斑马鱼ＳＡＡ蛋白原核表达、抗体制备及菌结合研究.doc

斑马鱼蛋白原核表达、抗体制备及菌结合研究 齐麟，李军，向志明，余英才 （铁道警察学院，郑州；聊城大学药学院，山东聊城；中国科学院南海海洋研究所，广州；江西中医药大学生物化学教研室，南昌） 摘要：通过构建斑马鱼（）原核表达载体，在大肠杆菌（E.coli）中诱导表达并纯化获得了斑马鱼融合蛋白，将纯化的斑马鱼蛋白免疫小鼠，制备了特异性多克隆抗血清，并研究了斑马鱼融合蛋白与细菌的结合能力及检测了抗体效价。结果表明，纯化的斑马鱼融合蛋白能够与种细菌直接结合，血清效价达到以上。 关键词：斑马鱼（）；血清淀粉样蛋白；原核表达；抗体制备；菌结合 ：A：0439114（15）020382-03 DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.02.031 血清样淀粉（，）为高度异质性蛋白，因与一系列疾病相关而成为病理学研究的热点。基因的多态性是淀粉样病变的高危因素，持续高水平是淀粉样病变发生的前提条件。除此之外，与胃癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌和绒毛膜癌等恶性肿瘤呈正相关，并将作为癌症临床常规检查的非特异性肿瘤标志物以及手术后康复程度的指标是可行的。人源可以通过信号通路诱导细胞间黏附分子（，）的表达而募集白细胞。本研究中在克隆获得全长斑马鱼（）的基础上，构建融合表达载体，在大肠杆菌TB1中表达斑马鱼并进行纯化，将纯化蛋白进行菌结合试验并免疫Balb/c小鼠制备了特异性多克隆抗体，为后续免疫及肿瘤病理学试验打下基础。 材料与方法 试验材料 载体与菌种原核表达载体、大肠杆菌（）表达宿主菌和多糖树脂购自公司；购自公司；大肠杆菌、野生型大肠杆菌、副溶血弧菌（）、溶澡酸弧菌（）、金黄色葡萄球菌（）和表皮葡萄球菌（）均为铁道警察学院生化快速鉴别实验室常规保种。 试剂琼脂糖胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒为公司产品；连接酶、酶、限制性内切酶和为宝生物工程（大连）有限公司产品；蛋白为公司产品；碱性磷酸酶羊抗鼠购自美国安玛西亚公司；膜购自公司；其他试剂均为国产分析纯。 原核表达载体pMal-c2x-SAA的构建 使用软件设计上、下游引物，以为模板进行扩增，其中上游引物序列：，下游引物序列： 。反应程序为：预变性；变性，退火，延伸，共个循环；延伸。将扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后和空载体质粒进行和双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后于连接过夜，并将连接产物转化原核表达宿主菌，保菌。 重组质粒的诱导表达及纯化 取“”中的菌液接种到含氨苄青霉素的新鲜液体培养基中，过夜培养后，转接到的新鲜培养基中，继续培养至，加入的诱导以上，以的电泳分析其表达后利用多糖树脂来纯化重组蛋白。 斑马鱼蛋白的菌结合试验 将获得的斑马鱼纯化蛋白用于细菌结合试验，具体操作见文献。 斑马鱼蛋白抗鼠血清制备 取纯化的斑马鱼融合蛋白进行，切下目的蛋白质条带，以去离子水反复漂洗，去除凝胶上的甲醇和冰醋酸，以的缓冲液浸泡过夜。于冰浴中用研钵研磨直至悬浮液中的凝胶颗粒细小而均匀，加入等体积的弗氏佐剂，继续研磨或用注射器反复抽打使完全乳化。将用弗氏完全佐剂乳化的抗原溶液通过腹腔注射接种发育良好的纯种小鼠体内做为基础免疫，基础免疫后进行加强免疫。注射间隔周期为，加强注射所用的抗原溶液用弗氏不完全佐剂进行乳化。加强免疫次后采用传统摘除眼球取血法采集Blab/c小鼠血液。取出的血液保温后，静置过夜，离心后，取上清分装保存。 斑马鱼蛋白抗鼠血清效价的测定 用缓冲液将抗鼠血清进行稀释，稀释梯度依次为、。取膜用缓冲液浸泡，晾干，取纯化的蛋白点于膜上，用含脱脂奶粉的缓冲液封闭，缓冲液洗涤（重复次）；将膜分别用封闭液稀释的抗血清孵育，缓冲液洗涤（重复次）；用羊抗鼠为二抗，哺育，缓冲液洗涤（重复次），显色。 结果与分析 原核表达载体的构建 使用载体构建的特异性引物进行菌落扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。由图可以看出，挑选的个克隆中有个大小约，与预期大小相符，表明成功构建原核表达载体。 蛋白的表达与纯化 将融合表达载体质粒转化到菌株，用的分别诱导、后，菌体用的电泳分析，结果如图所示。由图可以看出，在附近有明显的蛋白条带出现，与预期大小相同，并利用多糖树脂来纯化了重组蛋白，获得较为专一的蛋白条带。 斑马鱼蛋白菌结合试验结果 使用纯化的融合蛋白与种革兰氏阴性菌（野生型大肠杆菌、副溶血弧菌、溶澡酸弧菌）以及种革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）分别进行结合试验，以诱导空载体获得的融合蛋白为对照，结果如图所示。斑马鱼具有广谱的菌结合能力，与上述种细菌都能结合。 斑马鱼抗小鼠多克隆抗体效价的测定结果 取纯化后的重组斑马鱼蛋白对小鼠进行皮下免疫，经过次免疫后，从兔子耳静脉取血制备血清，用斑点酶联免疫吸附试验（）测定抗血清效价。由图4可知，鼠抗斑马鱼血清的效价达到以上。 小结与讨论 斑马鱼蛋白具有广谱的菌结合能力，对本试验所选取的种细菌均表现出很强的吸附能力。哺乳动物蛋白一般只能对革兰氏阴性菌有结合能力，对革兰氏阳性菌无结合能力。哺乳动物的免疫系统比鱼类复杂得多，对不同种类的细菌表现出不同的免疫机制。斑马鱼属于进化地位较低等脊椎动物，蛋白可能担负起对整个细菌的识别，而在哺乳动物中，蛋白功能可能被弱化和部分分离，进化压力胁迫对蛋白功能产生了较大的影响。 参考文献： 朱华，王娟，林燕，等血清淀粉样蛋白的研究进展心血管