0 中的a d h b 基因及其侧翼序列并以 p t - l s h 质粒为模体，构建了转录所用的模板质粒p h s h - t m p l 。在6 9 9 c 下，以该质 粒为模板分别用重组r n a 聚合和天然r n a 聚合酶进行转录，使用地高辛染色 检测转录产物，重组r n a 聚合酶没有检测到酶活而天然r n a 聚合酶转录出预 计大小的条带。 t e t h l l 作为一个背景完全未知的蛋白，我们采取生物信息学预测蛋白结构， 电泳迁移率变动分析和体外转录实验对其结构和功能进行研究。首先根据该蛋白 n 段氨基酸序列的测序结果，我们将该蛋白的基因克隆到p e t - 2 8 a ( + ) 中。测 序结果表明该蛋白有2 9 7b p ，编码9 8 个氨基酸，理论分子量为1 1k d 。n c b i 比 对结果显示该蛋白一级结构上具有两个保守区域，一个在8 1 1 个氨基酸之间， 另一个位于第4 3 个氨基酸和第8 3 个氨基酸之间，在三级结构上该蛋白具有螺旋 转角螺旋的d n a 结合模体。通过电泳迁移率变动实验验证，t e t h l l 能特异性 结合在a d h e 基因上游第一个启动子与第二个启动子之间的区域，不与a d h b 基 因上游启动子区域结合。当t e t h l l 终浓度为3 2 0n m 时，可以将5n m t r r a d h e 完全结合。运用本论文中构建的体外转录系统对该蛋白功能进一步研究，结果显 示该蛋白扮演阻遏蛋白的角色同时抑制a d h e 两个启动子的转录。 南京师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 关键词：r n a 聚合酶，蛋白质表达纯化，体外转录系统，转录调控因子，电泳 迁移率变动分析 a b s t r a e t c o n s t r u c t i o n ga n dl p p l i c a t i o no ft h e r m o a n a e r o b a c t e re t h a l ) l i c u s c o n s t m c t i o n g a n da p p l i c a t i o no fi h e r m o a n a e r o b a c t e re t h a n o l i c u s i nv i t r ot r a n s c r i p t i o ns y s t e m a b s t r a c t t h e r m o a n a e r o b a c t e re t h a n o l i c u sj - w 2 0 0i sa g r a m - p o s i t i v e ，a n a e r o b i ct h e r m o p h i l e t h a tc a l lp r o d u c ec o n s i d e r a b l ea m o u n t so fe t h a n 0 1 f r o maw i d er a n g eo fp o l y m e r i ca n d s o l u b l ec a r b o h y d r a t e s t h eh i g hr a t eo fe t h a n o lp r o d u c t i o ni l l a k e st h i ss p e c i e sa n a t t r a c t i v ec a n d i d a t ef o ru s ei nb i o c o n v e r s i o np r o c e s s e s d u et ot h el o wb a c k g r o u n d i n t e r f e r e n c ea n dr e l i a b l er e s u l t s ，nv i t r ot r a n s c r i p t i o nb e c o m e sap o w e r f u lt o o lf o r t r a n s c r i p ta n a l y s i s i nt h i ss t u d y , w ec o n s t r u c tt h ei nv i t r ot r a n s c r i p t i o ns y s t e mo f te t h a n o l i c u sj w 2 0 0 ，a n da p p l yi ti nt h er e s e a r c ho ft e t h l1 ，w h i c hi sa nu n k o w n f u n c t i o np r o t e i no fze t h a n o l i c u sj w 2 0 0 r n a p o l y m e r a s ei st h ek e y o fi nv i t r ot r a n s c r i p t i o n t oo b t a i nt h er n a p o l y m e r a s e ， w er e c o n s t i t u t e dt h er n a p o l y m e r a s es u b u n i t s nv i t r o f i r s t l y , w ec o n s t r u c t e dt h e e x p r e s s i o n v e c t o r so fr n ap o l y m e r a s es u b u n i t s i n c l u d i n gp e t - a l p h a - h i s 、 p e t - b e t a - h i s 、p e t - b e t a - h i s 、p e t - o m e g aa n dp e t - s i g m a - h i s ，a n do v e r e x p r e s s e d t h e mi ne s c h e r i c h i ac o l i t h e nw ep u r i f i e dt h e s es u b u n i t ss e p a r a t e l ya n dr e c o n s t i t u t e d t h e mf nv i t r o t h en a t u r a lk n a p o l y m e r a s ew a sp u r i f i e df r o mze t h a n o l i c u sy w 2 0 0 t h ep u r e c o r e e n z y m ew a si s o l a t e db yp o l y e t h y l e n e i m i n ep r e c i p i t a t i o n , n a c le x a c t i o n , h e p a r i n c o l u m n , a n d d e a ec o l u m n , t h ea d h bg e n eo fze t h a n o l i c u sy w 2 0 0i n c l u d i n g p r o m 酏e ra n dt e r m i n a t o rw a si n s e r t e di nt h ep m hw h i c hw a su s e da st r a n s c r i p t i o n t e m p l a t ep l a s m i d a n dt h ea c t i v i t yo fn a t u r a lr n ap o l y m e r a s ew a sd e t e c t e di nv i t r o t r a n s c r i p t i o nb yd i g o x i ns t a i n i n g a sa nl 1 1 】【o w i ip r o t e i n , t h es t r u c t u r e so ft e t h l1w e r ep r e d i c t e do nl i n e t w o c o n s e r v e dd o m a i n sw e r ef o u n di nt h ea n i m oa c i d ss e q u e n c e ，o n ec o n s e r v e dd o m a i ni s b e t w e e n8 也a a ( a m i n ea c i d ) a n d11 ma a , a n dt h eo t h e rd o m a i ni sb e t w e e n5 6 ma aa n d 7 2 f da a ；t h eh e l i x - t u r n - h e l i xm o t i fw a sf o r m e di ni t st e r t i a r ys t r u c t u r e e l e c t r o p h o r e t i e m o b i l i t ys h i f ta s s a ys h o w e dt h a tt e t h l1c o u l db i n dw i t ht h ez o n eb e t w e e nt h et w o p r o m o t e r so fa d h es p e c i f i c a l l y , a n d5n mt r r a d h ec o u l db eb o u n dw i t h3 2 0n m t e t h l1 f u r t h e r , w ea d d e dt e t h l1i n t ot h e 加v i t r ot r a n s c r i p t i o ns y s t e m ，a n dt h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt e t hlli n h i b i t e dt h et r a n s c r i p t i o no ft w oa d h ep r o m o t e r s m 南京师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 k e y w o r d s ：r n ap o l y m e r a s e ，o v e r e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no fp r o t e i n , 加v i t r o t r a n s c r i p t i o n , 仃a n s c f i p f i o nf a c t o r , e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y i v 第1 章前言 第1 章前言 1 。1 利用秸秆类纤维素生产燃料乙醇 石油、煤碳属于不可再生资源。目前，我国的能源消费几乎全部依赖这些一次性 资源。随着社会的进步，对石油的依赖又远超过煤炭。据石油科学院专家预测，我国 的石油储量，按目前的探储速度和开采速度，到2 0 3 0 年前后，将工业开采贻尽，世 界上的石油再有约5 0 年也将于完。燃料乙醇最有希望取代石油的新型能源。燃料乙 醇是通过对乙醇进一步脱水，再加上适量变性剂制成的，燃料乙醇可以直接作为液体 燃料或者和汽油混合使用，也能作为车用汽油的添加剂可以有效的提高汽油的抗爆 性。与石油相比，每吨燃料乙醇比减排2 吨二氧化碳，有利于环境保护，更为重要的 是燃料乙醇属于可再生能源，利用自然界中含量丰富的植物茎秆便可生产。 目前燃料乙醇的生产方法主要是物理化学法和生物发酵法两大类。物理化学法是 目前世界上普遍采用的纤维素生产燃料乙醇的工艺，该工艺通过纤维素原料预处理、 纤维素糖化、发酵、乙醇提炼四步获得成品燃料乙醇【l 】。整个生产过程需要多个阶段 完成，并且在纤维素预处理、纤维素糖化的步骤中要用到酸、碱等物质，能源、试剂 以及酶制剂消耗巨大，对环境的污染也严重。 生物发酵法制备燃料乙醇主要利用水解酶或者微生物对各种生物质底物进行水 解得到戊糖和己糖，再通过生物发酵途径获得乙醇。目前最常用的方法是同时糖化和 发酵法即纤维素酶解与葡萄糖的乙醇发酵在同一个反应器中进行，同时糖化和发酵法 是目前典型的木质纤维素生产乙醇的方法，国内外的中间试验基本都采用的此法。但 是更有前途的则是直接微生物转化法即作物秸秆中的纤维素成分通过某些微生物的 直接发酵可以转换为酒精。与物理化学法相比该法工艺流程简单：微生物的生长培养 过程即位发酵过程，对底物不需要预处理，反应条件温和，没有环境污染物的产生； 与现行的同时糖化和发酵法相比，不需添加额外的酶，工程菌中也不需要转入重组质 粒，性状可以稳定遗传。 1 2 燃料乙醇生产菌株与嗜热乙醇杆菌 1 2 1 燃料乙醇的生产菌株 一个具有良好工业应用前途的燃料乙醇生产菌株必须具备以下几个特点：较高的 乙醇耐受性和乙醇产量，乙醇转化速度快，培养基廉价，乙醇产生不受水解产物的抑 制，菌体生长条件偏酸或者高温防止杂茵污染。 南京师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 目前应用于工业的燃料乙醇生产菌株主要是酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 、运动发酵单胞菌( z y m o n o n a sm o b i l i s ) 、克雷伯氏菌( k l e b s i e i l ao x y t o c a ) 以及埃希氏大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 。 c e r e v i s i a e 是进行酒精发酵的传统菌株，它乙醇产量高达1 6 ( v v ) 、乙醇耐 受浓度达到2 0 ( v v ) 【z j 、耐酸。但是& c e r e v i s i a e 的生长周期较细菌长，只能利用 己糖，不能利用纤维素、半纤维素和大部分戊糖，但能代谢木糖的同分异构体木酮糖。 对酵母工程菌的改造基本是围绕戊糖代谢进行的。k 6 t t e rp 等人将p i c h i as t i p i t i s 来源 的木糖还原酶基因和木糖脱氢酶导入酵母中，使酵母能利用戊糖，但是乙醇的产量只 有2 1 7g 1 m 。而d e n gxx 等人则将来源的p x y l i 、x y l 2 和x k s i 三个基因导入酵母 中，构建的酵母菌株1 4 0 0p i _ n h 3 2 能单独利用木糖，并且实际产量达到了理论值的 6 6 ，缺点是有大量木糖醇的积累【4 】。 zm o b i l i s 是天然产生乙醇的菌株，该菌的乙醇耐受力和耐酸能力比较强，乙醇 产量最高可达1 2 ( v v ) 【5 】，故被广泛应用于酒类饮料的生产。但是zm o b i l i s 没有 戊糖代谢途径【6 】，c h o u s 等人利用整合载体将木糖、阿拉伯糖和p p 环中一些酶共7 个基因导入zm o b i l i s 中，构建的新工程菌zm o b i l i s2 0 6 c ( p z b 3 0 1 ) 利用木糖和阿 拉伯糖，乙醇产量达到理论值的8 4 【丌。 五o x y t o c a 在造纸厂的废蒸汽中广泛存在。该茵不但能代谢己糖、戊糖，因其含 p 葡萄糖苷酶，还能代谢纤维素水解的中间产物。通过向菌株中整合丙酮酸脱羧酶基 因p d c 和乙醇脱氢酶基因a d h b ，该菌可以降解废纸生产乙醇【8 】。 ec o l i 是基因工程中的良好宿主，它底物作用范围广泛，可以利用戊糖和己糖， 乙醇耐受性可达5 0 虮，并且遗传背景也研究得十分清楚。但是大肠杆菌在产生乙醇 的同时也会有其他有机酸生成。一般的改造途径是向菌株中导入酮酸脱羧酶基因p d c 和乙醇脱氢酶基因a d h b 9 1 ，敲除丙酮酸甲酸裂解酶的基因p f l t l 0 1 ；也有人将五 o x y t o c a 中的纤维素降解酶系整合进其中，获取具有代谢纤维二糖能力的高产菌株【1 l 】 i t 2 o 由上面的简介可以知道，现在构建乙醇生产菌株一般是通过两种途径：对应没有 乙醇生产能力的菌株，人们向其中导入丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因使之能够 发酵产生乙醇；而拥有乙醇代谢途径的菌株，人们则建立新的代谢途径，增强它的代 谢能力，扩展底物利用的范围。 1 2 2 嗜热乙醇杆菌 嗜热乙醇杆菌( t h e r m o a n a e r o b a c t e re t h a n o l i c u s ) 是一种革兰氏阳性高温厌氧细 菌，它具有己糖代谢途径和戊糖代谢途径，利用包括葡萄糖、阿拉伯糖、木糖半乳糖、 甘露糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和淀粉在内的底物进行发酵产生乙醇和c 0 2 ， 2 第1 章前言 同时该细菌还具有纤维素分解酶系【1 3 1 。其最适生长温度为6 9 。c ，可以在p h4 4 - 9 8 的环境中生长，对酸性物质有很强的耐受性。在已知的产乙醇的嗜热细菌中，是乙醇 产量最高的，可以达到8 【1 4 1 ，并且转化速度达到3g ，是乙醇发酵的良好菌株。 在分批发酵和连续发酵的条件下，产率能达到0 4g 乙醇佗木糖和0 4 2g 乙醇g 木糖 【1 5 】。该细菌最大的缺点是它对乙醇的耐受力较低( 4 ) ，但是b u r d e t t eds 等人发 现了的突变株，其乙醇耐受力明显升高【1 4 】，使得该菌的应用价值大大提升。 在ze t h a n o l i c u s 发酵过程中，涉及到乙醇的主要是i 型醇脱氢酶a d h a 、1 1 型醇 脱氢酶a d h b 和双功能的醇醛脱氢酶a d h e 三个酶。前人认为a d h b 负责产生乙醇， a d b a 负责乙醇消耗，对于a d h e 的作用却不是很清楚【1 6 1 ， 1 7 1 ， i s 】。在本实验室的研究 中发现a d h e 也是一种双功能的醇醛脱氢酶，它在乙醇的合成代谢中扮演着极为重要 的角色。更进一步的研究表明ze t h a n o l i c u s 在生长过程中，控制乙醇产生的几个相关 酶并不是一直都有表达的，在特定的生长阶段，每种酶的表达情况是不同的。这一现 象很明显的说明，和乙醇代谢相关酶的基因并不是看家基因( h o u s e k e e p i n gg e n e ) ，它 们的表达是有条件的，受到某些因子的调控的。 可见作为潜在的燃料乙醇生产菌株jze t h a n o l i c u s 有着其他工程菌无法比拟的巨 大优势：第一，它有包括戊糖途径、己糖途径以及纤维素分解酶系在内完整的代谢系 统，能广泛利用各种底物，有着较高的乙醇转化速度；第二，在高温下进行乙醇的发 酵生产，大大降低了染菌的可能性；第三，该菌对酸有着较强的耐受能力，低p h 下 生长不受抑制；第四，可以在高温下让发酵和乙醇蒸馏同时进行，大大简化乙醇的提 取过程。但是，ze t h a n o l i c u s 在乙醇发酵过程中存在的“开关”并不是我们想要的，我 们希望将这些调控位点进行修饰，让乙醇产生相关的酶高水平本底表达，以期提高乙 醇的产量。本研究以此为依据，构建ze t h a n o l i c u s 的体外转录体系，便于更好的研究 该菌在乙醇发酵方面的机理，为ze t h a n o l i c u s 的应用打下坚实的理论基础。 1 8r n a 聚合酶与体外转录 1 3 1r n a 聚合酶结构 r n a 聚合酶( r n a p o l y m e r a s e ，r _ n a p ) 主要是负责细胞内所有r n a 合成的多 亚基蛋白酶。真核生物的r n a p 存在r a n pi 、p _ n a pi i 、r n a p i t i 等多种类型，且 亚基数目多而复杂；而原核生物中只有一种r n a 聚合酶，负责所有m r n a 、r r n a 和t r n a 的合成 1 9 】。r n a 聚合酶存在全酶与核心酶的区别，全酶主要是由2 个q 亚基， 1 个p 亚基，一个p 亚基，一个亚基以及一个a 亚基构成( 旺2 p p d 。) ，分别由助0 4 、 助d b 、r 即c 、肋d z 和砌d d 四个基因编码。全酶分为两个部分：核心酶( c c 2 p p ) 和g 亚基。核心酶各亚基结合较为紧密不易分开形成一个整体，相比之下g 亚基与核 南京师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 心酶结合较松散，容易分开 2 们。仅亚基主要作用是与d n a 以及各种调控因子结合， 并引导整个核心酶的组装；p 和p 亚基形成酶活性中心，并可以与d n a 和某些调控因 子的结合；而6 亚基则能与核心酶结合引导全酶正确结合到启动子上启动转录。亚 基是最小的亚基，该亚基的大小只有1 0k d 左右【2 1 1 ，有文献表明亚基的缺失似乎并 不影响全酶识别以及核心酶的转录 h i ， 2 3 】，但最新文献显示亚基可能涉及到d 亚基 的折叠与保护 2 q ， 2 5 】、特定基因的转录调控【2 6 】以及调节r n a 聚合酶的严紧反应口7 】等。 1 3 2 原核生物的启动子结构 r n a 聚合酶能以很高的亲和性结合在基因上游的特定区域，这个特定区域称之 为启动子。一般以m r n a 的第一个核苷酸对应的模板链碱基做为转录起始位点，并 表示为+ 1 ，转录方向的核苷酸依次以递增的正值表示，逆向而上的上游区域则以负值 表示。在分析比较上百种启动子序列后，发现大多数的启动子都存在有保守的共同序 列，这些区域主要集中在1 0 和3 5 两个区域。有些启动子在3 5 区域的更远的上游还 存在一些调控转录的区域上游元件( u pe l e m e n t ) ，典型的启动子序列如图1 1 所示。 + 1 a a a w t w t t t t n n n 卢m ”4b p t t g a c a 1 4b p0 3 1 6 ) t g n t a t a a t g g ( 3 “4b p ( 2 - 8 ) 一- a ： u pe l e m e n t3 5h e x a m 鄂1oh e x a n 曾。 l s 瞰s 舱， 图1 1 典型的0 7 0 识别的启动子结构 f i 9 1 1c o n s e n s u ss e q u e n c e sf o r 口7 0r e c o g n i t i o ne l e m e n t s 3 5 序列又称s e x _ f a r e a 框，位于转录起始位点上游3 5b p 的位置，其中共有序列 是t t g a c a ，保守性程度为t 8 2 t 8 4 g 7 8 氏5 c 5 4 a 4 5 1 2 8 1 ，其中的t t g 十分保守。3 5 序列 对r _ n a p 全酶有很高的亲和性，是r n a 聚合酶6 亚基的初始识别位点 2 9 1 。3 5 区的核 苷酸结构在很大程度上决定启动子强度。 1 0 序列又称p r i b n o w 框，在距离转录开始位点上游约1 0 个碱基的位置存在_ 个 典型的6b p 序列，大多是t a t a a t 序列或者稍有变化。框中每个位点保守性在4 5 一 1 0 0 ，共同序列及其频率可写成t s o a 9 5 t 4 5 氏江5 0 t 9 6 【2 8 1 ，目前认为p r i b n o w 框决定转 录的方向，酶在此部位与d n a 结合成稳定的开放转录复合物【3 0 】。 - 3 5 和- 1 0 序列之间间隔的序列对启动子功能相对并不十分重要，远不如两个保 守序列对转录功能来得重要。两个序列之间的距离约1 5b p ，但有证据表明两个序列 之间的距离长短可以影响启动子的强度。 有些基因在一3 5 序列的上游还存在一个或多个有调控作用的上游元件。原核生物 中的c r p 结合位点、印操纵子中的衰减子以及增强子，真核生物中的c a a t 框、 4 第1 章前言 g c 框和八聚体等都属于上游元件。这些上游元件和特定的转录因子相互作用使转录 增强、减弱或者具有特异性，改变蛋白的表达量，改变生物体代谢过程或表型，增加 环境的适应性。 1 3 3r n a 聚合酶转录和终止 。 i l i a 聚合酶的酶学分类为e c2 7 7 6 ，属于合成酶。它以双链d n a 中的一条 链为模板，以核糖核酸( a r p 、g t p 、c t p 以及u t p ) 为底物沿着产物5 _ 3 的方向 转录r n a 。r n a 聚合酶不具有3 一5 外切酶活性，所以没有校正转录错误的能力。 r n a 聚合酶合成r n a 整个过程涉及到转录位点识别，转录延伸以及转录的终止，另 外在转录起始和延伸阶段还有可能涉及到转录的增强和抑制。 r n a 的转录起始主要涉及到r n a 聚合酶核心酶和6 亚基( 即r n a 聚合酶全酶) 。 6 亚基的主要功能是识别转录的起始位点( 表1 1 ) ，它与核心酶结合增强全酶对特定 启动子的亲和性，形成r n a p d n a 二元转录复合物，当转录开始延伸8 9b p 时，6 亚基与核心酶脱离，后者继续转录。酶与模板d n a 的结合是通过0 l 亚基的c 端( c 1 d ) 以及a 亚基共同实现的【2 9 】， 3 1 1 ，p 2 ，0 【亚基还可以和各种转录激活因子相互作用实现转 录的增强【j 3 j 。 表1 1 不同6 亚基识别的启动子保守序列【2 8 】 t a b l e1 - 1c o n s e n s u ss e q u e n c e sf o ros u b u n i ti nb a c i l l u ss u b 玎i i sa n de s c h e r i c h i ac o l i o 亚基。3 5 序列1 0 序列来源和使用 ( 3 - 4 3t t g a c at a t a a t营养生长 6 2 8c t a a ac c g a t a t营养生长 b s u b t i l i s一7a g g n ”盯g g n 触r r g n t 芽孢形成 万3 2a a a t c 己蝌t g t l n l a芽孢形成 6 2 91 n a a a c a t a t t产芽孢时合成 6 7 0t t g a c a t a ：r aa t一般生长 ec o l i 0 3 2c n c t t g a ac c c c a l n t热休克 6 5 4 c t g g n at t g c a 利用氮源 转录的延伸阶段主要是由核心酶执行的，根据互补配对原则沿着r n a 的5 _ 3 方向进行转录。酶在转录过程中覆盖大约8 0b p 的d n a 区域，但其中解链的部分只 有1 2 1 8b p 左右。解链的一条模板链进入r n a p 的活性中心，转录生成r n a ，并形 成r n a d n a 杂合链，当酶分子向前移动时，d n a 又重新形成双链，r n a 单链被置 换出来。 转录的终止存在两种类型，一种是依赖于p 因子的转录终止，另外一种是不依赖 于p 因子的转录终止。前者是r n a p 在p 因子的帮助下，从d n a 模板链上脱离下来； 后者的终止依赖于r n a 产物，该类终止中，合成的r n a 具有一个富含c g 的发夹结 南京师范大学2 010 届硕士学位论文 构和一段富含寡聚u 的片段，发夹结构使转录速度减慢，而寡聚u 使得r n a 从模板 d n a 上脱落下来从而实现终止。 。 1 3 4 转录调控蛋白的相关模体 ， 转录调控蛋白或称转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ) 是一类与d n a 或者r n a 相 互作用的蛋白，它们辅助r n a 聚合酶转录，使转录具有选择性或者终止转录，不属 于k n a 聚合酶的固定组成，统称为转录调控因子 2 3 1 。转录因子大小和结构不具有共 性，但是他们具有特定的结构或结构域参与特异性核酸序列结合，这些结构或结构域 我们称之为模体( m o t i f s ) 。按照转录因子所含模体的不同，我们可以将转录调控因 子分为以下几类：锌指结构型( z i n cf i n g e r ) 、亮氨酸拉链型( l u c i n ez i p p e r ，b z i p ) 、 螺旋转角螺旋型( h e l i x - t u r n - h e l i x ，h t h ) 以及p 折叠片型( b s h e e t ) 。 h t h 是第一个被鉴定出来的d n a 识别模体，它含有两个仪螺旋，中间由一个p 转角相连，其中第一个仅螺旋横于d n a 大沟之上，通过疏水作用与d n a 相结合；而 第二仅螺旋有一部分直接位于d n a 大沟的内部，是特异性d n a 序列的识别螺旋。含 有h t h 结构的蛋白经常以同源二聚体的形式参与蛋白质d n a 相互作用，两个单体 识别的结合序列相同，在核酸序列上有反向互补的特点。在原核生物中，大部分的调 控因子都含有h t h 模体。 b z i p 型的调控蛋白常见于动物当中，这种类型的调控蛋白除了可以形成同源二 聚体还能形成异源二聚体，典型的例子就是f o s 和j u n 蛋白的异源二聚体【3 4 】。b z i p 是一种蛋白相互结合的模体，实现调控功能还需要螺旋环螺旋( h e l i x l o o p h e l i x ) 、 h t h 等其他d n a 识别模体的配合。 z i n cf i n g e r 也是真核生物中较常见的d n a 识别模体，因为形成功能结构需要一 个z n 2 + 参与形成手指结构，故称为锌指结构。经典的z i n cf i n g e r 模体分为c y s 2 m s 2 和c y s 2 c y s 2 两种。典型序列分别为c y s - x 2 1 4 一c y s - x 1 2 h i s - x 3 5 - h i s 以及 c y s x 2 一c y s - x 13 - c y s - x 2 一c y s 州。 。 f ；- s h e e t 类型的蛋白典型代表是r e l 转录因子家族的蛋白 3 5 】，它们富含重复的亮 氨酸序列。 1 4 电泳迁移率变动实验与体外转录系统 1 4 1 电泳迁移率变动实验 凝胶迁移或电泳迁移率变动分析实验( e l e c t r o p h o r e f i cm o b r i t ys h i f ta s s a y ，e m s a ) 是一种研究d n a 结合蛋白和其相关的d n a 结合序列相互作用的技术，是用于分析 核酸和核酸结合蛋白质相互作用的有力工具，可用于定性和定量分析。通常情况下将 纯化的蛋白或者细胞粗提液与被标记的d n a 或r n a 探针共同孵育，用非变性的聚 6 第l 章前言 丙烯凝胶电泳分离复合物和未结合的探针。核酸复合物比游离的探针移动速度慢， 形成滞后条带。在分析未知蛋白的核酸结合能力时，竞争d n a 是必须的，竞争d n a 是可以是p o l y ( d i ：d c ) ( d i ：d c ) ( 聚核苷酸竞争物) 也可以是鲑鱼精片段，其浓度要根据 待分析蛋白来确定。 1 4 2 体外转录系统 体外转录系统( i nv i t r ot r a n s c r i p t i o n ) 是使用r n a 聚合酶，以含有启动子序列的 双链d n a 为模板，大量合成与启动子下游的单链d n a 互补的单链r n a ，整个实验 过程排除体内试验的各种干扰因素。它可以用于很多不同的实验目的，包括转录的机 制和动力学的研究、启动子和应答元件的分析及转录因子的鉴定和纯化。作为功能分 析，体外转录分析也可用于检测纯化期间转录因子的活性，并且还可以用于检测和研 究d n a 结合和非结合因子的活性 3 6 】。体外转录的结果既可以直接分析( 即把放射性 掺入转录产物中) ，也可以间接分析( 即用标记的探针检测转录产物) 。 典型的体外转录分析包括纯化的模板与r n a 聚合酶以及核糖核苷酸( n t p ) 、纯 化的转录因子以及基本转录装置。在适合的温度、盐浓度和缓冲条件下将各组分按比 例加入反应体系进行孵育，使用u r e a p a g e 或者s d s p a g e 电泳检测转录产物，分 析转录元件或者转录因子的功能。最适的转录条件会因r n a 聚合酶及所分析的转录 因子不同而不同，也与所用模板、方法的不同而有所变动。转录因子的用量、盐的种 类和浓度以及m 9 2 + 的浓度都是可调节的因素【，丌。在体外转录试验中，利用超螺旋或 者环状的d n a 作为模板是及其重要的。一般情况下，用线性的d n a 作为模板得到 的结果比较差【3 8 】，因为蛋白质似乎可以集合到d n a 的自由末端从而影响转录复合物 的形成【3 9 】，【4 0 】。 在体外研究转录功能时，一般采用大肠杆菌的r n a 聚合酶转录系统。研究其他原核 物种的时候可以使用大肠杆菌的r n a 聚合酶进行研究，也可以使用标准纯化方法将 物种自身r n a 聚合酶纯化出来使用j 。高等真核生物由于转录过程的复杂性不直接 提取r n a 聚合酶，而是获得该物种的核提取物进行转录研究。常见的t 7r n a 聚合 酶转录系统和s p 6r n a 聚合酶转录系统两类转录系统主要是用于高效率的r n a 合 成，例如合成r n a 探针、s i r n a 制作、r n a 修饰以及体外翻译。 1 5 研究意义及目标 目前我们对产乙醇菌株的研究主要集中在大肠杆菌，运动发酵单胞菌以及酵母的 菌株改造和发酵过程优化上。嗜热乙醇杆菌乙醇代谢酶系完整，乙醇转化速度快 4 2 1 ， 耐酸并且生长温度高，极具应用前景。目前对该菌的研究报道很少，特别是对乙醇代 7 南京师范大学2 0 1o 届硕士学位论文 谢机理的研究几乎没有，急需通过研究明确乙醇代谢过程中涉及的转录调控，便于有 目的的对该菌进行改造。 体外转录系统是研究基因表达调控的重要手段之一，通过该系统对嗜热乙醇杆菌 乙醇代谢调控系统的进行更深入研究，深刻理解乙醇代谢的调控机制，以便更好的改 造该菌，消除基因表达的负调控，增强正调控，从而提高乙醇的产量，为其工业化应 用打下坚实的理论基础。 本文研究目标是一方面是获得ze t h a n o l i c u sj w 2 0 0 的r n a 聚合酶构建体外转录 系统：另一方面利用该系统对ze t h a n o l i c u sj w 2 0 0 中发现的未知d n a 结合蛋白进行 初步研究。 1 6 研究内容 构建ze t h a n o l i c u s 的体外转录系统核心是获得该细菌的r n a 聚合酶。我们设计 两套实验方案来获得该酶：一方面提取ze t h a n o l i c u sj w 2 0 0 细菌中天然r n a p ；另一 方面检索g e n b a n k 中公布的和te t h a n o l i c u sj w 2 0 0 的亲缘关系极近的极端嗜热菌属 t h e r m o a n a e r o b a c t e rs p x 5 1 4 的r n a 聚合酶各亚基基因序列，设计相关引物，尝试 ，表达并进行体外重组r n a 聚合酶。最后利用获得的r n a 聚合酶构建体外转录系统。 对ze t h a n o l i c u sj w 2 0 0 中的未知d n a 结合蛋白进行初步研究，主要是通过生物 信息学、电泳迁移率变动分析实验和体外转录三方面进行分析，尝试阐明该蛋白在转 录调控中的地位和作用。 第2 章重组r n a 聚合酶的表达及纯化 第2 章重组r n a 聚合酶的表达及纯化 早在上个世纪7 0 年代，国外就已经有成功体外重组e s c h e r i c h i ac o l ir n a 聚合酶 的报道【4 3 】，【删。研究表明i l n a 聚合酶多亚基的装配是有顺序的，一般认为是沿着 “2 一啦一2 b - 啦p p ( 核心酶) - 啦p p o ( 全酶) ”的顺序进行组装的 4 5 1 。两个亚 基先形成二聚体，并与p 相结合形成仅2 p ：睨p 与p 复合体相互结合装配为核心酶啦p p ， 最后再与不同种类的6 亚基结合形成具有不同转录功能的全酶【4 6 】。但是体外重组r n a 聚合酶受操作过程中各种因素的影响极大，因此效率不高。 重组i l n a 聚合酶的表达及纯化，首先需要获得该酶各亚基的基因。鉴于 y h e r m o a n a e r o b a c t e re t h a n o l i c u sj w 2 0 0 的全基因组没没有测通，我们参考与之亲缘性 较高的t h e r m o a n a e r o b a c t e rs p x 5 1 4 基因组中该酶各亚基序列进行引物设计，并顺利 构建了p e t - a l p h a - h i s 、p e t - b e t a 和p e t - o m e g a 三个重组质粒。构建p e t - b e t a 的过程 中，我们发现ze t h a n o l i c u sj w 2 0 0 中编码p 亚基的肋柏基因c 末端碱基序列没有想 象中的保守，无法根据同源性获得肋以基因片段，因此我们将ze t h a n o i i c u sj w 2 0 0 和亲缘关系最近的三个菌株t h e r m o a n a e r o b a c t e rs p x 51 4 、t h e r m o a n a e r o b a c t e r t e n g c o n g e n s i sm b 4 和t h e r m o a n a e r o b a c t e rp s e u d e t h a n o l i c u sa t c c3 3 2 2 3 的r p 胡基因 序列进行比较，找出其中的保守区域，扩增获得含有勋犯的c 段基因序列并测序， 取得勋以的c 端准确的基因序列，最终成功构建重组质粒p e t - b e t a 。 将构建的重组质粒在大肠杆菌高效表达并分别纯化，进行体外亚基重组。利用 亚基上所带有的组氨酸标签进行进一步纯化，获得了较纯的重组r n a 聚合酶。但是 由于体外重组效率较低，以及检测手段的限制我们却没有测得i k n a 聚合酶的活性。 因此对于ze t h a n o l i c u sj w 2 0 0 体外重组r n a 聚合酶还需要进一步的研究和优化。 2 1 材料 2 1 1 菌种与质粒 嗜热乙醇杆菌t h e r m o a n a e r o b a c t e re t h a n o l i c u sj w 2 0 0 编号a t c c 3 1 5 5 0 ，由美国 佐治亚大学微生物系j w i e g e l 实验室惠赠。大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l id h l 0 b 、ec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) c o n d o n p l u s 购于p r o m e g a ( u s a ) 。 ， 质粒p e t - 2 8 a 卜) 购自n o v a g e n ( g e r m a n y ) ，卡那霉素抗性，t 7 启动子，i p t g 诱导。 2 1 2 培养基与溶液 嗜热乙醇杆菌液体培养基【4 7 】：4 2 酊n a 2 1 - r , _ p 0 4 1 2 h 2 0 ，1 5g 1k h 2 p 0 4 ，o 5 肌 4 c l ，o 1 8 酊m g c l 2 6 h 2 0 ，4g 1 酵母粉，8 酊葡萄糖，o 0 5 ( v v ) 2 0 0 0 xb a l c h s 9 南京师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 v i t a m i a ，0 1 6 6 ( v v ) 6 0 0 x w o l f