（微生物学专业论文）酶解工业纤维废渣生产乙醇技术的研究.pdf

山东人学硕+ 学位论文 摘要 利用地球上最丰富且廉价的可再生生物质资源纤维素材料转化生成燃料乙 醇，具有重要的社会、经济和生态意义。酶法生产纤维素乙醇目前面临多种困难：纤 维素原料比重轻，收集运输不方便：原料结构复杂，需要深度预处理；纤维素酶系的 酶解效率有待提高；半纤维素转化形成的木糖难以有效转化形成乙醇等。本论文以玉 米芯深力h - r - _ 生产木糖工业产生的废渣一木糖渣为原料，初步探讨了同步糖化发酵 ( s s f ) 木糖渣生产乙醇的技术。由于木糖渣中的纤维素已经过深度预处理，非常容 易被纤维素酶水解生成葡萄糖，进而发酵生成乙醇。本论文以提高s s f 过程中原料 的乙醇得率和纤维素的转化率为目的，针对p 葡萄糖苷酶活性不高导致纤维二糖积累 阻遏酶活作用以及斜卧青霉( p e n i c i l l i u md e c u m b e n s ) j u a 1 0 同步糖化发酵体系中存 在的问题，开展了以下三个方面的研究工作： 一，以筛选得到能够有效利用木糖渣为碳源生产b 葡萄糖苷酶的菌株为目标，利 用旷注入棘孢曲霉( a s p e r g i l l u sa c u l e a t u s ) l 2 2 ，筛选得到一株p 葡萄糖苷酶活显著 提高的突变株，命名n i p 3 5 ，通过单因子实验结合正交实验对其液体培养基成分进行 了优化，并对其固态培养进行了初步的摸索。结果发现，在培养基组成为3 酶解木 糖渣，3 麦麸，0 5 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，0 3 c a c 0 3 ，0 5 k h 2 p 0 4 ，0 0 5 m g s 0 4 ，0 2 t w e e n 8 0 ，p h 自然条件下，3 0 ，2 0 0 r p m 摇瓶振荡培养5 d ，水杨苷法测得酶活为 1 6 2 4i u m l ，比未优化培养基时提高了o 8 4 倍，较出发菌株提高了2 8 7 倍。 二，产滤纸酶活水平较高的j u a 1 0 和产p 葡萄糖苷酶活水平较高的n i p 3 5 液体 培养液的混合，可以有效地克服原酶系中p 葡萄糖苷酶活性不高的问题。实验通过酶 配比用量、发酵温度、酵母用量、料水比、发酵时间、表面活性剂的影响等比较实验， 对同步糖化发酵木糖渣实验条件进行了优化，并探讨了木糖渣一玉米粉共发酵的可行 性。研究表明，当滤纸酶活和b 葡萄糖苷酶活用量分别为2 0 i u g ，料水比l ：1 0 ，酵 母用量0 2 ( g g ) ，发酵3 6 h 即可达到原料近2 5 的乙醇得率，纤维素利用率高达7 3 。 添加适量的表面活性剂t w e e n 8 0 能够一定程度的提高乙醇的得率，但t w e e n 2 0 却表 现出抑制作用。木糖渣一玉米粉共发酵实验表明，利用混合酶液自身的淀粉酶转化淀 粉可以进一步的提高发酵液的乙醇浓度，有效降低了后期蒸馏工序的耗能。 三，初步摸索了青霉、曲霉混合培养的可能性。青霉、曲霉由于存在属间差异， 生长速度、培养基组成、生长条件等均不相同。为了使两株菌能够友好地共同生长、 山东大学硕士学位论文 产酶，得到一个酶活水平高，配比合理的纤维素酶系组成，本研究分别实验了三种不 同的接种方式：不同比例种子液接种；不同数量孢子接种；不同时间接种。结 。 果发现，降低混合种子液中曲霉的比例，延缓曲霉种子接入的时间可以提高酶液中滤 纸酶活水平，但仍低于二者单独培养时酶活水平，且没有达到1 ：1 的理想比例。 关键词：纤维素酶系；1 3 - 葡萄糖苷酶；生物乙醇；木糖渣；同步糖化发酵 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t i ti se c o n o m i ca n de n v i r o n m e n t a lt op r o d u c ee t h a n o lf r o mc e l l u l o s e ，w h i c hi st h em o s t a b u n d a n t r e g e n e r a t e dr e s o u r c e si nt h ew o r l d c e l l u l o s i cs a c c h a r i f i c a t i o na n de t h a n o l f e r m e n t a t i o na ret w oi m p o r t a n tr e s e a r c hp a r t si nt h eb i o c o n v e r s i o no fc e l l u l o s et oe t h a n o l c u r r e n t l y t h i sr e s e a r c hw a sa b o u tt h eb r e e d i n go f1 3 - g l u c o s i d a s e p r o d u c i n gs t r a i n s ，t h e o p t i m u mc o n d i t i o no fs s ff o re n h a n c i n gh y d r o l y t i ce f f i c i e n c ya n de t h a n o ly i e l da n dt h e m i x - c u l t u r e do f p e n i c i l l i u md e c u m b e n sj u - a 10w i t ha s p e r g i l l u sa c u l e a t u sl 2 2 1 ) n i p 3 5 ，m e1 3 - g l u c o s i d a s eh i g h y i e l ds t r a i n ，w a so b t a i n e dt h r o u g h 矿i m p l a n t i n gi n t o a s p e r g i l l u sa c u l e a t u sl 2 2 t h ey i e l di n c r e a s e d1 f o l dt h a nt h a to ft h eo r i g i n a l t h e c u l t u r i n gc o n d i t i o n ss u c ha sc a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e ，a n ds u r f a c t a n te f f e c to n f e r m e n t a t i o no f n i p 3 5w e r es t u d i e d u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n 3 c o r r lc o br e s i d u e ， 3 w h e a tb r a n ，o 5 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，o 3 c a c o s ，o 5 k h 2 p 0 4 ，0 0 5 m g s 0 4 ，o 2 t w e e n - 8 0 ，i n c u b a t e du n d e r30 c ，2 0 0 r p m f o r5d a y s ，t h ey i e l do f1 3 - g l u c o s i d a s ei n c r e a s e d t o16 2 4i u m l ，n e a r l y2f o l d so ft h eo r i g i n a ls t r a i n 2 ) w eo p t i m i z e dt h es s fc o n d i t i o no fj u a 10a n dn i p 3 5v i ag r a d u a lt e s t so f t e m p e r a t u r e ，y e a s ti n o c u l a t i o n ，t h er a t i oo fs u b s t r a t et of l u i d ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o na n d t h ee f f e c to fs u r f a c t a n t t h eb e s tc o n d i t i o ni ss s fw i t h2 0i u ge n z y m ec o n c e n t r a t i o n ，t h e r a t i oo fs u b s t r a t et of l u i di s1 ：10 ，0 2 t w e e n 一8 0 ，u s i n go 2 y e a s ti n o c u l a t i o ni n3 7 c w ea l s or e s e a r c h e do nt h ec o f e r m e n t a t i o no fc o mc o br e s i d u ea n dc o r n s t a r c h t h e o p t i m i z a t i o np r o v i d ei m p o r t a n tv a l u ef o rb i o e t h a n o li n d u s t r yp r o g r e s s 3 ) i no r d e rt os i m p l i f yt h et e c h n i c s ，w ea l s oo p t i m i z e dt h ec o n d i t i o no fj u a10 m i x c u l t u r e dw i t hl 2 2 f o rt h ed i f f e r e n c eo ft w og e n u s ，t h eg r o w t hr a t i oa n dc o m p o s i t i o n o fm e d i u ma r ea l s od i f f e r e n t t h er e s u l ts h o w si ti sh a r dt oc u l t u r et h et w os t r a i n s t o g e t h e r ，w ed i dn o tg e tas a t i s f a c t o r yr e s u l t k e y w o r d s ：c e l l u l a s e ；1 3 一g l u c o s i d a s e ；b i o e t h a n o l ；c o r nc o br e s i d u e ；s s f i i i 山东大学硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责 任由本人承担。 ， 、 论文作者签名：丑纽芝线日期：卫生翌：，篁：3 望 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电 子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：导师签名：锄蚌期 山东大学硕士学位论文 第一章研究背景 1 1 生物质乙醇的研究进展 1 1 1 燃料乙醇生产工业的发展现状 随着世界经济的飞速发展和人口的快速增长，石油、天然气等传统的不可再生 能源对于世界经济发展的制约和人类生存环境的影响越来越受到人们的重视。根据 2 0 0 7 年世界石油需求预测数据，国际油价总体呈上扬趋势。目前国际油价已经上升 至1 2 5 美元桶。各种矿物质资源的过度消耗同时导致生态环境的不断恶化，严重威 胁人类社会的可持续发展。2 0 世纪的能源紧张及当今世界对能源需求的急剧增长， 加快了人们寻找开发替代能源，特别是液体燃料的步伐【1 1 。 乙醇既可以单独燃烧，又可以作为一种良好的汽油增氧剂和高辛烷值调和组分， 已被公认为是最有发展前景的可再生清洁能源之一【2 ，3 1 。它的生产和应用在国际上已 呈高速发展趋势，燃料乙醇产业已成为各国政府解决石油资源短缺问题，保护城市大 气环境质量和调控农产品供需矛盾的重要政策手段和经济杠杆。 在众多发展燃料乙醇工业的国家中，美国和巴西走在了各国的前列。巴西是世界 上燃料乙醇发展的先驱，它于1 9 7 4 年在世界上第一个推出国家酒精计划。发展至今， 巴西的燃料乙醇产量居世界第一，最高年产达1 6 0 亿升，成为世界上唯一不供应纯汽 油的国家 4 】。美国的燃料乙醇项目启动于1 9 7 8 年，在政府扶持下目前已成为世界第 二大乙醇生产国，其中8 0 为燃料乙醇【5 】。自巴西、美国大力推行燃料乙醇政策以来， 加拿大、法国、西班牙、瑞典等国纷纷效仿，均已形成了较有规模的研究及生产。目 前还有许多农业资源国家如英国、荷兰、德国、奥地利、泰国、南非等国政府也均已 制定规划【6 】，积极发展燃料乙醇工业。从减少温室气体排放和环境保护角度出发，欧 盟国家已建议生物燃料的使用到2 0 0 5 年要占整个运输燃料消耗的2 ，而到2 0 1 0 年， 这一数值要到达5 7 5 【7 1 。在国际能源组织( i n t e r n a t i o n a le n e r g ya g e n c y ) 和各国政 府的帮助下，1 4 个国家和欧洲共同体的科学家们联合签订了生物能协议( b i o e n e r g y a g r e e m e n t ) ，共同致力于利用植物纤维资源制取燃料乙醇的研究和开发工作。 我国在2 0 0 2 年开始推广燃料乙醇的生产，“十五”期间，国家批准建设了吉林燃料 乙醇、黑龙江华润酒精、河南天冠燃料乙醇和安徽丰原燃料酒精4 家燃料乙醇定点厂， 总生产能力达：至l j l 0 2 万吨年，2 0 0 6 年起已经达标生产。专家预测，我国燃料乙醇需 求量保守估计每年也将达5 0 0 万吨。中国政府为了发展燃料乙醇产业，在2 0 0 2 年制定 山东大学硕士学位论文 了国家“十五”燃料乙醇发展及车用乙醇汽油推广使用专项规划【8 】。此外，国家相 关的法律法规也为生物质能源的发展提供保障。2 0 0 5 年，中华人民共和国可再生能 源法提出，“国家鼓励清洁、高效地开发利用生物质燃料、鼓励发展能源作物，将 符合国家标准的生物液体燃料纳入其燃料销售体系”。国家“十一五”规划纲要也提 出，“加快开发生物质能源，支持发展秸秆、垃圾焚烧和垃圾填埋发电，建设一批秸 秆发电站和林木质发电站，扩大生物质固体成型燃料、燃料乙醇和生物柴油生产能力 9 】这些有力举措给我国的燃料乙醇开发及工业化生产带来前所未有的发展机遇。 1 1 2 利用天然纤维素材料生产燃料乙醇 由于目前乙醇发酵工业主要以淀粉质的玉米、小麦等粮食作物为原料，与人畜争 粮，且原料成本在生产总成本中比例很高。受粮食资源不足的制约，目前，以粮食为 原料的生物质燃料生产已不具备再扩大规模的资源条件。与淀粉质原料不同，天然纤 维素材料作为植物体光合作用的产物，是地球上最为丰富的可再生生物质资源。地球 上每年光合作用的产物( 生物质) 高达1 5 0 0 2 0 0 0 亿吨，是地球上唯一可超大规模再生 的实物性资源。全球每年产生的生物量的5 所含的能量即可与人类对石油和天然气 的需求量相当。目前作为生物质能源的利用量还不到其总量的1 。将天然纤维素材 料通过生物法转化为燃料乙醇，不仅能为人类提供数量可观、经济可行的新型能源， 而且可在很大程度上减轻农业废弃物对生态环境造成的污染，具有重要的经济和生态 意义。 世界上的两大燃料乙醇生产国巴西和美国都研究利用纤维素材料作为乙醇 的生产原料。他们以三十多年的实践证明了天然纤维素材料生产燃料乙醇的可行性【l ， 4 ，5 ，1 0 1 。燃料乙醇生产技术的逐渐成熟和工业化，使以纤维素材料生产燃料乙醇在经 济上具有一定的可行性【1 1 】。巴西以甘蔗渣或废糖蜜为原料生产乙醇，成本为每公斤 o 1 9 美元；美国以玉米为原料生产乙醇，成本为每公斤0 3 3 美元【1 0 】。廉价清洁的燃料 乙醇己日趋优于传统能源。 我国以农作物秸秆为代表的木质纤维素类生物质资源十分丰富，年产量高达6 亿 多吨，大部分焚烧于田间地头，既浪费了资源，又造成了环境污染【1 2 】。若能采用适宜 的技术，将这些秸秆类生物质资源加以转化利用，不仅能够节粮代粮，降低燃料乙醇 生产的原料成本，还可以处理“废物”、消除公害、保护环境，对我国经济的可持续 发展将产生深远的影响。因此，以廉价的纤维素废料作为燃料乙醇生产的原料，成为 我国新型能源领域研究的主要方向之一。 2 山东大学硕士学位论文 1 1 ，- 3 生物乙醇转化技术 利用天然纤维素材料生产燃料乙醇的关键，是把纤维素水解为可发酵糖，即完 成纤维素材料的糖化过程。水解纤维素可以采取化学或生物的方法。 纤维素化学水解主要途径包括稀酸水解和浓酸水解 3 6 】。 稀酸水解是木质生物质原料水解较为成熟的方法。稀酸水解工艺采用两步法：第 一步在较低的温度下进行，在此过程中，半纤维素非常容易被水解得到木糖等五碳糖 产物；第二步稀酸水解是在较高的温度下进行，重新加酸水解残留固体( 主要为微晶 纤维素1 ，得到可发酵水解产物葡萄糖。稀酸处理法也有一些不足之处。生物质原料 在进行预处理之前要粉碎处理，能耗大，若要粉碎成1m i l l 左右的微粒，其能耗相当 于整个制备过程总能耗的3 3 ；对设备的耐腐蚀性要求高；完成预处理后，要进行中 和处理，以便水解和发酵过程的进行；半纤维素水解生成的木糖有可能进一步降解， 生成糠醛等副产物，对发酵过程有抑制作用【3 7 】。 浓酸水解是指结晶纤维素在较低的温度下溶解于7 2 的硫酸、4 2 的盐酸或 7 8 3 的磷酸溶液中，在溶解过程中导致纤维素的均相水解。浓硫酸水解为最常用 方法，其主要优点是糖的回收率高，大约有9 0 的半纤维素和纤维素可转化为可发酵 糖。缺点是浓酸的成本高，回收困难，对设备的耐腐蚀性要求更高 3 7 】。 生物法即酶水解过程具有反应条件温和，副产物少或无副产物的特点，被认为是 最有希望的工剖1 3 】。近二十年来，微生物发酵法即酶法发酵生产纤维素乙醇作为一种 环保的生产方式，得到了世界各国生物学家的青睐 1 3 】。直接生物转化天然纤维素材料 生成乙醇的工艺因其成本低、设备简单而具有良好的发展前景。酶法发酵生产纤维素 乙醇的一般工艺流程见图1 1 【1 4 】。 l i g n o e e 。l l u l 。妇厩c c l l u 囊l a 习s e 一c e l l u l a s l , 铭 孽一鲨率鳖h 窭2 卜融酬 l c e l l u l o s e 枣i l i i g m n il 建到 ! ! 蔓霉啼萎裟痰t y 图1 - 1 植物纤维类生物质转化为乙醇的主要工艺过程 酶法发酵生产纤维素乙醇的方法有直接发酵法、间接发酵法、混合菌种发酵法、 3 山东大学硕士学位论文 同步糖化发酵法、非等温同步糖化发酵法( n s s f ) 、固定化细胞发酵法等【”】。其中， 同步糖化发酵法因省时、高效、经济等优点，成为生物乙醇转化的常用方法。 同步糖化发酵在一定程度上可以减少纤维素水解产生的葡萄糖、纤维二糖对纤维 素酶的阻遏作用。但生产纤维素酶制剂常用的真菌菌株的酶系中，d 葡萄糖苷酶含量 往往较低，造成了发酵过程中纤维二糖的积累，进而影响酶解效率和发酵效果【l6 1 。如 何减少同步糖化发酵过程中积累的纤维二糖成为生物学家研究热点【1 7 ，1 8 1o 在乙醇的工 业生产中，经常采用添加外源的1 3 葡萄糖苷酶的方法来提高水解效率。 目前，发展纤维素乙醇最有争议的一点是其生产成本相对于汽油和粮食乙醇而言 仍然过高，距离实际应用仍有一定差距，造成这一问题的原因有许多方面，主要表现 在【2 8 】： ( 1 ) 秸秆作为农业废弃物分布分散，且比容很低，造成收集、运输困难，增加了 原料成本。如大规模收购玉米秸、麦秸，到厂价会涨n 2 0 0 - - 3 0 0 元吨以上。目前 的技术条件下，如所含的戊糖不能很好地利用，需要6 7 吨秸秆才能生产1 吨乙醇， 原料成本对总成本就有很大影响。 ( 2 ) 天然纤维素材料的结构非常复杂，主要是纤维素的高度结晶性和木质化，阻 碍了酶与纤维素的接触，使其难以直接被生物降解。对大多数天然纤维素材料来说， 如果没有经过适当预处理，直接进行酶促水解，酶解率一般都非常低( 2 0 ) 。这 就需要先进行适当的物理或化学预处理，如稀酸预处理、蒸汽爆碎处理等。经过适当 的预处理，破坏了天然纤维质原料的成分和结构，能显著地提高其对酶作用的敏感性。 但是，纤维质原料预处理的能耗太高。目前尚未找到一种既经济又有效的方法，使纤 维质原料组分分离完全且纤维素降解很少。同时这些预处理过程增加了工艺的复杂 性，增加了设备投资和生产成本。 ( 3 ) 同植物纤维酸法水解工艺相比，酶法水解具有反应条件温和、不生成有毒降 解产物、糖得率高和设备投资低等优点；而妨碍木质纤维素资源酶法生物转化技术实 用化的主要障碍之一，是纤维素酶的生产技术不够成熟，生产成本高，酶活力低，酶 解时用酶量大，酶解效率低。在目前产酶技术条件下，生产一加仑乙醇需用纤维素酶 的生产费用约为3 卜5 0 美分。美国近期的研究目标是将纤维素酶成本减少到低于每 加仑乙醇5 美分。这需要将酶的比活性或生产效率增高约1 0 倍，任务非常艰巨。 ( 4 ) 木质素和半纤维素充分转化利用目前还缺乏行之有效的技术。天然纤维素类 物质中大多含有木质素、半纤维素。木质素在稀酸或蒸气爆碎预处理过程中小部分已 4 山东大学硕士学位论文 经被除去，大部分与纤维素一起仍为固体状态，但结构已经发生变化，对纤维素酶解 的妨碍作用已明显减轻，最终留在发酵残渣中，可用于产热发电，高值化利用的途径 还有待开发。半纤维素在稀酸或蒸汽爆碎预处理过程中发生降解，产生的木糖或木寡 糖存留在反应液中，当浓度达到9 时对纤维素酶的抑制作用可达1 0 。消除木糖抑 制的方法是在纤维素酶解前将之分离掉，或利用能转化与利用木糖的菌株，如假丝酵 母、管囊酵母等，转化木糖为乙醇或其它产品。现在研究较多的是用基因工程手段构 建能同时利用葡萄糖与木糖的菌株，进行混合糖同步发酵。 ( 5 ) 纤维素酶解与酵母发酵合二为一的同步耦合技术还不太成熟，较为突出的是 两者的温度不协调。 ( 6 ) 发酵产生的乙醇对纤维素酶的活性可能存在一定的抑制作用。 ( 7 ) 由于纤维类底物的比重轻，难于进行高浓度发酵，致使发酵产物乙醇浓度低， 造成现有技术的产物回收费用高。 1 2 纤维素酶 纤维素酶( c e l l u l a s e ) 又称纤维素酶系，是由多种组分组成的一个复杂酶系，是 水解纤维素及其衍生物的一组酶的总称【1 9 】。目前最为典型并得到广泛研究的纤维素酶 生产菌株主要集中在丝状真菌，其中酶系较全且活性较高的纤维素酶菌株主要包括： 木霉( t r i c h o d e r m as p ) 、青霉( p e n i c i l l i u ms p ) 和担子菌( b a s i d i o m y c e t e s ) ，如木霉 属中的瑞氏木霉( zr e e s e i ) 、康氏木霉( zk o n i n g i i ) 、绿色木霉( zv i r i d e ) 以及青 霉属中的斜卧青霉( pd e c u m b e n s ) 、微紫青霉( pj a n t h i n e l l u m ) 和绳状青霉( p f u n i c u l o s u r n ) 等【1 9 】。 1 2 1 纤维素酶的组成和性质 国内外多根据纤维素酶的底物、作用位点和释放产物将其分为三类【1 9 】： ( 1 ) 内切一p - l ，4 一葡聚糖酶( 1 ，4 一d g l u c a n o h y d r o l a s e 或e n d o 一1 ，4 p d g l u c a n a s e ， e c3 2 1 4 ，简称e g ) 的分子量介于2 3 一- , 1 4 6k d a 之间。这类酶作用于纤维素分子内 部的非结晶区，随机水解p 1 ，4 糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还 原性末端的纤维素小分子，如短链纤维素，纤维寡糖等。如真菌的异构酶e gi 为5 3 k d a ，e gi l l 约为4 9 8k d a ，而有两种纤维粘菌的内切酶e g 分子量只有6 3k d a 。 ( 2 ) 外切一p 一1 ，4 - 葡聚糖酶，或称纤维二糖水解酶( 1 ，4 - 1 3 d - g l u c a nc e l l o b i o h y d r o l a s e 或e x o 一1 ，4 p d g l u c a n a s e ，e c3 2 1 9 1 ，简称c b h ) ，分子量介于3 8 1 1 8k d a 之间。这类酶作用于纤维素分子的还原或者非还原末端，水解p 1 ，4 糖苷键， 气 山东大学硕十学位论文 每次切下一个纤维二糖分子，从而破坏纤维素分子。如木霉的c b h 有两种，c b h1 分 子量约为6 6k d a ，c b hi i 约为5 3k d a 。 ( 3 ) 3 - 1 ，4 一葡萄糖苷酶( p 1 ，4 - g l u c o s i d a s e ，e c3 2 1 2 1 ，简称g e ) 有胞内( 或 胞壁) 酶和胞外酶之分，分子量介于4 7 - - - 7 6k d a ( 胞外酶) 或9 0 - 1 0 0k u a ( 胞内 酶) 之间。主要催化水解含有p 葡萄糖昔键的化合物，使非还原性p d 葡萄糖残基及 其末端断裂，同时释放出p d 葡萄糖和相应的配基，如芳香基和羟基等【2 0 1 。在纤维素 水解过程中，d 葡萄糖苷酶能够水解低分子量的纤维糊精和纤维二糖，生成葡萄糖， 从而解除因纤维二糖积累造成的对纤维素酶活性的抑制作用。因此，p 葡萄糖苷酶是 广义的纤维素酶系的主要成分之一，其酶活的高低直接影响整个纤维素酶系的作用效 果。 ， 除了上述三大组分外，真菌中参与纤维素降解过程的还有一些短肽类化合物、“氢 键酶”、纤维二糖脱氢酶等【2 l 】。它们通过氧化作用或者破坏氢键来降解纤维素分子。 1 2 2 纤维素酶的协同作用机制 纤维素酶降解纤维素的过程是从它吸附到纤维素上开始的，这个降解过程可以是 单一酶的作用，如热纤梭菌中存在一种多种组分结合形成的纤维素酶复合体；也可以 是多种酶协同完成的【2 2 1 。鉴于纤维素结构的复杂性，在真菌中，没有任何一种酶能将 纤维素彻底水解。不管是在纤维素酶复合体中，还是真菌体内，纤维素的降解需要多 种酶组分的协同作用。真菌通过分泌到胞外的游离纤维素酶，以水解酶机制降解纤维 素；而细菌纤维素酶则是以形成多酶复合体结构而起作用 1 9 】。 目前，最为广泛接受的纤维素酶解机制是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和p 葡萄 糖苷酶的协同作用机带l j 2 0 , 2 3 , 2 4 。这个机制的主要内容是：葡聚糖内切酶随机水解纤维 素分子链内部的1 3 葡聚糖苷键，形成新的链末端；外切葡聚糖苷酶从纤维素分子链一 端开始，连续切下并释放可溶性纤维二糖；3 - 葡萄糖苷酶将中间产物纤维二糖和 纤维寡糖水解成小分子糖，从而解除它们对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的产物抑制 作用【2 5 】。这三个水解过程同时进行，将纤维素完全降解成为葡萄糖。整个水解过程如 图1 2 所示。 6 山东大学硕士学位论文 蟊相 。 渡相 、： 删零 ( 次级水解) 一 馨 g o 尊i - 。气 0 ( 扔级水解) 圈1 2 瑞氏本霉( t r i c h o d e r m a ) 降鳃纤维素的作用模式图 2 5 l i 一一百一一4 i 山东大学硕士学位论文 薹3 1 麓步耱诧发酵工蓑的特点 由于糖化和发酵可在同一反成器里进行，s s f 节省了设铸投资，反应时间可缩短 一半，大幅度减少了纤维索酌酶瓣戚奉溺。与纤维薅耄糖纯器乙酵发酵穗继进善亍戆两步 法相比，s s f 过程中，水髂终产物葡萄糖不断被乙醇生产菌利用，生成与消失几 乎霹步，消除了蔫萄耱滚度懿增热黠纤维寨酶戆反馈捧裁髂霜挲霹，增蕊了乙醇懿发酵 产率。乙醇的存在和p h 值降低使发酵过程污染杂菌的可能性减少。而1 3 ，葡萄糖瞥酶及 时降解反馈撵制纤维素酶活酶纤黎= 糖，减轻了鹜解孛阕产物对酶活性发挥的攘锲， 促进了酶促反应的动力学过程。 舔步糖健发酵虽然被谈秀是纤维素乙醇转纯最有效酶途径，可戬便撵裁纤维素酶 的水解产物一葡萄糖和纤维二糖的积累降到最低，但常用作工业生产的纤维素酶生 产菌酶转。篱萄糖瞢酶在酶系孛含量攘对较诋，而发群体系孛水解酌中闯产裙纤维 二糖只能通过葡萄糖瞽辩来降解，因此发酵液中的纤维二糖不能得到完全的降解。 作为纤维素酶酶竞争健辩露l 物器霞渊，纤维二糖酶剥磁或减少裁成为提高酶藤效率戆重 要环节。 1 3 2 阔步糖倦发酵的影瞄因素 同步糖化发酵的效率遘常以乙醇产量米表示。嫩子发酵中存在多拳申影响因豢，乙 醇浓度受到多方面的影晌f 磺。其中，发酵溢度、底物浓度帮酶液滚度是影响较大的匿 素f 3 l 】。 纤维素酶解与酵母灞精发酵同时进行，较为突器的是舔者的温度不协调。在s s f 过程中，表现纾维素酶蚋最佳温度必4 5 5 0 ，两乙醇发酵的最佳温度为2 5 , - 一3 5 c 。 折衷两者的最健温度得到的温度既不最适合发酵、也不最适合水解。荚匿可群生能源 研究爨豹主b a l l e s t e r o s 等人选爰耐热酵母对提毫s s f 邀程豹转化率进行了研究，但由予 酵母产潜能力较差而无法应用到鼹际生产中【3 2 3 3 】。 在工选生产中，发酵熬乙醇达至1 5 以上巍比较经济豹蒸馏浓度，要达到这个浓 度最简单的办法是提高底物浓度和酶液浓度【3 4 】。理论上，底物浓度和酶液浓度匿接影 豌底耪糖化瑟熬慈糖量，进两影瞧酵母熬生长。巍予纤维素材料在预处理过糕中，会 产生乙酸、糠醛、羟甲基糠醛等一系列酵母生长的掷制物f 3 鄹，因而底物浓度的味提 高会影媳工盟酵母翡生长，继瑟辫低乙醇发簿浓霞。嚣嘉剂爨纤维素簿豹装嚣会盏接 增加乙醇的生产成本。适赢的底物浓度和酶液浓度燕同步糖化发酵体系中最蕊本的工 艺条件。 岛 山东大学硕士学位论文 1 4 产纤维素酶真菌混合发酵 1 4 1 混食发酵 虽然穰多徽生物都能产纤维紊酶，僵患予纤维素酶是一个复杂的多酶体系，同时 纤维素结构也比较复杂，在真菌中，没有任何一种酶能将纤维素彻底水解。不管是在 纤维素酶复合体中，还是真菌体蠹，纤维素的降解需要多种酶组分的协同作用。 正是由于纤维素的降解需要三种酶系协同作用，因而采用单一菌株产纤维豢酶再 甭酶降解纤维素的工艺，在实践中被证翡有很大的局限性。当单菌发酵生产纤维素酶 工艺遇到困难后，人们又转向研究如何以科学的菌种组合进行混合发酵工艺。 混合发酵蓠种组合选择常包括纤维素分解蘸、术质素分解菌，增加蛋蛊蘸等。产 纤维素酶菌株多选用木霉：包括康氏木霉、绿色木霉、长柄本霉等；也可用越霉、烟 曲霉、黑曲霉或字佐美曲霉；木质素分解茵有侧孢霉、白腐菌等；蛋崮的提高常用酵 母菌，如产疑假丝酵母、热带假丝酵母、嗥酒酵母、自地霉等。菌种搭配时应注意菌 株之间的相容性。李彩霞将纤维素降解菌株和高产蛋白菌株在改良p d a ( 加入l o 玉 米莘粉) 上进行混合培养，以菌丝是否共生良好作为菌种相容性好的依据，其研究中 证实一些菌种配合时菌丝生长受到不同程度的抑制睡。另外，菌种之间也应有适当的 比例。因搭配不当两出现负效应的报道，比如涂璇等的研究表竣，将烟鼗霉( a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ) 和黑曲霉口n i g e r ) 按一定比例进行双菌混合发酵时，能显著提高发酵产物 中3 辩纤维素酶缀分熬活性f l o l 。丽当囊以上混蓥发酵体系中接入酵母n ( c a n d i d as p 。) 时，三荫混合发酵产物中三种纤维素酶组分活性明遍降低。张冬艳等利用一种酵母菌 与木霉菌进行双莹发酵，结果显示产物中豹滤纸酶活( f p a ) 和羧警基纤维素酶活 ( c m c a s e ) 均有所降低【l l 】，究其原因可能是双菌发酵体系中只有木霉分泌纤维索酶分 解纤维索产生葡萄糖，酵母蓥帮木霉之闻争夺营养物从蠹影响了木霉菌翡生长。两司 美茹研究中，在烟曲霉和黑曲霉中加入假缝酵母，比例约为2 0 0 ：l ，产物中的滤纸酶 活( f p a ) 、羧翠基纤维素酶活( c m c a s e ) 帮微暴纤维素酶活溶v p 三群酶活性显著提高 【8 】 o 量4 2 声纤维素酶粪菌漫金发酵豹微生态原理 1 4 2 1 减弱酶的反馈抑制作用 纤维素酶在水解纤维素产葡萄糖过程中，葡萄糖穗纤维二糖对纤维素酶有强黧熬 反馈抑制作用，这就影响了纤维素的水解速度和程度。如将能分解纤维素的菌与能利 糟蓠萄糖帮纤维二糖嚣菌混合发酵，在发酵过程中，巍予蓠萄糖帮纤维= 藉被男一种 9 山东大学硕士学位论文 菌吸收铡用，从两大大减弱了酶的反馈挪制。所鼓，就纤维寨分解两富，涅合发酵耽 单一纯种培养发酵更快、更彻底。司美茹、薛泉宏等在研究假丝酵母对黑曲霉和烟曲 霉鋈态发酵中纤维素酶及淀粉酶活性麓影响，结果表舞，接入少量锻丝酵母，可大幅 度提高两种曲霉菌纤维素酶体系中滤纸酶( f p a ) 、羧甲基纤维素酶( c m c a s e ) 、微晶纤 维素酶( a v i ) 及淀粉酶酶活性戮。其原医是酵母菌利耀了求解形成静纾维二糖等小分 子还原糖，解除了纤维二糖对纤维素酶和淀粉酶合成的阻遏，从而提高了发酵产物的 酶活性。而且经检溅，体系孛的细胞羚可溶性蛋童峰值含量较无酵母慧接入时提高幅 度高达4 1 ，说明混合培养纤维素酶及淀粉酶活性的提高是酶蛋白合成与分泌量增加 的结果。 1 4 2 2 酶系互补 在煮菌发酵生产纤维素酶研究过程中发现，虽然术霉是公认的最好的纤维豢酶生 产菌，但仍存在蹲方面不足，一是术霉的毒性嫌疑大，二是木霉普遍存在产生的墨 葡萄糖瞢酶活性偏低。许多曲霉属菌株如黑馥霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、海枣曲霉 倦p h o e n i x ) 等都能产生高活力的b 葡萄糖苷酶。而且，曲霉是公认的产纤维素酶 活较强的安全菌株。张海等对木霉和益霉混合培养，不仅使。葡萄糖瞽酶活力比单 纯培养术霉提高3 2 倍，两且内切纤维素酶謦丑纤维二糖水解酶活性也同时增长2 4 和 5 【酿。李海红利用从牛霹中分离到的真菌发酵玉米秸秆时，发现单菌种发酵中，绿 色木霉的降解效果明显好于所利用的自腐菌和鳇霉，但三者结合使用降解效果比单纯 使用绿色木霉提高1 6 。o ，原因就是崮腐菌熊分解秸秆中的木质素成分，为木霉和睦霉 对纤维豢的降解提供了便利【1 2 1 。 1 4 2 3 赢利共生 蒲涛等将豳氮菌( a z o t o b a c 绍rs p 和纤维素分解菌( t r i c h o d e r m a p s e u d o k o n i n g i i ) 进行混合培养，观察到两菌的生长及固氮菌的固氮作用均高于两种菌备自单独培养， 与霹氮翦在土壤中凰氮能力比纯培养条件下嵩的实际情况摆符【1 3 1 。出现这群情况的原 因是，圃氮菌除能固定大气中的氮素外，还能形成维生素和生长素等，不仅能刺激农 作物生长发育，也能拥强其他根琢微生物的生命活动。磊土壤中的有橇质约一半是纤 维素，纤维素分解菌可以将这些物质分解成简单的物质，作为固氮蓠的碳源。 1 5 酶解本糖渣生产燃料乙醇 木糖渣是玉米芯深加工生产木糖类产品产生的废渣，经过测定，纤维素含量可达 5 0 戳上。这部分纤维素澄经过深度预处理，菲誊容易被纤维素酶水解生残葡萄糖， 山东大学硕士学位论文 进而发酵生成乙醇。山东禹城建立了多家利用玉米芯生产多种木糖相关产品的企业， 目前每年要消耗玉米芯3 0 余万吨，完全达产后需要5 0 6 0 万吨。然而，目前的生产 工艺只利用了原料中的部分半纤维素，且利用率较低，产生了大量的木糖渣，；给企业 造成了不小的麻烦。如能将这些纤维质的“废渣”转化利用，将带来很大的经济效益 和社会效益。 山东大学硕士学位论文 第二章1 3 葡萄糖苷酶高产菌株的选育及培养条件的优化 2 1 引言 p 葡萄糖苷酶( 1 3 - g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 1 ) 主要催化水解含有p 葡萄糖昔键的化 合物，使非还原性8 。d 葡萄糖残基及其末端断裂，同时释放如d 一葡莓糖和相疲的配 基，如芳香基和羟基等 4 6 1 。1 8 3 7 年，l i e b i g 和w o h l e r 首次在苦杏仁中发现。后来的研 究发现，多葡萄糖苷酶存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、越霉、木霉及缨蓠体内。 它参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用。在纤维素水解过 程中，葡萄糖营酶能够水解低分子量的纤维糊糖和纤维二糖，生成葡萄糖，从而解 除因纤维二糖积累造成的对纤维素酶的抑制作用。因此，p 葡萄糖苷酶是广义的纤维 素酶系的主要成分之一，其酶活的高低直接影响整个纤维素酶系的作用效果。 为了提高p 一葡萄糖苷酶的酶活水平，许多研究者采用了多种不同的方法对菌株进 行诱变。杨建海、任大明以黑盏霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 为出发菌株，经紫外线、硫酸二 乙醋( d e s ) 和c 0 6 0 复合诱变，使1 3 葡萄糖苷酶活性比原菌株显著提高，三种处理方法 分别提高3 6 ，2 8 季9 1 3 2 ，豆所获突变株具有较高的遗传稳定性【4 7 】。张芳、阖生全、 黎定标以黑曲霉为出发菌株，经紫外线一氯化锂诱变得到1 3 个长势良好的单菌落。通 过永解水扬营产还原糖方法测定这1 3 株菌固态发酵产$ 。葡萄糖苷酶活力，最高可达 1 1 8 9 5u m l ，比原始菌株提高了将近6 倍【4 8 1 。马旭光、蔺海明、刘星斌等对太空诱变 的黑莹霉进行筛选得到纤维素酶高产突变株，以玉米秸秆粉隽主要碳源经固体发酵培 养测得其p 葡萄糖苷酶酶活为1 2 0 8 1u g ，比出发菌株各组分的酶活了1 8 倍，经过5 次继代露体发酵试验证骧该菌株具奢较好的产酶稳定性9 1 。 离子注入应用于工业微生物诱变育种，具有损伤轻，突变率高，突变谱广等特点 测，受到了广泛的关注【5 1 巧弱。 离子注入技术在国外最初主要用于处理金属、塑料等以增加其抗磨性，减小磨擦 系数，抗腐蚀等，继而震于无生命有机物使其分子量分布和溶解度发生变化。1 9 8 6 年 由中科院等离子体所率先将低能离子束应用于诱变育种 5 4 1 ，从此，我囡将离子束用于 作物遗传改良方面走在了世界的前硼。 与传统的诱变方法相比，离子注入微生物育种有以下的特点： ( 1 ) 菌体突变的高效性。离子注入既有物理效廒，也有化学效应。雳于诱变育 种的特点是是集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法。它能够引起染色体的畸 1 2 山东大学硕士学位论文 变，导致d n a 链碱基的损伤、断裂【5 5 1 ，从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发 生改变或缺失，大幅提高变异的频率。特别是在工业微生物育种方面，为高效筛选正 突变菌株提供了更广阔的空间。龚加顺等【5 6 在研究单宁酸酶生产菌诱变过程中，发现 旷注入黑曲霉可获得较u v 诱变更高的正突变率和更大的变异幅度。u v 诱变的菌株负 突变率高，子代孢子生长缓慢，发酵单位普遍低于矿注入诱变结果。这验证了离子注 入诱变谱广、变异幅度大的特点。而离子注入v c 二步发酵混合菌育种，选育出了高 产菌株，已经进入工业化生产【5 5 1 ，说明了离子注入是一种高效的诱变方法，可减弱菌 种多次诱变产生的突变饱和性、抗性，提高工业微生物的发酵水平。许安掣5 5 ，5 刀采取 分别诱变和筛选v c 混合发酵体系，进行优一优组合，获得高产菌系，糖酸转化率较出 发菌株提高1 5 2 0 ，4 代传种平均转化率达9 5 。摇瓶培养具有产酸能力高、发酵 周期短的特点。 ( 2 ) 菌体细胞表面蚀刻性。离子注入生物体的动量传递，可以根据直观的表面现 象进行观察研究，注入的离子就像“手术刀”对细胞表面进行蚀刻，留下非常整齐的 创面。动量传递的结果引起生物组织或细胞的表面溅射，造成细胞形态的变异。y 。 射线辐射却未见这种直观的蚀刻现象。龚加顺等【5 6 也验证了会r 离子注入后，离子剂 量与孢子细胞表面刻蚀程度呈正相关。注入离子后的孢子有明显破壁现象，孢子上有 明显的凹陷区。认为离子先破细胞壁、膜，后到达细胞表面或内部，进行动量交换， 影响胞内物质的运动，导致染色体结构的重排和其他变化，从而产生稳定的遗传变化。 ( 3 ) 菌体存活曲线呈“马鞍型”。存活率是微生物育种中常测指标，存活曲线是 存活率变化趋势直观表现。传统的物理、化学诱变方法( u v 、y 射线、e m s 、d m s 等) 均产生指数型或肩型的存活曲线，而离子注入诱变的存活曲线为先降后升再降的 “马鞍型”。这说明了离子注入损伤小、突变率高的生物学效应 5 8 - 6 1 】。可以认为低剂 量n + 注入时，能量沉积效应和动量转移效应的综合作用，导致了d n a 的损伤和生物 膜等大分子的损伤，造成了存活率下降。中高剂量注入时存活率上升，可能是因为 n + 注入后电荷积累发挥了作用，激活了细胞的修复机制和修复酶。高剂量n + 时，细 胞损伤程度大于其修复能力；电荷效应也由于达到了临界值，而产生库仑爆炸，保护 屏障消失。虽然，理论上能解释其原因，但具体的修复机制情况需进一步研究。“马 鞍型”存活曲线充分地