（植物学专业论文）盐地碱蓬阳离子转运载体sshkt1的基因克隆及其功能分析.pdf

出东师范大学博士学位论文 英文缩略表 坐奎墅蔓查兰堡主堂垡堡苎 p b sp h os p h a t eb u f f e r 磷酸缓冲液 p m s f p h e n y l m e t h y ls u l f o n y lf l u o r i d e苯甲基磺酸氟 p v p p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e聚乙烯吡咯烷酮 r i f r i f a m p i c i n 利福平 r n a z ear i b o n u e l e a s ea 核糖核酸酶a r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 转分钟 r r n ar i b o s o m a lr n a 核糖体r n a r t p c rr e v e r s et r a n s c r i p m s e p o l y m e r a s ec h a i n 逆转录酶多聚酶链 r e a c t i o n 式反应 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 s d s p a g es d sp o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s 聚丙烯酰胺凝 胶电泳 s s cs o d i u mc h l o r i d e s o d i u mc i t r a t eb u f f e r 柠檬酸钠氯化钠缓 冲液 t 11 s tt r a n s f o r m e dg e n e r a t i o n 转化株第一代 t b at h i ob a rb i t u r i ca c i d 硫代巴比妥酸 r e t r i s h c i - e d t ab u f f e r t r i s h c l e d t a缓 冲液 t e a - c l t e t m e t h y l a m o n i u mc h l o r i d e t e m e d n ，n ，n n - t e l r a m e t h y le t h y l e n ed i a m i n e n ，n ，n ，n 四甲基乙 二胺 t n s t r i s o a y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e三羟甲基氨基甲烷 y n b y e a s tm 廿o g e nb a s em e d i u my n b 培养基 1 3 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位做储签名：研研 导师签字： 学位论文版权使用授权书 乃 i 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文技查阅和借阒。本人授权兰 控一可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：召f 兹手 签字日期：豇妒存月 日 p 导师签字： z 参与 签字日期：协7 年i 月7 日 山东师范大学博士学位论文 盐地碱蓬阳离子转运载体s s h k t l 的基因克隆及其功能分析 摘要 钾是植物中的重要元素，高亲和性的c 吸收系统在钾的吸收及转运过程中起关键 作用。植物h k t 蛋白与原核生物中的k t r b 、t r k h 及k d p a 转运载体、真菌中的 i r k 蛋白共同组成了一个超级转运载体家族，h k t 蛋白已经引起广泛的注意，其功能逐渐 被揭示。研究表明h k t 转运载体在长距离的n a + 转运及植物耐盐性中起重要作用。 目前报道的h k t 基因大都来自非盐生植物如小麦、拟南芥、水稻及桉树等，只有 m c h k t l 和m c h k t 2 来自兼性c a m 植物冰叶日中花。有关盐生植物中h k t 转运载 体的特性及功能研究的数据非常有限。本实验以典型的积盐型盐生植物盐地碱蓬 ( s u a e d as a l s a l ) 为材料，研究了盐鲍碱蓬中c 、n a + 的吸收特性：克隆了盐地碱蓬质膜 阳离子转运载体s s h k t l 的基因并进行了表达特性的分析，同时构建了含有s s h k t l 的 酵母表达载体和植物表达载体，分别转化高亲和性k + 吸收缺陷的酵母突变体c y l 6 2 、 n a + 敏感的酵母突变体g 1 9 和野生型拟南芥，以分析此基因在不同的异源表达系统中所 表现的主要功能及过量表达对拟南芥耐盐性的影响。主要结果总结如下： 1 、低k + 条件下n a c l 胁迫不影响盐地碱蓬中的k + 含量 k + 营养在盐地碱蓬生长中起关键作用。无n a c i 胁迫( om m o l ln a c l ) 和n a c l 胁迫( 1 0 0 ，4 0 0r e t o o l l ) 下，盐地碱蓬叶片和根系中的k + 含量均随k + 处理浓度的增 加而显著增加。此外，较高k + ( o 7 ，l ，6 r e t o o l l ) 浓度时，n a c i 胁迫造成植株叶片、 根系c 含量明显下降。但较低k + ( o ，0 1r e t o o l l ) 浓度条件下，n a c l 胁迫对叶片和 根系的k + 的含量几乎没有影响；而且，在根中，无论是在低k | + 浓度条件还是在高k + 浓度条件下，4 0 0m m o l ln a c i 胁迫与1 0 0m m o l ln a c l 胁迫相比，并没有使盐地碱蓬 根中的k ? 含量明显下降。由此可以看出，在盐胁迫下盐地碱蓬具有较高的维持k ? 稳 态的机制，这与非盐生植物明显不同，而k + 稳态对盐地碱蓬的耐盐性具有重要作用。 2 、k + 吸收系统抑制剂对盐地碱蓬中n a + 积累的效应 在较低，+ 浓度( o ，o 1 ，0 4r e t o o l l ) 条件下，高亲和k + 吸收系统抑制剂n e m ( 3r e t o o l l ) 处理对盐地碱蓬植株内n a + 积累影响不大，n a + 积累并没有降低。这说明 n a + 可能不是通过高亲和c 吸收系统进入盐地碱蓬体内的。在较高k + 浓度( 6 ，8 ，1 0 r e t o o l l ) 条件下，低亲和c 吸收系统抑制剂t e a ( 6r e t o o l l ) 对盐地碱蓬体内n a + 积 累具有显著影响，它明显抑制了n a + 的吸收和积累( pt 蝇v s 戡_ 心 o 0 5 ) 。这说明n a + 可以通过低亲和k + 吸收通道进入盐地碱蓬体内，t e a 对低亲和k + 吸收系统的抑制也 同时抑制了n d 的吸收。 山东师范大学博士学位论文 3 、盐地碱蓬中阳离子转运载体s s m ( t le d n a 的克隆及序列分析 根据g e n e b a n k 中已知的h k t 类蛋白的e d n a 和蛋白序列寻找保守区并合成简并 引物，用低k + 溶液处理盐地碱蓬幼苗1 6h ，提取根的m r n a 并反转录成c d n a ，以此 作为模板进行p c r 扩增，得到一条中间片段，经过测序并进行b l a s t 分析与h k t 的同 源性较高。根据中闻片段利用5 、3 r a c e 分别合成其5 、3 端序列，最终得到一条完 整的h k t 类基因，命名为s s h k t l 。s s h k t l 的c d n a ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o a y 5 3 0 7 5 4 ) 序列全长2 0 3 3b p ，包括5 4 b p 的5 非编码区和3 3 2b p 的3 非编码区。开放阅读框为1 6 5 0 b p 。编码5 5 0 个氨基酸残基，分子量约6 3 0k d ，s s h k t i 氢基酸序列与其他植物i - i k t 蛋白具有3 9 0 , , - 6 4 的同源性。在s s h k t l 的一级结构中推测的第一个p 环的g y g 基 序的第一个o l y 并不存在，而是由s e t 所替代。s s h k t i 氨基酸序列的疏水性分析表明 盐地碱蓬质膜s s m ，t l 为一跨膜多肽，存在l o 个可能的跨膜区。 4 、盐地碱蓬根中s s 汀1 的亚细胞定位 利用制备的s s h k t i 的抗体s s h k t l a l 3 5 - 2 0 4 进行盐地碱蓬根细胞质膜和液泡膜蛋白 的免疫印迹杂交，发现s s m 汀l 蛋白分布在裉细胞质膜上。 5 、低k ? 条件下盐地碱蓬s s h k t l 基因的表达特性分析 分离盐地碱蓬植株的根、茎、叶总r n a ，用半定量r t - p c r 分析s s h k t l 表达的组 织特异性发现，s s h k t l 主要在叶中表达，其次是根，在茎中没有检测到表达；在叶和 根中s s h k t l 的表达明显受到低k + 条件的诱导；在低k + 处理初期随处理时间的延长， 盐地碱蓬叶片翮基因表达量增加，到4 9 小时达到最大，随处理时间的延长，盐 地碱蓬叶片s s h k t l 基因表达量有所降低，但仍明显高于对照；较老的苗子中低i c i e r 对于此基因的诱导作用弱于幼嫩的盐地碱蓬苗。这表明低k + 条件下，盐地碱蓬中s s h k t l 基因表达存在动态变化。 6 、盐胁迫条件下盐地碱蓬黝基因的表达特性分析 在低k + 条件下同时用2 0 0m m o l l 、4 0 0m m o l ln a c i 处理盐地碱蓬4 8 小时，盐地 碱蓬叶片s s h k t i 表达量比单独用低c 处理时增加，但两种盐浓度处理样品之间差别不 大。 7 、s s 玎( t 1 在酵母突变体中主要转运k + 而非h i a + 酵母突变体c y l 6 2 由于缺失高亲和性c 转运载体基因t r k l 和t r k 2 而在低k ? 培养 基上不能生长；突变体g 1 9 中负责编码n a + 外排的a t p a s e s 的e n a i 4 基因缺失，造 6 山东师范大学博士学位论文 成n a + 敏感性增加，将s s h k t l 利用l i a e 转化方法分别转到酵母突变体c y l 6 2 和g 1 9 中，发现c y l 6 2 ( 岛肷列) 能在低k + 培养基上生长。而g 1 9 ( s s h k t l ) 对n a + 的敏感 性并未增加，初步说明s s h k t l 主要转运k + 而非n a + 。 8 、过量表达s s h k t l 能够增加转基因拟南芥植株耐盐性 过量表达盐地碱蓬s s h k t i 基因的拟南芥植株比野生型拟南芥植抹耐盐性增加。在 正常m s 培养基上，转基因植株的生长与野生型植株没有明显差异，说明外源基因的插 入和过量表达并没有影响植物的正常生长。在含不同浓度n a c i 的m s 培养基上萌发并 生长的转基因拟南芥植株其叶色、根发育均明显好于野生型植株。将在m s 培养基上生 长1 0 天的野生型及转基因拟南芥幼苗转移到0 m m o l lk + 或含不同浓度l i c l 的m s 培养 基上继续生长两周，转基因植株长势明显好于野生型植株。正常生长条件及不同处理的 转基因土培苗地上部分的k + 积累明显高于野生型，而n a + 积累在两者之间没有明显差 异 综上所述，实验证据表明，：q s h k t l 在酵母细胞中表达时主要转运而非n a + ；盈， 量表达盐地碱蓬k + 转运蛋白基因对明显提高了转基因拟南芥植株的耐盐性，这与 酵母中的表达结果一致，进一步证实s s h k t l 在维持正常的胞质k + 水平及植物抗盐性 方面具有重要作用，为利用分子生物学手段进行作物耐盐新品种的培育奠定了一定基 础。 本论文主要创新点： l 、首次从盐生植物盐地碱蓬中克隆了& 觚刀基因。 2 、证明了s s h k t i 基因的表达受c 饥饿及盐胁迫的诱导。 3 、证明了转s s h k t l 基因酵母菌的耐盐性提高。 4 、证明在拟南芥中过量表达s s h k t l 基因可以提高转基因植株的耐盐性。 关键词：盐地碱蓬；反转录p c r ；盛 解，；植物抗盐性 中图分类号：q 9 4 5 7 山东师范大学博士学位论文 c l o n in ga n df u n c t i o na n a l y s i so ft h ec a t i o nt r a n s p o r t e rs s h k t l i nac 3h a l o p h y t es u a e d as a l s al ( c o l l e g eo f l i f es c i e n c e ，s h a n d o n gn o r m a lu n i v e r s i t y , j i n a n , 2 5 0 0 1 4 ) a b s t r a c t p o t a s s i u mi sa ne s s e n t i a le l e m e n tf o rp l a n t ，a n dh i g h a f f i n i t yk + u p t a k es y s t e mp l a y sa c r u c i a lr o l ei np o t a s s i u ma b s o r p t i o na n dt r a n s p o r t a t i o n p l a n th k tp r o t e i n sc o m p r i s ea f a m i l yo fc a t i o nt r a n s p o r t e r st o g e t h e rw i t hp r o k a r y o t i ck t r b t r k i - ia n dk d p at r a n s p o r t e r s u b u n i t sa n df u n g a lt r kp r o t e i n s t h e s ep r o t e i n sh a v er e c e i v e de x t e n s i v ea t t e n t i o nd u r i n g r e c e n ty e a r sa n dac l e a ri n s i g h to ft h e i rf u n c t i o n si se m c r g m g f u n c t i o ns t u d i e so fh k t t r a n s p o r t e r ss h o w e dt h a tm e m b e r so ft h i sf a m i l yp l a y e di m p o r t a n tr o l e si nl o n g - d i s t a n c e n a + t r a n s p o r ta n dp l a n ts a l tt o l e r a n c e m o s th k d l i l 【eg e n e sh a v eb e e nc l o n e df r o m n o n h a l o p h y t e ss u c ha sa r a b i d o p s i st h a l i a n a , o f y z a $ a t i v a , o 尹n c a m a l d u l e n s i sa n d t r i t i c u ma e s t i v u m o n l ym c h k t la n dm c h k t 2w e r ec l o n e df r o mt h ef a c u l t i t i v ec a m p l a n t ( m e s e m b r y a n t h e m w nc r y s t a l l i n u m ) d a t ar e g a r d i n gt h ec h a r a c t e r i z a t i o n so fh k t p r o t e i n sf r o mh a l o p h y t e sh a v eb e e nl i m i t e du n t i ln o w h e r ew es t u d i e d 也e 也ee f f e c to fc u p t a k ei n h i b i t o r ( n z ma n dt e a ) o nt h en a * c o n t e n ta n dt h ee f f e c to f k + n u t r i t i o na n dn a c i s t r e s so nk c o n t e n to fs u a e d as a l s ap l a n t sf i r s t t h e nw er e p o r t e dt h ec l o n i n go fh k t l h o m o l o gf r o mc 3h a l o p h y t es u a e d as a l s a ( l ) ( s s h k t i ) ，a n l y s i n gt h ee x p r e s s i o np a t t e m a n di t sf u n c t i o n su s i n gd i f f e r e n te x p r e s s i o ns y s t e m s t h er e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w s ： 1 n a c is t r e s sd i dn o ta f f e c tf c o n t e n to f s u a e d as a l s a 螂l d e rl o wk + c o n c e n t r a t i o n 心n u t r i t i o np l a y sa l li m p o r t a n tt a l ci nt h eg r o w t ho fs u a e d as a l s a 心c o n t e n ti nl e a v e s a n dr o o t sw a si n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht h ei n c r e a s eo fk + c o n c e n t r a t i o ni nm e d i u m 1 1 1 e c l s i r e s sm a r k e d l yr e d u c e dt h ecc o n t e n ti nl e a v e sa n dr o o t so fp l a n t sg r o w ni n0 7 ，1 ，6 m m o l lk + m e d i u mb u th a r d l ya f f e c t e dk + c o n t e n ti n0 o 1m m o l lc m e d i u m m o r e o v e r , 4 0 0m m o f ln a c is t r e s sd i dn o tr e d u c ecc o n t e n tm a r k e d l yc o m p a r e dw i t h1 0 0m m o f l n a c ls t r e s sw h e t h e ru n d e rl o wk + c o n c e n t r a t i o no ru n d e rh i 曲k + c o n c e n t r a t i o n 砸si sv e r y d i f f e r e n tf r o mt h en o n h a l o p h y t e s sp r o v e dt h a tt h e r em a yb ea ne f f e c t i v em e c h a n i s mo f k ? h o m e o s t a s i si ns u a e d as a l s au n d e rs a l ts t r e s s w h i c h 、 i m p o r t a n ti nt h es a l tt o l e r a n c eo f b 山东师范大学博士学位论文 s z 帕p ( 缸s a l s a 2 e f f e c to f u p t a k es y s t e mi n h i b i t o ro nt h en 蠢c o n t e n ti ns u a e d as a l s a n e m ( 3m m o l l ) i sas p e c i f i ci n h i b i t o ro ft h eh i g ha f f i n i t ycu p t a k es y s t e m i th a d l i t t l ee f f e c to n 也cn a + c o n t e n to fs u a e d as a l s aa tl o wk + c o n c e n w a t i o n ( 0 ，o 1 ，0 4r e t o o l l ) si n d i c a t e dt h a tn de n t r yi n t ot h ep l a n t sw a sn o tm e d i a t e db yt h eh i g ha f f m i t yk ? u p t a k e s y s t e mu n d e rl o wk ? a p p l i c a t i o n t e a ( 6 m m o l l ) i sas p e c i f i ci n h i b i t o ro ft h el o wa f f i n i t yk + u p t a k es y s t e m i ti n h i b i t e d t h en a + u p t a k ea n da c c u m u l a t i o ns i g n i f i c a n f l ya th i g hk + c o n c e n t r a t i o n ( 6 ，8 ，1 0r e t o o l l ) ss u g g e s t e dt h a tn 矿e n t r yi n t os u a e d as a l s ap l a n t s a tl e a s t , w a sp a r t l ym e d i a t e db yl o w a f f i n i t yk + u p t a k es y s t e mu n d e rh i g hk ? 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